مستخلص Cistanche Deserticola يزيد من تكوين العظام في الخلايا العظمية العظمية

الاتصال: أودري هو واتساب / حصان: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

تي ماو لي^aهسين تشيه هوانغ,^bتشن مينغ سو,^cتين يون هو,^a، تشي مينغ وو^aون تشي تشن,^d,يي تشين فونغ^{أ، ه}وتشيه هسين تانغ^{و، ج}

تجريدي

اهداف:قمنا بالتحقيق في تأثيرCistanche deserticola Ma. (CD) على تكوين العظام بواسطة الخلايا العظمية المستزرعة.أساليبتم استخدام اختبار تكوين العقيدات المعدنية لفحص التأثيرات المخبرية ل CD على تكوين العظام. تم تحليل الفوسفاتيز القلوي (ALP) ، والبروتينات المورفوجينية العظمية (BMP) -2 ، وتعبير mRNA العظميوبونتين (OPN) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. تم التحقيق في آلية عمل مستخلص القرص المضغوط باستخدام النشاف الغربي. تم تقييم التأثير المضاد لهشاشة العظام في الجسم الحي لمستخلص CD في الفئران المبيضة.ثالثا - النتائج الرئيسيةلم يكن لمستخلص CD أي تأثير على انتشار أو هجرة أو التئام الجروح من الخلايا العظمية المستزرعة ، ولكنه زاد من ALP و BMP-2 و OPN mRNA وتمعدن العظام. قلل كيناز البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK) أو مثبطات العامل النووي (NF)-kB من تكوين العظام الناجم عن مستخلص CD وتعبير ALP و BMP-2 و OPN. ومع ذلك ، لم يؤثر مستخلص القرص المضغوط على تكوين العظام. بالإضافة إلى ذلك ، منع مستخلص CD فقدان العظام الناجم عن استئصال المبيض في الجسم الحي.الاستنتاجاتقد يكون CD عامل تكوين عظام جديد لعلاج هشاشة العظام.

سيستانش ديزرتيكولا

مقدمة

العظام هي نسيج معقد يتكون من عدة أنواع من الخلايا التي تخضع لعملية مستمرة من التجديد والإصلاح تسمى "إعادة تشكيل العظام". هناك نوعان رئيسيان من الخلايا المسؤولة عن إعادة تشكيل العظام هما الخلايا العظمية ، التي تمتص العظام ، والخلايا العظمية العظمية ، التي تشكل عظاما جديدة. يتم تنظيم إعادة تشكيل العظام من خلال العديد من الهرمونات الجهازية (مثل هرمون الغدة الدرقية ، 1 ، 25-هيدروكسي فيتامين D3 ، الهرمونات الجنسية ، والكالسيتونين) والعوامل المحلية (مثل أكسيد النيتريك ، البروستاجلاندين ، عوامل النمو ، والسيتوكينات). [1]

ينتج مرض هشاشة العظام عندما يكون ارتشاف العظام وتكوينها غير منسقين ويتجاوز انهيار العظام الزائد بناء العظام. [2] تشمل العلاجات الحالية لهشاشة العظام البايفوسفونيت والكالسيتونين والإستروجين، وهي مثبطات ارتشاف العظام التي تحافظ على كتلة العظام عن طريق تثبيط نشاط الخلايا العظمية. [3] ومع ذلك ، فإن تأثير هذه الأدوية في زيادة أو استعادة كتلة العظام صغير نسبيا ، وبالتأكيد لا يزيد عن 2٪ سنويا. [3] لذلك ، هناك حاجة إلى عوامل بناء العظام ، مثل teriparatide ، التي تحفز تكوين عظام جديدة وتصحح التغيير في البنية الدقيقة التربيقية التي تميز هشاشة العظام الراسخة. [4,5] نظرا لأن تكوين العظام الجديدة هو في المقام الأول وظيفة من وظائف الأرومة العظمية، فإن العوامل التي تعمل إما عن طريق زيادة انتشار خلايا السلالة العظمية أو تحفيز تمايز الخلايا العظمية يمكن أن تعزز تكوين العظام. [5,6]

