Cistanche Deserticola Polysaccharide يخفف تكوّن الخلايا العظمية وامتصاص العظام عن طريق تثبيط إشارات RANKL وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

Dezhi Song et al

هشاشة العظام هي مرض استقلابي يتميز بهشاشة العظام وتدهور البنية المجهرية للعظام. ناقضات العظم هي الخلايا المستجيبة الأولية التي تؤدي إلى تدهور مصفوفة العظام وتؤدي وظيفتها غير الطبيعية إلى تطور هشاشة العظام. يعزز تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أثناء عملية التمثيل الغذائي الخلوي تكاثر ناقضات العظم وتمايزها ، وبالتالي تلعب دورًا مهمًا في هشاشة العظام.سيستانشالصحراءعديد السكاريد(CDP) يمتلك نشاط مضاد للأورام ومضاد للالتهابات ومضاد للأكسدة. ومع ذلك ، فإن تأثير CDP على ناقضات العظم غير واضح. في هذه الدراسة ، تم استخدام تلطيخ الفوسفاتاز الحمضي المقاوم للطرطرات ، والتألق المناعي ، والنسخ العكسي ، تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحليل اللطخة الغربية لإثبات أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)تثبيط تكوين الخلايا العظمية وامتصاص هيدروكسيباتيت. بالإضافة إلى ذلك ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)منع أيضًا التعبير عن جينات علامة ناقضات العظم بما في ذلك Ctsk و Mmp9 و Acp5 ، ولم يكن له أي تأثير على منشط مستقبلات العامل النووي κB (RANK). كشفت التحليلات الآلية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يزيد من التعبير عن إنزيمات مضادات الأكسدة لتخفيف إنتاج ROS بوساطة RANKL في ناقضات العظم ويثبط العامل النووي للخلايا التائية المنشطة وتنشيط بروتين كيناز الميثوجين. تشير هذه النتائج إلى أن CDP قد يمثل دواءً مرشحًا لعلاج هشاشة العظام الناجم عن النشاط المفرط للخلايا العظمية.

الكلمات الدالةارتشاف العظامسيستانشالصحراءعديد السكاريد ، MAPK ، osteoclast ، أنواع الأكسجين التفاعلية

cistanche كمال الاجسام

1|المقدمة

يلعب التوازن بين تكوين العظام ، بوساطة بانيات العظم ، وارتشاف العظم ، بوساطة ناقضات العظم ، دورًا حيويًا في الحفاظ على التوازن الأيضي للعظام (Manolagas، 2000؛ Zhu et al.، 2018). عندما يتجاوز ارتشاف العظام تكوين العظام ، يحدث هشاشة العظام ، والتي تتميز بانخفاض كتلة العظام وتلف العظام المجهرية (Ikeda ، 2008). هشاشة العظام مرض شائع بين كبار السن والنساء بعد سن اليأس ولم يتم توضيح أسبابه بشكل كامل (Cooper & Melton ، 1992). يعد نقص هرمون الاستروجين سببًا رئيسيًا لهشاشة العظام (مانولاغاس ، أوبراين ، والميدا ، 2013). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحفيز أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عن طريق منشط مستقبلات العامل النووي κB يجند (RANKL) وترتبط بتشكيل ناقضات العظم (Yip et al. ، 2005) ، وبالتالي قد تساهم في تطور هشاشة العظام (Manolagas ، 2010). وجدت بعض الدراسات أن نقص مضادات الأكسدة Nrf2 يزيد من مستويات ROS ويعزز تمايز ناقضات العظم المستحثة بـ RANKL (Hyeon، Lee، Yang، and Jeong، 2013). لذلك ، يجب تقييم تقليل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أثناء تمايز ناقضات العظم كإستراتيجية علاجية لعلاج هشاشة العظام.

