استنساخ الجينات والتحديد الوظيفي والتحليل الهيكلي والتعبيري لسينثاز السكروز من Cistanche Tubulosa Ⅱ

النتائج والتحليل

1 التعدين واستنساخ جينات سينسيز السكروز في Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>الجزء الجوي.

لذلك، تم تطبيع قيم مستوى التعبير FPKM لجينات سينسيز السكروز المرشحة التي تم الحصول عليها في الفحص الأولي في بيانات النسخ لأجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa بواسطة Z-Score وتم إجراء التحليل التفاضلي (الشكل 1A). أظهرت النتائج أن جين CtSus كان لديه أعلى مستوى تعبير في الهوستوريوم، وكان مستوى التعبير في الجزء تحت الأرض أعلى منه في الجزء الجوي، وهو ما كان متسقًا مع نمط تراكم مركبات الجليكوسيدات في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa، بينما كان مستوى التعبير لجين CtSus1 في الهوستوريوم منخفضًا. لذلك، بناءً على النتائج المذكورة أعلاه، تم اختيار جين CtSus لتضخيم التسلسل اللاحق والتعبير الخارجي والتعرف الوظيفي. باستخدام Cistanche tubulosa [كدنا] كقالب، تم الحصول على منتج نطاق واحد عند ~ 2500 نقطة أساس بعد تضخيم PCR (الشكل 1B). تم استرداد منتج PCR من الجل وربطه بناقل الاستنساخ، وتم الحصول على منطقة الترميز كاملة الطول للجين المستهدف عن طريق التسلسل. كان طول تسلسل CtSus 2418 نقطة أساس.

الشكل 1: استكشاف الجينات واستنساخ CtSus من C. tubulosa وتحليل المعلومات الحيوية للبروتين المشفر. ج: مستويات التعبير عن جينات CtSus وCtSus1 في أجزاء مختلفة من C. tubulosanormalized كدرجات Z بناءً على قيم FPKM الخاصة بها؛ ب: تضخيم الجينات CtSus؛ M: علامة الحمض النووي؛ C: المجال المحافظ لبروتين CtSus الذي تنبأ به SMART؛ D: محاذاة التسلسل المتعدد لـCtSus وتركيبات السكروز التي تم تحديدها من نباتات أخرى بما في ذلك Arabidopsis thaliana وSolanumtuberosum وAlbuca bracteata. يتم تمثيل مجال تخليق السكروز ومجال نقل السكر بواسطة صناديق حمراء وزرقاء، على التوالي؛ E: التحليل التطوري للCtSus وsucrosesynthases من النباتات الأخرى؛ F: تحليل SDS-PAGE للتعبير غير المتجانس لـ CtSus باستخدام ناقل pCold ™ I في E. coli . حارة 1: علامة البروتين؛ لين 2: جزء طاف؛ حارة 3: الكسر الراسب. يظهر السهم الأحمر بروتين CtSus. G: مستعمرة PCR لاستنساخ واحد يحتوي على كلا البلازميدات المؤتلفة. M: علامة الحمض النووي؛ 1: بيت -28 a-UGT71BD1؛ 2: بي كولد™ آي-كتوس

شركة HETIAN DICHEN CISTANCHE للزراعة تتعاون مع جامعة بكين

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

انقر للحصول على مزيد من التفاصيل

2 تحليل المعلوماتية الحيوية لجين CtSus والبروتين المشفر الخاص به

2.1 تحليل الخواص الفيزيائية والكيميائية لـ CtSus والتنبؤ ببنية مجال الغشاء

تم تحليل الخواص الفيزيائية والكيميائية للبروتين المشفر CtSus باستخدام برنامج ProtParam عبر الإنترنت. يحتوي البروتين على 805 أحماض أمينية، بصيغة جزيئية C4189H6548N1104O1187S28 وكتلة جزيئية نسبية تبلغ 92266.44؛ نقطة التساوي الكهربي النظرية هي 6.00; معامل عدم الاستقرار II هو 35.45، وهو بروتين مستقر؛ المتوسط ​​الإجمالي للماء (GRAVY) هو .1870.187، وهو بروتين محب للماء. تم استخدام MHMM 2.0 للتنبؤ بمجال الغشاء من سينسيز السكروز CtSus، وأظهرت النتائج أن البروتين المشفر بواسطة هذا الجين ليس له مجال عبر الغشاء.