على الرغم من أن آليات هشاشة العظام لا تزال غير واضحة ، إلا أنها ترتبط على الأرجح بانخفاض توافر أو آثار عوامل نمو العظام ، مثل البروتينات المورفوجينية للعظام (BMPs). [7] تم تحديد BMPs ، والتي ترتبط هيكليا بالأسرة الفائقة لعامل النمو المحول ب ، في الأصل من خلال قدرتها على تحفيز تكوين العظام خارج الرحم في القوارض. [8] تلعب BMPs دورا مهما في تكوين العظام وتمايز خلايا العظام من خلال تحفيز نشاط الفوسفاتيز القلوي (ALP) بالإضافة إلى تخليق البروتيوغليكان والكولاجين و osteopontin (OPN). [9] وجدت دراسة حديثة وجود صلة بين هشاشة العظام وتعدد الأشكال المحددة في جينات BMP-2 و ALP و OPN ، مما يشير إلى أنها مرتبطة بتطور هشاشة العظام. [10]

Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae ؛ اختصارا باسم CD) هو عشب أصلي في الصين ويستخدم على نطاق واسع في الطب التقليدي كعامل علاجي بسبب خصائصه المهدئة والمسكنة والمناعة. [11] أظهرت الدراسات الدوائية المنطقية الحديثة أن مستخلصات الأقراص المضغوطة يمكن أن تحفز المناعة،[12] وإزالة الجذور الحرة[13]، وزيادة نشاط ديسموتاز الفائق الأكسدة. [14] العوامل المضادة للالتهابات والمضادة للأكسدة لديها القدرة على علاج هشاشة العظام عن طريق زيادة تكوين العظام و / أو قمع ارتشاف العظام. [15,16] ومع ذلك ، لم يتم بعد تحديد تأثير CD على وظيفة خلايا العظام. هنا ، نذكر أن مستخلص CD لم يؤثر على انتشار أو هجرة أو نشاط التئام الجروح للخلايا العظمية المستزرعة ، ولكنه زاد من ALP و BMP-2 وتعبير OPN وتمعدن العظام. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن كيناز البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK) ومسارات إشارات العامل النووي (NF)-kB قد تشارك في الزيادة بوساطة CD في التعبير الجيني وتمعدن العظام. في المقابل ، لم يقمع مستخلص القرص المضغوط تكوين العظم في المختبر. والجدير بالذكر أن علاج الفئران بمستخلص CD منع فقدان العظام الناجم عن استئصال المبيض في الجسم الحي. لذلك ، تشير بياناتنا إلى أنه يمكن استخدام CD لتحفيز تكوين العظام لعلاج هشاشة العظام.

سيستانش ديزرتيكولا

المواد والأساليب

سيستانش ديزرتيكولا استخراج والمواد

تم شراء مستخلص القرص المضغوط من شركة تشوانغ سونغ زونغ للأدوية (كاوشيونغ ، تايوان). تم اتباع استخراج وعزل CD كما هو موضح سابقا (على أساس البيانات الطيفية ، حددوا التركيب الكيميائي بما في ذلك بيتا سيتوستيرول ، داوكوستيرول ، حمض السكسينيك ، ترياكونتانول ، أكتيوسيد ، البيتين ، والسكريات). [17] تم شراء الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرنب الخاصة بالكينازات التي تنظمها الإشارة خارج الخلية (ERK) و ERK و p-p38 و p38 و p-c-Jun N-terminal kinases (JNK) و JNK و p-p65 و p65 من Santa Cruz Biotechnology (سانتا كروز ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مجموعة OSEOCALCIN ELISA من Biosource Technology (Nivelles ، بلجيكا). تم الحصول على تيلوببتيدات C-terminal من مجموعة الكولاجين ELISA من النوع الأول من Cross Laps (هيرليف ، الدنمارك). تم توفير المتحور السلبي المهيمن p38 من قبل الدكتور ج. هان (المركز الطبي الجنوبي الغربي ، دالاس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم توفير المتحور السلبي المهيمن JNK من قبل الدكتور M. Karin (جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم توفير المتحور السلبي المهيمن ERK2 من قبل الدكتور M. Cobb (المركز الطبي الجنوبي الغربي). تم الحصول على جميع الكواشف الأخرى من سيغما ألدريتش (سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية).