تشتق ناقضات العظم من سلالة المكونة للدم وحيدة الخلية أو البلاعم وهي الخلايا الوحيدة متعددة النوى التي تقوم بامتصاص العظم (Teitelbaum ، 2000). لذلك ، فإن البحث الذي يتضمن تكوين ناقضات العظم له أهمية كبيرة في تطوير علاجات فعالة لأمراض التمثيل الغذائي للعظام (Lorenzo ، 2017). يعد عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M ‐ CSF) و RANKL ، الذي تنتجه بانيات العظم والخلايا التائية المنشطة ، من السيتوكينات المهمة التي تنظم تكوين الخلايا العظمية (Kim & Kim، 2016؛ Teitelbaum & Ross، 2003). يحفز RANKL التعبير عن العامل النووي للخلايا التائية المنشطة (NFATc1) ، وهو عامل نسخ حاسم نشط أثناء تكوين ناقضات العظم (Ishida et al. ، 2002). يعزز NFATc1 المنشط التعبير عن جينات علامة ناقضات العظم مثل الفوسفاتاز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAcP) والكاثيبسين K (CTSK) الذي ينظم تكوين الخلايا العظمية ووظيفة ناقض العظم (Balkan et al. ، 2009 ؛ Crotti et al. ، 2008).

سيستانشالصحراءعديد السكاريد(CDP) معزول عن السيقان اللحمية لـسيستانشويمتلك تنظيمًا للمناعة ، ومضادًا للورم ، ومضادًا للشيخوخة ، وتأثيرات دوائية أخرى (Guo et al. ، 2016 ؛ Jia ، Guan ، Guo ، & Du ، 2012). CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)كان له تأثير مثبط على إنتاج أكسيد النيتريك الناجم عن عديد السكاريد الدهني في خلايا الفئران الدبقية الصغيرة (خلايا BV ‐ 2 ؛ نان وآخرون ، 2013). بالإضافة إلى ذلك ، مستخلص غني بالفينيلثانويد (ECD) منسيستانشعزز قدرة الفئران على السباحة عن طريق تقليل تلف العضلات ، وتأخير تراكم حمض اللاكتيك ، وتحسين تخزين الطاقة (Cai et al. ، 2010). ومع ذلك ، فإن تأثيرات CDP على وظيفة ونشاط ناقضة العظم تظل غير معروفة.

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يثبط تمايز ناقضات العظم المستحثة بـ RANKL وامتصاص العظم. كانت الآلية الأساسية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يعزز التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة لتخفيف إنتاج ROS ، ثم يثبط شلالات إشارات RANKL ‐ المنشط NFAT والبروتين كيناز المنشط (MAPK). تشير هذه النتائج إلى أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمكن استخدامها لعلاج هشاشة العظام الناجم عن فرط ارتشاف العظم الناجم عن ترقق العظام.

الجينسنغ maca cistanche

2|المواد والأساليب

2.1|المواد

CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)(نقاء> 98 في المائة) تم شراؤه من Solarbio (بكين ، الصين) وتم تحضيره بتركيز مخزون قدره 1 ملي مولار في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS). الأجسام المضادة خاصة بـ c ‐ Fos و CTSK و GSR و TRX1 و NOS2 و TRAF6 و RANK و NFATc1 و ERK و JNK و p38 و phosphorylated (p) ‐ERK و p ‐ p38 و p JNK و actin تم الحصول عليها من سانتا Cruz Biotechnology (سان خوسيه ، كاليفورنيا). تم إنتاج الأجسام المضادة لـ V-ATPase d2 كما هو موصوف سابقًا (H. Feng et al. ، 2009). تم الحصول على 3‐ (4،5 ‐ dimethylthiazol ‐ 2 ‐ yl) ‐5‐ (3 carboxymethoxyphenyl) ‐2‐ (4 ‐ sulfophenyl) ‐2H ‐ tetrazolium (MTS) ونظام فحص luciferase من Promega (سيدني ، أستراليا) . تم شراء Recombinant M ‐ CSF من R&D Systems (مينيابوليس ، مينيسوتا). تم التعبير عن بروتين GST ‐ rRANKL المؤتلف وتنقيته كما هو موصوف سابقًا (Xu et al. ، 2000).

