ينظم تعبير Clr‑f توازن الكلى والتمثيل الغذائي

مناقشة

الالتهابات والخلايا المناعية بوساطةيلعب الضرر دورًا رائدًا في تطور وتطور الإصابة والخلل الكلوي. في هذه الدراسة، قمنا بالإبلاغ عن متطلبات Clr-f في صيانةصحة الكلىوالوظيفةكعنصر تحكم متجانس جوهري ضدتلف الكلى المناعي والتمثيل الغذائي. تظهر النتائج التي توصلنا إليها تسلل الخلايا المناعية، وترسب الغلوبولين المناعي والبروتين المكمل في كليتي الفئران التي تعاني من نقص Clr-f. تقترن هذه السمات المناعية للفئران التي تعاني من نقص Clr-f بالمظهر المرتبط بالعمر للآفات الأنبوبية والكبيبية، وتراكم الدهون خارج الرحم، وخلل تنظيم العديد من عمليات النسخ.

انقر لcistancheherba لأمراض الكلى

كانت بروتينات Clr المشفرة داخل NKC بين مستقبلات NKR-P1 المرتبطة وراثيًا هي محور الدراسة باعتبارها وسطاء مستقلين من فئة MHC غير زائدة عن الحاجة للتعرف على الذات المفقودة بواسطة NKR-P1 معبرًا عن الخلايا المناعية 9،27-31. تم الإبلاغ أيضًا عن أن التعبير المتزايد عن بروتينات Clr المحددة استجابةً لإجهاد الخلية يؤدي إلى تقييد الاستجابات المناعية للخلايا المناعية المقيمة في الأنسجة وظيفيًا 7،12،32. وفقًا لذلك، تم افتراض أن Clr-f المعوي يساهم في التحمل المناعي داخل بيئة الأمعاء شديدة المناعة من خلال تفاعله مع الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة المثبطة لمستقبلات NKR-P1G. العمل الذي قام به ليبيلت وآخرون. أظهر أن الفئران التي تم تحديها باستخدام poly (I: C) أظهرت زيادة في تعبير Clr-f وأن تفاعلات Clr-f / NKR-P1G في المختبر مثبطة بقوة لخلايا التعبير NKR-P1G. يمكن تفسير هذه النتائج معًا على أنها آلية محتملة يمكن من خلالها أن يمنع Clr-f تفاعل المجموعات الفرعية الإيجابية NKR-P1G داخل الظهارة المعوية تجاه الحاجز الظهاري الذي يتم استفزازه باستمرار بواسطة المحفزات الميكروبية 7 .

لقد أتاح لنا جيل الفئران التي تعاني من نقص Clr-f الفرصة الأولى لتقييمالآثار الوظيفيةمن تعبير Clr-f في الجسم الحي وسمحت لنا بالتحقيق في الأدوار المتوازنة المناعية المحتملة لـ Clr-f في الكلى. يتوافق تلف الكلى الذي لوحظ في الفئران Clr-f−/− مع النموذج الذي يشير إلى أن تقليل تنظيم Clr-f يعمل كمؤشر على إجهاد الخلية والإصابة التي تطلق قيودًا على الخلايا الفعالة المعبرة عن NKR-P1G. تشير الزيادة في NKR-P1G على الخلايا التائية في كليتي الفئران Clr-f−/− إلى أن تعبير NKR-P1G يزداد بين الخلايا التائية المقيمة في الكلى في غياب Clr-f، أو أن كليتي Clr-f- تتعرض الفئران f - / - لتسلل الخلايا التائية المعبرة عن NKR-P1G. قد يشير عدم وجود تغيير يمكن اكتشافه في وجود أو توزيع الخلايا المعبرة عن NKR-P1G في أمعاء الفئران Clr-f−/− إلى أن العواقب الوظيفية لتفاعل NKR-P1G: Clr-f في القناة الهضمية محدودة للسيطرة على التفاعل المناعي في سياق العدوى بدلا من التحمل المناعي. وبدلاً من ذلك، قد تتحكم التفاعلات الزائدة أيضًا في نشاط الخلايا المعبرة عن NKR-P1G. ويدعم ذلك النتائج التي تشير إلى أن NKR-P1G لا يرتبط بـ Clr-f فحسب، بل يرتبط أيضًا بـ Clr-d وClr-g33، حيث يتم التعبير عن الأخير بشكل معتدل في أنسجة كل من الكلى والأمعاء6. بينما تكشف النتائج التي توصلنا إليها عن حاجة Clr-f للحماية من تلف الكلى المناعي الذاتي، فإن الدور الذي يتوسطه NKR-P1G في أمراض الكلى المناعية الذاتية لدى الفئران Clr-f−/− غير مكتمل. والجدير بالذكر أنه على الرغم من وجود زيادة في الخلايا التائية المعبرة عن NKR-P1G في كلية الفئران Clr-f−/−، إلا أن الفرق مخيب للآمال. من الممكن أن يشارك مستقبل بديل في مراقبة Clr-f في الكلى. لمعالجة محور التحكم هذا بشكل كامل في توازن الكلى، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات

