تحفز Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides موت الخلايا المبرمج في خلايا Eca-109 عبر المسار المعتمد على الميتوكوندريا

مقدمة

يعد سرطان المريء أحد أكثر أنواع السرطان شيوعًا حيث يحتل المرتبة الحادية عشرة من حيث أعلى معدل مراضة وسادس أعلى معدل وفيات على مستوى العالم، وتسبب في وفاة 439,000 تقريبًا في عام 2015. وتختلف معدلات الإصابة بسرطان المريء بشكل ملحوظ بين المناطق المختلفة، مع المناطق الشرقية أظهرت آسيا وشرق وجنوب أفريقيا أعلى معدلات الإصابة، بينما أظهرت غرب أفريقيا أدنى المعدلات في عام 2012. في الصين، بلغت حالات سرطان المريء والوفيات المقدرة 477،000 و375،000، على التوالي ، في عام 2015. على الرغم من انخفاض معدل الإصابة بسرطان المريء في البلدان ذات المؤشر الاجتماعي والديموغرافي المتوسط ​​والعالي بين عامي 2005 و 2015، إلا أن معدل الوفيات لا يزال مرتفعًا بسبب سوء التشخيص. تم استخدام الجمع بين الاستئصال الجراحي والعلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي لعلاج سرطان المريء، ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن أنه بين عامي 2003 و2014 ظل معدل البقاء على قيد الحياة 5-عامًا<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyأثبت ذلكCistanche tubulosa جليكوسيدات فينيليثانويد(CTPG) يمكنه كبح نمو خلايا سرطان الجلد B16-F10 في المختبر وفي الجسم الحي (24). ومع ذلك، فإن قابلية الذوبان الضعيفة في الماء لـ CTPG المستخدمة سابقًا تحد من تطوير الدواء. لذلك، تم استخدام CTPG (CTPG-W) القابل للذوبان في الماء وتم دراسة التأثير المضاد للورم على خلايا سرطان المريء (Eca-109). تم تحديد أن CTPG-W يمكن أن يمنع بشكل معتمد على الجرعة صلاحية خلايا Eca -109 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج عبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

المواد والأساليب

الحيوانات.

تم شراء الفئران الأنثوية C57BL/6 (6-8 أسبوع، حوالي 25 جم) من مركز أبحاث حيوانات مختبر بكين (بكين، الصين) وتم إيواؤها في غرفة يتم التحكم بدرجة حرارتها (25 درجة مئوية)، ودورة ضوئية (12 درجة مئوية). 12) منشأة الحيوان بجامعة شينجيانغ (أورومتشي، الصين). تلقت جميع الحيوانات الماء والغذاء الخالي من مسببات الأمراض.

خط الخلية والثقافة.

تم الحفاظ على خط خلايا سرطان المريء البشري (Eca-109) بواسطة مختبر شينجيانغ الرئيسي للموارد البيولوجية والهندسة الوراثية (كلية علوم الحياة والتكنولوجيا، جامعة شينجيانغ، أورومتشي، الصين) وتمت زراعته في RPMI{{1} } متوسط ​​(Gibco؛ Thermo Fisher Scientific، Inc.، Waltham، MA، USA) مكمل بـ 10٪ من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (FBS؛ MRC، EN MOASAI Biological Technology Co.، Ltd، Jiangsu، China)، 1٪ L - جلوتامين (100 ملم)، 100 وحدة/مل بنسلين و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون.

كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC).

تم شراء CTPG-W (رقم القطة SGJG20170410) من Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (شنغهاي، الصين). تم تأهيل المركبات الرئيسية لـ CTPG وقياسها بواسطة HPLC وفقًا لدراستنا السابقة (24). باختصار، تم إجراء HPLC على عمود ZORBAX SB-C18 (250x4.6 مم؛ 5 ميكرومتر) عند 30 درجة مئوية وتمت التصفية بمحلول حمض الفورميك بنسبة 0.2% وتدرج من الميثانول يبدأ بنسبة 23%، حيث تتم إضافة 1 مل كل دقيقة. لمدة 45 دقيقة حتى تصل إلى 31%. تم حقن ما مجموعه 10 ميكرولتر من العينة واكتشافها عند 330 نانومتر. تم شراء معيار echinacoside من شركة Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (شنغهاي، الصين)، وتم شراء معيار Acteoside من Sigma-Aldrich (Merck KGaA، Darmstadt، ألمانيا). تم استخدام المعايير لتحليل مكونات CTPG-W.