شركة HETIAN DICHEN CISTANCHE للزراعة تتعاون مع جامعة بكين

2.2 التنبؤ بالبنية المحافظة لـ CtSus ومحاذاة التسلسل

تم استخدام البرنامج عبر الإنترنت SMART للتنبؤ بالمجالات المحافظة لبروتين CtSus (الشكل 1C). يحتوي البروتين على مجالين محافظين. الطرف N (الأحماض الأمينية من 8 إلى 553) هو مجال سينسيز السكروز، والذي يمكن أن يحفز التفاعل العكسي لـ UDP والسكروز لتوليد UDP- الجلوكوز و D- الفركتوز؛ ينتمي الطرف C (الأحماض الأمينية 557 إلى 739) إلى مجال نقل الجليكوزيل (الشكل 1D). تم استخدام برنامج DNAMAN لمحاذاة تسلسل البروتين CtSus مع تسلسل الأحماض الأمينية سينسيز السكروز في قاعدة بيانات NCBI (الجدول 2). أظهرت النتائج أن تسلسل الأحماض الأمينية CtSus أظهر تشابها كبيرا مع تسلسل سينسيز السكروز من النباتات الأخرى. أعلى تشابه بين CtSus وتسلسل سينسيز السكروز من السمسم (Sesamum indicum) بلغ 94.78%، وكان التشابه مع تسلسلات سينسيز السكروز من النباتات الأخرى أيضًا أعلى من 65%، مما يشير إلى أن سينسيز السكروز من النباتات لديه درجة عالية من التسلسل حفظ.

الجدول 2: أوجه التشابه في تسلسل الأحماض الأمينية بين CtSus ومركبات السكروز المحددة من نبات آخر

2.3 التحليل التطوري

تم استخدام شجرة النشوء والتطور التي أنشأها برنامج MEGA لتحليل العلاقة التطورية بين سينسيز السكروز CtSus من Cistanche tubulosa و سينسيز السكروز من النباتات الأخرى. وتظهر النتائج في الشكل 1E. تُظهِر تركيبات السكروز من النباتات فروعًا تطورية متميزة في ثنائيات الفلقة (المنطقتين الأولى والثانية) وأحادية الفلقة (المنطقة الثالثة). يوجد CtSus في فرع dicot، والتسلسلات المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بـ CtSus كلها من نباتات Lamiaceae (Cistanche tubulosa عبارة عن نبات Lamiaceae Orobanchaceae)، بينما يتكون الفرع الآخر بشكل أساسي من نباتات Solanales، مما يشير أيضًا إلى الحفظ العالي والتماثل من جينات سينسيز السكروز المشتقة من النبات في تطور النباتات بنفس الترتيب. من بينها، سينسيز السكروز PrSus (AEN79500.1) من Phelipanche ramosa من نبات Orobanchaceae هو الأقرب إلى CtSus.

3 التعبير الخارجي وتحليل نشاط CtSus

3.1 التعبير الخارجي لجين CtSus

تم نقل البلازميدات pET-28a-CtSus وpET-24b-CtSus وpCold™ I-CtSus التي تم التحقق منها بالتسلسل إلى التعبير المختص E. coli Transetta (DE3)، وتم فحص النسخ الإيجابية بواسطة مستعمرة PCR للتحقق من التسلسل. تم تحفيز سلالات التعبير المؤتلف التي تم الحصول عليها بواسطة درجة حرارة IPTG المنخفضة للتعبير عن البروتين، وتم جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي. تمت إضافة المخزن المؤقت للتحلل لكسر البكتيريا للحصول على المادة طافية والترسيب، وتم إجراء SDS-PAGE للكشف. أظهرت النتائج أنه عند استخدام pET-28a وpET-24b كمتجهات تعبير، لم يتم التعبير عن CtSus في E. coli، بينما عندما تم استخدام pCold™ I كمتجه تعبير، كان CtSus واضحًا تم اكتشاف شريط البروتين المؤتلف في منطقة ~ 100 كيلو دالتون، وهو ما كان متسقًا مع كتلته الجزيئية النسبية المتوقعة نظريًا البالغة 92.2 كيلو دالتون (الشكل 1F).