2.2|زراعة الخلايا

تم الحصول على خلايا RAW264.7 (خلايا بلاعم الفأر) من American Type Culture Collection (ATCC ، Manassas ، VA) وتم تربيتها في وسط أساسي بسيط معدّل (Thermo Fisher Scientific ، Scoresby ، أستراليا) مكمل بـ 10 بالمائة من مصل بقري جنيني ، 2 ملي مولار من L ‐ الجلوتامين ، 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (وسط كامل). تم عزل الخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظم (BMMs) من الفئران C57BL / 6J القديمة لمدة 6 أسابيع ، والتي تم التخلص منها وفقًا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة غرب أستراليا (RA / 3/100/1244). تم تشريح العظام الطويلة الخالية من الأنسجة الرخوة وتم تنظيف النخاع العظمي من عظم الفخذ والساق ، ثم تم تربيته في وسط كامل في وجود M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل).

2.3|مقايسة تكون الخلايا العظمية

تم طلاء BMMs في لوحات استنبات 96 ‐ بكثافة 6 × 103 خلية لكل بئر ومعالجتها بوسط كامل يحتوي على M CSF (50 نانوغرام / مل) و GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) ، في وجود أو عدم وجود تركيزات متفاوتة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>ثلاثة نوى) على أنها ناقضات العظم.

2.4|فحوصات السمية الخلوية

تم زرع BMMs في 96 لوحات بئر عند 6 × 103 خلية لكل بئر وتركت طوال الليل للالتصاق. في اليوم التالي ، تم تحضين الخلايا بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). بعد 48 ساعة أخرى ، تمت إضافة محلول MTS (20 ميكرولتر / بئر) واحتضانه بالخلايا لمدة ساعتين. تم تحديد الامتصاصية عند 490 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (طيف متعدد ؛ أنظمة مختبرات حرارية ، شانتيلي ، فيرجينيا.

2.5|تلطيخ مناعي

تم زرع BMMs بكثافة 6 × 103 خلية لكل بئر في وجود M - CSF (50 نانوغرام / مل) طوال الليل. ثم تم تحفيز الخلايا باستخدام M ‐ CSF و GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) حتى تشكلت الخلايا الآكلة للعظم الناضجة. ثم عولجت ناقضات العظم بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لمدة 48 ساعة قبل التثبيت بـ 4٪ بارافورمالدهيد ، نفاذية بـ 0. 1٪ Triton X ‐ 100 – PBS ، وحجب بنسبة 3٪ من ألبومين مصل البقر في PBS. تم تحضين الخلايا المحضرة باستخدام phalloidin مترافق من رودامين لمدة 45 دقيقة في الظلام لتلطيخ F actin. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام PBS ، وواجهت النوى 4 ′ ، 6 Diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI) ، وتم تركيبها باستخدام ساترة من أجل الفحص المجهري متحد البؤر.

تجربة cistanche

2.6|مقايسة امتصاص هيدروكسيباتيت

لقياس نشاط ناقضات العظم تم تحفيز BMMs (1 × 105 خلية لكل بئر) المزروعة على ستة ألواح مغلفة بالكولاجين جيدًا (BD Biocoat ؛ Thermo Fisher Scientific) باستخدام GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) و M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل) حتى يتم إنشاء ناقضات العظم الناضجة (Zhou et al. ، 2016). تم بعد ذلك فصل الخلايا برفق عن اللوح باستخدام محلول تفكك الخلية (Sigma - Aldrich) وتم زرع أعداد متساوية من ناقضات العظم الناضجة على آبار فردية في ألواح هيدروكسيباتيت مغلفة بـ 96 بوصة (Corning Osteoassay ، Corning ، NY). تم تحضين ناقضات العظم الناضجة في وسط يحتوي على GST rRANKL و M ‐ CSF مع أو بدون CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)بتركيزات محددة. بعد 48 ساعة ، كانت نصف الآبار ملطخة مناعيًا لنشاط TRAcP ، كما هو موضح أعلاه ، لتقييم عدد الخلايا متعددة النوى لكل بئر. تم تبييض الآبار المتبقية لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا والسماح بقياس المناطق التي تم امتصاصها. تم تصوير المناطق التي تم امتصاصها تحت المجهر الضوئي القياسي وتم استخدام برنامج Image J (المعاهد الوطنية للصحة ، Bethesda ، MD) لتحديد النسبة المئوية لمساحة سطح هيدروكسيباتيت التي تمتصها ناقضات العظم.