فحص MTT.

تم قياس تكاثر الخلايا باستخدام اختبار MTT. تم تلقيح خلايا Eca {{0}} في صفائح البئر 96- بكثافة 5x103 خلايا في 100 ميكرولتر RPMI{{5 }} متوسطة/جيدة ومثقفة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم تعامل بتركيزات مختلفة (0، 200، 400، 600، و800 ميكروغرام/مل) من CTPG-W أو 0.4% ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 24، 48 و 72 ساعة. تم استخدام DMSO كعنصر تحكم في المذيبات (800 ميكروغرام / مل CTPG-W يحتوي على 0.4٪ DMSO). تم استخدام سيسبلاتين (20 ميكروغرام / مل) كعنصر تحكم إيجابي. بعد ذلك، تم التخلص من الطاف بعد الطرد المركزي عند 225 x جم لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة وأضيف 100 ميكرولتر من محلول MTT (0.5 مجم / مل في وسط RPMI-1640 بدون FBS) إلى كل بئر واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ح. تم إذابة بلورات الفورزان المشكلة في 200 ميكرولتر من DMSO. تم قياس قيم الكثافة الضوئية (OD) بطول موجة قدره 490 نانومتر بواسطة قارئ صفيحة ميكروية 96- جيدًا (Bio-Rad Laboratories، Inc.، Hercules، CA، USA). تم حساب صلاحية الخلية النسبية وفقًا للصيغة: صلاحية الخلية (٪)=(ODtreated / ODuntreated) x100٪. تمت ملاحظة مورفولوجيا خلايا Eca-109 باستخدام مجهر مضان مقلوب (التكبير، x200) (Nikon Eclipse Ti‑E؛ شركة Nikon، طوكيو، اليابان).

لتكاثر الخلايا الطحالية، تم الموت الرحيم للفئران C57BL/6 عن طريق خلع عنق الرحم، وتم عزل الطحال. تم عمل تعليق الخلية المفردة وتم زرع الخلايا الطحالية في 96- صفائح بئر بكثافة 1x105 خلايا/بئر في وسط 100 ميكرولتر RPMI-1640، ثم تمت معالجتها بتركيزات مختلفة (0، 200، 400، 600، و 800 ميكروغرام / مل) من CTPG-W لمدة 24 و 48 و 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تم قياس تكاثر الخلايا الطحالية بواسطة فحص MTT، وفقًا للبروتوكول المذكور أعلاه. مؤشر التحفيز =ODمعالج/ODغير معالج.

قياس موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية. تم استزراع خلايا Eca {{0}} في أطباق بحجم 6 0 مم بكثافة 2.5 × 1 0 5 خلايا / طبق لمدة 24 ساعة وتم معالجتها بتركيزات مختلفة ({{31} }، 200، 400، 600، و800 ميكروغرام/مل) من CTPG-W أو 0.4% DMSO لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. تم جمع الخلايا وتلطيخها باستخدام مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) / Propidium iodide (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co.، Ltd.، Shanghai، China) ، وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تم جمع العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur؛ BD Biosciences، Franklin Lakes، NJ، USA) وتم تحليلها بواسطة FlowJo 7.6 (Tree Star، Inc.، Ashland، OR، USA). لتحليل تأثير CTPG-W على دورة الخلية، تم زرع خلايا 2.5x105 Eca-109 في أطباق استنبات بحجم 60 مم وتم معالجتها بـ CTPG-W (0، 100، 200، و400 ميكروغرام/مل) أو 0.4 % DMSO لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. تم حصاد جميع الخلايا وغسلها مرتين باستخدام PBS المثلج (Gibco؛ Thermo Fisher Scientific، Inc.)، ثم تم تثبيتها في 70٪ من الإيثانول المثلج عند درجة حرارة 4 مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الغسيل مرتين باستخدام PBS المثلج ، تمت إعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI / RNase (BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم تحليل توزيع دورة الخلية باستخدام برنامج ModFit LT 3.0 عن طريق قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur).

