الجمع بين التسريب بالخلايا القاتلة الطبيعية بالتبني والببتيد المطلق للدوبامين يقلل من الخلايا الشائخة في الفئران المسنة

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

المقدمة

الشيخوخة هي أحد عوامل الخطر الرئيسية للعديد من الأمراض [1] ، كما أن تطوير طرق التدخل في الشيخوخة سيقلل بشكل كبير من خطر سلسلة من الأمراض المرتبطة بالعمر مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والدماغية [2 ، 3] ، والسرطان [4] ، ومرض الزهايمر [5]. تتراكم الخلايا الشائخة تدريجيًا في الأنسجة أثناء عملية الشيخوخة وتعتبر السبب الرئيسي للأمراض المرتبطة بالشيخوخة [6-8]. لقد ثبت أن إزالة SNCs في نماذج الفئران تمنع أو تؤخر اختلال وظائف الأنسجة وتطيل العمر الصحي [9 ، 10]. على النقيض من ذلك ، فإن زرع كميات صغيرة من الخلايا الجذعية السرطانية يؤدي إلى اختلال وظيفي فسيولوجي في الفئران الصغيرة [1]. فتحت هذه الدراسات الأبواب لتطوير الأساليب التي تستهدف إزالة SNCs لتخفيف الأمراض المزمنة المرتبطة بالعمر.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

استهداف تصفية SNCs ، المسمى "senolytics" كان العلاج الكيميائي الأول الذي تم اختباره بنجاح في نموذج ما قبل السريري في الجسم الحي ، وهناك العديد من العوامل الحالة للشيخوخة حاليًا [12]. تستهدف العديد من هذه الأدوية المسارات المضادة للاستماتة المنظمة في SNCs لتطهير أنواع معينة من SNCs بشكل انتقائي وأظهرت القدرة على إطالة العمر وتحسين وظائف الجسم [13 ، 14].مستخلص سيستانش المضاد للإشعاععلى الرغم من الانعكاس الناجح لعلم الأمراض المرتبط بالعمر في النماذج الحيوانية ، فقد تكون هناك بعض العقبات أمام استخدام الأدوية الحالة للشيخوخة في البشر بسبب عدم تجانس SNCs وارتفاع مخاطر السمية [15]. لذلك ، يجب استكشاف طريقة بديلة يمكنها القضاء بأمان على مجموعة واسعة من SNCs في البشر.

يمكن التعرف على SNPs وإزالتها بواسطة جهاز المناعة [16]. أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الجذعية السرطانية تنشط الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) من خلال تنظيم بروتين A و B المرتبط بالسلسلة الرئيسية المتوافقة مع النسيج من الفئة الأولى [17]. ومع ذلك ، مع تقدم العمر ، تنخفض كفاءة الجهاز المناعي ، مما قد يؤدي إلى هروب المناعة من SNCs [18]. تم استكشاف طرق التغلب على الهروب المناعي الناجم عن انخفاض وظيفة المناعة في علاج السرطان [19]. تم إحراز تقدم مؤخرًا في نقل الخلايا القاتلة الطبيعية بالتبني للقضاء على الأورام ، مما أظهر بعض الفعالية [20] ؛ وبالتالي ، كان من المعقول افتراض أن التسريب بالتبني لخلايا NK قد ينتج سمية خلوية في SNCs.

يعد الجهاز العصبي وجهاز المناعة أهم نظامين تكيفيين في الجسم. أظهرت العديد من الدراسات أن الدوبامين (DA) كمنظم للمناعة هو مفتاح للتواصل المناعي العصبي [21]. تؤدي DA وظائفها البيولوجية من خلال التفاعل مع مستقبلات الدوبامين (DR) وتنشيطها ، والتي تنقسم إلى مجموعتين فرعيتين ، D 1- مثل (D1 و D5) ، و D 2- مثل (D2 ، D3 ، و D4) من حيث وظائفها المختلفة ، فإن إشراك D 1- مثل DR يحفز إنتاج cAMP ، بينما إشراك D 2- مثل DR يثبط إنتاج cAMP [22]. أظهرت الدراسات السابقة أن D 1- مثل تحفيز DR يعزز السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية في كل من المختبر [23] وفي الجسم الحي [24]. ومع ذلك ، تنخفض مستويات DA مع زيادة عمر الإنسان [25]. وهكذا ، افترضنا أن الأدوية الدوبامينية يمكن أن تعزز السمية الخلوية للتسريب بالتبني للخلايا القاتلة الطبيعية.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

