الاستنساخ والتحديد الوظيفي وتحليل التعبير لسينثاز تشالكون من Cistanche Tubulosa

الملخص: الهدف دراسة وظيفة سينسيز الكالكون من نبات Guanhuaroucongrong (سيستانش توبولوسا) ونمط التعبير عن جين CtCHS في الزهور البيضاء والحمراء والأرجوانية.

الطرق تم استنساخ جين CtCHS بواسطة RT-PCR وتم إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية. تم نقل البلازميد pET-28a-CtCHS إلى الإشريكية القولونية للحث على التعبير البروتيني بواسطة IPTG. تم تحضين البروتين المؤتلف CtCHS مع الركائز p-coumaroyl CoA وmalonyl CoA، وتم اكتشاف المنتجات بواسطة HPLC وMS. تم نقل البلازميد pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS إلى البروتوبلاست من Arabidopsis thaliana لمراقبة التوطين تحت الخلوي لبروتين CtCHS. نمط التعبير عن CtCHSgene في زهورجيم توبولوساتم اكتشاف ثلاثة ألوان بواسطة qRT-PCR.

النتائج: تم استنساخ جين CtCHS. كان طول إطار القراءة المفتوحة (ORF) 1173 نقطة أساس، مشفرًا 390 حمضًا أمينيًا، وكان الوزن الجزيئي للبروتين 42 8000. يحتوي CtCHS على البقايا الحفزية Cys164، His303، Asn336، والتي تم حفظها في سينسيز الكالكون. تم التعبير عن بروتين CtCHS في E. coli وتنقيته للحصول على البروتين المؤتلف. يمكن لبروتين CtCHS أن يحفز p-coumaroyl CoA و malonyl CoA لإنتاج شالكون نارينجينين. تم ترجمة بروتين CtCHS بشكل رئيسي في السيتوبلازم. تم التعبير عن جين CtCHS بشكل كبير في الزهور الأرجوانية والحمراء، وكانت مستويات التعبير النسبي أعلى بـ 8.44 و3.21 مرة من تلك الموجودة في الزهور البيضاء، على التوالي.

الاستنتاج: تم استنساخ جين CtCHS من زهرةجيم توبولوساوتم التعبير عن البروتين. يحتوي بروتين CtCHS على وظيفة سينسيز الكالكون، ويكون التعبير عن جين CtCHS أعلى في الزهور الداكنة، مما يشير إلى أن جين CtCHS قد ينظم لون زهرة C. tubulosa، مما يضع الأساس لمزيد من البحث حولآلية تنظيم لون زهرة C. tubulosa.

الكلمات الدالة:Cistanche tubulosa (شينك) وايت; سينسيز كالكون. تحليل نشاط الانزيم. توطين تحت الخلوي. تحليل التعبير

انقر هنا للحصول على مستخلص سيستانش عضوي طبيعي يحتوي على 30% من الإكيناكوسيد و12% من الأكتيوسايد.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com٪2FCISTANCHE-shop