يتجلى تلف الكلى بوساطة المناعة عن طريق تسلل الخلايا الالتهابية إلى الفضاء الخلالي أو إلى الكبيبة . التراكمات الكلوية للخلايا الوحيدة والخلايا B وT والأجسام المضادة للكبيبات والسيتوكينات المرتفعة IL-12 وIFN والأمراض الكبيبية المختلفة في الفئران Clr-f−/− تشبه إلى حد كبير مشهد المناعة الذاتية لنماذج الفأر LN ( أي MRL-Faslpr) 35–37. على الرغم من أن الكلى Clr-f−/− تظهر رواسب مسراق الكبيبات المهيمنة IgA مع ترسبات IgM وIgG المرتبطة بها، وتجميع ملفات تعريف النسخ Clr-f−/− وIgAN، فمن المحتمل أن يكون من السابق لأوانه الإشارة إلى أن هذه الأنماط الظاهرية تشير إلى نوع من كد مع IgAN38. بدلاً من ذلك، فإن هذه الإصابات، إلى جانب وجود انحلال الأوعية الدموية المتوسطة، وسماكة GBM، وموت الخلايا الرجلية في الكلى Clr-f−/− بالإضافة إلى التغيرات الأنبوبية الخلالية، وتراكم الدهون، والخلل الكبير في التنظيم في المسارات الأيضية هي عناصر شائعة في مجموعة متنوعة من الأمراض. المستمدة من العيوب الأيضية التي تفاقمت بسبب الجهاز المناعي . بغض النظر عن السبب الكامن أو نوع المرض لخلل وظائف الكلى Clr-f -/−، يبدو أن Clr-f يلعب دورًا مخففًا ضد تطور المناعة الذاتية مع أمراض واضحة مرتبطة بالتهاب كبيبات الكلى.

يشير فحصنا للفئران Rag1−/−Clr-f−/− إلى مساهمة بارزة للوسطاء المستقلين عن الخلايا T وB في استجابات المناعة الذاتية للفئران Clr-f−/−. على وجه الخصوص، كان تراكم خلايا CD11c+ المحيطة بالكبيبات وخلايا F4/80+ وخلايا NKp46+ أكثر وضوحًا في غياب الخلايا التائية والبائية وارتبط بوجود كبير للتلف الكبيبي. يشير هذا إلى أنه على الرغم من أن الخلايا التائية والبائية يمكن أن تساهم في الالتهاب المدمر للكلى ومجمعات الأجسام المضادة الذاتية، إلا أنها في الفئران Clr-f−/− قد لا تكون محددات مركزية لعلم الأمراض، ولكنها إما مساهمات ثانوية في النشاط الالتهابي للخلايا المناعية الأخرى أو ربما تكون مساهمات ثانوية في النشاط الالتهابي للخلايا المناعية الأخرى. يخدم دورًا تنظيميًا مناعيًا في الفئران التي تفتقر إلى Clr-f. يتناقض هذا مع الأدلة من نموذج الفأر ddY الخاص بـ IgAN والذي يُظهر استجابة مستقطبة قوية من T1، مع زيادة الخلايا التائية المنتجة للإنترفيرون مع تقدم العمر وتطور الإصابة الكبيبية. كما ظهر أيضًا التسلل الكلوي للخلايا البائية في الفئران التي تعاني من نقص Clr-f في نماذج الفئران من SLE42. حتى الآن، ليس من الواضح ما إذا كانت الخلايا البائية الموجودة في الكلى تساهم في الالتهاب الضار في مرض الكلى المزمن أو تلعب أدوارًا تنظيمية أكثر. وجدت الأدلة الحديثة على مرض الكلى المزمن لدى المرضى المسنين أن الانخفاض في أعداد الخلايا البائية ارتبط بتطور مرض الكلى . ثبت أن الأدلة المستمدة من كل من الخلايا التائية والبائية لها نشاط مثبط للمناعة في أمراض الكلى المناعية الذاتية، وبالتالي فإن مدى مساهمتها أو تنظيمها في أمراض الفئران Clr-f -/− يتطلب مزيدًا من البحث.

