HRMS UPLC-Q-Orbitrap مع الإرساء الجزيئي للتحقيق في أساس المواد لعلاقة المريرة وعلاقة النكهة في ديستيرتيكا cistanchia ⅱ
Dec 18, 2024
2 طرق ونتائج
2.1 تحديد مواد Cistanche Deserticola
2.1.1 uplc-q-orbitrap ظروف الكشف عن شروط الكروماتوغرافيا:
عمود Phenomenex Kinetex C18 (2.1 مم × 1 0 0 mm ، 2.6 μm) ؛ المرحلة المتنقلة A (المرحلة المائية ، التي تحتوي على 0.1 ٪ من حمض الأسيتيك) ، B (Isopropanol-Acetonitrile 1: 1) ، شطف التدرج (0-1 min ، 1 ٪ b ؛ 1-8 min ، 1 ٪ -99} 8-9 min ، 99 ٪}} 99 ٪ -1 ٪ b ؛ معدل التدفق 0.2 مل · دقيقة -1 ؛ درجة حرارة العمود 30 درجة ؛ الحقن المجلد 2 ميكرولتر.
شروط قياس الطيف الكتلي: تم استخدام مقياس الطيف الكتلي 120 لجمع بيانات قياس الطيف الابتدائية والثانوية تحت التحكم في البرنامج (برنامج Thermo Scientific Xcalibur ، الإصدار: 4.4). كان جهد الرش 3.8 كيلو فولت (إيجابي) أو -3. كان وضع المسح الكامل المسح الضوئي/المعتمد على البيانات (MS/DD-MS2 الكامل) ، كان الدقة الأساسية 60 000 ، وكان الدقة الثانوية 15 000 ، وكان نطاق المسح الأيوني m/z100 ~ 1 500 ، وكان تدرج طاقة التصادم 20 ، 30 ، 40 eV.
مواد cistanche عالية الجودة مع أعلىEchinacoside ، فيباسكوسيد ، أنبوبوسيد A ، جليكوسيد غير متزايد
2.1.2 إعداد الحل المرجعي
وزن بدقة كميات مناسبة منEchinacoside ، فيباسكوسيد ، أنبوبوسيد A ، جليكوسيد غير متزايد، و Gentianoside ، و Geniposide المرجعية ، أضف 50 ٪ من الميثانول لإجراء حل مرجعي مختلط مع تركيز الكتلة 500 نانوغرام · مل -1 ، هز جيدا ، والحصول.
2.1.3 إعداد حل الاختبار
وزن 1. 0 g من مسحوق العينة (M1) تم جمعه في الربيع و 1. r · min -1 لمدة 10 دقائق ، وتصفية للحصول على مستخلص الكحول من cistanche deserticola.
2.1.4 تحديد المواد
من خلال مقارنة بيانات معلومات الطيف الابتدائية والثانوية لكل عينة من عينة DeSerticola Cistanche ، والدمج مع الأدبيات والمواد المرجعية ذات الصلة ، تم تحديد أن عينات مختلفة من Deserticola cistanche تحتوي على 69 مكونًا كيميائيًا مشتركًا ، انظر الجدول 2 ، وترسم تدفق أيون الكلي ل deserche cistanche في الشكل 2.
