تكشف المقارنة بين QPCR و RNA seq عن تحديات قياس تعبير HLA الجزء 1

خلاصة

مستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) من الصنف الأول والثاني من العناصر الأساسية للمناعة الفطرية والمكتسبة. تشمل وظائفها تقديم المستضد إلى الخلايا التائية مما يؤدي إلى استجابات مناعية خلوية وخلطية ، وتعديل الخلايا القاتلة الطبيعية. لقد تم الآن توضيح تأثيرها الاستثنائي على نتائج المرض من خلال دراسات الارتباط على مستوى الجينوم. كانت exons التي تشفر أخدود ربط الببتيد هي المحور الرئيسي لتحديد تأثيرات HLA على قابلية المرض / التسبب في المرض. ومع ذلك ، فقد تورطت مستويات تعبير HLA أيضًا في نتائج المرض ، مما أضاف بُعدًا آخر للتنوع الشديد لـ HLA الذي يؤثر على التباين في الاستجابات المناعية بين الأفراد.

هناك علاقة وثيقة بين مستضدات الكريات البيض والمناعة. يشير مستضد الكريات البيض إلى الجزيء الموجود على سطح خلايا الدم البيضاء البشرية ، والذي يمكنه تحديد وتمييز أنواع الخلايا المختلفة ومسببات الأمراض. إنه جزء مهم من جهاز المناعة البشري ومنظم مهم للاستجابة المناعية.

قد تؤدي الاختلافات في مستضدات الكريات البيض إلى استجابات مناعية مختلفة وقابلية للمرض. على سبيل المثال ، ترتبط بعض مستضدات الكريات البيض بأمراض المناعة الذاتية والأمراض المعدية والأورام. يرتبط التعبير عن مستضدات كريات الدم البيضاء أيضًا بوظيفة وكمية الخلايا المناعية.

لذلك ، فإن فهم الخصائص الجزيئية لسطح الكريات البيض للفرد له أهمية كبيرة لتقييم الحالة المناعية للفرد وخطر المرض والتشخيص به. في الوقت نفسه ، يساعد أيضًا على صياغة العلاج الشخصي والتدابير الوقائية. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين المناعة. Cistanche له تأثير كبير على تحسين المناعة. الكستانش غني بالعديد من المواد المضادة للأكسدة ، مثل فيتامين ج ، والكاروتينات.هذه المكونات يمكن أن تزيل الجذور الحرة ، وتقلل من الإجهاد التأكسدي ، وتحسن مقاومة جهاز المناعة.

انقر فوق cistanche tubulosa استخراج مسحوق

لتقدير تعبير HLA ، تعتمد الدراسات المناعية تقليديًا على PCR الكمي (qPCR). تم إعاقة اعتماد التقنيات البديلة عالية الإنتاجية مثل RNA-seq بسبب المشكلات الفنية بسبب تعدد الأشكال الشديد في جينات HLA. في الآونة الأخيرة ، ومع ذلك ، تم تطوير طرق معلوماتية حيوية متعددة لتقدير تعبير HLA بدقة من بيانات RNA-seq. يفتح هذا فرصة مثيرة لتحديد تعبير HLA في مجموعات البيانات الكبيرة ولكنه يثير أيضًا أسئلة حول ما إذا كانت نتائج RNA-seq قابلة للمقارنة مع نتائج qPCR. في هذه الدراسة ، نقوم بتحليل ثلاث فئات من بيانات التعبير لجينات الفئة الأولى من HLA لمجموعة متطابقة من الأفراد: (أ) RNA-seq ، (ب) qPCR ، و (ج) تعبير HLA-C على سطح الخلية. لاحظنا وجود ارتباط متوسط ​​بين تقديرات التعبير من qPCR و RNA-seq لـ HLA-A و -B و -C ({{1 0}}. 2 أقل من أو يساوي rho أقل من أو يساوي 0.53 ). نناقش العوامل التقنية والبيولوجية التي يجب أخذها في الاعتبار عند مقارنة الكميات لأنماط جزيئية مختلفة أو باستخدام تقنيات مختلفة.

الكلمات الدالة

HLA · Expression · PCR · RNA-seq.