تُظهر النتائج التي توصلنا إليها معًا الحاجة إلى تعبير Clr-f في الظهارة الأنبوبية للأنابيب الملتوية القريبة و/أو الخلايا الرجلية و/أو الظهارة المعوية. يؤدي فقدان تعبير Clr-f إلى سلسلة من الالتهابات والمناعة الذاتية الواضحة التي تؤدي إلى تلف الكلى والسمنة المرتبطة بها. يبدو أن الاستجابات المناعية الناجمة عن فقدان Clr-f مستقلة عن الخلايا التائية والبائية. بشكل عام، يمكن تصور الدور الوظيفي لـ Clr-f في الكلى كجزيء مثبط للخلايا المناعية المراقبة في الكلى كما هو مفترض في القناة الهضمية، أو كعامل مساعد.منظم جوهري لوظيفة الخلية الأنبوبية.

المواد والأساليب الفئران.

وتم الحفاظ على جميع الفئران في بيئة مخصصة خالية من مسببات الأمراض. تم الحصول على الفئران C57BL/6 (WT) وB6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) من مختبر جاكسون (Bar Harbour، ME، USA). تم إنشاء الفئران التي تحمل الطفرات الفارغة المدمجة في Rag1 و Clr-f (Rag1−/−;Clr-f -/−) عن طريق عبور الفئران التي تعاني من نقص Clr-f (Clr f -/−) مع الفئران (Rag1−/−) . كانت جميع عمليات التربية والتلاعب التي تم إجراؤها على الحيوانات متوافقة مع إرشادات الجامعة ووافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة دالهوزي ولجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) بجامعة أوتاوا. تم إجراء جميع تصميمات الدراسات الحيوانية والتجارب وإعداد التقارير وفقًا لإرشادات الوصول.

جيل من الفئران التي تعاني من نقص Clr-f. تم إنشاء الفئران التي تعاني من نقص Clr-f (Clr-f -/−) من خلال إعادة التركيب المتماثل لبناء استهداف يحتوي على كيناز فسفوغليسيرات ثعلبي (PGK) - كاسيت نيومايسين وتسلسل جينومي يمتد إلى الإكسونات 3 و 4 وجزء من إكسون 5 من الجين Clr-f. تمت الموافقة على بنية الاستهداف الكاملة من خلال التسلسل في معهد أبحاث مستشفيات أوتاوا (OHRI) قبل التثقيب الكهربائي في الخلايا الجذعية الجنينية (ES) C57BL/6 Bruce-4. تم إجراء اختيار استنساخ ES بواسطة مقاومة G {{1 0}} بواسطة IRCM (معهد مونتريال للأبحاث السريرية) Transgenic Core Facility (مونتريال، QC، كندا). وفي الوقت نفسه، تم اختبار مجسات 5 ′ و 3 ′ Clr-f في تحليل تعدد الأشكال لطول الجزء المقيد (RFLP) باستخدام الحمض النووي الجينومي الغدة الصعترية من فأر WT B6، والذي تم هضمه باستخدام BamHI وPstI، على التوالي. تم حل شظايا الحمض النووي المهضومة على هلام الاغاروز 1٪ ونقلها إلى بقع غشاء النايلون. تم تصنيف تحقيقات Clr-f cDNA باستخدام 32P-dCTP المشعة (Perkin Elmer، Guelph، ON، Canada) باستخدام مجموعة NEB (New England Biolabs، USA). تم فحص البقع باستخدام تحقيقات Clr-f cDNA المسمى 32P في محلول تهجين (1 0٪ (وزن / حجم) كبريتات ديكستران ؛ 1 M NaCl ؛ 1٪ SDS). تم إجراء التهجين طوال الليل عند 65 درجة وتم إجراء عمليات غسل ما بعد التهجين بمحلول يحتوي على 2 × SSC و1% SDS تم تسخينه مسبقًا إلى 65 درجة. تم تعريض البقع لأفلام فوتوغرافية للكشف عن إشارات التهجين (الأشكال S1A، S3B). تم تجريد الأغشية بـ 0.2% SSC/0.2% SDS لمدة 30 دقيقة عند 85 درجة بين التهجينات المختلفة. تم فحص الحيوانات المستنسخة المقاومة للنيومايسين عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية، ولوحظت كفاءة استهداف تصل إلى 15% تقريبًا. تم حقن الحيوانات المستنسخة المختارة من ES في الكيسة الأريمية في مرفق خدمة الحقن المجهري IRCM لتوليد الفئران مؤسس Clr-flox الخيمرية. تم فحص الفئران عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية ثم تم تربيتها مع إناث B6 لإنتاج فئران متغايرة الزيجوت Clr-fwt/lox. تم تهجين الفئران غير المتجانسة للحصول على الفئران Clr-flox/lox. لإزالة كاسيت النيومايسين، تم تربية الفئران Clr-flox/lox مع الفئران المعدلة وراثيا متماثلة اللواقح CMV-cre على خلفية B6 (مختبر جاكسون). الناتج المزدوج المتخالف CMV-CreTg/0؛ تم تهجين الفئران Clr-f−/+ لإنتاج فئران Clr-f−/− التي تفتقر إلى الجينات المحورة CMV-cre. تم التنميط الجيني للفئران باستخدام بادئات محددة (الجدول 1، الشكل S1B، C، والشكل S3C، D). تم إجراء تضخيم PCR باستخدام بوليميريز الحمض النووي AccuStart II Taq (Quanta Biosciences، Gaithersburg، MD، USA). تم تحضير خليط PCR باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم استخدام الحمض النووي للأذن المستخرج من الفينول/الكلوروفورم كقوالب. تم استخدام معلمات ركوب الدراجات PCR التالية: 30 دورة تضخيم تبلغ 94 درجة لمدة 40 ثانية، و60 درجة لمدة 45 ثانية، و72 درجة لمدة 60 ثانية. تم استخدام زملاء WT وClr-f -/− في جميع التجارب ما لم تتم الإشارة إلى خلاف ذلك.