الاصطناعية الحيويةمسار الفلافونويداتيبدأ بمسار فينيل بروبانويد.فينيل ألانينيتم تحويله أولاً إلى حمض السيناميك تحتعمل فينيل ألانين الأمونياليز(PAL)، ويتم هيدروكسيل حمض السيناميك 4-بواسطة حمض السيناميك. يحفز الإنزيم (حمض السيناميك -4- هيدروكسيلاز، C4H) و4- الإنزيم الكوماراتي A ليجاز (4- الإنزيم الكوماراتي A ليجاز، 4CL) التفاعل لتوليد 4- الكومارويل-CoA [11 ]. يتم تحفيز جزيء واحد من 4- الكومارويل-CoA وثلاثة جزيئات من المالونيل-CoA بواسطة سينسيز الكالكون (CHS) لتوليد شالكون نارينجينين، الذي يحتوي على مركبات فلافونويد. الهيكل الأساسي لإيزوميراز الكالكون، فلافانون-3-هيدروكسيلاز، يولد ثنائي هيدروفلافونول 4- اختزال، وما إلى ذلك مجموعة متنوعة من مركبات الفلافونويد مثل الايسوفلافون، والفلافونول، والأنثوسيانين، وما إلى ذلك. [12]. باعتباره إنزيمًا رئيسيًا في مسار التخليق الحيوي للفلافونويد، ينظم CHS محتوى الفلافونويد في النباتات ويلعب أيضًا دورًا مهمًا في تنظيم لون زهرة النبات [13]. على سبيل المثال، يمكن لإسكات الجينات بعد النسخ في Gentiana Scabra Bunge CHS أن يمنع التخليق الحيوي للأنثوسيانين ويسبب تبييضًا محددًا لفصوص الكورولا [14]. إسكات جينات CHS لـ Actinidia erianthaBenth. يقلل CHS من محتوى الأنثوسيانين في البتلات ويجعل البتلات حمراء. تصبح البتلات أفتح في اللون[15]. لذلك، في هذه الدراسة، تم استنساخ جين CtCHS من زهور Cistanche tubulosa، وتم إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية والتعبير وتنقية بدائيات النواة وتحليل نشاط الإنزيم وتحليل التوطين تحت الخلوي وتحليل التعبير في ثلاثة ألوان من الزهور لاستكشاف وظيفة CtCHS تم استخدام البروتين ونمط التعبير عن جين CtCHS لاستكشاف العلاقة بين CtCHS ولون زهرة Cistanche tubulosa بشكل مبدئي، مما وضع الأساس لدراسة الآلية التنظيمية لـ CtCHS ولون زهرة Cistanche tubulosa.لون زهرة Cistanche tubulosa.

1 المواد والأدوات

1.1 المواد

تم جمع زهور Cistanche tubulosa من مقاطعة يوتيان، محافظة Hotan، شينجيانغ في مايو 2018. وتم اتباع المبدأ العشوائي أثناء أخذ العينات، وتم اختيار زهور Cistanche tubulosa ذات الحالة الفسيولوجية الجيدة وارتفاع النبات الثابت. تم أخذ ثلاث سلالات من Cistanche tubulosa بثلاثة ألوان من الزهور هي الأبيض والأحمر والأرجواني وتم تحديدها على أنها Cistanche tubulosa (Schenk) Wight بواسطة البروفيسور تو بنغفي من كلية الصيدلة بجامعة بكين. تم تجميدها بسرعة في النيتروجين السائل ثم نقلها إلى بكين في مخزن الثلج الجاف. تم شراء خلايا E. coli DH5 المختصة كيميائيًا من شركة Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd.، وتم شراء خلايا E. coli BL21 (DE3) المختصة كيميائيًا من شركة Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.؛ pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP تم شراء المتجه من شركة Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. وتم شراء Malonyl-CoA من شركة Sigma, 4- coumaroyl-CoA, naringenin - تم شراء الكالكون من شركة Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.، وتم شراء النارينجينين من شركة Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 الأدوات

مقياس الطيف الضوئي Nanodrop 2000C (شركة Thermo Fisher، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ أداة PCR التدرج (شركة إيبندورف، ألمانيا)؛ أداة PCR الكمية الفلورية CFX 96، جهاز تصوير جل UVP، أداة الفصل الكهربائي للهلام، أداة التحليل الكهربائي للبروتين (شركة BioRad، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ EnSpire

قارئ صفيحة ميكروية (شركة PerkinElmer، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ حاضنة درجة حرارة ثابتة (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.)؛ مذبذب DHZ-D ذو سعة كبيرة ودرجة حرارة كاملة (مصنع Taicang للمعدات التجريبية)؛ THZ-82مذبذب درجة حرارة ثابتة للحمام المائي (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); منضدة العمل فائقة النظافة AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.)؛ ومعقم بخاري عالي الضغط (شركة TOMY، اليابان)؛ أداة المياه النقية Milli Q (ميليبور، الولايات المتحدة)؛ LC-20جهاز كروماتوجرافيا الطور السائل عالي الكفاءة (شركة شيمادزو، اليابان)؛ UPLC-Q-Exactive-Orbitrap قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (شركة Thermo Fisher، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ مجهر ليزر FV1200 متحد البؤر (شركة أوليمبوس، اليابان).

2 الطرق التجريبية

2.1 استخراج الحمض النووي الريبي وتوليف [كدنا]

تم طحن زهور Cistanche tubulosa في النيتروجين السائل ثم إخضاعها لفحص استخلاص الحمض النووي الريبي (RNA).

