التنميط الشامل لتركيبات سيكريتوم من الخلايا الجذعية للسائل الذي يحيط بالجنين البشري في الفترة المحيطة بالولادة والجنين الجزء 1

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:لقد ذكرنا سابقًا أن الخلايا الجذعية المشتقة من السائل الأمنيوسي c-KIT بالإضافة إلى السائلة المشتقة من htaman والتي تم الحصول عليها من عينات بقايا التشخيص الروتيني قبل الولادة في الثلث الأخير (hAFS الجنينية) تتمتع بتأثيرات باراكرين متجددة مؤيدة للبقاء على قيد الحياة ومضادة للتليف والتكاثر. قد يتم عزلها أيضًا من عينات النفايات السريرية في الثلث الثالث من الحمل خلال المقاطع القيصرية المجدولة (hAFS في الفترة المحيطة بالولادة) ، مما يوفر بديلاً يسهل الوصول إليه عند مقارنته بـ hAFS الجنين. ومع ذلك ، لا يُعرف سوى القليل عن ملف paracrine من hAFS في الفترة المحيطة بالولادة. هنا نقدم توصيفًا مفصلاً لإجمالي إفراز hAFS (على سبيل المثال ، كامل عوامل الباراكرين القابلة للذوبان التي تطلقها الخلايا في الوسط المكيف ، hAFS-CM) والحويصلات خارج الخلية ( hAFS-EVs) داخله ، من خلايا الفترة المحيطة بالولادة الجنينية مقابل الثلث الثالث. تم وصف hAFS الجنين والفترة المحيطة بالولادة وخاضعة لشروط مسبقة نقص الأكسجة لتعزيز إمكاناتها paracrine. تم تحليل تركيبات hAFS-CM و hAFS-EV لمحتوى البروتين والكيموكين / السيتوكين ، وتم فحص شحنة EV من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي. يتداخل النمط الظاهري للجنين والفترة المحيطة بالولادة ، جنبًا إلى جنب مع التركيبات الإفرازية المقابلة ؛ ومع ذلك ، أظهر hAFS الجنين نشاط فسفرة مؤكسدة غير ناضجة بالمقارنة مع تلك التي تحدث في الفترة المحيطة بالولادة. كشف التنميط عن حمولتهم paracrine بعض الاختلافات وفقا لمرحلة الحمل والتكييف المسبق ناقص التأكسج. قدم كلا مصدري الخلايا تركيبات غنية بالتغذية العصبية ، ومعدلة للمناعة ، ومضادة للتليف ، وعوامل تحفيز بطانية ، وتم تحديد إفراز hAFS الجنيني غير الناضج من خلال ملف تعريف أكثر وضوحًا مؤيدًا للأوعية الدموية ، وتجديدًا ، ومحسّنًا ، ومقاومًا للشيخوخة. أظهر التنميط الصغير للحمض النووي الريبي إثراء microRNA في كل من حمولة hAFS-EV الجنينية والفترة المحيطة بالولادة ، مع جوهر مؤيد معبر عنه بشكل ثابت كتوقيع جزيئي مرجعي. هنا نؤكد أن hAFS يمثل مصدرًا جذابًا لعوامل paracrine التجدد ؛ يجب تقييم اختيار تركيبات إفراز HAFS للجنين أو الفترة المحيطة بالولادة للعلاج بالباراكرين في المستقبل مع الأخذ في الاعتبار السيناريو السريري المحدد.

الكلمات الدالة:السائل الذي يحيط بالجنين؛ الخلايا الجذعية؛ آثار باراكرين حويصلات خارج الخلية وسط مكيف الخلية كيموكين. السيتوكينات. البروتينات. تسلسل الحمض النووي الريبي ميكرو آر إن إيه