التهجين في الموقع.

تم إجراء تحليلات التهجين في الموقع لـ Clr-f من خلال استنساخ حبلا CDS ذات الطول الكامل وحبلا مضاد التحسس Clr-f-span في ناقل pGEM-T Easy كما هو موضح سابقًا. تم نسخ تحقيقات التحسس والحمض النووي الريبي (RNA) المسمى بـ Digoxi genin من البلازميدات الخطية التي تشفر جين Clr-f مع بوليميريز T7 باستخدام مزيج وضع العلامات DIG RNA (روش ، بازل ، سويسرا). تم جمع الأنسجة من الفئران البالغة B6 وتم تثبيتها إما في 10٪ من الفورمالين عند درجة حرارة الغرفة أو في بارافورمالدهيد 4٪ عند 4 درجات مع اهتزاز لطيف لمدة تصل إلى 24 ساعة. تم بعد ذلك دمج الأنسجة في البارافين وتم تحضير مقاطع بحجم 4 ميكرومتر على شرائح زجاجية. تمت إزالة الكربونات من شرائح الأنسجة عن طريق المعالجة باستخدام 0.2 N HCl لمدة 15 دقيقة و30 ميكروغرام/مل من بروتيناز K عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة. تم إصلاح الأنسجة في 4٪ PFA لمدة 10 دقائق تليها المعالجة بـ 0.25٪ من أنهيدريد الأسيتيك في 0.1 م من ثلاثي إيثانولامين مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما. تم بعد ذلك تهجين الشرائح مسبقًا بمحلول التهجين (50٪ (حجم / حجم) فورماميد / 5 × SSC، درجة الحموضة 4.5؛ 2٪ (وزن / حجم) مسحوق الحجب (روش)؛ 0.05٪ (وزن / حجم) CHAPS؛ 5 مم EDTA؛ 50 ميكروغرام/مل من الهيبارين؛ 1 ميكروغرام/مل من الخميرة RNA) في فرن بدرجة حرارة 58 درجة لمدة ساعة واحدة على الأقل، ثم يتم احتضانها بمحلول تهجين يحتوي على 500 نانوغرام/مل من مسبار الديجوكسيجينين طوال الليل عند درجة حرارة 58 درجة. تم إجراء عمليات غسل ما بعد التهجين باستخدام 50٪ فورماميد / 2 × SSC، ودرجة الحموضة 4.5 عند 55 درجة 3 × لمدة 20 دقيقة لكل منهما، وتم تلطيخ الشرائح بأجسام مضادة مترافقة مع الفوسفاتيز القلوي المضاد للديجوكسيجينين عند تخفيف 1: 1000 في محلول مانع ( روش). تم إجراء تطوير اللون عن طريق إضافة ركائز نيترو بلو تيترازوليوم/5-برومو، و4-كلورو، و3-إيندويلفوسفات (NBT/ BCIP، Roche) إلى الشرائح. تم الاحتفاظ بالشرائح في الظلام عند RT حتى ظهور الإشارات المثالية. تم إجراء وضع العلامات على التحكم باستخدام مسبار حس الجديلة ودراسات ملزمة تنافسية مع خصوصية مسبار المعنى والمضاد للحساسية. تم بعد ذلك تلوين الشرائح باللون الأخضر الفاتح أو الأخضر الميثيل وتصورها تحت المجهر الضوئي.