الجدول 2 مكونات مستخلصات Cistanche Deserticola تم تحديدها على أساس HRMS UPLC-Q-Orbitrap
| لا. | مُجَمَّع | الصيغة الجزيئية | القيمة المقاسة (م/ض) | خطأ (× 10⁻⁶) | وضع أيون | أيونات الشظية | يكتب |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.02 | isomenthone | C₁₀H₁₈O | 223.06 | -8.7 | [M + H]⁺ | 223.06, 207.02, 137.02 | monoterpenoids |
| 0.57 | أوراسيل | C₄H₄N₂O₂ | 157.04 | 1.8 | [M + H]⁺ | 157.03, 59.02, 49.01 | آخر |
| 0.67 | الجلوكوزامين | c₆h₁₃no₅ | 195.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 75.01, 195.05, 59.01 | الكربوهيدرات |
| 0.68 | جالاكتوسامين | c₆h₁₃no₅ | 181.07 | 1.1 | [M + H]⁺ | 181.07, 71.01, 89.02 | الكربوهيدرات |
| 0.81 | حمض الكابريليك | C₈H₁₆O₂ | 144.11 | 1.0 | [M + H]⁺ | 104.11, 103.08, 87.03 | آخر |
| 0.83 | L - حمض الأسبارتيك | c₄h₇no₄ | 132.03 | 0.7 | [M + H]⁺ | 132.03, 115.00, 71.01 | الأحماض الأمينية |
| 0.97 | إيثيل خلات | C₄H₈O₂ | 198.19 | 1.4 | [M + H]⁺ | 197.02, 54.02, 153.02 | آخر |
| 0.98 | حمض الماليك | C₄H₆O₅ | 155.00 | 0.0 | [M + H]⁺ | 111.00, 49.00, 68.99 | الأحماض العضوية |
| 0.99 | د - الجالاكتوز | C₆H₁₂O₆ | 180.16 | 1.1 | [M + H]⁺ | 179.06, 89.02, 59.01 | الكربوهيدرات |
| 1.00 | L - حمض الجلوتاميك | c₅h₉no₄ | 188.09 | -0.4 | [M + H]⁺ | 118.09, 119.09, 72.08 | الأحماض الأمينية |
| 1.01 | L - Isoleucine | c₆h₁₃no₂ | 132.10 | -0.9 | [M + H]⁺ | 132.10, 86.03, 115.07 | الأحماض الأمينية |
| 1.05 | جليكاين | c₂h₅no₂ | 182.08 | -0.9 | [M + H]⁺ | 182.08, 95.04, 29.03 | الأحماض الأمينية |
| 1.48 | يوريدين | C₉H₁₂N₂O₆ | 243.06 | 0.3 | [M + H]⁺ | 243.06, 103.01, 102.10 | النيوكليوسيدات |
| 1.93 | ميثيل د - يوديد | C₂H₅I | 131.03 | 0.0 | [M + H]⁺ | 131.03, 59.00, 41.01 | آخر |
| 2.29 | naringin | C₂₇H₃₂O₁₄ | 345.12 | 3.2 | [M + H]⁺ | 345.12, 327.11, 147.05 | الفلافونويد |
| 3.29 | حمض protocatechuic | C₇H₆O₄ | 153.02 | 1.1 | [M + H]⁺ | 153.02, 109.02, 41.00 | الأحماض الفينولية |
| 3.46 | Triacontanol | C₃₀H₆₂O | 445.10 | 2.7 | [M + H]⁺ | 445.10, 271.08, 101.00 | الكانول |
| 3.47 | Kaempferol - 3 - o - glucoside | C₂₁H₂₀O₁₁ | 373.11 | 2.3 | [M + H]⁺ | 123.01, 149.06, 167.07 | الفلافونويد |
| 3.48 | كيرسيتين | C₁₅H₁₀O₇ | 109.03 | 0.6 | [M + H]⁺ | 109.03, 79.05, 77.03 | الفلافونويد |
| 3.66 | حمض الكلوروجين | C₁₆H₁₈O₉ | 375.09 | -0.7 | [M + H]⁺ | 375.11, 359.07, 309.03 | الأحماض الفينولية |