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

1 المقدمة

تطور الطب التجديدي مؤخرًا كمجال ناشئ لتوفير الاستعادة الوظيفية للأنسجة المصابة عن طريق عدة استراتيجيات. مع تقدم نهج هندسة الأنسجة بشكل كبير في السنوات الأخيرة ، تم تكثيف التحقيق في تأثيرات paracrine الخلايا الجذعية بشكل متزامن بشكل متزايد. لقد ثبت على نطاق واسع أن الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية المزروعة يتم توسطها في الغالب من خلال العوامل القابلة للذوبان التي تم إفرازها ، والتي يمكن أن تنظم بيئة مكروية مؤيدة للتجدد في أنسجة المضيف بينما تحفز تنشيط الآليات الذاتية للتعافي الوظيفي [1 ، 2]. لذلك ، فإن الخلايا الجذعية تفرز مجمل جزيئات paracrine الغذائية المنبعثة من الخلايا ، وكذلك الحويصلات خارج الخلية المرتبطة بالغشاء والتي تم اقتراحها بشكل متزايد كمنتج طبي علاجي مبتكر من خلال العديد من الدراسات قبل السريرية المستقلة التي تستهدف القلب والأوعية الدموية ، والعصبية ، و / أو الالتهابات. مرض. وفقًا لذلك ، يمكن تصور الخلايا الجذعية كمصانع بيولوجية لاستغلال إفرازاتها العلاجية من خلال تقديم علاجات تجديدية جاهزة للاستخدام. من خلال تطبيق مثل هذه الإستراتيجية القائمة على الخلايا ، والخالية من الخلايا ، يمكن التغلب على العديد من الجوانب المقيدة المرتبطة بالعلاج بالخلايا الكنسية ، مع ضمان التأثيرات المفيدة.ما هو الكفالةفي هذا المنظور ، تم اختبار الخلايا اللحمية اللحمية (MSC) على نطاق واسع كمرشحين مفترض للخلايا؟ في الواقع ، تم تصميم و / أو تحفيز خلايا MSC والخلايا الجذعية / السلفية من خلال استراتيجيات تكييف مسبقة مختلفة لتعزيز قدرتها على التجدد وإمكاناتها الإفرازية [3،4] مع الاهتمام الصريح بالأهمية البيولوجية للحويصلات خارج الخلية المفرزة (EVs).

المركبات الكهربائية هي جسيمات بحجم النانو تحددها طبقة ثنائية من الدهون وتفرزها جميع أنواع الخلايا بنشاط. تشمل المركبات الكهربائية الصغيرة جدًا (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 نانومتر) ؛ تعمل كناقلات بيولوجية حرجة للإشارات بين الخلايا من خلال تسليم حمولتها الجزيئية من خلية أبوية إلى مستجيب / مستهدف واحد [5،6]. نظرًا لأن إمكاناتها الغريبة في ممارسة تأثيرات مفيدة يمكن مقارنتها بخلاياها الأصلية ، فقد نشأت المركبات الكهربائية للخلايا الجذعية كخيارات علاجية جذابة في النماذج قبل السريرية للأمراض ، مثل نقص التروية أو الالتهاب أو الإصابة ، كما تمت مراجعته على نطاق واسع في [{{3 }}]. من منظور متعدية ، بالإضافة إلى إمكانات تعديل الخلية ، تعد جدوى العزل والتجديد الذاتي المرتفع جوانب رئيسية للمصدر المثالي للمركبات الكهربائية العلاجية والعوامل القابلة للذوبان. في مثل هذا السيناريو ، قد يوفر MSC للجنين والفترة المحيطة بالولادة خيارًا مثيرًا للاهتمام نظرًا لإمكانياتهم التكاثرية ، والملف الشخصي غير الناضج من الناحية التطورية مع ميزات وسيطة بين السلالات الجسدية الجنينية والبالغين [10،11]. يمكن عزل MSC الجنيني من الملاحق الجنينية الإضافية أثناء الحمل كعينة متبقية تم الحصول عليها أثناء الفحص قبل الولادة (على سبيل المثال ، الزغابات المشيمية [12-14] والسائل الأمنيوسي [15،16]) أو الحصول عليها كأسلاف الفترة المحيطة بالولادة عند الولادة ، من مواد النفايات السريرية (مثل الأغشية التي يحيط بالجنين والمشيمة [17-21] ، ومكونات الحبل السري [22-24] ومصطلح السائل الأمنيوسي [25،26]).