RT-PCR. تم استئصال أنسجة الكلى من الفئران WT و Clr-f -/− المتطابقة مع العمر والجنس، وشطفها باستخدام برنامج تلفزيوني، وتجميدها عند درجة -80 . تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) من الأنسجة المجمدة باستخدام كاشف استخراج RiboZol RNA (AMRESCO Inc.، West Chester، PA، USA) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم نسخ ما يقرب من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) إلى [كدنا] باستخدام مجموعة Verso cDNA (Thermo Scientific، Waltham، MA، USA). تم إجراء تضخيم PCR على 1 ميكرولتر من منتج [كدنا] باستخدام الاشعال محددة (الجدول 1). كانت ظروف PCR المستخدمة هي 94 درجة لمدة 30 ثانية، و58 درجة لمدة 30 ثانية، و72 درجة لمدة 60 ثانية، و35 دورة تضخيم. تم تصور منتجات PCR على 1٪ من هلام الاغاروز الملون ببروميد الإيثيديوم (الشكل 1C، الشكل S3A).

الكيمياء المناعية.

تم إزالة أنسجة الكلى من الفئران WT وClr-f −/− المتطابقة مع العمر والجنس بواسطة ثلاث حضانات مدتها 5 دقائق في الزيلين، وحضانات مدتها 5 دقائق في 100٪ من الإيثانول، تليها 90 % إيثانول، ثم 80% إيثانول، وأخيراً 70% إيثانول. تم ترطيب الشرائح عن طريق الغسيل في الماء المقطر (20 نقطة)، وتم إجراء استرجاع الحاتمة الناجم عن الحرارة باستخدام طنجرة الضغط في محلول السترات (درجة الحموضة 6.0). تم حظر البيروكسيداز الداخلي بنسبة 3٪ من بيروكسيد الهيدروجين في ماء معقم لمدة 10 دقائق، وتم حظر البروتينات باستخدام الخلفية Sniper (Biocare Medical، Pacheco، CA، USA). تم بعد ذلك تحضين الأقسام باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للفئران المضادة للفئران Clr-f عند 4 درجات خلال الليل. في اليوم التالي، تم شطف الشرائح بـ 0.1 M PBS واحتضانها لمدة ساعة واحدة في الأجسام المضادة الثانوية. تم تطوير التلوين باستخدام مجموعة Goat-on-Rodent HRP-Polymer (Biocare Medical) وBetazoid DAB Bufer (Biocare Medical)، متبوعًا بتلطيخ الهيماتوكسيلين المضاد. تم استخدام نفس العملية لتلوين قسم الأنسجة الكلوية لوضع علامات IHC على خلايا NKp 46+ وCD 3+، باستخدام مضاد NKp46 (eBioscience، Santa Clara، CA، USA، clone 29A1.4، CAT#). 48-3351-82) ومضاد CD3 (BioLegend CAT#100,327) على التوالي كأجسام مضادة أولية. تم إجراء وضع العلامات IHC لـ F4/80 على أقسام الكلى المجمدة باستخدام الجسم المضاد BM8 أحادي النسيلة المضاد لـ F4/80. تم استخدام جسم مضاد ثانوي مترافق مع IgG H&L HRP للماعز المضاد للفئران (Abcam، Cambridge، UK CAT #ab97057) على النحو الوارد أعلاه وتم تطوير IHCs باستخدام ركيزة بيروكسيداز فجل الحصان (HRP) تم استخدام DAB Substrate Kit (Abcam، CAT # ab64238).

التألق المناعي.