شركة HETIAN DICHEN CISTANCHE للزراعة تتعاون مع جامعة بكين

3.2 تحول الخلية الكاملة

من أجل التحقق مبدئيًا من الوظيفة الحفزية لـ CtSus، تم إنشاء سلالة التعبير المشترك لـ CtSus وجين جليكوسيل ترانسفيراز UGT71BD1. تم استنساخ UGT71BD1 وتحديده من Cistanche tubulosa وهو عبارة عن UDP-glucosyltransferase الذي يمكنه قبول المركبات العطرية على نطاق واسع مثل جليكوسيدات فينيلثانويد وأنواع مختلفة من الفلافونويد والستيلبين والكومارين كمستقبلات وتحفيز تفاعل الجلوكوزيل لمجموعة الهيدروكسيل الفينولية الأساسية باستخدام UDP-glucose. كمتبرع بالسكر[18]. يمكن أن يوفر إدخال CtSus نظريًا المزيد من الجلوكوز UDP المانح للجليكوزيل لتفاعل الجلوكوزيل المحفز بواسطة UGT71BD1، وبالتالي تعزيز توازن التفاعل للتحرك نحو تكوين منتجات الجليكوزيل، وبالتالي زيادة إنتاج منتجات الجليكوزيل. تم تحويل البلازميد pCold™ I-CtSus والبلازميد pET-28 a-UGT71BD1 في وقت واحد إلى التعبير المختص بـ E. coli Transetta (DE3). تم فحص الحيوانات المستنسخة المفردة التي تحتوي على كل من البلازميدات المؤتلفة بواسطة مستعمرة PCR، وتم الحصول على سلالات التعبير المؤتلف الإيجابية عن طريق التحقق من التسلسل (الشكل 1G). تم تحفيز التعبير الجيني المزدوج في المختبر، وتم استخدام سلالة التعبير الجيني المفرد pET-28 aUGT71BD1 كمجموعة تحكم. تم التحقق مبدئيًا من نشاط CtSus في تحفيز توليد متبرع UDP-glucose عن طريق تحويل الخلية بأكملها. أظهرت نتائج HPLC وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة أنه عندما تم إجراء تفاعل تحويل الخلية بالكامل باستخدام الإسكوليتين 1 والريسفيراترول 2 كركائز، تم اكتشاف توليد منتجات الارتباط بالجليكوزيل الواضحة بعد 24 ساعة من التحول، كما هو موضح في الشكل 2.

الشكل 2: التحول الحيوي للخلية الكاملة للركيزة 1 أو 2 عن طريق سلالة مؤتلفة تؤوي UGT71BD1 أو سلالة مؤتلفة تحتوي على اقتران UGT71BD1 مع CtSus، على التوالي. ج: HPLCchromatograms للتحول الحيوي للخلية الكاملة للركيزة 1. كان الطول الموجي للكشف 360 نانومتر؛ B: HRESI-MS وMS2spectra للمنتج 1أ؛ C: اللوني HPLC للتحول الحيوي للخلية بأكملها من الركيزة 2؛ كان الطول الموجي للكشف 330 نانومتر. D: أطياف HRESI-MS للمنتجات 2a و2b

عندما تم استخدام 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+، الصيغة الجزيئية C9H6O4) كركيزة، كانت الذروة الكروماتوغرافية للمنتج 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +، تم اكتشاف الصيغة الجزيئية المتوقعة C15H16O9) عند 5.39 دقيقة، وهو ما يتوافق مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للركيزة ومنتج التحكم. في الوقت نفسه، تم اكتشاف ذروة الجزء m/z 179.033 4 [M+H]+ في طيف MS2 لـ 1a، والذي تم إنتاجه عن طريق فقدان 1a لجزيء الجلوكوز (162 Da)، مما يشير إلى أن 1a كان نتاج الركيزة 1 المتصلة بجزيء الجلوكوز. تم حساب معدل التحويل من خلال دمج منطقة الذروة. لقد وجد أن معدل تحويل الخلايا الكاملة UGT71BD1 التي تحفز الركيزة 1 لتوليد المنتج الغليكوزيلاتي 1أ كان 71.87%، بينما أدت إضافة CtSus إلى زيادة معدل تحويل التفاعل إلى 95.84%، وهو ما كان 1.3 مرة مقارنة بالمجموعة الضابطة. عندما كانت الركيزة مركبة 2 (m/z 227.072 5 [MH]-، الصيغة الجزيئية C14H12O3)، بلغت الذروة الكروماتوغرافية للمنتج 2a (m/z 389.123 4 [MH]-، الجزيئي المتوقع تم اكتشاف الصيغة C20H22O8) و2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+، الصيغة الجزيئية المتوقعة 26H32O13) عند 10.32 و6.52 دقيقة، على التوالي، والتي كانت متسقة مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المميز للركيزة و منتج التحكم. تم اكتشاف ذروة الشظية عند 227.071 3 [MH]-، والتي تم إنتاجها عن طريق فقدان جزيء جلوكوز واحد (162 Da)، مما يشير إلى أن 2a كان نتاج الركيزة 2 المتصلة بجزيء جلوكوز واحد. من خلال المقارنة مع البيانات الموجودة في الأدبيات [18] ومعلومات التنبؤ بقياس الطيف الكتلي، تم تحديد أن المنتج 2ب كان نتاج الركيزة 2 المتصلة بجزيئين من الجلوكوز. تم حساب معدل التحويل باستخدام منطقة الذروة المتكاملة. لقد وجد أن إضافة CtSus يمكن أن يزيد معدل تحويل تفاعل الارتباط بالجليكوزيل للركيزة 2 من 64.01% إلى 78.51%، ومن بينها زيادة إنتاج منتج السكر الأحادي 2أ من 45.09% إلى 63.58%، وإنتاج منتج ثنائي السكاريد 2ب. تغيرت من 18.92% إلى 14.93%.