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

والجدير بالذكر أن الخلايا الجذعية للسائل الأمنيوسي البشري (hAFS) قد تم تسليط الضوء عليها كاستراتيجيات علاجية واعدة في الطب التجديدي. وقد ثبت أنها متعددة القدرات على نطاق واسع في المختبر وفي الجسم الحي [16،27،28] ، وتساهم في النسب المكونة للدم بعد زراعة الرحم [29] ، وتغرس في الأعضاء المصابة أثناء ممارسة تأثيرات مناعية [26،30] وتنشيط الاستجابات التعويضية الذاتية ، كما هو موصوف بشكل شامل في [31]. أظهر فريقنا وآخرون أيضًا أن hAFS يطلق إفرازًا عالي التخصيب بجزيئات غذائية نشطة بيولوجيًا قادرة على استهداف آليات إصلاح مختلفة. تم الإبلاغ عن عوامل paracrine hAFS لتوفير محفزات مؤيدة للبقاء مع إخماد الالتهاب [32] ، وتوفير الحماية للقلب ضد نقص التروية طويل الأمد [33.34] ، والسمية القلبية [35] ، وتحفيز تكوين الأوعية الدموية المحلية مع إعادة دخول دورة خلايا عضلة القلب [32]. 34،36]. نظرًا لأن معظم هذه التأثيرات قد تم تلخيصها عن طريق إدارة hAFS-EV وحدها ، فقد ركزت الدراسات المستقلة على تشريح ملفها التجديدي ضد الخلفيات المرضية المختلفة ، بما في ذلك إصابة عضلات الهيكل العظمي والقلب ، وأمراض الكلى ، وهشاشة العظام ، وهشاشة العظام ، والتهاب الأمعاء والقولون الناخر ، والتنكس العصبي. النماذج [34 ، 37-44].

في حين أن الأدلة قد تدعم الترجمة السريرية لـ hAFS-EVs من أجل العلاج بالباراكرين في المستقبل ، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن معظم هذه الدراسات قد بحثت بشكل أساسي في الإمكانات المعدلة لـ hAFS الجنينية التي تم الحصول عليها خلال فحص ما قبل الولادة في الثلث الأخير من الحمل. الفترة المحيطة بالولادة لها نظير (أي من القسم الثالث للثلث الثالث) لم يتم استكشافها بالتفصيل. أظهرت hAFS في الفترة المحيطة بالولادة في الثلث الثالث خواصًا تنظيمية مناعية مميزة مقارنةً بخصائص الفصل الثاني والثاني [26] ، مع الحفاظ على إمكانات التجدد البطانية ذات الصلة [25].كم cistanche لاتخاذمن الجدير بالذكر أن التقرير الأخير عن التشكل غير المتجانسة لـ hAFS الجنيني [45] قد قدم رؤى جديدة في ملف تعريف الجذور والتعبير الجيني.بيوفلافونويدسوقد ألقى هذا تمامًا ضوءًا جديدًا على القيمة التجديدية للكسور الخلوية المختلفة لـ hAFS [46]. ومن ثم ، فإن التوصيف الشامل للمجموعات السكانية الفرعية المختلفة لـ hAFS يجذب انتباهًا متزايدًا. لقد أبلغنا سابقًا أن التحفيز الخالي من الأكسجين والخالي من المصل لمدة 24 ساعة يمثل استراتيجية فعالة لتعزيز إمكانات الباراكرين لـ hAFS الجنين في الثلث [34،35،37]. نظرًا لأنه لا يُعرف سوى القليل عن تكوين الإفراز من hAFS في الثلث الثالث من الحمل ، فإننا نبلغ هنا عن المقارنة الشاملة لـ hAFS مقابل في الثلث الأخير وكسورها المفرزة (بما في ذلك القبعات EVs) ، من أجل معالجة تأثير مرحلة الحمل وخلية نقص الأكسجة التكييف المسبق لخصائص الخلية والإفراز.

