يعمل سيستانوسيد من سيستانش هيربا على تحسين الضرر الإنجابي للذكور الناجم عن نقص الأكسجة عن طريق قمع الإجهاد التأكسدي-Ⅰ

مقدمة

في الوقت الحالي، يعاني ما يقرب من 48.5 مليون (15%) من الأزواج في سن الإنجاب في جميع أنحاء العالم من العقم، من بينهم 40-50% من الحالات تعزى إلى العقم عند الذكور، وهي حالة ترتبط بقوة بالعوامل البيئية ونمط الحياة. تشير الأدلة إلى أن تعرض خصية الثدييات لانخفاض ضغط الأكسجين هو عامل مسبب في بعض أشكال العقم عند الذكور. كما هو موضح في الدراسات السابقة، فإن تكوين الحيوانات المنوية يكون ضعيفًا وينخفض ​​عند التعرض لنقص الأكسجة تحت الضغط.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

لاستكشاف الآلية الأساسية، أظهرت الدراسات أن التعرض لنقص الأكسجة الناقص الضغط يزيد من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يلعب ROS دورًا مهمًا في الجهاز التناسلي الذكري. عند المستويات المنخفضة، تكون مطلوبة لتعزيز قدرة الحيوانات المنوية، وتفاعل الأكروسوم، واندماج الحيوانات المنوية والبويضة [10]. ومع ذلك، فإن الإفراط في أنواع الأكسجين التفاعلية يمكن أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي النووي/الميتوكوندريا للحيوانات المنوية وتلف بيروكسيدات غشاء البلازما، والتي تعد بدورها عوامل مسببة رئيسية للمرض.زيادة خطر العقم عند الذكور. وبالتالي، فإن تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية الناجم عن نقص الأكسجة قد يكون أحد أسباب العقم عند الذكور.

سيستانشس هربا، نبات طبي طفيلي معمر، ينتشر على نطاق واسع في المناطق القاحلة ويستخدم على نطاق واسع بسبب أنشطته الدوائية. من بين جميع المحتويات الفعالة لسيستانشس هربا، تعتبر PhGs العنصر النشط الرئيسي. حتى الآن، تم عزل 34 PhGs مننباتات السيستانش. سيستانوسيد(Cis)، وهو PhG نشط معزول عنسيستانشس هربا، وقد حظي بالاهتمام لآثاره المضادة للأكسدة.

بالنظر إلى التأثيرات المضادة للأكسدة لـ Cis ودور ROS في العقم عند الذكور الناجم عن نقص الأكسجة، يعتبر Cis مرشحًا محتملًا للأدوية لعلاجالعقم عند الذكور الناجم عن نقص الأكسجة. ومع ذلك، فقد تناولت تقارير قليلة تأثيرات مضادات الأكسدة لـ Cis المستخرج من Cistanches Herba في علاج العقم عند الذكور الناجم عن نقص الأكسجة أو مسارات الإشارة المعنية. في هذه الدراسة، تم بناء نماذج تجريبية لنقص الأكسجة في المختبر وفي الجسم الحي وتم تقييم مكونات تأثيرات رابطة الدول المستقلة المختلفة.

المواد والأساليب

ثقافة الخلية والكاشف

تم شراء خط خلايا الحيوانات المنوية للفأر GC-1spg (GC-1) من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC) وتم تربيته في DMEM (Invitrogen، الولايات المتحدة الأمريكية) مع إضافة 10% من مصل الأبقار الجنيني، 1% L- الجلوتامين (100 ملم)، والبنسلين (100 وحدة / مل)، والستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة في حاضنة مرطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تم شراء Cis (Cis-A، B، C، H) من Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (الصين).

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

فحص بقاء الخلية

تم اختبار صلاحية الخلية عن طريق فحص مجموعة عد الخلايا {{0}} (CCK -8). باختصار، تم زرع خلايا GC-1 في 96-صفائح بئر عند 1.5×103 لكل بئر، وتم زراعتها عند 37 درجة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة (20%، 15%، 10%، 5%) من الأكسجين أو بتركيزات مختلفة (2 ميكرومتر، 0.2 ميكرومتر، 0.02 ميكرومتر) من رابطة الدول المستقلة (Cis-A، Cis-B، Cis- C، Cis-H) للوقت المطلوب. بعد ذلك، تم التخلص من الطاف، وتم اكتشاف صلاحية الخلية باستخدام مجموعة CCK -8 (Dojindo Japan). تم قياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروية (BioRad USA). أخيرًا، تم حساب صلاحية الخلية وفقًا للصيغة التالية: صلاحية الخلية=(مجموعة OD التجريبية - مجموعة ODblank)/ (مجموعة ODcontrol - مجموعة ODblank) × 100%.