سيستانتشي توبولوسا الطبيعيمكافحة التعبحماية الكبد PHGS75% ECH 30% ACT 12%

تحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا (Δψm) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS).لتحليل ميكرومتر، تمت معالجة خلايا Eca{{0}} باستخدام CTPG-W (0 و4 00 و600 و800 ميكروغرام/مل) أو 0.4% DMSO لـ 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون، وملطخة بمجموعة مقايسة غشاء الميتوكوندريا المحتملة مع JC -1 (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية، شنغهاي، الصين)، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ج. بعد الغسيل مرتين باستخدام محلول الغسيل JC -1 (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية)، تمت إعادة تعليق العينات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول الغسيل JC-1 وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur). ولوحظ أيضًا مضان صبغة JC-1 في خلايا Eca-109 باستخدام مجهر مضان مقلوب (التكبير، x200؛ Nikon Eclipse Ti-E). لتحليل ROS، تمت معالجة خلايا Eca-109 باستخدام CTPG-W (0 و400 و600 و800 ميكروغرام/مل) لمدة 2 و4 و6 و12 و24 ساعة، وتم صبغها باستخدام مقايسة أنواع الأكسجين التفاعلية. (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية)، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS المثلج، تم جمع العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي (BD FACSCalibur) وتم تحليلها بواسطة برنامج FlowJo 7.6.

الشكل 1. السيطرة المؤهلة على CTPG-W. تم تحليل مكونات CTPG-W نوعيًا وكميًا بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء ومقارنتها بمعايير الإيتشيناكوسايد والأكتيوسيد. CTPG-W، جليكوسيدات فينيلثانويد القابلة للذوبان في الماءC. tubulosa.

نشاط الكسح الجذري 2،2 ثنائي فينيل 1 بيكريل هيدرازيل (DPPH). تم تحديد نشاط مسح الجذور الحرة لـ CTPG-W باستخدام اختبار الجذور الحرة DPPH وفقًا للبروتوكول المنشور مع تعديل بسيط، حيث تم استبدال الميثانول بالإيثانول لإذابة DPPH (25،26). بالنسبة لقياسات الحالة المستقرة، تم خلط 150 ميكرولتر DPPH (100 مليمول/لتر) في الإيثانول مع تركيزات مختلفة من CTPG-W (25، 50، 75، 100، 250، 300، 400، 500 و 600 ميكروغرام / مل) في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وحضنت في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم اكتشاف الامتصاصية عند 517 نانومتر في وجود وغياب CTPG-W. تم استخدام ما مجموعه 50 ميكرولتر من فيتامين C كعنصر تحكم إيجابي. تم حساب نشاط الكسح الجذري DPPH باستخدام الصيغة: الكسح (%) =[1-(Asample-Ablank)/A0] x100، حيث Ablank هو امتصاص عنصر التحكم (بدون DPPH)، Asample هو امتصاص العينة وA0 هو امتصاص PBS مع DPPH.

تحليل لطخة غربية. تمت معالجة خلايا Eca {{0}} باستخدام CTPG-W (0، 200، 600 ميكروغرام / مل) أو 0.4٪ DMSO لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الغسيل التالي مرتين مع خلايا PBS 

الشكل 2. تأثير CTPG-W على نمو خلايا Eca -109 وخلايا الطحال. (A) تمت معالجة خلايا Eca-109 بتركيزات مختلفة من CTPG-W لمدة 24 و48 و72 ساعة، ثم تم اكتشاف صلاحية الخلية باستخدام اختبار MTT. (ب) التغيرات المورفولوجية لخلايا Eca-109 عند علاج CTPG-W عند 24 ساعة. (C) تمت معالجة الخلايا الطحالية من الفئران C57BL/6 بتركيزات مختلفة من CTPG-W لمدة 24 و48 و72 ساعة، ثم تم تحليل الانتشار باستخدام اختبار MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