هنا ، نقترح استخدام nonapeptide Acein ، الذي تفاعل مع إنزيم محول للأنجيوتنسين (ACE I) للحث على إفراز DA [26] ، بالاقتران مع العلاج الجهازي بالخلايا القاتلة الطبيعية للقضاء على SNCs. أظهرت النتائج في المختبر أن الخلايا القاتلة الطبيعية تزيل SNCs ، بغض النظر عن محرضات الشيخوخة وأنواع الخلايا.cistanche هيربافي نموذج الفأر المُتقدم في العمر ، أدى العلاج بالخلايا القاتلة الطبيعية بالاشتراك مع Acein إلى تقليل عدد الخلايا الإيجابية المرتبطة بالشيخوخة -Galactosidase (SA - - gal) في الأنسجة المتعددة ، مما قلل من التعبير عن الجينات المرتبطة بالشيخوخة في الأعضاء الرئيسية وتخفيف الأنماط الظاهرية المرتبطة بالشيخوخة (SSPs). تقدم نتائج هذه الدراسة نظرة ثاقبة حول الاستعادة المحتملة للمراقبة المناعية للـ SNCs المزمنة باستخدام العلاج بالخلايا القاتلة الطبيعية بالاشتراك مع Ace.

النتائج

يقلل التسريب بالتبني من الخلايا القاتلة الطبيعية شيخوخة CD3 بالإضافة إلى الخلايا التائية في الدم المحيطي

تم تجنيد ستة وعشرين متطوعًا تلقوا حقن الخلايا القاتلة الطبيعية للدراسة. يتم عرض خصائص وخصائص الخلايا القاتلة الطبيعية للمتطوعين في الجدول 1. كان الفاصل الزمني لتذكر الدم بعد نقل الخلايا القاتلة الطبيعية حوالي 37 (25-57) يومًا. كانت النسبة (الشكل 1 أ) والعدد المطلق (الشكل 1 ب) للخلايا القاتلة الطبيعية في الدم المحيطي مرتبطة عكسياً بعمر المتطوعين. والمثير للدهشة أن نقاء منتج الخلية NK المعاد دمجه في كل فرد كان أيضًا مرتبطًا عكسياً مع عمر المتطوعين (الشكل 1C).cistanche نمو القضيبقد يكون هذا بسبب الانخفاض التدريجي في عدد الخلايا القاتلة الطبيعية مع تقدم العمر. من أجل عكس التأثير المضاد للشيخوخة لإدارة الخلايا القاتلة الطبيعية ، تم اكتشاف علامات الشيخوخة المتعددة في الدم المحيطي CD3 بالإضافة إلى الخلايا التائية ، والتي تعكس إلى حد كبير النمط الظاهري المرتبط بالعمر للجسم [27] ، قبل وبعد حقن الخلايا القاتلة الطبيعية. مقارنةً بعلامات الشيخوخة وعامل SASP لخلايا CD3 بالإضافة إلى الخلايا التائية في الدم المحيطي قبل وبعد التسريب الذاتي للخلايا NK ، انخفضت نسبة الخلايا التائية الإيجابية للـ SA - - بشكل ملحوظ بعد التسريب (الشكل 1 د). انخفضت مستويات mRNA لـ P16 و P21 ومثبط منشط البلازمينوجين 1 (Pai1) بشكل ملحوظ ، في حين أن التغيرات في مستويات mRNA لبروتين الجذب الكيميائي أحادي الخلية -1 (MCP -1) و IL -6 لم تكن كبيرة (الشكل 1E). لم يكن هناك فرق كبير في الفهارس البيوكيميائية (الجدول التكميلي 1) في الدم المحيطي.

تقلل الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية علامات شيخوخة الأنسجة الدهنية وإفراز السيتوكينات المنشطة للالتهابات

تم جمع الأنسجة الدهنية من ثلاثة أفراد يعانون من السمنة المفرطة ، حيث تميل السمنة إلى التسبب في تراكم الخلايا الجذعية السرطانية [28]. بالإضافة إلى ذلك ، تمت زراعة الأنسجة الدهنية في وسط مكيف من SNCs لزيادة تحفيز شيخوخة الأنسجة الدهنية. تم اعتبار الأنسجة الدهنية المستزرعة في وسط مكيف من غير SNCs بمثابة عنصر تحكم. تم تنظيم تعبير Perforin (الشكل 2 أ) و CD69 (الشكل 2 ب) في الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل كبير بعد الحضانة المشتركة مع الأنسجة الدهنية المتخلفة مقارنةً بالحضانة المشتركة مع الأنسجة الدهنية الضابطة. التعبير عن علامات الشيخوخة p16 و p21 بوصة

تم تقليل الأنسجة الدهنية الشائخة بشكل كبير بعد علاج الخلايا القاتلة الطبيعية (الشكل 2C ، الشكل التكميلي 1 أ ، ب). وجدنا أيضًا أن المكون الرئيسي لـ SASP في الوسط المكيف بعد الحضانة المشتركة مع خلايا NK في المجموعة الشائخة قد انخفض بشكل كبير (الشكل 2D). تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية يمكنها القضاء على SNCs من الأنسجة الدهنية وتقليل النمط الظاهري لـ SASP.