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام مجموعة (Norgen، Cat 17200)، وتم اكتشاف تركيز الحمض النووي الريبي وجودته بواسطة NanoDrop 2000C، وتم اختيار عينات الحمض النووي الريبي (RNA) بنسبة A260 / A280 بين 1.8 و2.1 للنسخ العكسي لتجميع [كدنا]. تم استخدام النسخ العكسي M-MLV (Promega، M170B) لعكس نسخ الحمض النووي الريبي الكلي المؤهل إلى cDNA. تم تنفيذ العمليات التجريبية وفقا للتعليمات.

2.2 استنساخ جين CtCHS

استنادًا إلى بيانات نسخة زهرة Cistanche tubulosa الخاصة بمجموعتنا البحثية [16]، تم فحص CtCHS مع إطار قراءة مفتوح كامل، وتم استخدام برنامج SnapGene لتصميم بادئات محددة بناءً على تسلسل الجينات (الجدول 1). تم إجراء تضخيم PCR باستخدام Cistanche tubulosa زهرة [كدنا] كقالب. كان نظام التضخيم 2 × Phanta Max Buffer 25 ميكرولتر، dNTPMix (10 مليمول / لتر) 1 ميكرولتر، الاشعال المنبع والمصب (10 ميكروليتر / لتر) 2 ميكرولتر لكل منهما، cDNA 2 ميكرولتر، Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 ميكرولتر، ddH2O 17 ميكرولتر. كانت ظروف التفاعل هي: التسخين المسبق عند 95 درجة لمدة 3 دقائق؛ 25 دورة تمسخ عند 95 درجة لمدة 15 ثانية، التلدين عند 55 درجة لمدة 15 ثانية، والتمديد عند 72 درجة لمدة دقيقة واحدة؛ تمديد التفاعل عند 72 درجة لمدة 5 دقائق. تم الكشف عن منتج PCR بواسطة رحلان كهربائي لهلام الاغاروز بنسبة 1٪، وتم استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (Novizan، Cat DC 301-01) لاستعادة الهلام، ثم تمت تنقية الحمض النووي المستعاد بواسطة مجموعة استنساخ سريعة (Novizan، Cat ج601-01). تم ربط جزء الحمض النووي باستخدام ناقل pCE2TA/Blunt-Zero، وتم تحويله إلى خلايا مختصة ببكتيريا Escherichia coli DH5، وبعد زراعتها طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة، تم اختيار سلالات استنساخ واحدة وإرسالها إلى الشركة لتسلسلها.

الجدول بالحجم الكامل

2.3 تحليل المعلوماتية الحيوية

استخدام برنامج ProtParam عبر الإنترنت لتحليل الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبروتين؛ استخدم أداة Prot Scale عبر الإنترنت لتحليل محبة البروتين للماء/كراهية الماء؛ استخدام أداة SOPMA عبر الإنترنت للتنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين؛ استخدام برنامج التحليل عبر الإنترنت SWISS-MODEL للتنبؤ بالبنية الثلاثية للبروتين؛ استخدم البرنامج عبر الإنترنت TMHMM توقع بنية الغشاء البروتيني؛ استخدام برنامج DNAMAN لمقارنة تماثل CtCHS مع تسلسل الأحماض الأمينية CHS للأنواع الأخرى؛ استخدم برنامج MEGA-X لإنشاء شجرة النشوء والتطور باستخدام ربط الجوار (NJ) وتصحيح بواسون. يتم حساب المسافة التطورية باستخدام طريقة Bootstrap، وعدد تكرارات Bootstrap هو 1000 مرة.