تم التخلص منها في المخزن المؤقت لفحص تحلل الهطول الإشعاعي (Beijing ComWin Biotech Co.، Ltd.، بكين، الصين) لمدة 20 دقيقة على الجليد. بعد الطرد المركزي عند 10,000 xg لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية، تم جمع المواد الطافية، وتم اكتشاف تركيزات البروتين باستخدام مجموعة حمض البيكينكونيك (Thermo Fisher Scientific, Inc.) وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تم إجراء تحليل لطخة غربية وفقًا لوصفنا السابق (24). الأجسام المضادة ضد كاسباس -7 (قطة رقم D120077)، كاسباس -8 (قطة رقم D155240)، كاسباس -9 (قطة رقم D220078)، سرطان الغدد الليمفاوية في الخلايا البائية{ {13}} (Bcl-2) - مرتبط بـ X (Bax) (رقم القطة D220073) وBcl -2 (قطة رقم D260117)، وبيروكسيديز الفجل IgG المضاد للفأر (HRP) ) (القطط رقم D111050) وIgG-HRP المضاد للأرنب (القطط رقم D110058) تم شراؤها من BBI Life Sciences (شنغهاي، الصين). تم شراء الأجسام المضادة ضد caspase -3 (cat. no. E-AB -10050) وcaspase النشط -3 (cat. no. E-AB -22115) من Elabscience ( ووهان، الصين). أجسام مضادة أخرى ضد كاسباس -7 (قطة رقم 9492)، بوليميريز بولي (ADP-ريبوز) (PARP) (قطة رقم 9542)، سيتوكروم ج (قطة رقم AC909)، c-Jun NH{ {37}} تم الحصول على كيناز المحطة (JNK) (القطط رقم 9252S) و-actin (القطط رقم 58169) من شركة Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers، MA، USA). تم تخفيف جميع الأجسام المضادة الأولية والثانوية بنسبة 1:1 000. تم تحضين الأجسام المضادة الأولية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية طوال الليل وتم تحضين الأجسام المضادة الثانوية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

الشكل 3. موت الخلايا المبرمج للخلايا Eca -109 الناجم عن CTPG-W. عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من CTPG-W لمدة 24 ساعة. ( أ ) تم تحليل خلايا Eca-109 المبرمج والنخرية عن طريق قياس التدفق الخلوي. تصور اللوحة العلوية مخططات النقاط الفردية وتصور اللوحة السفلية بيانات التلخيص. * ص<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

تم اكتشاف البروتينات المستهدفة باستخدام مجموعة مقايسة اللمعان الكيميائي المحسنة (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية)، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

تحليل احصائي. تم حساب الأهمية الإحصائية من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق وتم تحليل النتائج باستخدام برنامج GraphPad Prism 5.0 (برنامج GraphPad، La Jolla، CA، USA) بين مجموعات العلاج والسيطرة. تم تقديم جميع البيانات على أنها الانحراف المعياري المتوسط. ص<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

مستخلص سيستانش توبولوسا لتحسين وظيفة الكلى PHGS75% ECH 30% ACT 12%

نتائج

CTPG-W يمنع نمو خلايا Eca-109.

تم تأهيل مكونات CTPG-W وقياسها بواسطة HPLC (الشكل 1)، والتي تمت مقارنتها بمعايير الإيتشيناكوسايد والأكتيوسيد. وفقًا لأوقات ذروة الاستبقاء ومناطق الذروة، احتوى CTPG-W على 39.16% من الإكيناكوسيد و2.44% من الأكتيوسيد. أولاً، تم تحديد تأثير CTPG-W على صلاحية خلايا Eca-109 من خلال اختبار MTT. تم إذابة CTPG-W في DMSO بمعدل 200 مجم/مل وتم تخفيفه باستخدام وسط RPMI-1640 يحتوي على 10% FBS معطل للحرارة للتركيزات المشار إليها. تمت معالجة خلايا Eca -109 باستخدام CTPG-W وتم تحليل قابلية الخلية للخلية باستخدام اختبار MTT في النقاط الزمنية المحددة. أدى علاج CTPG-W إلى تقليل صلاحية خلايا Eca -109 بشكل كبير بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

الشكل 4. تأثير CTPG-W على توزيع دورة الخلية في خلايا Eca -109. تم استخدام تركيزات مختلفة من CTPG-W لعلاج خلايا Eca -109 لمدة 24 ساعة وتم تحليل توزيع دورة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. * ص<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W يستحث موت الخلايا المبرمج في خلايا Eca-109. لاستكشاف ما إذا كان CTPG-W يقمع نمو خلايا Eca -109 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج أو النخر، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من CTPG-W. بعد 24 ساعة، تم اكتشاف موت الخلايا المبرمج ونخر خلايا Eca-109 باستخدام تلطيخ Annexin V/PI. كما هو مبين في الشكل 3A، تم بوابات خلايا Annexin V- / PI+ كخلايا نخرية، وتم بوابات خلايا Annexin V+ / PI+ و Annexin V+ / PI- كخلايا موت الخلايا المبرمج. تسبب CTPG-W في المقام الأول في موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109 بطريقة تعتمد على الجرعة، على الرغم من أن خلايا Eca -109 النخرية زادت أيضًا بشكل ملحوظ تحت علاج 600 و800 ميكروغرام / مل CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