يمكن تنشيط خلايا Mouse NK ضد SNCs وممارسة السمية الخلوية

لقد تسببنا أولاً في شيخوخة الخلايا السلفية الدهنية للفأر عن طريق التشعيع أو الأدرياميسين كما هو موصوف سابقًا [29]. لتحديد ما إذا كانت الخلايا القاتلة الطبيعية قد تم تنشيطها على وجه التحديد بواسطة SNCs ، تم تحضين خلايا التحكم غير المشععة أو خلايا SNC المشععة مع خلايا NK لمدة 24 ساعة. أظهر قياس التدفق الخلوي أن مستويات التعبير عن CD69 (الشكل 3A) و IFN-y (الشكل 3B) في الخلايا القاتلة الطبيعية تم تنظيمها بشكل كبير في الخلايا المستهدفة SNC مقارنة بالخلايا المستهدفة للتحكم. في هذه الأثناء ، بعد الحضانة المشتركة مع الخلايا القاتلة الطبيعية ، كان مستوى موت الخلايا المبرمج للـ SNCs أعلى بكثير من مستوى خلايا التحكم (الشكل 3C). بعد ذلك ، اكتشفنا التعبير عن الروابط المثبطة والمنشطة للخلايا NK في SNC. أظهرت نتائج qPCR أن مستوى التعبير عن تنشيط الروابط في الخلايا القاتلة الطبيعية قد تم تنظيمه بشكل كبير مقارنة بخلايا التحكم ، وأن مستوى التعبير عن بعض الروابط المثبطة ، مثل بيتا 2 ميكروغلوبولين (2 م) ، تم تقليله مقارنة بخلايا التحكم (الشكل 2). .3D). لقد درسنا أيضًا قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية على القضاء على SNCs في الجسم الحي.فوائد الصلصا cistancheتم زرع خلايا التحكم التي تحمل علامة DiR و SNCs التي تحمل علامة DiR في التجويف البطني للفئران ، وتم إعطاء خلايا NK من خلال وريد الذيل. أظهرت نتائج التصوير في الجسم الحي أن شدة التألق في الفئران المزروعة باستخدام خلايا SNC بعد العلاج بالخلايا القاتلة الطبيعية كانت أضعف بكثير من تلك الموجودة في الفئران المزروعة بخلايا تحكم (الشكل 3E). يشير هذا إلى أن قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية على قتل SNCs كانت أعلى بكثير من قدرة الخلايا SNC في الجسم الحي. بعد ذلك ، حددنا ما إذا كانت السمية الخلوية لخلايا NK ضد SNCs تعتمد على الجرعة والخاصة بالخلية. في الوقت نفسه ، استخدمنا أيضًا الشيخوخة المستحثة بالدوكسوروبيسين لتحديد ما إذا كانت السمية الخلوية لخلايا NK ضد SNCs مقصورة على تحريض الإشعاع. أظهرت النتائج أن الخلايا القاتلة الطبيعية لديها نشاط سام للخلايا كبير ضد SNCs بطريقة تعتمد على الجرعة ، ولكن سمية خلوية قليلة ضد الخلايا الضابطة. لم يكن لطرق تحفيز الشيخوخة المختلفة أي تأثير على قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية على قتل SNCs (الشكل 3F). تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن تنشيط خلايا NK على وجه التحديد بواسطة SNCs وإنتاج سمية خلوية كبيرة ضد SNCs في المختبر وفي الجسم الحي.

يعزز DA السمية الخلوية لخلايا NK الفأرية ضد SNCs من خلال D 1- مثل المستقبلات

في ضوء وظيفة الاتصال المناعي العصبي المهمة لـ DA [30] ، قمنا بتقييم ما إذا كان DA يمكن أن يعزز السمية الخلوية لخلايا NK الفأرية ضد SNCs. تم احتضان خلايا NK بشكل مشترك مع SNCs المستحثة بالإشعاع ، وأضيفت تركيزات مختلفة من DA إلى الوسط. أظهرت النتائج أن DA يمكن أن يعزز السمية الخلوية لخلايا NK ضد SNCs (الشكل 4 أ ، ب). لتوصيف مسار الإشارات الذي عزز من خلاله DA تأثير القتل لخلايا NK على SNCs ، تم تقييم التغييرات في تعبير DR ، ومحتوى cAMP ، وفسفرة بروتين ربط عنصر استجابة cAMP (CREB) في خلايا NK. في خلايا NK المحتضنة بشكل مشترك مع SNCs جنبًا إلى جنب مع DA ، تمت زيادة محتوى cAMP (الشكل 4C) ومستوى الفسفرة لـ CREB (الشكل 4D ، الشكل التكميلي 2A) بشكل ملحوظ ، مقارنة بخلايا NK وحضانة SNC المشتركة بدون DA. من أجل توضيح سبب تعزيز DA للنشاط القاتل لخلايا NK ضد SNCs ، قمنا بمقارنة تغييرات DR على خلايا NK بعد أن تم احتضان خلايا NK بشكل مشترك مع خلايا SNC أو خلايا التحكم. أظهرت النتائج أن مستوى التعبير D1 و D5 DR قد تم تنظيمه بشكل كبير بعد أن تم احتضان خلايا NK بشكل مشترك مع SNCs مقارنة بخلايا التحكم (الشكل 4E). بعد ذلك ، DA و D 1- مثل مضادات المستقبلات أو D 2- مثل