| 3.70 | حمض السيناميك | C₉H₈O₂ | 347.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 347.13, 181.09, 113.07 | الأحماض الفينولية |
| 3.74 | 8 - epigallocatechin - 3 - gallate | C₂₂H₁₈O₁₁ | 315.37 | 13.6 | [M + H]⁺ | 315.37, 136.05, 103.04 | الفلافونويد |
| 3.76 | الليمونين | C₁₀H₁₆ | 163.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 163.04, 93.07, 62.03 | monoterpenoids |
| 3.77 | Hesperidin | C₂₈H₃₄O₁₅ | 299.11 | -1.9 | [M + H]⁺ | 299.11, 181.08, 101.04 | الفلافونويد |
| 3.91 | الفانيلين | C₈H₈O₃ | 307.81 | 3.8 | [M + H]⁺ | 307.83, 173.03, 149.02 | الأحماض الفينولية |
| 4.11 | isoquercitrin | C₂₁H₂₀O₁₂ | 419.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 419.13, 149.02, 101.00 | الفلافونويد |
| 4.21 | إيزوبروبيل ميثيلفينيديت | c₁₄h₂₁no₂ | 221.08 | -0.8 | [M + H]⁺ | 221.08, 205.09, 104.00 | آخر |
| 4.22 | حمض المحقنة | C₉H₁₀O₅ | 785.25 | 1.4 | [M + H]⁺ | 785.25, 663.21, 661.19 | الأحماض الفينولية |
| 4.30 | يوجينول | C₁₀H₁₂O₂ | 179.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 179.04, 153.03, 113.03 | الأحماض الفينولية |
| 4.40 | الكافيين | C₈H₁₀N₄O₂ | 769.26 | 1.4 | [M + H]⁺ | 769.26, 629.24, 622.14 | قلويدات |
| 4.43 | كرايسين | C₁₅H₁₀O₄ | 442.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 442.05, 173.03, 113.03 | الفلافونويد |
2.2 فحص الالتحام الجزيئي للمواد المريرة في Cistanche Deserticola
2.2.1 بناء قاعدة بيانات يجند
وفقًا للمكونات الكيميائية لـ Cistanche Deserticola المحددة في 2.1.4 ، تم تنزيل هياكل SDF الخاصة بهم من قاعدة بيانات PubChem لإنشاء مكتبة مركب جزيء صغير يجند. تم تحسين جميع الجزيئات الصغيرة ليجند من الناحية الهيكلية باستخدام برنامج الميكانيكا الجزيئية إلى الحد الأدنى.
2.2.2 اختيار مستقبلات مريرة
مستقبلات الذوق المرير (TAS2R) هي عضو في عائلة GPCRS ويتوسط عملية تصور المذاق المريرة لخلايا براعم الذوق على اللسان. هناك 25 أنواع فرعية للمستقبلات. من بينها ، يمكن تنشيط TAS2R1 و TAS2R7 و TAS2R8 و TAS2R14 من خلال مجموعة متنوعة من المواد المريرة وينتمي إلى مستقبلات الإدراك المريرة على نطاق واسع [14-15]. لذلك ، اختارت هذه الدراسة TAS2R1 و TAS2R7 و TAS2R8 و TAS2R14 بروتينات مستقبلات المذاق المريرة للرسو مع المكونات الكيميائية من DeSerticola cistanche ، وتم الحصول على بنية بلورية البروتين المريرة من قاعدة بيانات ألفافولد.