تحليل لطخة غربية

تم تجانس الخلايا أو الأنسجة المحصودة في محلول RIPA لاستخراج البروتينات (RIPA Beyotime China؛ Cocktail Roche Switzerland). تم جمع المواد الطافية واختبار تركيز البروتينات بواسطة طريقة BCA (Beyotime). تم فصل ما يقرب من 40 ميكروغرام من البروتينات المستخرجة من كل عينة بواسطة SDS-PAGE ونقلها كهربيًا إلى غشاء مرشح النيتروسليلوز (NC) (Beyotime China). تم حظر أغشية مرشح NC بحليب خالي الدسم بنسبة 5% لمدة 1.5 ساعة وتم تحضينها بأجسام مضادة محددة (anti-PARP 1:1000، antiCaspase-3 1:1000، anti-Bcl-2 1:1000، anti-Bax 1 :1000، مضاد GAPDH 1:1000؛ تم شراء جميع الأجسام المضادة من Cell Signaling Technology، الولايات المتحدة الأمريكية) طوال الليل عند 4 درجات. بعد ذلك، تم تحضين جميع أغشية NC مع الجسم المضاد الثانوي المصاحب لبيروكسيديز الفجل لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة وتم تصويرها باستخدام نظام التصوير (تانون، الصين).

الكشف عن دورة الخلية

تم إجراء فحص التدفق الخلوي (FCM) لتحليل دورة الخلية. تم علاج الخلايا في ظل ظروف مختلفة لمدة 72 ساعة وحصادها. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام PBS، وتثبيتها في 75٪ من الإيثانول، وملطخة بيوديد البروبيديوم (PI). لكل عينة، تم جمع 1 × 104 خلية وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (FACS Calibur، BD Biosciences). بعد ذلك، تم حساب نسبة خلايا الطور G1/S/G2 ومؤشر الانتشار [Phase(S+G2)/Phase(G1+S+G2) × 100%).

تلطيخ كي-67.

تم استزراع الخلايا في طبق متحد البؤر وعولجت بنقص الأكسجة أو أنواع فرعية مختلفة من رابطة الدول المستقلة لمدة 72 ساعة. بعد تثبيت جميع الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد بنسبة 4%، تم تحضينها بجسم مضاد لـ Ki-67 (1:200، تقنية تشوير الخلية). بعد ذلك، تم تحضين جميع الخلايا باستخدام الجسم المضاد IgG المترافق CY-3- المتوافق مع الأرانب (1:200، Boster، الصين) ومحلول DAPI (1.0 ميكروغرام/مل، Beyotime). وقد لوحظ الإسفار باستخدام مجهر متحد البؤر Fluoview FV1000 (أوليمبوس، اليابان).

مستخلص سيستانش توبولوسا من الدرجة الأولى لتعزيز هرمون التستوستيرون PHGS75% ECH 30% ACT 12%

الكشف عن ROS

تم تقديم FCM لقياس مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام DCFH-DA. تم زرع الخلايا المعلقة في 6-ألواح جيدة وإخضاعها لمعالجات مختلفة. بعد 72 ساعة من العلاج، تم تعليق الخلايا في DMEM خالي من المصل مع 10 ميكرومتر DCFH-DA (Beyotime). تم بعد ذلك تحديد محتويات ROS عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت على نظام قياس التدفق الخلوي بيكمان كولتر مع طول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 525 نانومتر [18].

تحديد بيروكسيد الدهون (LPO)

تم إجراء اختبار المواد التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) للكشف عن LPO. تم تنفيذ جميع خطوات التشغيل حسب تعليمات (Sigma USA). تم حساب التركيزات باستخدام معامل الانقراض المولي البالغ 1.56×105/(M·cm)، والذي تم الحصول عليه باستخدام المالونديالدهيد كمعيار. يتم التعبير عن النتائج على أنها نانومول من مكافئات MDA / ملغ من البروتين.