مقدمة

يوفر التعبير الجيني النمط الظاهري الجزيئي الذي يقع في موضع وسيط بين التباين الجيني والأنماط الظاهرية المعقدة ، مثل حالة المرض. يمكن أن يكون فهم الأساس الجيني للتعبير الجيني استراتيجيًا لإيجاد روابط بين التباين الجيني والأنماط الظاهرية المعقدة (GTEx Consortium 2013 ؛ Lappalainen et al. 2013) ، بما في ذلك القابلية للإصابة بأمراض المناعة الذاتية والأمراض المعدية. على الرغم من أن دراسة التباين الجيني في مواقع مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) ، وداخل منطقة مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) بشكل عام ، قد تم استخدامها لتشريح الأساس الجيني للعديد من الأمراض المعقدة (Trowsdale and Knight 2013؛ Dendrou et al. 2018) ، فإن إدراج الأنماط الظاهرية الجزيئية ، ولا سيما تلك المرتبطة بالتعبير الجيني ، حديث نسبيًا (Apps et al. 2015 ؛ Vince et al. 2016 ؛ Ramsuran et al. 2018 ؛ Johansson et al. 2022).

تعرض منطقة MHC البشرية على الكروموسوم 6p21 كثافة جينية عالية ، مع أنماط فريدة من اختلال التوازن (LD) وتعدد الأشكال الشديد (دي باكر وآخرون 2006 ؛ رضوان وآخرون 2020). تحتوي منطقة معقد التوافق النسيجي الكبير على موقعي HLA من الفئة الأولى والثانية اللذين يشفران الجزيئات المشاركة في تحفيز الاستجابة المناعية وتعديلها. يتم التعبير عن جزيئات الفئة الأولى من HLA بواسطة معظم الخلايا المنواة وتقدم بشكل عام الببتيدات داخل الخلايا لخلايا CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية. على النقيض من ذلك ، يتم التعبير عن جزيئات HLA من الدرجة الثانية بشكل أساسي بواسطة الخلايا المحترفة التي تقدم المستضد ، وتقدم إلى المستضدات الخارجية لخلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية التي تم استيعابها عن طريق الالتقام الخلوي. يتم التعرف أيضًا على جزيئات الفئة الأولى من خلال المستقبلات الموجودة على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، وهي المستقبلات الشبيهة بالجلوبيولين المناعي للخلايا القاتلة (KIRs) ، والتي تؤثر على كل من تعليم وتفعيل الخلايا القاتلة الطبيعية (Colonna and Samaridis 1995 ؛ Goodson-Gregg et al. 2020). يؤثر الاقتران بين الأنماط المختلفة من HLA من الدرجة الأولى وجزيئات KIR المحددة على نشاط الخلية NK (ومجموعة فرعية من CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية) ، مما يؤدي إلى مخاطر تفاضلية للإصابة بالسرطان والأمراض المعدية والمناعة الذاتية (تمت المراجعة في Kulkarni et al.2008).

تُعزى ارتباطات مرض HLA بشكل أساسي إلى الاختلافات الخاصة بالأليل في عرض المستضد ، بسبب تعدد الأشكال الواسع في أخدود ربط الببتيد. ومع ذلك ، تساهم مستويات التعبير HLA في بعض الارتباطات التي لوحظت بين تعدد أشكال HLA ونتائج المرض. يعد مستوى تعبير HLA معدلًا مهمًا للمناعة الذاتية ولقوة الاستجابة المناعية بوساطة HLA للسرطان والالتهابات (تمت مراجعته في René et al. 2016).

هناك أمثلة متعددة للارتباطات بين مستويات التعبير عن مستضدات الكريات البيضاء البشرية ونتائج العدوى الفيروسية. من الموثق جيدًا ، على سبيل المثال ، أن المستويات الأعلى من التعبير عن HLA-C ، على كل من مستوى الرنا المرسال والبروتين على سطح الخلية ، ترتبط بتحكم أفضل في فيروس نقص المناعة البشرية -1 (Thomas et al. 2009؛ Kulkarni et 2011 ؛ Apps وآخرون 2013 ؛ Parolini وآخرون 2018 ؛ Bachtel وآخرون 2018) ، في حين يرتبط تعبير HLA-A المرتفع بضعف السيطرة على فيروس نقص المناعة البشرية (Ramsuran et al. 2018). عدوى SARS-CoV -2 تقلل من تنظيم التعبير الجيني HLA-C (Loi et al. 2022) وتعبير HLA من الفئة الأولى على سطح الخلية (Zhang et al. 2021 ؛ Arshad et al. 2023) ، بالإضافة إلى فئة HLA التعبير الجيني الثاني ، بما في ذلك HLA-DPA1 و -DPB1 و -DRA و -DRB1 (Wilk et al. 2020).