2.7|فحوصات مراسل Luciferase

للتحقيق في تنشيط النسخ NFATc1 ، تم نقل خلايا RAW264.7 بشكل ثابت باستخدام بنية مراسل لوسيفيراز المستجيب NFATc1 (Cheng et al. ، 2018 ؛ van der Kraan et al. ، 2013). تمت زراعة الخلايا المنقولة في 48 طبقًا جيدًا بكثافة 1.5 × 105 خلية لكل بئر ومعالجتها مسبقًا بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لمدة 1 ساعة. بعد المعالجة المسبقة ، تم تحفيز الخلايا باستخدام GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) لمدة 24 ساعة ، وتم قياس نشاط luciferase باستخدام نظام فحص مراسل luciferase وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Promega).

2.8|النسخ العكسي الكمي ‐ تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل (RT ‐ PCR)

تم عزل Total RNA من الخلايا باستخدام كاشف Trizol وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Thermo Fisher Scientific). تم تصنيع الحمض النووي التكميلي باستخدام النسخ العكسي لفيروس سرطان الدم Moloney Murine مع 1 ميكروغرام من قالب RNA و oligo ‐ dT. تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسلسلات محددة باستخدام البرنامج التالي: 94 درجة لمدة 5 دقائق ، تليها 30 دورة من 94 درجة لمدة 40 ثانية ، و 60 درجة لمدة 40 ثانية ، و 72 درجة لمدة 40 ثانية ، وخطوة التمديد النهائية لـ 5 دقائق عند 72 درجة. يتم عرض المعلومات التفصيلية الخاصة بالبادئات المحددة في الجدول 1. تم حساب مستويات الحمض النووي الريبي (RNA) النسبية عن طريق التطبيع للتعبير عن جين التدبير المنزلي Hmbs.

2.9|تحليل لطخة غربية

تمت تربية BMMs في وسط كامل باستخدام M ‐ CSF في ستة أطباق جيدة وتحفيزها باستخدام GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) للأوقات المحددة. تم تحلل الخلايا في محلول تحلل مناعي إشعاعي وتم حل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد ونقلها إلى أغشية بولي (فلوريد فينيلدين) (GE Healthcare ، Silverwater ، أستراليا). تم حظر الأغشية في حليب خالي الدسم بنسبة 5 في المائة لمدة ساعة واحدة ثم فحصها بأجسام مضادة أولية محددة مع اهتزاز لطيف طوال الليل عند 4 درجات. تم غسل الأغشية واحتضانها لاحقًا بأجسام مضادة ثانوية مترافقة مع بيروكسيداز الفجل. تم اكتشاف تفاعل الجسم المضاد بعد ذلك باستخدام كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن (Amersham Pharmacia Biotech ، Piscataway ، NJ) وتم تصويره باستخدام Image quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|كشف ROS داخل الخلايا

تم الكشف عن مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام 2 ، 7′ ‐ dichlorofluorescein diacetate الخلوي ROS طقم فحص (Abcam ، ملبورن ، أستراليا). تم تربيتها BMMs (5 × 103 خلية لكل بئر) في أطباق بئر 96 وعولجت بـ RANKL (100 نانوغرام / مل) ، M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل) ، و CDP لمدة 72 ساعة. تم قياس مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام ثنائي كلورو فلورسين ثنائي الأسيتات ، والذي يتأكسد إلى DCF الفلوري في وجود ROS. تم غسل الخلايا في المخزن المؤقت لـ Hank واحتضانها في الظلام لمدة 30 دقيقة بـ 10 ميكرومتر من DCFH - DA. تم الحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري (كنفوكل).