زراعة الخلايا

تم شراء خط خلايا الأرومة العظمية الفئرانية MC3T3-E1 من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC; روكفيل، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استزراع الخلايا في 95٪ من الهواء ، و 5٪ CO2 مع a-MEM الذي تم استكماله ب HEPES 20 مم و 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية المعطل حراريا ، و 2 مم الجلوتامين ، والبنسلين (100 U / ml) ، والستربتومايسين (100 مجم / مل).

قياس تكوين العقيدات المعدنية

تم تقييم تكوين العقيدات المعدنية على النحو الموصوف. [18] باختصار، تم استزراع الخلايا العظمية العظمية في وسط يحتوي على فيتامين C (50 ملغم/مل) وب-غليسيروفوسفات (10 مم) لمدة أسبوعين، وتم تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. بعد الحضانة بمستخلص CD لمدة 12 يوما ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن مؤقتا من 20 مم يحتوي على Tris-buffered.

0.15 م كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، مثبت في الإيثانول البارد المثلج بنسبة 75٪ (v / v) لمدة 30 دقيقة ، ومجفف في الهواء. تم تحديد ترسب الكالسيوم باستخدام تلطيخ اليزارين الأحمر-S. باختصار ، تم تلطيخ الخلايا والمصفوفة الثابتة بالإيثانول لمدة 1 ساعة باستخدام 40 مم من الألزارين الأحمر S (الرقم الهيدروجيني 4.2) وشطفها على نطاق واسع بالماء. تم إزالة البقعة المربوطة بنسبة 10٪ (ث / v) كلوريد سيتيل بيريدينيوم ، وتم قياس أليزارين الأحمر-S في العينات كميا عن طريق قياس الامتصاص عند 550 نانومتر ومقارنته بمنحنى قياسي. شامة واحدة من الأليزارين الأحمر-S تربط بشكل انتقائي ما يقرب من مولين من الكالسيوم.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي

تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا العظمية باستخدام مجموعة TRIzol (MDBio Inc. ، تايبيه ، تايوان). تم إجراء النسخ العكسي باستخدام 2 ملغ من الحمض النووي الريبي الكلي والتمهيدي oligo (dT). [19,20] تم تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) باستخدام TaqMan® المكون من خطوة واحدة PCR Master Mix (النظم الحيوية التطبيقية، كارلسباد، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت إضافة إجمالي cDNA (100 نانوغرام لكل تفاعل 25 مل) مع الاشعال الخاصة بالتسلسل ومجسات Taqman®. تم شراء جميع الاشعال والمجسات الجينية المستهدفة تجاريا ، بما في ذلك b-actin كمراقبة داخلية (النظم الحيوية التطبيقية). تم إجراء فحوصات qPCR في ثلاثة أضعاف على نظام الكشف عن تسلسل Ste- pOnePlus (الأنظمة الحيوية التطبيقية). كانت ظروف ركوب الدراجات عبارة عن تنشيط بوليميراز لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. تم تعيين العتبة فوق خلفية التحكم غير القالب وضمن المرحلة الخطية لتضخيم الجينات المستهدفة لحساب رقم الدورة التي تم فيها اكتشاف النص (يشار إليه بالتصوير المقطعي المحوسب).