3

شركة HETIAN DICHEN CISTANCHE للزراعة تتعاون مع جامعة بكين

3.3 كتوس

تنقية البروتين المؤتلف وتحديد النشاط التحفيزي للإنزيم في المختبر أشارت نتائج تجربة تحويل الخلية بأكملها إلى أن CtSus لديه نشاط تحفيز إنتاج الجلوكوز UDP- الجلوكوز المتبرع النشط. من أجل التحقق بشكل أكبر من النشاط التحفيزي من خلال التحفيز الأنزيمي في المختبر، تم فصل بروتين الاندماج لجين CtSus في نظام التعبير pCold™ وتنقيته بواسطة تحليل كروماتوجرافي متقارب. أظهرت النتائج أنه عند استخدام pCold™ I كناقل للتعبير، تم التعبير عن البروتين المؤتلف بكميات كبيرة، ولكن في الغالب في الراسب. عندما تم استخدام pCold™ TF كمتجه للتعبير، تم التعبير عن جين CtSus بكميات كبيرة في E. coli (الشكل 3A). تمت تنقية بروتين الاندماج بواسطة تحليل كروماتوجرافي تقارب HisTrap FF للتفاعل الأنزيمي في المختبر. وتظهر النتائج في الشكل 3B. عندما تم استخدام السكروز وUDP كركائز، مقارنة مع مجموعة التحكم السلبية، تم اكتشاف ذروة منتج جديد عند 10.32 دقيقة. كان وقت الاحتفاظ به وامتصاصه للأشعة فوق البنفسجية متسقًا مع الجلوكوز UDP. وقد ثبت أن المنتج هو UDP-glucose بالمقارنة مع المعيار. ومع ذلك، نظرًا لأن بروتين الاندماج المعبر عنه بواسطة ناقل التعبير pCold™ TF يحتوي على علامة قابلة للذوبان لعامل تحفيز كبير (حجم بروتين العلامة هو 48 كيلو دالتون)، فسيكون له تأثير كبير على النشاط التحفيزي للبروتين. لذلك، تم قطع علامة بروتين الاندماج بشكل أكبر بواسطة إنزيم العامل Xa، وتمت تنقية بروتين CtSus بدون علامات خارجية (الشكل 3A). تعرض البروتين للتحفيز الأنزيمي في المختبر، وأظهرت النتائج أن العائد من الجلوكوز UDP زاد من 3.53٪ إلى 10.66٪ (الشكل 3B). أكدت النتائج المذكورة أعلاه نشاط CtSus في تحفيز إنتاج الجلوكوز UDP من خلال التحفيز الأنزيمي في المختبر، وأظهرت أيضًا أن وجود علامة تقارب كبيرة يفضي إلى التعبير القابل للذوبان عن CtSus، ولكنه سيؤثر أيضًا بشكل كبير على النشاط التحفيزي للإنزيم في المختبر.

الشكل 3: التعبير غير المتجانس والتعريف الوظيفي لـ CtSus. ج: تحليل SDS-PAGE لبروتينات CtSus. حارة 1: علامة البروتين؛ المسار 2: CtSus المؤتلف مع عامل الزناد؛ الخط 3: انقسام علامة Trigger13factor باستخدام بروتياز العامل Xa لإعطاء بروتين CtSus المسمى بالسهم الأحمر. ب: المقايسات الأنزيمية في المختبر باستخدام بروتين الاندماج وبروتينات CtSus الخالية من العوامل لتحفيز تخليق UDP- الجلوكوز في وجود السكروز و UDP، على التوالي، مع معيار UDP- الجلوكوز المرجعي. تم استخدام البروتين المسلوق كمجموعة مراقبة تحت نفس الظروف. وكان الطول الموجي للكشف 260 نانومتر