2.11|تحاليل احصائية

جميع البيانات تمثل ثلاث تجارب على الأقل أجريت في ثلاث نسخ ما لم يُذكر خلاف ذلك. يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني ± SD. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعًا باختبارات الطالب - نيومان - Keuls اللاحقة لتحديد أهمية الفروق بين النتائج ، مع اعتبار p <0. 05="">

3|النتائج

3.1|CDP يثبط تكوّن العظم الناجم عن RANKL واندماج ناقضة العظم

لتحديد ما إذا كان CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمكن أن يقمع تشكيل ناقضات العظم المستحثة بـ RANKL ، أجرينا أولاً اختبار تكوين الخلايا العظمية باستخدام BMMs للماوس (Liu et al. ، 2013 ؛ Song et al. ، 2016). تم علاج BMMs باستخدام RANKL و M ‐ CSF لمدة 5 أيام مع زيادة تركيزات CDP. خفض CDP عدد الخلايا متعددة النوى الموجبة لـ TRAcP‐ عند تركيز CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)وصلت إلى 5 ميكرومتر أو أعلى (الشكل 1 أ ، ب). لتقييم CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)السمية وتأكيد أن هذه النتائج لم تكن انعكاسًا لموت الخلية أو عددها ، أجرينا اختبار MTS. تم علاج BMMs باستخدام RANKL و M ‐ CSF لمدة 48 ساعة بجرعات متفاوتة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). لم يكن لـ CDP أي تأثير على انتشار BMM بتركيز 15 ميكرومتر أو أقل (الشكل 1 ج).

لاختبار تأثيرات CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)عند اندماج ناقضات العظم ، تم تحفيز ناقضات العظم باستخدام علاج RANKL و M ‐ CSF ، مع أو بدون جرعات متفاوتة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). كانت ناقضات العظم ملطخة بالرودامين ‐ phalloidin و DAPI لتقييم عدد النوى لكل ناقضة عظمية (الشكل 2 أ). انخفض كل من عدد ناقضات العظم ومتوسط ​​عدد النوى لكل ناقضة عظمية بعد CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)العلاج (5-10 ميكرومتر ، الشكل 2 ب ، ج). لذلك ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)كان له تأثيرات مثبطة على تكوّن العظم الناجم عن RANKL و اندماج ناقضات العظم بطريقة تعتمد على الجرعة.

3.2|CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يخفف من نشاط امتصاص هيدروكسيباتيت العظم الناجم عن RANKL

تم إجراء اختبار امتصاص هيدروكسيباتيت للكشف عن تأثير CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)على وظيفة ناقضة العظم (الشكل 3 أ). بعد فترة حضانة لمدة 24 ساعة ، لم يتغير عدد ناقضات العظم لكل بئر بينما انخفضت منطقة امتصاص هيدروكسيباتيت بشكل كبير عن طريق العلاج بـ 5 و 10 ميكرومتر CDP مقارنة بمجموعات التحكم (الشكل 3 ب ، ج). توضح هذه النتائج أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)له تأثيرات مثبطة قوية على كل من تكوين ناقضات العظم ونشاط ارتشاف ناقضة العظم دون أي تأثيرات سامة للخلايا.

3.3|CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمنع التعبير الجيني لعلامة ناقضة العظم

لمزيد من التحقيق في التأثيرات المثبطة لـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)تم علاج BMMs باستخدام RANKL و M ‐ CSF لمدة 5 أيام بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). تم بعد ذلك إجراء RT-PCR للكشف عن التعبير عن جينات علامة ناقضة العظم. تم تثبيط التعبير عن Nfatc1 ، وهو عامل نسخ حاسم أثناء تكوين الخلايا العظمية ، بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)(5 و 10 ميكرومتر) قللت من تنظيم التعبير عن الجينات المرتبطة بارتشاف العظم ، بما في ذلك Mmp9 و Ctsk و Acp5 (الشكل 4 ب-د).