تحديد أنشطة الانزيم

تم اختبار أنشطة الإنزيم باستخدام مجموعات الفحص بما في ذلك الجلوتاثيون المختزل (GR)، والجلوتاثيون بيروكسيديز (GPx)، وديسموتاز الفائق أكسيد (SOD). تم تنفيذ جميع خطوات التشغيل وفقًا للتعليمات المقدمة (معهد Nan Jing Jian Cheng للهندسة الحيوية في الصين).

الحيوانات والبروتوكول التجريبي

تم الحصول على ذكور فئران ويستار الناضجة (180-220 جم، 8 وات) من مركز الحيوانات التابع للجامعة الطبية العسكرية الرابعة، شيان، الصين. تم الحصول على إذن لاستخدام الحيوانات من لجنة الأخلاقيات بالجامعة (الرقم المرجعي: 20190506). تم إجراء التجربة على الحيوانات وفقًا لإرشادات الجامعة الخاصة برعاية واستخدام حيوانات المختبر.

تم السماح لجميع الفئران بالتكيف لمدة أسبوع تقريبًا قبل بدء التجربة. بعد التأقلم، تم توزيع الفئران عشوائيا على 6 مجموعات بواقع 5 حيوانات في كل مجموعة. تم رفع الفئران في المجموعة الضابطة تحت الضغط الطبيعي (PO2: 20٪؛ ضغط الهواء: 101.3 كيلو باسكال)، في حين تم رفع الفئران في النموذج والمجموعات المعالجة بـ Cis في غرفة الأكسجين منخفض الضغط (الضغط الداخلي 61.6 كيلو باسكال). ، أي ما يعادل ارتفاع 4000 متر فوق مستوى سطح البحر؛ PO2: 14.55٪ لمحاكاة بيئة نقص الأكسجين على ارتفاعات عالية. تتمتع جميع الفئران بحرية الوصول إلى الطعام والماء في أقفاص بلاستيكية عند درجة حرارة 22 ± 2 وظروف رطوبة مع دورة الضوء / الظلام التلقائية 12- ساعة. ظلت الفئران في النموذج والمجموعات المعالجة بـ Cis تحت ظروف نقص الضغط ولكن تم نقلها إلى ظروف الضغط الطبيعي كل 96 ساعة، وفي ذلك الوقت تم توفير الغذاء والماء لهم وتنظيف الأقفاص. كانت مدة الانتقال من خافض الضغط إلى ناقص الضغط حوالي ساعتين. تمت معالجة جميع مجموعات العلاج باستخدام Cis المقابل (8 ملغم / كغم / يوم) عن طريق التغذية الفموية لمدة 8 أسابيع، في حين عولجت الفئران الضابطة والفئران النموذجية بكمية متساوية من الماء.

وبعد 8 أسابيع، تم التضحية بالفئران تحت التخدير. تم فصل ووزن الخصيتين والبربخ والحويصلات المنوية، وتم حساب مؤشر العضو وفق الصيغة التالية: (وزن العضو/وزن الحيوان) × 100%. بعد ذلك، تم جمع الحيوانات المنوية الموجودة في البربخ واختبار حركتها ونشاط إنزيم الأكروسوم. وبالمثل، تم جمع أنسجة الخصية للدراسات النسيجية والكشف عن نشاط إنزيم ROS وLPO ومضادات الأكسدة.

مستخلص سيستانش توبولوسا عشب سيستانش يزيد القوة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

تقييم معدل الحيوانات المنوية الحية

تم شق البربخ بمقص جراحي، وتم تحضير معلق الحيوانات المنوية في محلول ملحي طبيعي. لتقييم معدل الحيوانات المنوية الحية، تم خلط 5 ميكرولتر من معلق الحيوانات المنوية بعناية مع كمية متساوية من صبغة eosin-Y. ثم تم عد الحيوانات المنوية تحت المجهر الضوئي. تم تقييم معدلات الحيوانات المنوية الحية عن طريق حساب كل من الحيوانات المنوية الملطخة (الحيوانات المنوية الميتة) والحيوانات المنوية غير الملوثة (الحيوانات المنوية الحية).

تحديد نشاط انزيم الاكروسوم في الحيوانات المنوية

تم استخدام مقايسة نشاط إنزيم الأكروسوم في الحيوانات المنوية لتقييم إنزيمات الأكروسوم في الحيوانات المنوية [19]. تم حساب النتائج في كل مجموعة باستخدام الصيغة التالية: نشاط إنزيم الأكروسوم (μIU)=(مجموعة ODExperiment - مجموعة ODBlank)/(247.5×10) × 106.