2.2.3 الالتحام الجزيئي
تم استخدام المكون الكيميائي من Cistanche Deserticola التي تم تحديدها بواسطة HRMS UPLC-Q-Orbitrap كدولة ، واستخدمت الأنواع الفرعية لمستقبلات الذوق المريرة TAS2R1 و TAS2R7 و TAS2R8 و TAS2R14 كمتداولات بروتين. تم إجراء الإرساء الجزيئي باستخدام برنامج Vina Autodock. أصغر درجة الإرساء ، كلما كانت الطاقة الملزمة أفضل. تمت معالجة بروتين المستقبلات مسبقًا باستخدام أدوات رصيف السيارات (ADT) ، بما في ذلك الجفاف والهثة. تمت معالجة يجند أيضًا باستخدام ADT ، بما في ذلك الهدرجة ، وحساب الشحن ، والكشف ، واختيار الروابط القابلة للدوار. تم تحديد الموقع النشط للمستقبل باستخدام ADT ، وتم تعيين مربع الإرساء للتأكد من أن حجم الصندوق كان كافياً لاحتواء الموقع النشط. بعد الانتهاء من الإرساء ، تم استخدام برنامج Pymol لبرنامج التصور لعرض نتائج الإرساء وتحليلها. من أجل تقليل النتائج الإيجابية الخاطئة للرسو الجزيئي ، استخدمت هذه الدراسة درجة الإرساء من الكينين الإيجابي المريرة كمعيار للفحص والمكونات الكيميائية المختارة التي ترتبط بشكل جيد بمستقبلات مريرة على الأقل كمواد مريرة من مصقفة Cistanche. ونتيجة لذلك ، كان ما مجموعه 20 مكونًا كيميائيًا موادًا محتملة ، بما في ذلك 6 جليكوسيدات فينيل إيثانويد ، و 5 فلافونويدات ، و 3 أحماض الفينول ، و 2 تكلوبنتادين الأثير ، والفلافونويد ، و 2 مكونات رئيسية في cistanche. تظهر درجات الالتحام في الجدول 3.
الجدول 3 عشرات الالتحام الجزيئي من مواد تقديم المريرة من مستخلصات ديستيروفيكولا cistanche مع مستقبلات المذاق المرير kcal · mol -1
| لا. | مادة مريرة | TAS2R1 | TAS2R7 | TAS2R8 | TAS2R14 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | بروناسين | -7.6 | -6.6 | -7.8 | -7.1 |
| 2 | trifolirhizin | -8.8 | -7 | -8.7 | -8.5 |
| 3 | حمض البنزويك | -7.9 | -6.9 | -8.2 | -7.1 |
| 4 | vitexin | -7.6 | -6.8 | -8.5 | -7.1 |
| 5 | trifolin | -8.4 | -7.5 | -8.2 | -7.7 |
| 6 | isoquercitrin | -9.2 | -7.5 | -8.1 | -7.8 |
| 7 | isomenthone | -7.3 | -6.7 | -7.4 | -6.9 |
| 8 | الكركمين | -9.2 | -8.1 | -8.3 | -7.4 |
| 9 | حمض الهدروكيتيك | -6.6 | -6 | -7.8 | -7.9 |
| 10 | جينسنوسيد | -7.3 | -7.9 | -8.8 | -8.3 |
| 11 | بايبرين | -8.8 | -7.9 | -7.9 | -7.9 |
| 12 | epicatechin | -9.8 | -6.9 | -9.1 | -8.7 |
| 13 | isoquercitrin (مرة أخرى) | -8.1 | -8 | -8.2 | -8 |
| 14 | راين | -8.7 | -7 | -8.9 | -8.5 |
| 15 | حمض Isosalicylic | -8.7 | -6.5 | -8.3 | -9.3 |
| 16 | pinocembrin | -9.1 | -7.6 | -8.1 | -8.6 |
| 17 | eriocitrin | -7.9 | -7.6 | -8.2 | -8.4 |
| 18 | جينيستين | -8.1 | -8.2 | -9.1 | -8.2 |
| 19 | كيمبفيرول | -8.4 | -8.1 | -9.1 | -8.4 |
| 20 | Isoquercitrin (ذكر ثالث) | -8.2 | -8.4 | -7.9 | -8.7 |
2.3 تقييم اللسان الإلكترونية لمرارة Cistanche Deserticola
2.3.1 اكتساب الإشارة
ارجع إلى طريقة الأدب وتحسينها [16]. المعلمات هي: درجة حرارة التجميع 25 درجة ، وقت جمع البيانات 120 ثانية ، فترة التجميع 1 ثانية ، وسرعة التحريك 1 r · s -1 ، باستخدام المياه الفائقة كسائل التنظيف ، قبل كل عينة من قياس المستشعر لمدة 10 ثوان.