3.4|يمنع CDP نشاط NFATc1 وتعبير البروتين المصب

لفحص تأثير CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)على نشاط NFATc1 الناجم عن RANKL ، تم إجراء اختبار مراسل لوسيفيراز. العلاج بـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)، بتركيزات 5 ميكرومتر وأعلى ، تم تثبيط نشاط NFATc1 الناجم عن RANKL بشكل كبير (الشكل 5 أ). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل اللطخة الغربية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)تعبير البروتين المكبوت بشكل كبير عن NFATc1 و c ‐ Fos في BMMs تعامل مع RANKL و M ‐ CSF لمدة 3 و 5 أيام (الشكل 5 ب). علاوة على ذلك ، تم تقليل التعبير عن البروتينات المرتبطة بوظيفة ناقضات العظم ، مثل V - ATPase ‐ d2 و CTSK ، في وجود CDP.(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)مقارنة بمجموعات التحكم. ومع ذلك ، لم يكن لـ CDP أي تأثير على تعبير RANK (الشكل 5 ب).

3.5|يعزز CDP التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة لكبح إنتاج ROS أثناء تكوين الخلايا العظمية المستحثة بـ RANKL

لاستكشاف الآلية الأساسية لتثبيط تكوّن العظم العظمي المعتمد على CDP ، تم علاج BMMs باستخدام RANKL (100 نانوغرام / مل) و M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل) مع PBS أو CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لمدة 72 ساعة. درسنا تأثير CDP على إنتاج ROS داخل الخلايا الذي يحفزه RANKL. تمت زيادة مستويات ROS داخل الخلايا بواسطة علاج RANKL ، والذي تم تخفيفه بواسطة CDP (5 و 10 ميكرومتر ؛ الشكل 6 أ). تم تقليل كل من عدد الخلايا الإيجابية لـ ROS وشدة تلطيخ ROS بواسطة علاج CDP بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 6 ب ، ج). أظهر تحليل اللطخة الغربية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)روجت ثيوردوكسين (TRX1) وتعبير اختزال الجلوتاثيون (GSR) أثناء قمع التعبير عن سينثاز أكسيد النيتريك المحرض (NOS2) في BMMs التي عولجت بـ RANKL و M ‐ CSF لمدة 3 أيام (الشكل 6 د).

لمزيد من استكشاف ما إذا كان CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)قمع تمايز ناقضات العظم عن طريق تقليل إنتاج ROS ، ثم عالجنا BMMs بالبيروكسيد (10 ميكرومتر) لتقليد حالة ROS المرتفعة في الخلايا. تم تحفيز BMMs بواسطة RANKL و M ‐ CSF لمدة 3 أيام وأظهرت نتائج تحليل اللطخة الغربية و RT-PCR أن البيروكسيد عزز تعبير NFATc1 و c ‐ Fos مقارنة بمجموعات التحكم. تمشيا مع النتائج الواردة في الشكل 5 ، تم قمع التعبير عن NFATc1 و c ‐ Fos بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)بينما أنقذ البيروكسيد التأثير المثبط لـ CDP (الشكل 6 هـ ، و). أشارت هذه البيانات إلى أن CDP قمع تعبير NFATc1 و c ‐ Fos عن طريق مسح إنتاج ROS.

3.6|CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يقمع مسارات MAPK أثناء تكون الخلايا العظمية المستحثة بـ RANKL

بعد ذلك ، حققنا في تأثير CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)العلاج على تعبير TRAF6 بوساطة RANKL ‐ وتفعيل مسار MAPK. بعد الحضانة في وسط خالٍ من المصل لمدة ساعتين ، تم تحفيز BMMs باستخدام RANKL ، مع أو بدون CDP ، لمدة 60 دقيقة. لم يكن للتحفيز باستخدام CDP (10 ميكرومتر) أي تأثير على تعبير TRAF6 والفسفرة المخففة لـ JNK2 و ERK1 / 2 في 10 و 20 دقيقة (الشكل 7). بالإضافة إلى ذلك ، تم تثبيط الفسفرة p38 بشكل كبير بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)العلاج لمدة 60 دقيقة مقارنة بمجموعات التحكم (الشكل 7). تكشف هذه البيانات أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمنع مسارات إشارات MAPK التي يسببها RANKL ، بما يتوافق مع تأثيره المثبط على تكوين ونشاط ناقضات العظم.