يستحث CTPG-W إيقاف دورة الخلية في المرحلة S في خلايا Eca-109. سيؤدي اضطراب دورة الخلايا السرطانية إلى تثبيط نمو الخلايا وتعزيز موت الخلايا المبرمج (27). تم اكتشاف توزيع دورة الخلية في خلايا Eca -109 من خلال تلطيخ PI بعد علاج CTPG-W لمدة 24 ساعة. وقد لوحظ أن الخلايا في المرحلة S زادت والخلايا في المراحل G0 / G1 أشارت إلى انخفاض كبير بشكل عام عند علاج CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W يقلل Δψm ويحث على إطلاق السيتوكروم c. يمكن أن يحدث موت الخلايا المبرمج عن طريق مسار يعتمد على الميتوكوندريا (28،29). يخدم الأعضاء المؤيدون والمناهضون لموت الخلايا المبرمج في عائلة البروتين BCL -2 أدوارًا مهمة في تنظيم سلامة غشاء الميتوكوندريا (30،31). بعد علاج CTPG-W لمدة 24 ساعة، تم تقييم ميكرومتر باستخدام تلطيخ JC-1. سوف يتفكك مجموع JC-1 (مضان أحمر تم اكتشافه في FL-2) إلى مونومر (تم اكتشاف مضان أخضر في FL-1) عندما يتم تقليل Δψm (32). كما هو مبين في الشكل 5A، زادت ترددات خلايا FL-1+ FL-2-/+ بشكل ملحوظ بطريقة تعتمد على الجرعة، مما يشير إلى انخفاض Δψm لخلايا Eca-109. ولوحظت أيضًا تغيرات التألق في خلايا Eca-109 باستخدام مجهر مضان مقلوب (الشكل 5 ب). مع زيادة تركيزات CTPG-W، انخفض الفلورسنت الأحمر وزاد الفلورسنت الأخضر، وهو ما يتوافق مع البيانات المستمدة من قياس التدفق الخلوي. ولوحظ أيضًا أن مستوى السيتوكروم c في العصارة الخلوية قد زاد بشكل ملحوظ (الشكل 5C) ، وهو نتيجة لانخفاض ميكرومتر. هذا يعزز الاستنتاج المستخلص من العدد المتزايد لخلايا FL -1+ FL -2- / + التي انخفضت ميكرومتر نتيجة لعلاج CTPG-W. تم الإبلاغ عن أن JNK يمكنه تنظيم تنشيط عائلة البروتين BCL -2 التي تسبب إطلاق السيتوكروم c (33-35). وقد تقرر أيضًا أن مستوى JNK تم تنظيمه بشكل ملحوظ بعد علاج CTPG-W (الشكل 5C). أشارت النتائج إلى أن CTPG-W قد يحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109 من خلال مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

الشكل 5. الحد من Δψm وتنظيم السيتوكروم ج وJNK. تمت معالجة خلايا Eca -109 بتركيزات مختلفة من CTPG-W لمدة 24 ساعة. ( أ ) تم اكتشاف ميكرومتر بواسطة تلطيخ JC-1 وتم تحليل العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي. تصور مخططات النقاط الفردية التغييرات في مضان JC-1. ترددات خلايا FL -1+ FL -2-/+ موضحة في اللوحة السفلية. *** ص<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

الشكل 6. مستويات ROS في خلايا Eca-109 عند علاج CTPG-W ونشاط مضادات الأكسدة لـ CTPG-W. (A) عولجت خلايا Eca-109 بتركيزات مختلفة من CTPG-W وتم تحليل مستويات ROS بواسطة قياس التدفق الخلوي في نقاط زمنية محددة. * ص<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