تمت إضافة مضادات المستقبلات معًا في نظام الحضانة المشترك لخلايا NK و SNCs. بالمقارنة مع إضافة DA وحدها ، انخفض مستوى موت الخلايا المبرمج لـ SNCs عند إضافة DA plus SCH -23300 (D 1- مثل مضادات المستقبلات) (الشكل 4F ، G). وفي الوقت نفسه ، تم تنظيم محتوى cAMP (الشكل 4H) ومستوى الفسفرة لـ CREB (الشكل 4l ، الشكل التكميلي 2B) في خلايا NK. على النقيض من ذلك ، فإن إضافة DA plus هالوبيريدول (مضاد مستقبلات D2) لم يغير بشكل كبير من مستوى موت الخلايا المبرمج لـ SNCs ، ومحتوى cAMP ، وفسفرة CREB في الخلايا القاتلة الطبيعية ، مقارنة بإضافة DA وحده. أظهرت هذه النتائج أن DA عزز نشاط قتل خلايا NK الفأرية ضد SNCs من خلال D 1- مثل Drs.

يعزز Ace مع خلايا الماوس NK بشكل كبير من إزالة SNCs في الجسم الحي

أظهرت دراسة سابقة أن الدوبامين يتناقص مع تقدم العمر لدى البشر [22]. قمنا أولاً بقياس مستوى الدوبامين المحيطي في الفئران الصغيرة والكبيرة. أشارت النتائج إلى أن مستويات الدوبامين في البلازما لدى الفئران المسنة كانت أقل من تلك الخاصة بالفئران الصغيرة (الشكل 5 أ). بعد ذلك ، تم استكشاف إطلاق الدوبامين المحيطي بعد الحقن داخل الصفاق من Acein في الفئران القديمة. وجدنا أن مستويات الدوبامين في البلازما زادت بشكل ملحوظ بعد حقن 10 مجم / كجم من الآسين (الشكل 5 ب ، الشكل التكميلي 3). في ضوء ذلك ، أجرينا خلايا الماوس NK جنبًا إلى جنب مع Acein لعلاج الفئران المسنة. اكتشفنا حالة الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم المحيطي للفئران بعد العلاج ووجدنا أن عدد الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم المحيطي لتسريب الخلايا القاتلة الطبيعية وحدها أو الخلايا القاتلة الطبيعية مجتمعة مع Acein كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في المجموعة المعالجة بـ Ace و مجموعة PBS ، في حين أن عدد الخلايا القاتلة الطبيعية لم يكن مختلفًا بشكل كبير بين مجموعة الخلايا القاتلة الطبيعية المعالجة وخلايا NK مجتمعة مع المجموعة المعالجة Acein (الشكل 5C ، D).cistanche tubulosa جرعة redditأظهر الكشف الإضافي عن مستوى تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية أن مستوى التعبير عن CD69 في خلايا الدم المحيطي NK في المجموعة المعالجة المشتركة قد تم تنظيمه بشكل كبير مقارنة بالمجموعة المعالجة بالخلايا القاتلة الطبيعية (الشكل 5E). بعد ذلك ، قمنا بتقييم SNCs في الأنسجة. لقد وجدنا أن تسريب الخلايا القاتلة الطبيعية وحدها قلل من تعبير بعض علامات الشيخوخة مقارنة بمجموعة PBS والمجموعة المعالجة بـ Acein ، في حين أن تسريب خلايا NK جنبًا إلى جنب مع Acein قلل بشكل كبير من SA - - الخلايا الموجبة (الشكل 5F. ) وكذلك مستويات التعبير عن P16 و P21 (الشكل 5G ، الشكل التكميلي 4 أ ، ب) في الأنسجة الدهنية ، مقارنةً بمعالجة الخلايا القاتلة الطبيعية وحدها. تم أيضًا زيادة عدد خلايا Ki67BrdU في الأنسجة الدهنية بشكل كبير (الشكل 5H) مما يثبت أيضًا أن محتوى SNCs في الأنسجة الدهنية كان أقل في المجموعة المعالجة المشتركة. أظهر تلوين SA - - لأقسام الكبد والرئة والكلى والدهون أيضًا أدنى مستوى من SNCs في المجموعة المعالجة المشتركة (الشكل التكميلي 5A-D). أظهرت هذه النتائج أن خلايا NK جنبًا إلى جنب مع علاج Acein عززت مستوى تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية في الفئران ، وتسببت في القضاء بشكل كبير على SNCs في الجسم الحي.