4|نقاش

جذب Cistanche ، المعروف باسم "الجينسنغ الصحراوي" ، الكثير من الاهتمام مؤخرًا لقدرته على تعديل المناعة والعمل بشكل وقائي أثناء الشيخوخة والإجهاد التأكسدي (Jia et al. ، 2012 ؛ Snytnikova et al. ، 2012). ثبت أن Phenylpropanoid جليكوسيدات بديلة ، المكونات النشطة الرئيسية لـ Cistanche ، تمنع نشاط NO في الضامة (Ahn ، Chae ، Chin ، & Kim ، 2017). بالإضافة إلى ذلك ، أسيستانشيقلل المستخلص من الإجهاد التأكسدي في عضلة القلب المعاد تسريبه بعد نقص التروية ولعب دورًا مهمًا في تثبيط مسارات موت الخلايا المبرمج التي تؤدي إلى حماية القلب (Yu ، Li ، & Cao ، 2016). كعنصر مهم في Cistanche ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لديها مجموعة متنوعة من الوظائف الدوائية. وجدت دراستنا الحالية أن CDP قام بقمع تمايز وتنشيط ناقضات العظم المنشط من RANKL عن طريق تخفيف إنتاج ROS وكذلك تنشيط NFAT و MAPK.

باعتباره الفوسفاتيز الحمضي ، يوجد TRAcP في مجموعة متنوعة من الخلايا وهو وفير في الخلايا الآكلة للعظام والضامة السنخية (Snipes ، Lam ، Dodd ، Gray ، & Cohen ، 1986). TRAcP هو إنزيم مميز للخلايا الآكلة للعظم ويرتبط تعبيره ارتباطًا وثيقًا بوظيفة ناقضة العظم ، والتي تعتبر مؤشرًا على نشاط ناقضة العظم وارتشاف العظام (Minkin ، 1982). في دراستنا ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يثبط عدد الخلايا الإيجابية لـ TRAcP ، مما يشير إلى أن تكوين الخلايا العظمية المستحثة بـ RANKL تم حظره بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). يعتمد تدهور مصفوفة العظام بواسطة ناقضات العظم على cathepsin K (CTSK) و MMPs (Gruber ، 2015). هنا ، قلل CDP بشكل كبير من التعبير عن الجينات الوظيفية لخلايا العظم مثل Mmp9 و Ctsk و Acp5.

يتم تنظيم تمايز الخلايا العظمية ووظيفتها من خلال مسارات إشارات متعددة (Boyle ، Simonet ، & Lacey ، 2003). بعد الارتباط بـ RANK ، تقوم RANKL بتجنيد بروتين المحول TRAF6 لتنشيط التعبير عن NFATc1 ، وهو عامل نسخ مهم لتشكيل ناقضات العظم ، مما يؤثر على التعبير الجيني الخاص بناض العظم ، بما في ذلك TRAcP و CTSK (X. Feng ، 2005 ؛ Takayanagi et al. ، 2002). في هذه الدراسة ، وجدنا أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لم يكن له أي تأثير على تعبير RANK و TRAF6 في ناقضات العظم. ومع ذلك ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يثبط تنشيط NFATc1 المستحث بـ RANKL أثناء تكوّن الأرومة العظمية لـ BMMs. إلى جانب ذلك ، تم إثبات أن ROS ، التي تنتجها الميتوكوندريا في عملية توصيل الإلكترونات ، عززت تكاثر وتمايز ناقضات العظم وتدهور مصفوفة العظام المنظم (Ha et al. ، 2004). وجدت دراسة حديثة أن RANKL تسبب في استيراد Bach1 النووي وتخفيف إنتاج إنزيم مضادات الأكسدة Nrf2 بوساطة ، وبالتالي زيادة تعبير ROS داخل الخلايا وتكوين الخلايا العظمية في الفئران (Kanzaki et al. ، 2017). بالإضافة إلى ذلك ، زيادة توليد ROS داخل الخلايا عن طريق تكوين ونشاط ناقضات العظم المعززة للحوموسيستين (Koh et al. ، 2006). وجدت دراستنا أن CDP قلل من تراكم ROS في ناقضات العظم عن طريق تثبيط تعبير NOS2 وتعزيز التعبير عن إنزيمات مضادات الأكسدة ، مثل TRX1 و glutathione reductase. عندما تعاملنا مع BMMs مع البيروكسيد لتعزيز تراكم ROS داخل الخلايا ، أظهرت النتائج التي أدت إلى زيادة ROS أن تحسن تعبير NFATc1 أن ROS كان منبع NFATc1. وجدنا أيضًا أن البيروكسيد أنقذ التأثير المثبط لـ CDP على تعبير NFATc1. لذلك ، تشير بياناتنا إلى أن CDP يمنع تراكم ROS لمنع تعبير NFATc1 ، ثم لقمع تشكيل ووظيفة ناقضات العظم.