بالإضافة إلى ذلك ، هناك ارتباطات بين مستويات التعبير HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) و HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012 ؛ Ou et al. 2021) مع تصفية HBV ؛ تعبير HLA-DRA مع القابلية للإصابة بفيروس أنفلونزا الخفافيش A في خطوط الخلايا البشرية (Karakus et al. 2019) ؛ والارتباطات الواسعة بين المتغيرات التنظيمية ومستويات التعبير في جينات الفئة الثانية من HLA ، بما في ذلك HLA-DQA1 و -DQB1 و -DQB2 و -DRB1 و -DRB5 مع استجابة الجسم المضاد ضد الفيروسات السائدة المتعددة (Kachuri et al. 2020).

ترتبط مستويات التعبير عن HLA loci أيضًا بالمناعة الذاتية (انظر Johansson et al. 2022 للمراجعة). ارتبطت مستويات تعبير HLA-C على سطح الخلية (Apps et al. 2013 ؛ Kulkarni وآخرون 2013) ، بالإضافة إلى مستويات HLA-G على سطح الخلية وفي البلازما (da Costa Ferreira et al. 2021) مع خطر الإصابة بأمراض الأمعاء الالتهابية. لوحظ زيادة تعبير HLA-B27 على سطح الخلية بين مرضى التهاب الفقار اللاصق (Cauli et al. 2002) ، كما كان التعبير العام عن HLA من الفئة الأولى بين مرضى مرض Graves (Weider et al. 2021). تؤثر مستويات التعبير HLA class II أيضًا على مخاطر أمراض المناعة الذاتية.

يتم زيادة التعبير الجيني HLA-DQA1 و -DRB1 والتعبير عن جزيئات DQ و DR على سطح الخلية في حيدات الدم المحيطية لمرضى البهاق (Cavalli et al. 2016) ؛ ترتبط المتغيرات التنظيمية المرتبطة بارتفاع مستوى التعبير الجيني HLA-DQA1 و -DQB1 و -DRB1 وتعبير DQ و DR على سطح الخلية بخطر الإصابة بالذئبة الحمامية الجهازية (Raj et al. 2016) ؛ يكون التعبير الجيني HLA-DRB5 أعلى في مرضى تصلب الجلد المصابين بأمراض الرئة الخلالية (Odani et al. 2012) ؛ يتم التعبير عن أليلات HLA-DRB1 محددة بدرجة عالية في مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي (Houtman et al. 2021) ؛ والتعبير الأعلى عن DRB1 * 15:01 يرتبط بخطر الإصابة بالتصلب المتعدد (Alcina et al. 2012). لذلك ، فإن فهم تباين تعبير HLA بين الأفراد والآليات التي تنظم مستويات تعبير HLA سيكون مفتاحًا للكشف عن الأساس الجيني للأنماط الظاهرية للمرض.

تقليديا ، تم تقدير تعبير HLA من خلال التقنيات القائمة على الأجسام المضادة لمستويات التعبير على سطح الخلية (Thomas et al. 2012 ؛ Apps et al. 2013) أو عن طريق PCR الكمي (qPCR أو RT-PCR) لمستويات نسخ mRNA (Bettens et 2014 ؛ Ramsuran وآخرون 2015 ، 2017). من الصعب مقارنة النتائج عبر الدراسات أو حتى مقارنة مواقع HLA المميزة في نفس الدراسة نظرًا لاستخدام إجراءات تجريبية مختلفة لكل تحليل ولكل موضع HLA ، مما قد يؤدي إلى كفاءات تضخيم مختلفة في qPCR أو تقاربات الأجسام المضادة في قياس التدفق الخلوي.