تأثير CTPG-W على توليد ROS داخل الخلايا.يمكن أن يقلل ROS ميكرومتر للحث على موت الخلايا المبرمج (36). لاستكشاف ما إذا كان CTPG-W يمكنه زيادة إنتاج ROS، تمت معالجة خلايا Eca -109 بتركيزات مختلفة من CTPG-W. تم جمع الخلايا في النقاط الزمنية المحددة وملطخة بـ DCFH-DA. تم تحديد إنتاج ROS داخل الخلايا في خلايا Eca -109 عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما هو مبين في الشكل 6A، 800 ميكروغرام / مل CTPG-W زاد بشكل كبير إنتاج ROS من 2-6 ساعة، وانخفض من 12-24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، أدى 400 ميكروغرام/مل من CTPG-W إلى زيادة إنتاج ROS بشكل ملحوظ من 12-24 ساعة. علاوة على ذلك، فإن 200 ميكروغرام/مل CTPG-W لم يغير إنتاج ROS بشكل ملحوظ. قد تترافق التغييرات الديناميكية في إنتاج ROS مع موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca-109. تم تحديد أيضًا أن CTPG-W كان له نشاط مسح جذري حر (الشكل 6B) ، والذي قد يرتبط بانخفاض إنتاج ROS في خلايا Eca -109 المعالجة بـ 800 ميكروغرام / مل CTPG-W بعد 12 ساعة.

الشكل 7. مستويات الكاسبيز المشقوق والبارب المشقوق بعد علاج CTPG-W. تم عزل البروتينات من خلايا Eca -109 التي عولجت بـ CTPG-W لمدة 24 ساعة وتم اكتشاف مستويات الكاسبيز المشقوق وPARP المشقوق من خلال تحليل اللطخة الغربية. [دمس]، ثنائي ميثيل سلفوكسيد؛ CTPG-W، جليكوسيدات فينيلثانويد القابلة للذوبان في الماءC. tubulosa; PARP، بوليميريز بولي (ADP- ريبوز).

ينظم CTPG-W نشاط caspase-3 وcaspase-7 وcaspase-9 وPARP. يمكن أن يؤدي إطلاق السيتوكروم c الناتج عن تقليل ميكرومتر إلى تنشيط بروتياز الكاسبيز للحث على موت الخلايا المبرمج (29،30،37). بعد علاج CTPG-W لمدة 24 ساعة، تم اكتشاف تنشيط الكاسبيز -3، 7، 8، 9، وPARP عن طريق تحليل اللطخة الغربية. بالمقارنة مع التحكم، فإن مستويات الكاسبيز المشقوق -9، والكاسبيز المشقوق -7، والكاسبيز المشقوق -3، والـ PARP المشقوق، ولكن ليس مستويات الكاسبيز المشقوق {{20 }}، تم تنظيمها عن طريق علاج CTPG بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 7). أشارت هذه النتائج إلى أن CTPG-W قلل Δψm وعزز إطلاق السيتوكروم c لتنشيط الكاسبيز الذي يحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca -109.