2. النتائج

2.1. hAFS قبل الولادة يقدم مطابقة مظهرية قريبة للجنين

لم يتم تقدير أي فرق ذي صلة إحصائيًا في عمر المتبرع بين الأثلوث الأول للجنين وعينات السائل الأمنيوسي في الثلث الثالث من الحمل. أكد الجنين c-KIT * hAFS (f-hAFS من عينات السائل الأمنيوسي في الثلث الثاني من الحمل) و c-KIT * hAFS في الفترة المحيطة بالولادة (p-hAFS من النفايات السريرية للسائل الأمنيوسي في الثلث الثالث) ميزات مماثلة مع شكل بيضاوي الشكل وشبيه بالأرومة الليفية (الشكل 1A) والنمط الظاهري اللحمية اللحمية الوسيطة (البيانات غير معروضة) ، كما ورد سابقًا [16،25]. أظهر كل من f-hAFS و p-hAFS المستزرع في المختبر حتى المقطع 5 مستويات ضئيلة من الشيخوخة من تنشيط الجالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة - - (SA - - غال) في حوالي 4 بالمائة من الخلايا (الشكل 1 ب) . قدم كل من f-hAFS و p-hAFS مستوى عاليًا من التعبير المشترك لعلامات اللحمة المتوسطة CD107a و CD146 ، والتي تم الإبلاغ عنها مؤخرًا لتعريف النمط الظاهري الإفرازي للغاية [47]. تمثل خلايا CD107at CD146 * غالبية سكان f-hAFS (حوالي 64 بالمائة ، * ص<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

الشكل 1. الجنين والفترة المحيطة بالولادة لديها تقييم النمط الظاهري. (أ) صور تمثيلية لـ hAFS الجنين (f-hAFS ، اللوحة اليسرى) و hAFS في الفترة المحيطة بالولادة (p-hAFS ، اللوحة اليمنى) المستزرعة في المختبر في ظروف قياسية ؛ شريط المقياس: 2 0 0 أم. (ب) تحليل بيتا غالاكتوزيداز علامة شيخوخة (SA - - غال ، باللون الأزرق) عبر تلطيخ الكيمياء الخلوية على f-hAFS و p-hAFS بعد 5 مقاطع في الثقافة ؛ تم الإبلاغ عن الصور التمثيلية في اللوحة اليسرى ، شريط المقياس: 200 ميكرومتر. تم الإبلاغ عن النسبة المئوية المقابلة للخلايا / الحقل الموجب -Gal في الرسم البياني باللوحة اليمنى (f-hAFS: 4.12 ± 0.58 بالمائة و p-hAFS: 3.88 ± 2.10 بالمائة ؛ p =0. 1424، n { {24}} من التجارب). (C) النمط المناعي لـ hAFS معربًا عن علامات الوسيطة CD146 و CD107a. مخططات التدفق الخلوي التمثيلية لـ f-hAFS و p-hAFS (اللوحة اليسرى) والقيم المقابلة تشير إلى خلايا CD107a موجبة مزدوجة بالإضافة إلى CD146 plus ؛ CD107a بالإضافة إلى CD146 * f-hAFS: 63.68 ± 5.82 بالمائة ، * p =0. 016 مقارنة بـ remaing36.32 ± 5.82 بالمائة f-hAFS (أخرى) ؛ CD107at CD146 بالإضافة إلى p-hAFS: 52.07 ± 6.76 بالمائة مع المتبقي 47. 93 ± 56.76 بالمائة من p-hAFS (أخرى) ؛ CD107a بالإضافة إلى CD146 بالإضافة إلى f-hAFS مقابل CD107a بالإضافة إلى CD146 بالإضافة إلى p-hAFS p =0. 2403 ، n =4 تجارب. أخرى: إجمالي المبلغ المتبقي CD107a-CD146 ~ hAFS و CD107a ~ CD146 * hAFS و CD107at CD 146- hAFS. يتم التعبير عن جميع القيم على أنها متوسط ​​± sem للتجارب المستقلة. SA - - غال: Senescence-Associated - - galactosidase.