2.3.2 تحديد العينة
تزن 1. 0 g من مسحوق عينة Deserticola cistanche على التوالي ، ووزنه بدقة ، وإضافة 80 مل من الماء ، والارتجاع ، والاستخراج لمدة ساعة واحدة ، واتركه بارد ، والطرد المركزي ، والمرشح ، والاستمتاع 40 مل من المرشح ، وأضف الماء المقطر لجعل المجلد إلى 100 مل. ضع العينة المعدة في دورق قياسي 100 مل للأداة وأداء القياس. كرر القياس ثلاث مرات لكل عينة.
2.3.3 نتائج تقييم المرارة باستخدام اللسان الإلكتروني
بعد الفحص المنهجي ، كانت التجارب الثابتة المعيارية النسبية (RSD) للدقة ، التكرار ، و {0}} h 1.7 ٪ ، 3.6 ٪ ، و 1.4 ٪ على التوالي ، كلها أقل من 5.0 ٪ ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة ممكنة. تراوحت قيم المرارة الكمية لعينات Deserticola المختلفة من 8.856 إلى 27.32 ، كما هو موضح في الجدول 4 ، مع اختلافات كبيرة.
3 مناقشة
في هذه الدراسة ، تم تحديد 69 مكونًا كيميائيًا في Cistanche Deserticola باستخدام تقنية HRMS لـ UPLC-Q-orbbitrap ، و 20 مادة مريرة تحفز مستقبلات المذاق المري مكونات ، بما في ذلك Echinacoside ، وفيرباسكوسيد ، والأنابيبوسيد A ، و isoverboscoside ، و geniposide ، وما إلى ذلك ؛ تم جمع 9 دفعات من عينات ديستيرتيكولا cistanche الطازجة من نفس الأصل في أشهر مختلفة وتقسيمها إلى أشهر مختلفة وأجزاء مختلفة. تم استخدام طريقة اللسان الإلكترونية لتحديد القيمة الكمية لارتياح العينات ، وتم استخدام HPLC لتحديد المكونات الدوائية المحتملة الستة المحتملة (Echinacoside ، فيباسكوسيد ، أنبوبوسايد) في العينات. تم استخدام محتوى A ، Iso-Verbascoside ، جينشيكانوسيد ، جينيبوسيد) ، وقياس الطيف المرئي للأشعة فوق البنفسجية لتحديد غليكوسيدات فينيل إيثانويد ، ومجموعة السكريات الكلية ، والقلويات الكلية ، والفلافونويدات الكلية ، ومحتوى حمض الفينول الكلي في العينات. على هذا الأساس ، إلى جانب التحليل الكيميائي ، تم استخدام تحليل ارتباط بيرسون ، تحليل الارتباط الرمادي ، OPLS-DA ، وما إلى ذلك للعثور على المكونات المريرة في Cistanche Deserticola. أظهرت نتائج تحليل الارتباط أن محتوى جليكوسيدات فينيل إيثانويد الكلي والفلافونويد الكلي في ديسيتيكولا cistanche ارتبط بشكل إيجابي مع قيمة الاستجابة المريرة ، وارتبطت السكريات الكلية لسيارة ديسكوسيولا سلبا مع قيمة الاستجابة المريرة. من بينها ، ارتبط محتوى مكونات الجليكوسيد فينيل إيثانويد إيتشناكوسيد ، وفيرباسكوسيد ، وجينشيكانوسيد بشكل إيجابي مع قيمة الاستجابة المريرة ، والتي كانت متسقة مع نتائج الإرساء الجزيئي ، والتحقق من دقة نتائج الالتحاق الجزيئي. دعمت الطريقتان بعضهما البعض وقدموا مرجعًا لتصحيح الجليد والمكانة اللاحقة لسيارة الديموتيكولا cistanche.