مناقشة

يمكن لآلية تبادل المعلومات التقليدية أن تحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان المريء من خلال مسارات مختلفة، بما في ذلك مستقبل الموت الخارجي، ومسارات إجهاد الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا الداخلية (29). أظهرت دراستنا السابقة أن CTPG، باعتباره المكون الرئيسي لـ C. tubulosa، يمنع نمو خلايا سرطان الجلد B 16- F1 0 من خلال تحريض موت الخلايا المبرمج عبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا (24). في الدراسة الحالية، تم دراسة التأثير المضاد للأورام لـ CTPG-W على خلايا Eca-109 وتم تحديد أن CTPG-W يثبط نمو خلايا Eca-109، ويسبب موت الخلايا المبرمج، وتوقف دورة الخلية. انخفاض Δψm، وزيادة إطلاق السيتوكروم ج والكاسبيزات المنشطة. CTPG وCTPG-W يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية في الخلايا السرطانية. ومع ذلك، تختلف الآليات الدقيقة بسبب المكونات المختلفة لـ CTPG (26.64% إيتشيناكوسيدي، 10.19% أكتيوسيدي، و1.71% إيزواكتيوسيدي) وCTPG-W (39.16% إيتشيناكوسيدي و2.44% أكتيوسيدي). اعتقل CTPG خلايا B16- F10 في المرحلتين G0/G1، لكن CTPG-W اعتقل خلايا Eca -109 في المرحلة S (24). تم زيادة إنتاج ROS اعتمادًا على الجرعة بواسطة CTPG، لكنه أشار إلى حدوث تغيير بطريقة تعتمد على الوقت بجرعة عالية من CTPG-W، والتي زادت بشكل ملحوظ في بداية علاج CTPG-W (2-6 ح) و انخفض بشكل ملحوظ بعد 12 ساعة، مقارنة مع السيطرة. أحد الأسباب المحتملة هو أن المكون الرئيسي لـ CTPG-W هو الإيتشيناكوسايد. ذكرت العديد من الدراسات أن الإكيناكوسيد يمكن أن يمنع إنتاج ROS وموت الخلايا المبرمج الناجم عن ROS لممارسة آثاره الوقائية العصبية ومكافحة الشيخوخة (38-40). وبالمثل، لوحظ نشاط مسح الجذور الحرة في هذه الدراسة. لذلك، تم التكهن بأن بعض المكونات، بما في ذلك فيرباسكوسيد، وإيزو-فيرباسكوسايد، وساليدروسيد في جرعة عالية من CTPG-W قد تحفز على الفور توليد ROS للتسبب في موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca-109 (41,42)، ومن ثم تم نبش ROS بواسطة echinacoside. سبب آخر محتمل للاختلافات في إنتاج ROS بواسطة CTPG وCTPG-W هو أنه تم استخدام خطوط خلايا مختلفة في هذه الدراسة والدراسة السابقة (24). أفاد Dong et al (43) أن الإكيناكوسيد يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج لخلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية SW480 من خلال توليد تلف الحمض النووي المؤكسد دون زيادة مستويات ROS.

أدى علاج CTPG-W إلى تقليل Δψm وتسبب في إطلاق السيتوكروم c، الذي يعزز انقسام الكاسبيز -9 (28). على نحو متسق، تم تنظيم مستويات الكاسبيز المشقوق -9 عن طريق علاج CTPG-W. بعد ذلك، يمكن لـ caspase -9 النشط تنشيط caspase -3 للحث على موت الخلايا المبرمج (44). تم أيضًا تنظيم مستويات الكاسبيز المشقوق-3 عن طريق علاج CTPG-W. ومع ذلك، لم يتم تنشيط كاسباس -8 بواسطة CTPG-W، مما يشير إلى أن مسار مستقبلات الموت الخارجي لم يشارك في موت الخلايا المبرمج الناجم عن CTPG-W. تشير هذه الملاحظات إلى أن CTPG-W يستحث موت الخلايا المبرمج لخلايا Eca-109 من خلال تنشيط مسار يعتمد على الميتوكوندريا.

يخدم PARP أدوارًا مهمة في الاستقرار الجيني ويمكن تقسيمه بواسطة الكاسبيزات النشطة، وخاصة الكاسبيز -3 و-7 (45). تم تحديد أن علاج CTPG-W ينشط الكاسبيز -3 و-7، والذي قد يلتصق PARP لمنع إصلاح الحمض النووي ويسبب موت الخلايا المبرمج.

يعمل CTPG-W أيضًا على إيقاف نمو خلايا سرطان الكبد البشري BEL -7404 بشكل يعتمد على الجرعة والوقت (بيانات غير منشورة). على الرغم من أن CTPG-W يمنع نمو خلايا Eca-109 وBEL-7404، فإنه يعزز تكاثر الخلايا الطحالية، والذي قد يكون بسبب محتوى السكريات (~ 50٪) في CTPG-W (46 ). وبالمثل، أفادت العديد من الدراسات أن السكريات يمكن أن تعزز تكاثر الخلايا الطحالية (46-49). في نموذج الفأر، تبين أن CTPG-W زاد بشكل كبير مؤشر الطحال، مقارنة بالمجموعة الضابطة، لكنه لم يؤثر على وزن الجسم ومؤشرات الأعضاء الأخرى بما في ذلك القلب والكبد والكلى والرئة (بيانات غير منشورة). مما يشير إلى أن CTPG-W ليس له أي تأثير سام للخلايا على الخلايا الطبيعية.

بشكل جماعي، أشارت البيانات إلى أن CTPG-W يمنع نمو خلايا Eca-109 عن طريق تحريض موت الخلايا المبرمج عبر مسار يعتمد على الميتوكوندريا

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%