2.4 تعبير وتنقية CtCHS بدائية النواة

كبسولة تفجير التصميم مع مواقع التقييد BamHⅠ وXhoⅠ استناداً إلى تسلسل CtCHS، وPCR تضخيم الأجزاء المستهدفة المقابلة. تم هضم ناقل pET-28 والجزء المستهدف باستخدام نوكليازات داخلية BamHI ويتم تسلسل السلالة المستنسخة، ويتم استخراج البلازميد بعد التسلسل الصحيح. تم نقل البلازميد pET-28 a-CtCHS الذي تم التحقق منه بالتسلسل إلى الخلايا المختصة بالإشريكية القولونية BL21 (DE3). الرجوع إلى طريقة دينغ نينغ وآخرون. [17] مع الأيزوبروبيل

- تم استخدام D-thiogalactopyranoside (IPTG) للحث على التعبير البروتيني عند درجة حرارة منخفضة وتمت تنقيته من خلال عمود كروماتوجرافيا التقارب Ni2+ (Cytiva، Cat 17531901). تم تركيز البروتين بواسطة الطرد المركزي في أنبوب الترشيح الفائق (Millipore، 30 000) وتم تحليته. قم بالتخزين في المخزن المؤقت 20 مليمول/لتر KPB (الرقم الهيدروجيني 8.0، الذي يحتوي على 1 مليمول/LEDTA) وتخزينه في ثلاجة -80 درجة للتخزين على المدى الطويل.

2.5 تحليل نشاط إنزيم CtCHS

نظام تفاعل إنزيم CtCHS: 100 مليمول/لتر KPB (الرقم الهيدروجيني 7.5) 468 ميكرولتر، 1 مليمول/لتر malonyl-CoA 10 ميكرولتر، 5 مليمول/لتر 4- الكومارويل-CoA 2 ميكرولتر، CtCHS المؤتلف بروتين 20 ميكرولتر، بعد التفاعل في حمام مائي عند 37 درجة لمدة 12 ساعة، تم استخلاص الخليط ثلاث مرات مع 800 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل، وتجفيفه بتدفق النيتروجين، ثم إذابته في 100 ميكرولتر من الميثانول. استخدم التحليل اللوني السائل عالي الأداء للكشف عن المنتج. الشروط هي عمود LP-C18 النهائي (250 مم × 4.6 مم، 5 ميكرومتر)، ودرجة حرارة العمود 30 درجة، وحجم العينة 10 ميكرولتر، والماء (A) والأسيتونيتريل (B) كالتدفق. المرحلة، شطف التدرج: 0 ~ 10

دقيقة، 30% ب؛ 10 ~ 20 دقيقة، 30% ~ 60% ب؛ 20 ~ 25 دقيقة، 60% ~ 70% ب؛ 25 ~ 30 دقيقة، 70% ~ 80% ب؛ 30~35 دقيقة، 80%~100% ب؛ 35-40 دقيقة، 100% ب؛ 40-46 دقيقة، 100%-30% B. معدل التدفق الحجمي هو 1 مل/دقيقة ويتم الكشف عند طول موجة 290 نانومتر.

تم استخدام UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS لمزيد من الكشف. كانت ظروف الطور السائل هي عمود Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 مم × 3.0 مم، 1.7 ميكرومتر)، ودرجة حرارة العمود 40 درجة، نارينجينين- ضوابط الكالكون والنارينجين. حجم التحميل للمنتج هو 4 ميكرولتر، وحجم التحميل لمنتج تفاعل الإنزيم هو 7 ميكرولتر. يتم استخدام الماء (A)-الأسيتونيتريل (B) كمرحلة متنقلة. التدرج شطف هو: 0 إلى 5 دقائق، 30% ب؛ 5 إلى 15 دقيقة، 30%-60% ب؛ 15-20 دقيقة، 60%-100% ب؛ 20-25 دقيقة، 100% ب؛ 25-31 دقيقة، 100%-30% B. معدل التدفق الحجمي هو 0.3 مل/دقيقة. ظروف قياس الطيف الكتلي هي مصدر أيون الرذاذ الكهربائي، النيتروجين كغاز حامل، ضغط الغاز الغمد 3.5 ميجا باسكال، ضغط الغاز المساعد 1.0 ميجا باسكال، ضغط الرش 3500 فولت، درجة حرارة الشعرية 350 درجة، درجة حرارة تسخين الغاز المساعد 200 درجة، أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة، المسح نطاق الأيونات m/z هو 100-1500، دقة MS الكاملة هي 35 000، دقة dd-MS2 هي 17 500، (N)

CE/steped nce مضبوط على 35، 60.