تحليل اللطخة الغربية

تم إعداد محللات الخلايا كما هو موضح سابقا. [21,22] تم حل البروتينات بواسطة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيل Immobilon (Millipore، Billerica، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حظر البقع بنسبة 4٪ من ألبومين مصل البقر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم تم فحصها باستخدام الأجسام المضادة المضادة للأرنب ضد p-65 ، أو p-p65 (1: 1000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات ، تم احتضان البقع بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب مضاد للأرانب مترافق مع البيروكسيديز (1: 1000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصوير البقع من خلال التلألؤ الكيميائي المحسن باستخدام فيلم X-OMAT LS (Eastman Kodak ، روتشستر ، الولايات المتحدة الأمريكية).

هشاشة العظام الناجمة عن استئصال المبيض

تم استخدام إناث فئران ICR ، البالغة من العمر أربعة أسابيع ، 22 ~ 28 جم ، لهذه الدراسة. تم استئصال الفئران المبيض بشكل ثنائي تحت تخدير ثلاثي كلورو - الأسيتالديهيد (100 ملغم / كغ) وكانت الفئران الضابطة تعمل بشكل صوري (الشام) للمقارنة. تم قياس كثافة المعادن في العظام ومحتوى المعادن في العظام بعد تناوله عن طريق الفم لتركيزات مختلفة من مستخلصات الأقراص المضغوطة كل يومين لمدة أربعة أسابيع. تم تحديد إجمالي كثافة المعادن في عظام الجسم والمحتوى المعدني للعظام بواسطة مقياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة (DEXA; XR-26 ؛ Norland, Fort Atkinson, USA) باستخدام وضع للمواضيع الصغيرة كما هو موضح سابقا. [18,23] امتثلت جميع البروتوكولات للمبادئ التوجيهية المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان في جامعة الصين الطبية.

التحليل الإحصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام Prism 4.01soft- ware. (GraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية). القيم المعطاة هي متوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي بين عينتين باستخدام اختبار t للطالب. تم إجراء مقارنات إحصائية لأكثر من مجموعتين باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين مع اختبار بونفر روني اللاحق. في جميع الحالات، P< 0.05="" was="" considered="">

سيستانش ديزرتيكولا استخراج

النتائج

مستخلص Cistanche deserticola يزيد من تمعدن العظام بواسطة الخلايا العظمية

لم تؤثر إضافة مستخلص القرص المضغوط لمدة 24 أو 48 ساعة على انتشار خلايا الخلايا العظمية للفئران MC3T3-E1 في فحص MTT (البيانات غير معروضة). نظرا لأن تمايز الخلايا العظمية هو عملية معقدة تنطوي على تكاثر الخلايا وهجرتها ، فقد اختبرنا أيضا القدرة على الهجرة لخلايا MC3T3-E1 بعد العلاج بمستخلص CD. باستخدام مقايسات Transwell والتئام الجروح ، وجدنا أن مستخلص CD لم يؤثر على هجرة الخلايا العظمية (البيانات غير معروضة). تشكيل العقيدات المعدنية هي واحدة من علامات نضج الخلايا العظمية. أظهر تلطيخ Alizarin red S أن العقيدات المعدنية تشكلت عندما تم استزراع الخلايا العظمية لمدة أسبوعين في وسط يحتوي على فيتامين C (50 mg / ml) و b-glycerophosphate (10 mm) ، وقد زاد هذا بطريقة تعتمد على التركيز بإضافة CD (الشكل 1 أ). لذلك ، تسبب مستخلص CD في تكوين عقيدات العظام بواسطة الخلايا العظمية المستزرعة ، ولكن ليس انتشارها أو هجرتها. فحصنا أيضا دور مستخلص القرص المضغوط في تكوين العظم الناجم عن RANKL ولكننا لم نجد أي تأثير (لم تظهر البيانات).