يقلل الآس مع الخلايا القاتلة الطبيعية من الأنماط الظاهرية المرتبطة بالعمر في الفئران المسنة

لتأكيد الأنماط الظاهرية المرتبطة بالعمر في الفئران والكبد والرئة والكلى والدهون وأنسجة العين ، تم جمع مجموعة متنوعة من علامات الشيخوخة بما في ذلك عوامل P16 و P21 و SASP. تم اختيار هذه العينات لأن هذه الأنسجة هي أكثر عرضة للشيخوخة مع تقدم العمر [31]. في كل نسيج ، بعد التسريب بالخلايا القاتلة الطبيعية وحدها ، كانت مستويات الرنا المرسال لعوامل P16 و P21 و SASP أقل بكثير من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة ، في حين أن مستويات علامات الشيخوخة في أنسجة الكبد والدهون والحواء في المجموعة المعالجة مجتمعة تم تقليل المجموعة بشكل أكبر مقارنة بالمجموعة التي عولجت بالتسريب بالخلايا القاتلة الطبيعية وحدها (الشكل 6 أ). وبالمثل ، اكتشفنا أيضًا عامل SASP الرئيسي في مصل الفئران ، وكانت النتائج متوافقة مع النتائج في الأنسجة (الشكل 6 ب). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا أيضًا بفحص مستويات NAD في الكبد والأنسجة الدهنية ، والتي ترتبط بالشيخوخة [32]. وجدنا أن ضخ الخلايا القاتلة الطبيعية وحدها أو في العلاج المركب زاد بشكل ملحوظ من محتوى NAD في الكبد والأنسجة الدهنية ، وكان مستوى التحسن أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة العلاج المشتركة (الشكل 6 ج). ترتبط بعض الفهارس البيوكيميائية في المصل بما في ذلك ALT و AST و CREA و UA و CHOL و BUN بمستويات الشيخوخة [33]. لقد وجدنا أن UA فقط قد انخفض بشكل كبير في مصل الفئران في المجموعة المعالجة المركبة ، في حين أن المؤشرات الكيميائية الحيوية الرئيسية الأخرى لم تنخفض

المواد والطرق ضخ الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية

تم إجراء التسريب الذاتي للخلايا NK من قبل مستشفى Shanghai Mengchao للسرطان (شنغهاي ، الصين) ، وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات من قبل لجنة الأخلاقيات الخاصة بهم (رقم 052020 ، لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى Shanghai Mengchao للسرطان). قدم جميع المتطوعين موافقة مستنيرة موقعة للحصول على الدم المحيطي. باختصار ، تم استخراج 50 مل من الدم المحيطي من كل فرد ، وبعد ذلك تم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) ونقلها إلى قارورة T75 مع ExCellerate "Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems ، الولايات المتحدة الأمريكية) التي تحتوي على 1 × Cloudz CD2 / NKp46 و Recombinant Human IL -2 (27ng / mL) و Recombinant Human L -12 (10 نانوغرام / مل) و IL البشري المؤتلف -18 (10 نانوغرام / مل و Human L المؤتلف {{ 13}} (10 نانوغرام / مل) (R&D Systems ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 48 ساعة ، ثم استبدالها بالوسط المنشط (270 نانوغرام / مل مؤتلف Human IL -2 ، 20 نانوغرام / مل مؤتلف بشري IL -12 ، 20 نانوغرام / مل من IL البشري المؤتلف -18 ، و 20 نانوغرام / مل من IL البشري المؤتلف -21) لمزيد من الثقافة. تم الحفاظ على كثافة الخلايا عند 1 × 10 درجة خلية / مل. في اليوم 28 من الثقافة ، تم جمع عدد صغير من الخلايا القاتلة الطبيعية ذاتيًا لمراقبة الجودة وإعادة حقنها عن طريق الوريد مع خلايا NK ذاتية بكثافة 4.15 × 10 درجة (3. 76-5. 87 × 10) خلية ، مع وقت تسريب يبلغ 30 دقيقة أجريت العملية التجريبية في مدينة أكوردا مع الممارسة السريرية الجيدة. كان الفاصل الزمني لجمع الدم الثاني حوالي 37 (25-57) يومًا.