2.3 تحليل المعلوماتية الحيوية

استخدام برنامج ProtParam عبر الإنترنت لتحليل الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبروتين؛ استخدم أداة Prot Scale عبر الإنترنت لتحليل محبة البروتين للماء/كراهية الماء؛ استخدام أداة SOPMA عبر الإنترنت للتنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين؛ استخدام برنامج التحليل عبر الإنترنت SWISS-MODEL للتنبؤ بالبنية الثلاثية للبروتين؛ استخدم البرنامج عبر الإنترنت TMHMM توقع بنية الغشاء البروتيني؛ استخدام برنامج DNAMAN لمقارنة تماثل CtCHS مع تسلسل الأحماض الأمينية CHS للأنواع الأخرى؛ استخدم برنامج MEGA-X لإنشاء شجرة النشوء والتطور باستخدام ربط الجوار (NJ) وتصحيح بواسون. يتم حساب المسافة التطورية باستخدام طريقة Bootstrap، وعدد تكرارات Bootstrap هو 1000 مرة.

2.4 تعبير وتنقية CtCHS بدائية النواة

كبسولة تفجير التصميم مع مواقع التقييد BamHⅠ وXhoⅠ استناداً إلى تسلسل CtCHS، وPCR تضخيم الأجزاء المستهدفة المقابلة. تم هضم ناقل pET-28 والجزء المستهدف باستخدام نوكليازات داخلية BamHI ويتم تسلسل السلالة المستنسخة، ويتم استخراج البلازميد بعد التسلسل الصحيح. تم نقل البلازميد pET-28 a-CtCHS الذي تم التحقق منه بالتسلسل إلى الخلايا المختصة بالإشريكية القولونية BL21 (DE3). الرجوع إلى طريقة دينغ نينغ وآخرون. [17] مع الأيزوبروبيل

- تم استخدام D-thiogalactopyranoside (IPTG) للحث على التعبير البروتيني عند درجة حرارة منخفضة وتمت تنقيته من خلال عمود كروماتوجرافيا التقارب Ni2+ (Cytiva، Cat 17531901). تم تركيز البروتين بواسطة الطرد المركزي في أنبوب الترشيح الفائق (Millipore، 30 000) وتم تحليته. قم بالتخزين في المخزن المؤقت 20 مليمول/لتر KPB (الرقم الهيدروجيني 8.0، الذي يحتوي على 1 مليمول/LEDTA) وتخزينه في ثلاجة -80 درجة للتخزين على المدى الطويل.

2.5 تحليل نشاط إنزيم CtCHS

نظام تفاعل إنزيم CtCHS: 100 مليمول/لتر KPB (الرقم الهيدروجيني 7.5) 468 ميكرولتر، 1 مليمول/لتر malonyl-CoA 10 ميكرولتر، 5 مليمول/لتر 4- الكومارويل-CoA 2 ميكرولتر، CtCHS المؤتلف بروتين 20 ميكرولتر، بعد التفاعل في حمام مائي عند 37 درجة لمدة 12 ساعة، تم استخلاص الخليط ثلاث مرات مع 800 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل، وتجفيفه بتدفق النيتروجين، ثم إذابته في 100 ميكرولتر من الميثانول. استخدم التحليل اللوني السائل عالي الأداء للكشف عن المنتج. الشروط هي عمود LP-C18 النهائي (250 مم × 4.6 مم، 5 ميكرومتر)، ودرجة حرارة العمود 30 درجة، وحجم العينة 10 ميكرولتر، والماء (A) والأسيتونيتريل (B) كالتدفق. المرحلة، شطف التدرج: 0 ~ 10

دقيقة، 30% ب؛ 10 ~ 20 دقيقة، 30% ~ 60% ب؛ 20 ~ 25 دقيقة، 60% ~ 70% ب؛ 25 ~ 30 دقيقة، 70% ~ 80% ب؛ 30~35 دقيقة، 80%~100% ب؛ 35-40 دقيقة، 100% ب؛ 40-46 دقيقة، 100%-30% B. معدل التدفق الحجمي هو 1 مل/دقيقة ويتم الكشف عند طول موجة 290 نانومتر.