يزيد مستخلص Cistanche deserticola من الفوسفاتيز القلوي والبروتين المورفوجيني العظمي -2 وتعبير أوستيوبونتين في الخلايا العظمية المزروعة

تظهر الخلايا العظمية المتمايزة نشاطا مرتفعا ل ALP ، والذي يرتبط بمستويات عالية من التعبير عن الإنزيم. [18] وجدنا أن العلاج بمستخلص CD لمدة 72 ساعة زاد بشكل كبير من نشاط ALP العظمي (الشكل 1b). بالنظر إلى الدور الحاسم ل BMP-2 و ALP و OPN في تمايز الخلايا العظمية ، اختبرنا ما إذا كان مستخلص CD يمارس تأثيره على تمايز الخلايا العظمية من خلال تنظيم تعبير BMP-2 و ALP و OPN. زادت معالجة الخلايا بمستخلص CD من تعبير mRNA عن ALP و BMP-2 و OPN بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 1 ج) ، مما يدل على أن مستخلص القرص المضغوط يحفز تمايز الخلايا العظمية عن طريق تنظيم ALP و BMP-2 وتعبير OPN.

مستخلص Cistanche deserticola يزيد من تكوين عقيدات العظام من خلال مسار كيناز البروتين المنشط بالميتوجين

وقد أفيد أن MAPK يلعب دورا مهما في تكوين العظام [24،25] لذلك قمنا بعد ذلك بفحص ما إذا كان مسار الإشارات هذا متورطا في تمعدن العظام الناجم عن استخراج CD. المعالجة المسبقة للخلايا باستخدام مثبط ERK U0126 أو مثبط p38 SB203580 أو مثبط JNK SP600125 يقلل من تمعدن العظام المعزز بمستخلص CD (الأشكال 2a و 3a و 4a). علاوة على ذلك ، منعت المثبطات أيضا ALP المستحث بمستخلص الأقراص المضغوطة ، BMP-2 ، وتعبير OPN (الأشكال 2b-4c). أدى نقل الخلايا باستخدام متحور ERK2 أو p38 أو JNK إلى تقليل زيادة مستخلص القرص المضغوط في تعبير ALP و BMP-2 و OPN mRNA (الأشكال 2c و 3c و 4c). بعد ذلك ، فحصنا مباشرة تنشيط ERK و p38 و JNK بعد معالجة مستخلص القرص المضغوط. حضانة الخلايا مع مستخلص CD المستحث ERK ، p38 ، وفسفرة JNK (الأشكال 2d و 3d و 4d). لذلك ، يتوسط ERK و p38 و JNK في زيادة تكوين العظام الناجم عن علاج CD للخلايا العظمية.

مستخلص Cistanche deserticola يزيد من تكوين عقيدات العظام من خلال مسار العامل النووي kB

كما ذكرنا سابقا ، فإن تنشيط NF-kB ضروري لتشكيل العظام. [26,27] قمنا بعد ذلك بمعالجة الخلايا العظمية باستخدام مثبطات NF-kB pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) و N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) تم شراؤها من Calbiochem (دارمشتات ، ألمانيا) لتحديد ما إذا كان تنشيط NF-kB متورطا في تمعدن العظام الناجم عن مستخلص الأقراص المضغوطة. ويبين الشكل 5 (أ) أن المعالجة المسبقة للخلايا العظمية باستخدام PDTC أو TPCK قد حالت دون تكوين عقيدات العظام التي يسببها مستخلص القرص المضغوط وقللت أيضا من الزيادة في تعبير ALP و BMP-2 و OPN (الشكل 5 ب و 5 ج). الفسفرة من الوحدة الفرعية NF-kB p65 هو مؤشر على تنشيط NF-kB. [28] تمشيا مع هذا ، وجدنا أن مستخلص CD زاد من الفسفرة p65 في الخلايا العظمية (الشكل 5d). أشارت هذه النتائج إلى أن تنشيط NF-kB مهم لتعبير ALP و BMP-2 و OPN الناجم عن مستخلص CD وتكوين عقيدات العظام.