2.2.HAFS الجنين تظهر التمثيل الغذائي مختلفة من hAFS الفترة المحيطة بالولادة

لتقييم ما إذا كانت مرحلة الحمل قد تؤثر على استقلاب الميتوكوندريا ، تم تحليل f-hAFS و p-hAFS في ظروف الثقافة المختبرية القياسية عن طريق التحليلات الكيميائية الحيوية. أظهر تقييم التمثيل الغذائي الهوائي أن معدل استهلاك الأكسجين (OCR) وتوليف ATP كان أقل في f-hAFS فيما يتعلق بـ p-hAFS ، عند تحفيزهما باستخدام البيروفات بالإضافة إلى malate (P / M ؛ *** p.<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3.التكييف المسبق ناقص التأكسج لا يؤثر على الجنين - ولفترة ما حول الولادة قابلية للبقاء وتحافظ على نشاطهما الإفرازي

من أجل تحديد تركيبات إفراز hAFS ، تمت زراعة الخلايا في ظروف خالية من المصل لتجنب أي تلوث من FBS. لقد أظهرنا سابقًا أن ظروف استنبات نقص الأكسجين لمدة 24 ساعة (SF) و 1 في المائة من O2 لم تغير بشكل كبير قابلية بقاء Ⅱtrimester الجنين hAFS (f-HAFS) ، بينما دعموا إطلاق عوامل paracrine المتجددة في وسطهم المكيف للخلايا. (hAFS-CM) وفي الحويصلات خارج الخلية (hAFS. EVs) [34،35،37،49]. هنا ، بالإضافة إلى تحديد سمات الكسور الإفرازية p-hAFS لأول مرة ، قمنا بتقييم ما إذا كان p قد قدم سلوكًا مشابهًا في ظل نفس نظام التهيئة المسبقة ، باستخدام حالة الثقافة السامة كعنصر تحكم. تم تحليل قابلية f-hAFS و p-hAFS بعد 24 ساعة في الإعدادات التالية: حالة معيارية (20 بالمائة O2) في وسط ثقافة التحكم الكامل (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo و Ctrl p-hAFSnormo) ، حالة طبيعية في وسط SF (SF f-hAFSnormo و SF p-hAFSnormo) ، حالة نقص الأكسجين (1 بالمائة O2) في وسط تحكم كامل (Ctrlf-has hypo و Ctrl p-hAFSnypo) ، وحالة نقص الأكسجين في وسط SF (SF f لديها hypo و SF p - لديه نقص ، الشكل 3 أ). لقد أكدنا أن صلاحية f-has لم تتغير في كل من ظروف Ctrl و SF وتحت تحفيز نقص التأكسج ، مع عدم تأثر أكثر من 80 بالمائة (ما يصل إلى 88 بالمائة تقريبًا) من إجمالي الخلايا. تراوحت الخلايا المبرمجة المبكرة والمتأخرة من كاليفورنيا. 13٪ إلى 18٪ في ظروف SF6 ، دون أي صلة ذات دلالة إحصائية. وبالمثل ، كانت قابلية البقاء في الفترة المحيطة بالولادة في نطاق 80-92 في المائة ، وخلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة والمتأخرة تمثل ما يصل إلى 18 في المائة في ظروف سداسي البروم. تأثر p-hAFS بشكل هامشي فقط في ظل ظروف نقص الأكسجين و SF6 مجتمعة ؛ في الواقع ، بينما لم يؤثر التكييف المسبق على بقاء الخلية عندما تمت زراعة p-hAFS في وسط كامل ، أظهرت حالة SF المقابلة زيادة بمقدار ca. 4- أضعاف (* ص<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

الشكل 2. التوصيف الأيضي للجنين وما حول الولادة. (أ) معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ، تخليق ATP من خلال F 1- FATP synthase ، ونسبة P / O في f-have and-have في وجود البيروفات بالإضافة إلى malate (P / M) أو السكسينات (Succ)؛ *** p =0. 0005، ** p =0. 0012، **** p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche أسترالياتم الإبلاغ عن مقارنة النسبة المئوية لتثبيط تخليق OCR و ATP في f-and-hAFS بسبب المثبطات المذكورة أعلاه في اللوحة السفلية B. بالنسبة لتجارب التعرف الضوئي على الحروف: hAFS بالإضافة إلى Etomoxir **** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