عزل خلايا الدم المحيطية البشرية وخلايا NK تم الحصول على دم طازج من متطوعين أصحاء بعد تقديم الموافقة المستنيرة ، وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسي للجامعة الصينية للصيدلة (رقم التصريح: SYXK 2016-0011). تم استخدام Lymphoprep (STEMCELL Technologies ، كندا) لعزل PBMCs البشرية. تم الحصول على خلايا CD3 بالإضافة إلى T البشرية من PBMCs باستخدام حبات مغناطيسية لفرز الخلايا التائية CD3 البشرية (Miltenyi Biotec ، ألمانيا) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من الدم المحيطي باستخدام كوكتيل RosetteSep "Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة

فصل وتوسيع خلايا الفئران القاتلة الطبيعية في المختبر

تم عزل خلايا NK الفأرية الطحالية باستخدام NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم الحصول على طحال الفأر ، وتم ترشيح خلايا الطحال باستخدام مرشح خلية 70 ميكرومتر ، وتم الحصول على الخلايا الليمفاوية في الطحال عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام مجموعة فصل الخلايا الليمفاوية في طحال الفأر (سولاربيو ، الصين). تم جمع الخلايا الليمفاوية الطحالية للحصول على خلايا NK عالية النقاء باستخدام حبات مغناطيسية لفصل خلايا الفئران القاتلة الطبيعية. تمت زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة في وسط RPMI -1640 للصيانة مع 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، و 1 بالمائة L- الجلوتامين ، و 1 بالمائة من البنسلين / الستربتومايسين ، و 1 بالمائة من الوسط الأساسي الأدنى (MEM) غير- حمض أميني أساسي ، وحمض بيروفات الصوديوم بنسبة 1 في المائة ، و 50 ميكرومتر ميركابتويثانول (جميعها من Life Technologies ، الولايات المتحدة الأمريكية). بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة 200 وحدة دولية / مل من الإنترلوكين 2 (RL -2) (PeproTech ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 10 نانوغرام / مل من الماوس I -15 (ml -15) (PeproTech) إلى متوسط. ثم تم جمع 10 خلايا NK و 10 درجات من الخلايا الليمفاوية الطحالية المشعة ، ووسط تضخيم 5 مل (وسيط صيانة مكمل بـ 1000 وحدة دولية / مل rlL -2 ، 10 نانوغرام / مل مل -15 ، و 30 نانوغرام / مل مضاد -NKp46 (PA 5-46986 ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية)) كان

الشكل 3 ينشط SNCs خلايا NK وقتلها خلايا NK. تم إجراء قياس التدفق الخلوي للكشف عن التعبير عن (A) CD69 و (B) IFN-y بعد حضانة مشتركة لمدة 24 ساعة مع خلايا NK للماوس وخلايا مسبقة الصبغية أو خلايا preadipocytes التي يسببها التشعيع. ن =3. يتم تقديم البيانات كوسائل ± SD. تم تقييم الفروق عن طريق اختبار t غير حدودي غير ثنائي الذيل. ** ص<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

استخراج الخلايا الأولية والخلايا العضلية الساتلية

تم استخراج الخلايا الأولية كما هو موضح سابقًا [11]. لفترة وجيزة ، تمت إزالة الدهون البشرية أو الفئران في ظل ظروف معقمة وتقطيعها إلى قطع 1-2 مم ، وغسلها مرتين باستخدام PBS ، وهضمها باستخدام كولاجيناز ll Solarbio عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة. ثم تم ترشيح الخلايا باستخدام مرشح خلية 100 ميكرومتر ، وطردها عند 300 جم لمدة 5 دقائق ، وتم جمعها. تم استنبات الخلايا الملتصقة في MEM مع 20 بالمائة من FBS لمدة 12 ساعة وهضمها مع التربسين لجمع الخلايا الملتصقة. تم عزل الخلايا العضلية الساتلية كما هو موصوف سابقًا [34]. تم تقطيع العضلة الرباعية الرؤوس إلى قطع 1-2 مم ، وتمت إضافة 5 مل من كولاجيناز ليرة لبنانية للهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. يخلط الخليط مع ماصة ، ويضاف وسط كامل 5 مل بعد هضم إضافي لمدة 12 دقيقة. تم ترشيح الخلايا باستخدام مرشح خلية 70 ميكرومتر وطردها عند 300 جم لمدة 5 دقائق. ثم كانت الخلايا

المزروعة ب 5 مل وسط مضاف يوميا لمدة 4 أيام. تم تفجير الخلايا الملتصقة باستخدام ماصة وطردها عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق. بعد هضم التربسين عند 37 درجة لمدة 5 دقائق ، تم طرد الخلايا عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق وتم جمعها. ثم تمت إضافة 5 مل F -10 وسط هام مع 20 في المائة من FBS و 4 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (PeproTech).