من خلال التنبؤ الصيدلة الشبكة ، تم الحصول على 245 هدفًا للمواد المريرة ، وكانت الأهداف الرئيسية هي EGFR ، PIK3CB ، PTK2 ، PIK3CD ، PIK3R1 ، PTPN11 ، IK3CA ، SRC ، JAK2 ، PDGFRB ، إلخ. أظهرت نتائج مسار Kegg و GO Function أهداف المادة المريرة أن مقاومة الأنسولين ، ودور مسار إشارات PI3K-AKT في المضاعفات السكرية ، ومسار الإشارة AGR في المضاعفات السكري كان المسارات الرئيسية لأهداف المادة المريرة لمهمة CISTANCHE. تم الحصول على ما مجموعه 267 وظائف GO لأهداف المادة المريرة. بما في ذلك 123 عملية بيولوجية ، 75 وظيفة جزيئية و 69 مكونات الخلايا ؛ من خلال إجراء تحليل واين على أهداف المادة المريرة وأهداف المرض للتأثير المرير ل deserticola cistanche ، أظهرت النتائج أن 54.69 ٪ و 65.30 ٪ و 48.16 ٪ و 40.40 ٪ و 20.40 ٪ و 19.59 ٪ من أهداف المواد المري مضاد للتهاب. هذا يدل على أن المواد المريرة في Cistanche Deserticola لها أساس مادي معين للتأثيرات المريرة.
في هذه الدراسة ، تم استخدام مقتطف من cistanche deserticola ككائن بحث ، وتم فحص المواد المريرة في ديسيتيكولا cistanche بواسطة rms uplc-q-orbitrap والرسو الجزيئي ؛ تم استخدام HPLC لتحديد محتوى المكونات الطبية المريرة الرئيسية ، وتم استخدام قياس الطيف المرئي للأشعة فوق البنفسجية لتحديد محتوى كل فئة رئيسية من المواد المريرة. تم استخدام اللسان الإلكتروني لتقييم درجة المرارة ، وتم التحقق من المكونات المريرة بواسطة القياسات الكيميائية. تم استخدام أساليب البحث التقنية الحديثة بالكامل لاستكشاف معلومات طعم Cistanche Deserticola وكشفت عن أساس المواد المريرة ، والتي ستوفر مرجعًا للدخل اللاحق وتصحيح نكهة Cistanche Deserticola. من خلال دراسة علم صيدلة الشبكة ، تم استكشاف آلية عمل المواد المريرة في DeSerticola cistanche وعلاقتها مع الهدف من الفعالية المريرة بشكل مسبق ، والتي ستوفر أفكارًا ومراجع للدراسة المستقبلية لعلاقة "التأثير الذوق" للنكهات الخمسة للطب الصيني. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض أوجه القصور: هذه التجربة اختارت فقط النباتات ذات النوعية الجيدة في موسم الحصاد التقليدي لقياس محتوى المادة المريرة ومرارة أجزاء مختلفة. هناك درجة معينة من حجم العينة غير الكافي ، ونتائج الاختلافات في مرارة أجزاء مختلفة تفتقر إلى موثوقية معينة. من المخطط استخدام عينات واسعة النطاق للتحقق وإجراء المزيد من الأبحاث المنهجية في المستقبل ؛ يُعتقد عمومًا أن مكونات قلويد مريرة ، لكن تحليل الارتباط لهذه التجربة أظهر أن القلويات والمرارة ترتبط سلبًا ، والتي قد تكون لأن المكون القلوي في DeSerticola cistanche هو betaine بشكل أساسي ، ويظهر الإرساء الجزيئي أنه يرتبط بشكل سيء مع المستقبلات المريرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النتائج المريرة التي يتم فحصها بواسطة الإرساء الجزيئي تفتقر إلى مرارة محددة للتقييم الكمي لبيانات التحقق التجريبية ، وقد يكون لنتائج الفحص إيجابيات كاذبة ، وهناك حاجة إلى مزيد من البحث واستكشاف التجربة.