تثبيط فقدان العظام بواسطة مستخلص Cistanche deserticola في الفئران المبيضة

لدراسة تأثير مستخلص CD على فقدان العظام ، تم تحفيز هشاشة العظام في الفئران الإناث عن طريق استئصال المبيض. وكما هو متوقع، أظهرت الفئران المبيضة انخفاضا في إجمالي كثافة المعادن في عظام الجسم والمحتوى المعدني للعظام (الشكل 6 أ و 6 ب). العلاج بمستخلص CD لمدة أربعة أسابيع يمنع فقدان كثافة المعادن في العظام والمحتوى المعدني للعظام بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 6 أ و 6 ب). يمكن أن تعكس تركيزات ALP في الدم نشاط الأرومة العظمية. [29] كما هو موضح في الشكل 6 ج ، فإن مستخلص القرص المضغوط يمنع الانخفاض في نشاط ALP في المصل الناجم عن استئصال المبيض. بالإضافة إلى ذلك ، زاد مستخلص CD أيضا من مستوى osteocalcin ، وهو علامة على تكوين العظام ، وخفض مستوى telopeptides الطرفية C من الكولاجين من النوع الأول ، وهو علامة على ارتشاف العظام (الشكل 6d و 6e). وبالتالي فإن هذه النتائج تدعم فعالية وفعالية مستخلص CD في منع فقدان العظام في الجسم الحي.

مناقشة

سيستانش ديزرتيكولاMa ، عشب أصلي في الصين ، يستخدم على نطاق واسع في الطب التقليدي لمختلف العلاجات العلاجية بسبب نشاطه المهدئ والمسكن والمناعي. [11–15] هنا ، أظهرنا أن مستخلص CD تسبب في تمعدن العظام في الخلايا العظمية المستزرعة ، لكنه لم يؤثر على هجرة خلاياها أو انتشارها. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن ALP و BMP-2 و OPN هي بروتينات مستهدفة من الإشارات التي يسببها مستخلص CD ، والتي تتطلب تنشيط ERK و p38 و JNK و NF-kB.

العظام هي نسيج معقد يتكون من عدة أنواع من الخلايا التي تخضع باستمرار لعملية تجديد وإصلاح. [30] عندما يكون ارتشاف العظام وتكوينها غير متوازنين، فإن انهيار العظام يتجاوز تكوين العظام ونتائج هشاشة العظام. [30] استخدمنا الفئران المبيضة لفحص التأثير المضاد لهشاشة العظام لمستخلص CD. خفضت الفئران المبيضة من إجمالي كثافة المعادن في عظام الجسم والمحتوى المعدني للعظام ، والذي تم تخفيفه عن طريق العلاج بمستخلص CD. كما زاد مستخلص CD من مستويات المصل من علامة osteogenic ALP و osteocalcin. لذلك ، فإن CD هو عامل تكوين العظام الذي يمنع فقدان العظام الناجم عن استئصال المبيض في الجسم الحي.

على الرغم من أن آليات هشاشة العظام ليست واضحة تماما ، إلا أنها من المحتمل أن تكون مرتبطة بانخفاض توافر عوامل نمو العظام أو آثارها ، مثل ALP و BMP-2 و OPN. تلعب هذه العوامل الثلاثة أدوارا مهمة في عملية تكوين العظام وإعادة تشكيلها،[31] وقد تم توثيقها جيدا أن تحفيز تمايز الخلايا العظمية يتميز بشكل رئيسي بزيادة التعبير عن ALP و BMP-2 و OPN. [32] في هذه الدراسة ، وجدنا أن مستخلص CD زاد من تعبير ALP و BMP-2 و OPN وعزز تمعدن العظام. لذلك ، يتوسط مستخلص CD تكوين العظام جزئيا عن طريق تنظيم التعبير عن ALP و BMP-2 و OPN.