تم الكشف عن السمية الخلوية لخلايا NK الطحالية للفأر إلى SNCs بواسطة فحص نازعة هيدروجين اللاكتات

تم تحفيز SNCs بواسطة 0. 2 ميكرومتر Adriamycin （MedChemExpress ، USA لمدة 24 ساعة أو عن طريق الثقافة المستمرة لمدة 20 يومًا بعد 10 أشعة سينية من الأشعة السينية. ثم تم وضع 5000 SNCs في لوحة ، وتمت إضافة خلايا NK الطحالية (صلاحية الخلية: 93. 5-97. 1 بالمائة) عند المستجيب لاستهداف النسب 50: 1،25: 1،12.5: 1 ، 6.25: 1،3.125: 1 ، و 1.563: 1. تم جمع المواد الطافية بعد الزراعة المشتركة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، واستخدمت مجموعة اكتشاف السمية الخلوية اللاكتات (LDH) (كايمان كيميكال ، الولايات المتحدة الأمريكية) للكشف. تم حساب السمية الخلوية بالصيغة التالية: السمية الخلوية (النسبة المئوية)=(تجربة الخلية المختلطة - الخلية المستهدفة تلقائيًا - خلية المستجيب التلقائي) / (الخلية المستهدفة القصوى - الخلية المستهدفة تلقائيًا) × 100.

التصوير الحي

تم شراء اثني عشر 10- فأرًا C57BL / 6 عمرها من قبل شركة Changzhou Cavens Laboratory Animal Co، Ltd. (جيانغسو ، الصين). ثم 1 × 10 درجة 1،1'-octadecyl -3، 3،3 '، 3'-tetramethylindocarbocyanine iodide (DiR) (Invitrogen) - عنصر تحكم

تم تعليق الخلايا الأولية أو الخلايا الدهنية المتشيخة الناتجة عن الإشعاع في 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS) وحقنت في التجويف البطني للفئران بإبرة قياس 22. بعد ثلاثة أيام ، تم حقن الخلايا القاتلة الطبيعية 5 × 10 درجة (قابلية الخلية للحياة: 93. 6-96. 2 بالمائة) في 100 ميكرولتر PBS من خلال الوريد الذيل. في اليوم العاشر ، تم تخدير الفئران بالإيزوفلورين. تم الكشف عن الإسفار باستخدام نظام التصوير MS 100 Series In Vivo (PerkinElmer ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

التدفق الخلوي

لاكتشاف موت الخلايا المبرمج لـ SNCs المحتضنة بشكل مشترك مع خلايا NK الطحالية المسمى DiR (قابلية الخلية للحياة: 91. 8-93. 2 بالمائة) ، تم هضم 1 × 10 درجة SNC بدقة عند 37 درجة لمدة 10 دقائق ثم تلطيخ مع ملحق V و Propidium iodide (PI) مجموعة تلطيخ موت الخلايا المبرمج (Multisciences Biotech Co ، Ltd. ، الصين) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إغلاق SNCs في الوضع السلبي DiR. لاختبار تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية ، تم جمع خلايا الفئران القاتلة الطبيعية وتلطيخها بـ mNK1. 1- ألوفيكوسيانين (APC) (S17016D) وباستخدام مجموعة فئران التمايز 69- R-phycoerythrin-cyanine7 (mCD {{ 17}} PE-Cy7) (H1.2F3) (Biolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية) بمعدل 4 درجات لمدة 30 دقيقة. ثم تمت معالجة الخلايا باستخدام CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية) وملطخة بالفأر البنفسجي اللامع الإنترفيرون 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) عند 4 درجات لمدة 30 دقيقة. تم إجراء تلطيخ Perforin-APC (S16009A) لخلايا NK البشرية باستخدام نفس البروتوكول المستخدم للتلوين خارج الخلية (CD 56- أيزوثيوسيانات فلوريسئين [FITC] (5.1H11) ، قرص مضغوط 69- PE (FN50) ) وتلطيخ الخلايا (perforin-APC) (Biolegend).

للكشف عن خلايا الدم المحيطية NK ، تم جمع 100 ميكرولتر من الدم المضاد للتخثر. بالنسبة للدم المحيط بالفأر ، تمت إضافة القرص المضغوط 3- FITC و NK1. 1- APC والقرص المضغوط 69- PE-Cy7. بالنسبة للدم المحيطي البشري ، تمت إضافة القرص المضغوط 3- BV421 (OKT3) والقرص المضغوط 56- FITC واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم تمت إضافة 400 ميكرولتر 1 × محلول كريات الدم الحمراء （BD Biosciences واحتضانها لمدة 3 دقائق ، تليها ثلاث غسلات باستخدام PBS. للكشف عن تكاثر الخلايا في الأنسجة الدهنية ، تم حقن الفئران داخل الصفاق بـ 200 ميكرولتر من 10 مجم / مل من بروموديوكسيوريدين （BrdU） 24 و 72 ساعة قبل القتل الرحيم. بعد القتل الرحيم ، تمت إزالة مستودعات الدهون الأربية وتقطيعها إلى شظايا ، وهضمها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام كولاجيناز ll و DNase ، وتصفيتها باستخدام مرشح خلية 100 ميكرومتر. تمت معالجة الخلايا باستخدام Cytofix / Cytoperm Plus Kit وتم تلوينها باستخدام BrdU-FITC (3D4) و Ki 67- PE (16A8). تم إجراء قياس التدفق الخلوي على مقياس التدفق الخلوي CytoFLEX. تم استخدام مجموعة LIVE / DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) لاستبعاد الخلايا الميتة في جميع التجارب. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo (FlowJo LLC ، Ashland ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكية).