تنتمي ERK و JNK و p38 إلى عائلة MAPK ، والتي تشارك أيضًا في تنظيم تمايز ناقضات العظم (Seger & Krebs ، 1995). ينشط RANKL مسار MAPK عن طريق زيادة فسفرة ERK و JNK و p38 (Mizukami et al. ، 2002). أظهرنا أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)قمع الفسفرة بوساطة RANKL للبروتينات الرئيسية في مسار MAPK ، مما يساهم في التأثير المثبط لـ CDP على التعبير عن جينات علامة ناقضات العظم. على حد علمنا ، هذه هي الدراسة الأولى التي تظهر التأثيرات المثبطة لـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)على إنتاج ROS و NFAT و MAPK ، مما يمثل آليات جديدة لعمل CDP في المختبر.

باختصار ، أظهرنا أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يخفف تكوّن الخلايا العظمية وارتشاف هيدروكسيباتيت ، والتعبير عن جينات علامة ناقضات العظم بما في ذلك Ctsk و Mmp9 و Acp5. CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)كان قادرًا على قمع إنتاج ROS بوساطة RANKL ، وكذلك تنشيط NFAT و MAPK (الشكل 8). بشكل جماعي ، تشير نتائجنا إلى أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)قد يمثل دواءً مرشحًا لعلاج الحالات المرتبطة بخلايا العظم المصحوبة بإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية.

الشكل 8 رسم تخطيطي لـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)وظيفة في تمايز ناقضات العظم. CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمنع إنتاج ROS المستحث بـ RANKL ، وكذلك تنشيط NFATc1 و MAPK ، وبالتالي تثبيط تكوّن الخلايا العظمية. CDP ،سيستانشالصحراءعديد السكاريد؛ MAPK ، بروتين كيناز المنشط بالميتوجين ؛ NFATc1 ، العامل النووي للخلية التائية المنشطة ؛ RANKL ، منشط مستقبلات العامل النووي κB يجند ؛ ROS ، أنواع الأكسجين التفاعلية [يمكن رؤية الشكل الملون على wileyonlinelibrary.com]

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة علوم الطبيعة في الصين (81572164) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير التكنولوجي الرئيسي في الصين (2017YFC1103300) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جوانجشي (2016GXNSFAA380295) ، ومشروع أبحاث العلوم والتكنولوجيا بجامعة قوانغشي. مقاطعة (KY2015YB054). كما أنه مدعوم جزئيًا من مشروع جوانجشي للبحث العلمي وتطوير التكنولوجيا (GKG13349003 ، 1598013-15) ، وصندوق البنية التحتية للبحوث الطبية والصحية في أستراليا الغربية ، ومؤسسة التهاب المفاصل الأسترالي ، وجوائز التعاون البحثي بجامعة غرب أستراليا (UWA) ، وجوائز التعاون البحثي لجامعة أستراليا الغربية (UWA). مجلس البحوث الصحية والطبية الأسترالي (NHMRC ، رقم 1107828 و 1027932).

تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح

من: 'سيستانشالصحراءعديد السكاريديخفف تكوّن الخلايا العظمية وارتشاف العظام عن طريق تثبيط إشارات RANKL وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة Dezhi Song et al

--- © 2018 Wiley Periodicals، Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018 ؛ 233: 9674-9684