وقد أفيد أن p38 يشارك في تنظيم تعبير ALP أثناء تمايز الخلايا العظمية الأروماتية. [33] وبالمثل ، فإن ERK1/2 مهم لانتشار وتمايز الخلايا العظمية. [34,35] يشارك JNK في تكوين الخلايا العظمية. [36] أظهرنا هنا أن مستخلص CD المستحث بفسفرة ERK و p38 و JNK ، ومثبطات هذه الإنزيمات تعادي التقوية بوساطة مستخلص CD لتمعدن العظام ، مما يشير إلى أن تنشيط ERK و p38 و JNK يلعب دورا إلزاميا في تكوين العظام الناجم عن مستخلص CD بواسطة الخلايا العظمية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مثبطات الإنزيم والطفرات السلبية المهيمنة ل ERK و p38 و JNK خفضت من تعبير ALP و BMP-2 و OPN المحسن بمستخلص الأقراص المضغوطة. تشير هذه البيانات إلى أن تنشيط مسارات ERK و p38 و JNK مطلوب لزيادة تعبير ALP و BMP-2 و OPN والنضج الناجم عن مستخلص القرص المضغوط في الخلايا العظمية. تم الإبلاغ عن أن ERK يزيد من انتشار الخلايا العظمية العظمية والتمايز. [34,35] ومع ذلك، لم نكتشف تأثير مستخلص القرص المضغوط على انتشار الخلايا العظمية. لذلك ، قد تكون المسارات الأخرى قد واجهت تأثير ERK بعد تحفيز مستخلص CD ، أو تكون ضرورية للانتشار. في هذا الصدد ، وجدنا أن مثبطات PI3K و Akt تقلل أيضا من تمعدن العظام الناجم عن مستخلص CD وتعبير ALP أو BMP-2 أو OPN mRNA (البيانات غير معروضة). لذلك ، قد تكون هذه المسارات مطلوبة لتشكيل العظام التي يسببها مستخلص CD.

وقد ثبت أن NF-kB يتحكم في وظيفة الأرومة العظمية في العظام. [37] تظهر نتائج هذه الدراسة أن تنشيط NF-kB يساهم في تمعدن العظام الناجم عن مستخلص CD وتعبير ALP و BMP-2 و OPN في الخلايا العظمية المستزرعة وأن مثبطات مسار الإشارات المعتمد على NF-kB (PDTC و TPCK) تمنع تمعدن العظام الناجم عن مستخلص CD وتعبير ALP و BMP-2 و OPN. يتم فسفور p65 في Ser536 بواسطة مجموعة متنوعة من الكينازات في العديد من مسارات الإشارات ، مما يعزز إمكانات إعادة التنشيط p65. [38] أظهرت نتائج هذه الدراسة أن مستخلص CD زاد من فسفرة p65. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن تنشيط NF-kB مطلوب لتشكيل العظام التي يسببها مستخلص CD في الخلايا العظمية المستزرعة. وجدنا أيضا أن مثبطات ERK و p38 و JNK عكست نشاط لوسيفيراز NF-kB الناجم عن مستخلص الأقراص المضغوطة (البيانات غير معروضة) ، بما يتفق مع كون هذه الإنزيمات وسطاء في المنبع لتنشيط NF-kB الناجم عن مستخلص الأقراص المضغوطة. لذلك ، يحفز مستخلص القرص المضغوط تكوين العظام من خلال مسارات ERK / p38 / JNK / و NF-kB.

الاستنتاجات

أظهرت هذه الدراسة أن مستخلص CD يحفز تمايز الخلايا العظمية ونضجها ولكن ليس الانتشار أو الهجرة. كما زاد مستخلص الأقراص المضغوطة من تعبير ALP و BMP-2 و OPN وتمعدن العظام. أظهرنا أن مسارات ERK و p38 و JNK و NF-kB تشارك في تكوين العظام بوساطة مستخلص القرص المضغوط وتعبير ALP و BMP-2 و OPN. علاوة على ذلك ، منع مستخلص CD فقدان العظام في الجسم الحي الناجم عن استئصال المبيض. لذلك ، قد يكون CD مفيدا في تحفيز تكوين العظام في علاج أمراض هشاشة العظام.