توفر التقنيات عالية الإنتاجية مثل RNA-seq تقديرات تعبيرية لجميع الجينات في الجينوم ، بما في ذلك جينات HLA ، مما يسمح بتقييم تعبير HLA في سياق الجينوم بأكمله. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات تجلب العديد من التحديات عند استخدامها لتقدير مستويات التعبير لجينات HLA. بالإضافة إلى التحيزات الموثقة جيدًا المرتبطة بمقايسات RNA-seq (على سبيل المثال ، التأثيرات المجمعة ، وإعداد المكتبة ، ومحتوى GC ('t Hoen وآخرون. 2013) ، فإن الصعوبة في تقدير مستويات التعبير لجينات HLA تنتج من حقيقة أن القياس الكمي يتضمن محاذاة القراءات القصيرة لجينوم مرجعي ، والذي لا يوفر تمثيلًا كاملاً للتنوع الأليلي HLA.

لذلك ، قد تفشل بعض القراءات في التوافق بسبب الأعداد الكبيرة من الاختلافات المتعلقة بالجينوم المرجعي (Brandt et al. 2015). بالإضافة إلى ذلك ، تعد جينات HLA جزءًا من عائلة الجينات التي تشكلت بعد جولات متتالية من الازدواجية وغالبًا ما تحتوي على شرائح متشابهة جدًا بين المتماثلات ، مما يؤدي إلى محاذاة متقاطعة بين الجينات والتقدير الكمي المتحيز لمستويات التعبير. حفزت هذه الصعوبات على تطوير خطوط الأنابيب الحسابية (انظر يوهانسون وآخرون 2022 للمراجعة) والتي تفسر تنوع HLA المعروف في خطوة المحاذاة وقد ثبت أنها توفر مستويات تعبير دقيقة لجينات HLA (Boegel et al. 2012؛ Lee et 2018؛ Aguiar et al. 2019؛ Gutierrez-Arcelus et al. 2020؛ Darby et al. 2020).

في حين أن كلا النهجين RNA-seq و qPCR يقدران تعبير HLA عن طريق قياس وفرة النصوص ، فإن الأساليب تتضمن إجراءات معالجة تجريبية وبيولوجية مختلفة. على حد علمنا ، لم يتم إجراء مقارنة كمية للنتائج من تسلسل الحمض النووي الريبي إلى تلك المستمدة من qPCR لجينات HLA. في هذه الدراسة ، سعينا إلى مقارنة التقنيات المختلفة والأنماط الظاهرية الجزيئية لتقدير تعبير HLA من الفئة الأولى ، مع الأخذ في الاعتبار أنه لا يمكن اعتبار أي تقنية معيارًا ذهبيًا. لتقليل تأثير الاختلاف التقني والبيولوجي في مقارنة الدراسات المختلفة ، أجرينا اختبار RNA-seq على مجموعة من 96 فردًا كانت تقديرات تعبير qPCR متاحة (لـ HLA-A ، -B ، -C) ، و لمجموعة فرعية منها يتوفر أيضًا تعبير سطح الخلية المستند إلى الجسم المضاد HLA-C. تم إجراء التقدير الكمي لـ RNA-seq باستخدام خط أنابيب مصمم لـ HLA والذي يسمح بتقدير دقيق للتعبير ، مما يقلل من تحيز الأساليب القياسية التي تعتمد على جينوم مرجعي واحد.

المواد والأساليب

عينات

تم الحصول على عينات الدم من 96 متبرعًا صحيًا بالدم مسجلين في برنامج التبرع الطوعي في مختبر فريدريك الوطني لأبحاث السرطان (FNLCR). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المواد وتم إخفاء هويتها من خلال الإجراءات المعتمدة من IRB للمعهد الوطني للسرطان. تم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المعزولة حديثًا (PBMC) باستخدام مجموعة RNeasy Universal (Qiagen). تم علاج الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الخالي من الحمض النووي الريبي لإزالة الحمض النووي الجيني. تم تحديد كمية الحمض النووي الريبي المستخرج من PBMCs باستخدام HT RNA Lab Chip (الفرجار ، علوم الحياة). تم استخدام جميع العينات التي أظهرت درجة جودة RNA أعلى من 8 في تحليلات التعبير الجيني.