نتائج

تأثيرات نقص الأكسجة على خلايا GC-1.

لتحديد تأثيرات نقص الأكسجة على الخلايا الجرثومية، قمنا أولاً بفحص التغيرات في قابلية الخلية للخلايا بعد علاج نقص الأكسجة بتركيزات مختلفة من الأكسجين (20%، 15%، 10%، و5%) لمدة 1، 3، 5 و7 أيام على التوالي. أظهرت نتائج اختبار CCK -8 أنه بالمقارنة مع مجموعة التحكم (تركيز الأكسجين بنسبة 20٪)، أظهرت الخلايا المعرضة لنقص الأكسجة انخفاضًا كبيرًا في قابلية البقاء (P <0.01؛ الشكل 1A). علاوة على ذلك، كان معدل بقائهم على قيد الحياة متناسبًا عكسيًا مع تركيز الأكسجين، كما انخفض مع مرور الوقت. لتجنب التأثير المفرط السام للخلايا، تم اختيار تركيز الأكسجين بنسبة 10% ووقت الحث 3-يوم كمعايير نموذج نقص الأكسجين للتجارب اللاحقة في المختبر.

بعد ذلك، تم إجراء FCM وتلطيخ المناعي لمواصلة تقييم تغيير تكاثر خلايا GC {{0}} تحت علاج نقص الأكسجة. أظهرت النتائج أن نقص الأكسجة يمكن أن يؤدي إلى توقف خلايا GC-1 في الطور G1، وبالتالي تقليل دخول الخلية إلى الطور S وتثبيط تكرار الحمض النووي. وبالتالي، أدى نقص الأكسجة إلى انخفاض كبير في مؤشر انتشار خلايا GC -1 (P <0.01؛ الشكل 1B). يعد تلطيخ Ki -67 الإيجابي علامة حيوية محددة أخرى للخلايا المتكاثرة. لذلك، قمنا أيضًا بفحص نسبة الخلايا الإيجابية Ki-67- مع أو بدون علاج نقص الأكسجة. بالمقارنة مع مجموعة التحكم، أدى علاج نقص الأكسجة إلى تقليل الخلايا الإيجابية Ki-67- بشكل ملحوظ، كما هو موضح في الشكل 1C.

بعد ذلك، كنا نهدف إلى استكشاف وضع تثبيط صلاحية الخلية GC{{0}} الناجم عن نقص الأكسجة. كما ورد في الأدبيات، ارتفع مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية عندما تعرضت الفئران لبيئة نقص الأكسجين في الضغط [8، 20]. وبالتالي، تم قياس مستويات ROS الداخلية في خلايا GC -1 باستخدام اختبار FCM. وأظهرت النتائج ارتفاع مستويات ROS تحت نقص الأكسجة بالمقارنة مع مجموعة الأكسجين العادية (P <0.01؛ الشكل 1D). يسبب ROS المتراكم ضعفًا ملحوظًا في الحمض النووي، والذي بدوره يؤدي إلى تنشيط مسار موت الخلايا المبرمج وقد يكون العامل المسبب الرئيسي لزيادة خطر العقم عند الذكور [21، 22]. بعد ذلك، اكتشفنا تأثير تنشيط موت الخلايا المبرمج لنقص الأكسجة على خلايا GC -1 عن طريق تلطيخ TUNEL. كما هو مبين في الشكل 1E، أدى العلاج بنقص الأكسجة إلى زيادة في مضان TUNEL مقارنة بالمجموعة الضابطة، مما يشير إلى زيادة في موت الخلايا المبرمج في المجموعة النموذجية.

نظرًا لأن تلف الخلايا الناجم عن ROS يحدث عادةً بسبب نظام التشغيل، فقد قمنا باختبار نظام تشغيل خلايا GC-1 أيضًا. كما هو موضح في الشكل 1F، تمت زيادة مستويات LPO لخلايا GC -1 في المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ مقارنة بمستويات LPO لخلايا GC -1 في مجموعة التحكم. تشير هذه النتائج إلى أن إصابة خلايا GC -1 الناجمة عن نقص الأكسجة قد تكون مرتبطة بنظام التشغيل، والذي يحدث بسبب تراكم ROS.