تم حفظ أنسجة الكلى و / أو الأمعاء من الفئران WT و Clr-f −/− المتطابقة مع العمر والجنس في 3 0٪ سكروز عند -80 درجة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل Tissue-Tek (Fisher Scientific، بيتسبرغ، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تثبيت أقسام ناظم البرد بحجم 20 ميكرومتر باستخدام الأسيتون في غطاء الدخان عند درجة حرارة الغرفة لمدة 16 دقيقة وتجفيفها بالهواء لمدة 30 دقيقة على الأقل، بعد الغسيل في 0.01 م PBS، درجة الحموضة 7.4. تم حظر الارتباط غير المحدد بنسبة 10٪ من مصل الحمير. تم تحضين الأقسام طوال الليل عند 4 درجات باستخدام الأجسام المضادة الأولية: مضاد Clr-f7، مضاد NKR-P1G (جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر موصوف سابقًا 7 ) ، مضاد IgA (سلسلة ألفا IgA المضادة للفأر عنزة (Abcam، Cambridge ، UK CAT#ab97235)، مضاد IgG-PE (BioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية CAT # 405324، مضاد IgM-FITC (Life Technologies، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية CAT # A21042)، الجسم المضاد C3 المضاد (11H9) ) (Novus Biologicals، Littleton، CO، USA Cat# NB200-540)، مضاد IFN -PE (BD-Biosciences، Franklin Lakes، NJ، USA CAT#554411)، مضاد IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479)، مضاد CD45-FITC (BioLegend CAT#103108)، مضاد CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85)، مضاد F4/80- APC (BioLegend CAT#123116)، وanti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) بتركيز 1:100 في مصل طبيعي بنسبة 5% في غرفة مرطبة. وضع علامات ثانوية على الأجسام المضادة للأجسام المضادة - تم إجراء الأجسام المضادة Clr-f والأجسام المضادة لـ NKR-P1G باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة المترافقة مع FITC عند درجة حرارة الغرفة لمدة حضانة لمدة ساعة واحدة، وكانت العينات ملطخة نوويًا بـ DAPI عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، وتم غسلها باستخدام برنامج تلفزيوني، وتم تركيبها على شرائح زجاجية بقطرة واحدة من VECTASHIELD PLUS وسائط التثبيت المضادة للتلاشي (Vector Laboratories، سان فرانسيسكو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) ومغطاة بغطاء زجاجي. تم فحص الشرائح باستخدام مجهر متحد البؤر المسح بالليزر Zeiss LSM 510.

تسجيل الأنسجة وعلم الأمراض.

كانت أقسام الكلى من الفئران WT و Clr-f -/− و Rag1−/− و Rag1−/−Clr-f -/− (3 ميكرومتر) ملطخة بحمض الدوري شيف (PAS). تم تقييم الأنسجة الكلوية من حيث خلوية مسراق الكبيبة (التي تم تعريفها على أنها 4 نوى أو أكثر في منطقة مسراق الكبيبة)، وانتشار الشعيرات الدموية الداخلية، والأهلة، والتصلب الكبيبي. تم تقييم المقاطع أيضًا لوجود اعتلال الأنابيب والتليف الخلالي والضمور الأنبوبي وتسلل الخلايا الأنبوبية الخلالية. بالنسبة لعلم أمراض الكبيبات، تم استخدام درجة شبه كمية لتقييم درجة الضرر الكبيبي. تم فحص ما لا يقل عن 5 0 كبيبات في كل مجموعة وتم تصنيف شدة الآفة من 0 إلى +3: تمثل الآفة +1 تورطًا بنسبة أقل من أو تساوي 30٪ من الكبيبة،+2 بنسبة 30-60%، بينما تشير الآفة +3 إلى أن نسبة أكبر من أو تساوي 60% من الكبيبة كانت متورطة. تم إجراء قياس سمك GBM على الصور المجهرية الإلكترونية الكبيبية لـ WT و Clr-f -/− باستخدام الصورة J V1.53a47. بالإضافة إلى ذلك، تم تسجيل أنسجة الكلى الملطخة بـ PAS من اثنين من الفئران Rag1−/− واثنين من Rag1−/−Clr-f -/− بشكل أعمى لوجود السمات المرضية أعلاه، وتم حساب الميزات الكمية من متوسط ​​​​أقسام الكلى الأربعة لكل الفأر.

المجهر الإلكتروني.

معالجة الأنسجة للمجهر الإلكتروني النافذ تتبع البروتوكول المنشور . باختصار، تم تثبيت قطع صغيرة من أنسجة الكلى من فئران WT وClr-f −/− عمرها أسبوع في محلول غلوتارالدهيد 2.5% ثم معالجتها باستخدام طريقة رباعي أكسيد الأوزميوم/خلات اليورانيل 1%. تم تضمين العينات في راتنجات Epon Araldite قبل القطع باستخدام جهاز Reichert-Jung الفائق القطع E. تم تصوير العينات على مجهر إلكتروني JEOL JEM 1230 وتم التقاط الصور باستخدام كاميرا Hamamatsu ORCA-HR الرقمية.

البول والبلازما النفايات الكيميائية وقياس المنحل بالكهرباء.

تم جمع ما يقرب من 150 ميكرولتر من البول يوميًا من فئران WT و Clr-f −/− البالغة من العمر أسبوعًا في نفس الوقت من اليوم لمدة 5 أيام متتالية. تم طرد البول بالطرد المركزي عند 10,{6}} دورة في الدقيقة لإزالة الحطام ثم تخزينه عند -80 درجة. تم جمع دم الوريد الوجهي من نفس الفئران في أنابيب الهيبارين وعزلها بالطرد المركزي عند 3000 جم لمدة 5 دقائق وتخزينها في درجة -80 درجة. تم إرسال عينات البول والبلازما إلى مختبرات Idexx (ماركهام، أونتاريو) لقياسات تركيز البروتين والكرياتينين والكهارل.