النسخ العكسي الكمي PCR

تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف Trizol وعكسه ونسخه إلى (كدنا) باستخدام مجموعة تركيب الشعر الأول ستراند (كدنا) (التكنولوجيا الحيوية يبسن ، الصين). تم إجراء PCR الكمي (qPCR) باستخدام مزيج تفاعل SYBR Green (Yepsen Biotechnology) على نظام ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR (النظم البيولوجية التطبيقية ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مع GAPDH بمثابة عنصر تحكم داخلي. تم تحليل البيانات باستخدام طريقة 2- △ ACt. تم الإبلاغ عن قائمة تسلسل التمهيدي في المواد التكميلية (الجدول 2-3).

تلطيخ الجالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة

بالنسبة لتلطيخ الخلايا ، تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، وتثبيتها في محلول الجلاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة (SA - - غال) (تقنية تشوير الخلايا ، الولايات المتحدة الأمريكية) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، وغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، واحتضانها بين عشية وضحاها في محلول تلوين غالون SA - - عند 37 درجة مئوية. الخلايا

تم غسلها ببرنامج تلفزيوني وملاحظتها بالمجهر. بالنسبة لتلطيخ المقطع المجمد ، تم تجفيف المقاطع عند 37 درجة لمدة 3 {{11} دقيقة وتثبيتها في درجة حرارة الغرفة في محلول تثبيت غالون SA - - لمدة 15 دقيقة. تم غسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام PBS واحتضانها طوال الليل في محلول تلوين SA - - جالون عند 37 درجة مئوية ، ثم تم تلطيخها باليوزين لمدة دقيقة واحدة وشطفها بالماء لمدة دقيقتين. تم تحليل بيانات تلوين SA - - باستخدام برنامج Image-Pro Plus 6.0.

إإكسبلنتس الأنسجة الدهنية البشرية

تم الحصول على الأنسجة الدهنية من ثلاثة أفراد عن طريق شفط الدهون. كان أحد المشاركين من الذكور ، واثنتان من الإناث. كان متوسط ​​عمر المفحوصين 57. 0 ± 7.6 سنة (متوسط ​​± SD: النطاق ، 50-65). كان متوسط ​​مؤشر كتلة الجسم 40.5 ± 5.1 كجم / متر مربع （يعني ± SD ؛ النطاق 36. 7-46. 2）. وافقت لجنة الأخلاقيات في مستشفى Shanghai Mengchao للسرطان (رقم 05 ، 2020 ، لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى Shanghai Mengchao للسرطان) على المخطط التجريبي. تم الحصول على الموافقة المسبقة لجميع المتطوعين. تم تقطيع الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة يبلغ قطرها حوالي 2 مم. تم وضع خمس قطع من الأنسجة في كل بئر من 96- صفيحة آبار ، و 200 ميكرولتر من الخلايا الأولية أو الوسط المكيف من الخلايا المتشيخة التي يسببها الإشعاع ، مكملة بنسبة 10 في المائة من مصل AB البشري ، و 1 في المائة من L- الجلوتامين ، 1 تمت إضافة في المائة من البنسلين / الستربتومايسين ، و 1 في المائة من الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM ، و 1 في المائة من حمض بيروفات الصوديوم ، إلى الثقافة المشتركة لمدة 24 ساعة. ثم تم استبدال الوسيط بوسط جديد يحتوي على خلايا NK ذاتية المنشأ 5 × 10 درجة (قابلية الخلية للبقاء: 92. 3-95. 7 بالمائة 6) وتم تربيتها لمدة 48 ساعة أخرى ، وبعد ذلك تم جمع الخلايا القاتلة الطبيعية لقياس التدفق الخلوي. تم غسل الأنسجة الدهنية خمس مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتمت إضافة نفس الوسيلة لمزيد من الثقافة لمدة 48 ساعة ؛ تم استخدام المادة الطافية (100 ميكرولتر) للكشف متعدد العوامل. تم اشتقاق الخلايا الدهنية أو الخلايا الدهنية المتشيخة الناتجة عن الإشعاع من الأنسجة الدهنية للفرد نفسه.

تم اقتباس هذه المقالة من موت الخلايا والأمراض (2022) 13: 305