قمنا بعد ذلك بتقييم عائد الكسور الإفرازية التي تم الحصول عليها من f-hAFS مقابل p-hAFS بناءً على تخصيب البروتين. المجموع يحتوي على إفراز ، حيث يتم تمثيل مجمل عوامل الباراكرين التي تفرزها الخلية هنا بواسطة hAFS-CM. تركيز البروتين لـ f-hAFS-CM و p-hAFS-CM في وسط SF بعد التكييف المسبق للخلايا ناقصة التأكسج مقابل التحكم في الحالة السامة كخط أساس (أي f-hAFS-CMnormo و f-hAFS-CMNypo و P has-CMnormo و p -hAFS-CMHypo ،) عن طريق مقايسة BCA وقياسها حسب 10 § خلايا.سيستانشأشارت النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن f-has-CM و p-hAFS-CM أظهروا اتجاهًا إيجابيًا متساويًا في تخصيب البروتين بعد التهيئة الناقصة للتأكسج (f-hAFS-CMnypo'166.1 0 ± 22.13 ug / 1 0 خلايا درجة ؛ p-hAFS-CMNypo∶182.3 0 ± 29.71 ميكروغرام / 1 0 خلايا درجة） على نظائرها السامة (f-hAFS-CMnormo: 105.50 ± 19.89 ميكروغرام / 10 درجات الخلايا ؛ p- hAFS-CMhypoi 91.12 ± 24.39 ميكروغرام / 10 درجة خلايا）. وبالمثل ، تم قياس تركيز البروتين السطحي لـ hAFS-EVs في f-have-EVSnormo و f-hAFS-EVShypo و p-hAFS-EVSnormo و p-hAFS-EVShypo أظهرت المركبات الكهربائية عائدًا مشابهًا عند الحصول عليها من f-hAFS أو p-hAFS. أما بالنسبة لتركيبات hAFS-CM ، فهناك اتجاه إيجابي في زيادة محتوى البروتين في f-hAFS-EVs و p-hAFS. الحالة السامة المقابلة （f-hAFS-EVSHypo∶2.03 ± 0.67 ميكروغرام / 10 درجة من الخلايا و p-hAFS-EVSHypo∶1.85 ± 0.47 ميكروغرام / 10 درجة الخلايا ؛ f-have-EVsnormo∶1.28 ± 0.36ug / 10 درجة الخلايا و p -hAFS-EVsnormo∶1.19 ± 0.31 ميكروغرام / 10 درجة من الخلايا ، الشكل 3C).

2.4. EVs إصدار hAFS الجنين وفترة ما حول الولادة مع مورفولوجيا مماثلة وتوزيع الحجم

أدى التحليل المورفولوجي عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني (TEM) إلى زيادة انتشار إفراز EV المرتفع لكل من f-hAFS و p-hAFS (الشكل 4). لقد بحثنا أيضًا في حجم ومساحة f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs (الشكل 4 ب) بعد شروط مسبقة نقص الأكسجين مقارنة بخط الأساس الطبيعي. أطلق الجنين والفترة المحيطة بالولادة مركبات كهربائية غير متجانسة في الحجم ، في نطاق 40-250 نانومتر ، وبالتالي بما في ذلك كل من exosomes / EVs الصغيرة والحويصلات الدقيقة / الحويصلات المتساقطة. كان متوسط ​​حجم EVs / الحقل في المجموعات المختلفة قابلاً للمقارنة ، حيث تم قياس hAFS-EVs الجنينية 90-100 نانومتر (f-hAFS-EVsnormo: 104. 00 ± 3. 00 نانومتر ؛ f - لديها EVSHvpo: 97.10 ± 10.10 نانومتر) وتلك التي تم قياسها في الفترة المحيطة بالولادة 70-114 نانومتر (p-hAFS-EVsnormo: 94.60 ± 19.53 nm؛ p-hAFS-EVShypo: 76.43 ± 4. 86 نانومتر ، الشكل 4B ، اللوحة اليسرى). أما بالنسبة للإنتاجية ، فقد أظهر hAFS المحفز تحت نقص الأكسجة اتجاهًا إيجابيًا في زيادة كمية المركبات الكهربائية الصغيرة ، على الرغم من أن هذه الزيادة لم تكن ذات دلالة إحصائية. قاس f-hAFS-EVStypo 40-70 نانومتر والذي كان تقريبًا ضعف ذلك مقارنة بنظيره المعياري. كانت الفترة المحيطة بالولادة - لديها - EVSHypo التي تقاس 40-70 نانومتر و 70-100 نانومتر و 100-130 نانومتر تقريبًا ثلاثة أضعاف تلك التي تم الحصول عليها في الثقافة السامة (الشكل 4 ب).