قياسات ضغط الدم على فئران عمرها 12 و 24 أسبوعًا. تم قياس ضغط الدم الانقباضي والانبساطي (BPs) عن طريق تخطيط التحجم في الكفة الذيل على فئران WT وClr-f -/− بعمر 12 و24- أسبوع في حالة مستقرة باستخدام نموذج BP2000 Visitech. تم قياس ضغط الدم يوميًا في نفس الغرفة وفي نفس الساعة من اليوم لمدة 5 أيام متتالية. تم استخدام قيم BP لآخر 3 قياسات متتالية لحساب متوسط ​​قيمة BP حيث اعتبر اليومان الأولان ضروريين لتكيف الفئران.

Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30 × 106 عمق القراءة لكل عينة.

RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 وتغيير قطع السجل بمقدار 1.5. يتم توفير قيم FPKM لجميع النقاط الزمنية والعينات (ملف مجموعة البيانات التكميلية 1). تحليل الإثراء الوظيفي. تم إجراء تحليل الجينات والإثراء الوظيفي باستخدام g: Profiler (الإصدار e102_على سبيل المثال 49_p15_7a9b4d6) مع g: طريقة تصحيح الاختبار المتعدد SCS التي تطبق عتبة الأهمية البالغة 0.05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 ونظام تصنيف PANTHER مع اختبار فيشر الدقيق وعتبة FDR البالغة<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53. 

تم إنشاء شبكات التخصيب الوظيفية باستخدام مجموعات الجينات من العمليات البيولوجية GO (GO: BP) لإصدار Mus Musculus (GRCm38.p6) BioMart: 2020-12-08 تم تنزيله من g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee) /gprofiler/gost). تم إجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) باستخدام GSEA V4.0354,55 باستخدام إثراء الشبكة استنادًا إلى FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).

تحليل الدهون في البطن وخارج الرحم. تم تحديد تراكم الدهون من خلال وزن الدهون في البطن التي تم تشريحها من الفئران الفردية. تم أخذ قياسات وزن الجسم قبل استخلاص الدهون. بالنسبة لتلوين الزيت الأحمر O (ORO)، تم قطع أقسام الكلى المجمدة عند 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد ثم تجفيفها بالهواء لمدة 30 دقيقة. تم إجراء تلطيخ ORO عن طريق تثبيت المقاطع بثلاث عمليات غسل من الأيزوبروبانول بنسبة 60٪، واحتضانها بتركيز عمل (66٪) من محلول ORO (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) تلطيخ لمدة 15 دقيقة. تم بعد ذلك غسل الشرائح بسرعة باستخدام الأيزوبروبانول بنسبة 60٪، وصبغها سريعًا بهيماتوكسيلين ماير لتسليط الضوء على النوى، ثم تركيبها باستخدام VectaMount AQ Aqueous Mounting Media (Vector Laboratories).

تحليل النمط المرضي. تم إجراء تحليل النمط المساري باستخدام الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) مع q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation. 

تم تمرير الأنسجة المهضومة من خلال مرشح نايلون 70- ميكرومتر، وغسل برنامج تلفزيوني، وتم التخلص من الخلايا الحمراء المتبقية باستخدام محلول ACK لمدة 5 دقائق على الجليد. تم عزل الخلايا المناعية في الكلى عن طريق الطرد المركزي RT عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 40٪ بيركول. تمت إعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني وتم الحصول على تعداد الخلايا بواسطة عدادة الكريات. تم استخدام mAbs المختلفة للتحقق من التعبير البروتيني على سطح الخلية، وتم تلوين الخلايا لتحليل القياس الخلوي باستخدام الأجسام المضادة للفأر الموسومة بالفلوروكروم: anti-CD45 (eBioscience, clone 30-F11)، anti-TCR (eBioscience, clone H{ {12}})، مضاد NK1.1 (eBioscience، استنساخ PK136)، مضاد CD19 (BioLegend، استنساخ 1D3/CD19)، مضاد CD11b (BioLegend، استنساخ M1/70)، مضاد F4/80 (BioLegend، استنساخ BM8)، ومكافحة MHCII (IA/IE) (BioLegend، استنساخ M5 / 114.15.2)، ومكافحة Ly6G (BioLegend، استنساخ 1A8)، ومكافحة NKp46 (eBioscience، استنساخ 29A1.4)، وضوابط النظير. تم تحديد صلاحية الخلية باستخدام صبغة قابلة للإصلاح (eBioscience، Cat# 65-0865-14). لتحديد وقياس مجموعات الخلايا المناعية في الكليتين WT وClr-f -/−، تم استخدام تحليلات قياس الخلايا الخلوية متعددة المعلمات باستخدام الأجسام المضادة ضد العلامات الخاصة بالخلية لتحديد العدلات (CD11b + Ly6G +)، البلاعم (CD11b + Ly6G − F4 / { {57}}MHCII+)، وخلايا NK (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+)، وخلايا NKp46+ (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+)، والخلايا التائية (Ly6G− NK1) .1−TCR +) والخلايا B (CD11b − Ly6G − TCR −CD 19+). تم الحصول على جميع العينات باستخدام مقياس الكريات الخلوية BD-Fortessa.