تم استخدام UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS لمزيد من الكشف. كانت ظروف الطور السائل هي عمود Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 مم × 3.0 مم، 1.7 ميكرومتر)، ودرجة حرارة العمود 40 درجة، نارينجينين- ضوابط الكالكون والنارينجين. حجم التحميل للمنتج هو 4 ميكرولتر، وحجم التحميل لمنتج تفاعل الإنزيم هو 7 ميكرولتر. يتم استخدام الماء (A)-الأسيتونيتريل (B) كمرحلة متنقلة. التدرج شطف هو: 0 إلى 5 دقائق، 30% ب؛ 5 إلى 15 دقيقة، 30%-60% ب؛ 15-20 دقيقة، 60%-100% ب؛ 20-25 دقيقة، 100% ب؛ 25-31 دقيقة، 100%-30% B. معدل التدفق الحجمي هو 0.3 مل/دقيقة. ظروف قياس الطيف الكتلي هي مصدر أيون الرذاذ الكهربائي، النيتروجين كغاز حامل، ضغط الغاز الغمد 3.5 ميجا باسكال، ضغط الغاز المساعد 1.0 ميجا باسكال، ضغط الرش 3500 فولت، درجة حرارة الشعرية 350 درجة، درجة حرارة تسخين الغاز المساعد 200 درجة، أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة، المسح نطاق الأيونات m/z هو 100-1500، دقة MS الكاملة هي 35 000، دقة dd-MS2 هي 17 500، (N)

CE/steped nce مضبوط على 35، 60.

2.6 التوطين تحت الخلوي لبروتين CtCHS

استنادًا إلى تسلسل CtCHS ومبدأ الاستنساخ السلس، تم تصميم البادئات مع مواقع قطع الإنزيمات Kpn Ⅰ وBamH Ⅰ، وتم تضخيم الأجزاء المستهدفة المقابلة بواسطة PCR. تم هضم بلازميد pCAMBIA1300-35S-GFP باستخدام نوكليازات داخلية مقيدة Kpn Ⅰ وBamH Ⅰ، وتم توصيل الجزء المستهدف والمتجه من خلال مجموعة الاستنساخ السلس (Novizan, Cat C115-01)، ثم نقلهما إلى خلايا E. coli DH5 المختصة. ، حدد سلالات استنساخ واحدة للتسلسل، واستخراج البلازميدات من السلالات الصحيحة. تم تحويل البلازميدات pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS وpCAMBIA 1300-35S-GFP إلى بلاستات أرابيدوبسيس ثاليانا الأولية باستخدام PEG4000، وتم تربيتها تحت الإضاءة المنخفضة لمدة 8 إلى 10 ساعات. وقد لوحظ توطين البروتين CtCHS تحت الخلوي تحت مجهر الليزر متحد البؤر.

2.7 تحليل نمط التعبير CtCHS

تم تصميم الاشعال الكمي الفلورسنت في الوقت الحقيقي باستخدام DNAMAN استنادًا إلى تسلسل CtCHS، مع F-box باعتباره الجين المرجعي الداخلي. يتم عرض تسلسلات التمهيدي في الجدول 1. تم الكشف عن التعبير النسبي لـ CtCHS في زهور Cistanche tubulosa بألوان مختلفة بواسطة PCR الكمي الفلورسنت في الوقت الحقيقي. استخدم TransStart Green qPCR SuperMix (الذهب الكامل، AQ 101-02) للقياس باستخدام طريقة صبغ الفلورسنت SYBRGreen. نظام التفاعل: 2 × TransStartGreen qPCR SuperMix 5 ميكرولتر، الاشعال المنبع والمصب (1 0 ميكرومول / لتر) 0.2 ميكرولتر لكل منهما، قالب cDNA 0.5 ميكرولتر، تم استخدام 4.1 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليوتيداز للتفاعل باستخدام طريقة من خطوتين. استند إجراء التفاعل إلى طريقة Dong Xianjuan et al. [18]. احتوت كل عينة على 3 مكررات بيولوجية، وتم تكرار التجربة ثلاث مرات. تم تحليل البيانات التجريبية باستخدام Excel، وتم حساب التعبير النسبي لـ CtCHS باستخدام طريقة 2−ΔΔCt، وتم استخدام GraphPadPrism 8 لإجراء تحليل الأهمية ورسم الرسوم البيانية.