كتابة HLA

تم تحديد أليلات HLA بواسطة تسلسل Sanger. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتشغيل HLApers (Aguiar et al. 2019) و Kourami (Lee and Kingsford 2018) لاستنتاج أليلات HLA مباشرة من RNAseq والتحقق من الاتفاق مع المكالمات المستندة إلى التسلسل Sanger. إذا أخذنا في الاعتبار مكالمات متسقة بين HLApers و Kourami ، فقد لاحظنا 10 اختلافات فقط مع مكالمات Sanger من بين 288 مقارنة (3 مواضع × 96 فردًا). أظهر معظمهم (n {7}}) دعمًا من RNA-seq لأليل قريب جدًا من الذي يحدده تسلسل Sanger ، لذلك اخترنا الاحتفاظ بالمكالمات المستندة إلى RNA-seq. بالنسبة لثلاثة أنماط وراثية ، نلاحظ وجود مكالمات متماثلة اللواقح من RNA-seq على الأرجح لأنه لم يتم التعبير عن أليل واحد ، واحتفظنا بالمكالمات من تسلسل Sanger. هذا لا يؤثر على تقدير التعبير ، حيث لا توجد قراءات تتماشى مع الأليل الذي لم يتم اكتشافه عبر RNA-seq. بالنسبة إلى نمط وراثي واحد ، لاحظنا دعمًا جيدًا لمكالمة متغايرة الزيجوت بينما كان يُطلق على تسلسل Sanger اسم الزيجوت المتماثل. في هذه الحالة ، احتفظنا بالمكالمة القائمة على RNA-seq نظرًا لأنه أوضح القراءات المرصودة بشكل أفضل. بالنسبة لاستدعاء أليل واحد ، اعتبرنا خطأً في المكالمات المستندة إلى RNA-seq بسبب تغطية القراءة غير الكافية.

PCR الكمي (qPCR)

تم قياس مستويات نسخ HLA mRNA لـ HLA-A و -B و -C بواسطة qPCR في اختبار يضمن التضخيم غير المتحيز للأليلات المشتركة في كل موضع مع تجنب تضخيم جميع المواقع الأخرى. البادئات المستخدمة هي: HLA-A (F ، GCTCCCACTCCATGAGGTAT ؛ R ، AGTCTG TGACTGGGCCTTCA) ؛ HLA-B (F ، ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA ؛ R ، GCAGCCCCTCATGCTGT) ؛ HLA-C (F ، CTGGCCCTGACCGAGACCTG ، R ، CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة RNA-to-cDNA عالية السعة (النظم البيولوجية التطبيقية). تم إجراء تضخيم HLA وجين التدبير المنزلي 2 ميكروغلوبولين (B2M) (كدنا) باستخدام المزيج الرئيسي الأخضر Power SYBR (النظم البيولوجية التطبيقية) ، على جهاز ABI 7900HT. تم وصف تسلسل التمهيدي لـ B2M في الجدول S4 من Kulkarni et al. (2013). تم تطبيع مستوى التعبير المتوسط ​​لكل جين HLA مع مستوى B2M وتم حسابه باستخدام طريقة 2- ∆∆Ct (حيث Ct هي دورة العتبة).

تم تقدير متوسط ​​مستويات التعبير الخاصة بالأليل لأليلات HLA الشائعة بواسطة نموذج خطي كما هو موضح في Ramsuran et al. (2015). على وجه التحديد ، قمنا بنمذجة التعبير كدالة خطية للأليلين اللذين يحملهما كل فرد واستخلصنا تأثيرات كل أليل على التعبير الجيني. نفذنا هذه الخطوة في R (انظر قسم توفر الكود).

تعبير السطح

تم قياس تعبير سطح خلية HLA-C على خلايا CD3 plus من PBMCs المعزولة حديثًا عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة الخاص بـ HLA-C DT9 (Apps et al. 2013). لتحليل HLA-A في مجموعة فرعية من الأفراد الذين يحملون A * 03 و A * 11 ، قمنا بتلوين الخلايا بالجسم المضاد 0554HA (One Lambda ، Inc.).

RNA seq

إعداد الحمض النووي الريبي

تم إجراء RNA-seq على RNA المخزن عند − 80 درجة. تم قياس كمية الحمض النووي الريبي الإجمالي باستخدام Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher). تم تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام أداة 2100 Bioanalyzer ومجموعة Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies). لكل عينة ، تم استخدام إجمالي 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي كمدخلات لإعداد مكتبات نسخ كاملة من الرنا الريباسي المستنفدة. تم إعداد مكتبة مرتبطة بالمحول باستخدام KAPA HyperPrep Kit (KAPA Biosystems ، Wilmington ، MA) باستخدام Bioo Scientific NEXTfex ™ DNA Barcoded Adapters (BioScientifc ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا للبروتوكول المقدم من KAPA.