مراجع

1. Hato, T. & Dagher, PC كيف يستشعر الجهاز المناعي الفطري المشاكل ويسبب المشاكل.كلين. ج. صباحا. شركة نفط الجنوب. نيفرول.10, 1459–1469 (2015).

2. كروجر، ت.وآخرون.تحديد وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية في كلية الفئران السليمة وفي التجربةالتهاب كبيبات الكلى.ج. صباحا. شركة نفط الجنوب. نيفرول.15, 613–621 (2004). 

3. Weisheit، CK، Engel، DR & Kurts، C. الخلايا الجذعية والبلاعم: حراس في الكلى.كلين. ج. صباحا. شركة نفط الجنوب. نيفرول.10, 1841–1851 (2015).

4. وولتمان، صباحاوآخرون.القياس الكمي لمجموعات فرعية من الخلايا الجذعية في أنسجة الكلى البشرية في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.كثافة العمليات في الكلى.71, 1001–1008 (2007). 5. جوتشالك، سي.وآخرون.الخلايا الجذعية المعتمدة على Batf3- في العقدة الليمفاوية الكلوية تحفز التحمل ضد المستضدات المنتشرة.ج. صباحا.شركة نفط الجنوب. نيفرول.24, 543–549 (2013).

6. تشانغ، س.وآخرون.Mouse Nkrp1-يكشف تحليل تسلسل مجموعة الجينات Clr وتحليل التعبير عن الحفاظ على معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) الخاص بالأنسجةالمراقبة المناعية المستقلةبلوس واحد7, e50561 (2012).

7. ليبيلت، س.وآخرون.التحسس المناعي المخصص للظهارة المعوية للفأر يتم تسهيله بواسطة زوج من الليكتين المقترن وراثياالمستقبلات.المناعي المخاطي.

8, 232–242 (2015). 8. رحيم، مجلس العمل المتحدوآخرون.Te mouse NKR-P1B: نظام التعرف على Clr-b هو منظم سلبي للاستجابات المناعية الفطرية.دم125, 2217–2227 (2015). 

9. كارلايل، جي آروآخرون.فقدان التعرف على الذات لـ Ocil / Clr-b بواسطة مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية المثبطة NKR-P1.بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004). 

10. روتكوفسكي، إي.وآخرون.Clr-a: جزيء جديد يشبه الليكتين من النوع C مرتبط بالمناعة يتم التعبير عنه حصريًا بواسطة ظهارة أمعاء الفأر.J. إيمونول.198, 916–926 (2017).

11. بالاجي، GRوآخرون.يوفر التعرف على المضيف Clr-b بواسطة مستقبل NKR-P1B المثبط أساسًا للتعرف على الذات المفقودة.نات.مشترك.9, 4623 (2018)

12. Friede، ME، Leibelt، S.، Dudziak، D. & Steinle، A. Select تعبير Clr-g على الخلايا الجذعية المنشطة يسهل التفاعل المشابهمع مجموعة فرعية صغيرة من خلايا NK الطحالية التي تعبر عن مستقبل Nkrp1g المثبط.جي إمونول.200, 983–996 (2018). 

13. أبو سمرة، ع.وآخرون.مطلوب تعبير NKR-P1B في الخلايا اللمفاوية الفطرية المرتبطة بالأمعاء للتحكم في الجهاز الهضميالتهابات المسالك.خلية. مول. إيمونول.16, 868–877 (2019).

14. جيرمان، سي.وآخرون.توصيف متغيرات النص المقسمة بديلاً لجين CLEC2D.جي بيول. الكيمياء.285, 36207–36215 (2010).

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

احصل على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد لعلاج عدوى الكلى