نضوب الرنا الريباسي باستخدام RiboErase

تم استنفاد الحمض النووي الريبي الريبوزي عن طريق احتضان إجمالي الحمض النووي الريبي مع تحقيقات مكملة لتسلسل الرنا الريباسي. بعد التهجين ، تم استخدام RNase H لتحلل الرنا الريباسي إنزيميًا. تم إجراء التنظيف وهضم DNase باستخدام Kapa Pure Beads و DNase وفقًا لبروتوكول Kapa.

التجزئة وتوليف (كدنا) وبناء المكتبة

تم تجزئة العينات المستنفدة من الرنا الريباسي عند 85 درجة لمدة 4.5 دقيقة في وجود المغنيسيوم قبل تخليق الشريط الأول والثاني وتفاعلات A-Tailing. تم ربط محولات NEXTfex DNA Barcoded (1.5 ميكرومتر) بـ A-Tailed cDNA مع رمز شريطي فريد لكل عينة. تمت تنقية المنتجات باستخدام خرز Kapa Pure وتم إجراء 8 دورات لتضخيم المكتبة. بعد التضخيم ، تم إجراء تنظيف نهائي للمكتبة ، وتم تقييم قياس المكتبة ومراقبة الجودة باستخدام Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) ومجموعة Agilent DNA HS على أداة التحليل الحيوي 2100.

التسلسل

تم استخدام مكتبات التسلسل متعددة الإرسال الناتجة في تكوين الكتلة على Illumina cBOT (Illumina ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم إجراء التسلسل باستخدام Illumina HiSeq 2500 بعد البروتوكولات التي توفرها Illumina لتسلسل ثنائي الطرف 2 × 126 نقطة أساس. تم تسلسل كل نسخة إلى عمق مستهدف يبلغ 40-50 مليون قراءة.

تسلسل الحمض النووي الريبي على عينات جديدة من 11 فردًا

للتحقيق في إمكانية تدهور العينة للمواد المخزنة عند 80 درجة قبل تسلسل الحمض النووي الريبي ، وهو مصدر محتمل للخلاف مع تقديرات qPCR ، قمنا بإعادة جمع الدم من 11 متبرعًا وأجرينا RNA-seq على العينات الجديدة. تم إجراء التجربة بنفس طريقة إعداد المكتبة وطرقها السابقة ، ولكن تم إجراء التجربة باستخدام متسلسل Illumina NextSeq بقراءات 2 × 150 pb.

القياس الكمي للتعبير عن RNA seq

نسخة مرجعية

استخدمنا Salmon (Patro et al. 2017) لتقدير مستويات التعبير لجميع النصوص المشروحة في قاعدة بيانات Gencode v37. استخدمنا جميع الخيارات لتصحيح التحيز على السلمون (تحيز GC ، والتحيز الموضعي ، والتحيز الخاص بالتسلسل).

شخصية

مثل "نسخة المرجع" ، ولكن مع نسخ HLA الشخصية وفقًا للأنماط الجينية HLA-A و -B و -C التي يحملها كل فرد. تم إجراء التخصيص عن طريق محاذاة التسلسل الخاص بأليل HLA للجينوم المرجعي مع الجينوم للحصول على الإحداثيات. بعد ذلك ، باستخدام المحاذاة متعددة التسلسلات للأليل الموجود في الجينوم المرجعي مع جميع الأليلات الأخرى (متوفرة من الإصدار 3.43 من IPD-IMGT / HLA. 0 (Robinson et al. 2020)) ، نعزو الجينوم مواقف لجميع أليلات HLA. أخيرًا ، قمنا ببناء نسخة مخصصة بناءً على مجموعة من المعلومات حول إحداثيات النص وتسلسل أليل HLA. تم تنفيذ هذا الإجراء في R (R Core Team 2020) ، باستخدام حزمة Biostrings (Pagès et al. 2020) والحزمة الوصفية tidyverse (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com