أظهر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) عددًا مرتفعًا من الجسيمات في كل من تحضيرات f-hAFS-EV و p-hAFS-EV ، وأكد زيادة المركبات الكهربائية في عينات نقص الأكسجين ، كما لوحظ أيضًا من التحليلات السابقة (f-hAFS- EVsnormo: 182 ± 0. 1 0 'جسيم / 1 0 خلايا درجة ؛ f-have-EVshypo: 3.3 0 ± 0.22 × 10 جسيمات / 10 درجات خلايا ؛ p-hAFS-EVsnormo: 2.43 ± 0.80 × 10 جسيمات درجة / 10 خلايا درجة ؛ p-hAFS-EVshypo: 3.05 ± 0.62 × 10 جسيمات / 10 خلايا درجة ، الشكل 4C).

الشكل 4. التوصيف المورفولوجي للجنين وفي الفترة المحيطة بالولادة لديهم EVs. (أ) صور تمثيلية للمجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) لـ f-hAFS و p-hAFS (اللوحة اليسرى العلوية والسفلية ، على التوالي ، مع أسهم سوداء تشير إلى أجسام متعددة الحويصلات داخل الهيولى مع EVs / exosomes صغيرة بداخلها) ، و f -hAFS-EVs و p-hAFS-EVs (اللوحة اليمنى العلوية والسفلية ، على التوالي) التي تم إطلاقها في ظروف خالية من المصل وتحت ظروف سامة مقابل ظروف ناقصة التأكسج (f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo ؛ و f-hAFS-EVshypo ، على التوالي) ، أشرطة مقياس: 200 نانومتر. (ب) اللوحة اليسرى: تحليل TEM لتوزيع حجم hAFS-EVs ؛ اللوحة اليمنى: تم النظر في توزيع عدد f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs لكل فترات حجم المجال من 40 نانومتر حتى 250 نانومتر ؛ يتم التعبير عن القيم على أنها متوسط ​​± sem من n =3 تجارب مستقلة. (ج) تحليل تتبع الجسيمات النانوية لحجم وتوزيع hAFS. اللوحة اليسرى: صورة تمثيلية للإخراج الرسومي ؛ اللوحة اليمنى: تركيز hAFS-EVs يقاس بجزيئات 10 درجة لكل خلايا إفراز 10 درجة ؛ نانومتر: نانومتر. مل: مليلتر.

2.5.التوصيف البروتيني للجنين مقابل hAFS يسلط الضوء على الاختلافات في تكوين إفرازهم وفقًا لعمر الحمل والتكييف المسبق ناقص التأكسج

تم إجراء التوصيف البروتيني لكل من تركيبات إفراز f-hAFS و p-hAFS عن طريق منصة خالية من الملصقات ، بناءً على اقتران كروماتوجرافيا السائل النانوي وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة (nLC-HRMS). تم الحصول على ثمانية وأربعين ملفًا جانبيًا بروتينيًا من خلال التحليل المكرر لثلاث مكررات بيولوجية لـ hAFS-CM ولديها EVs من f-hAFS و p-hAFS التي تخضع لخلية ناقصة التأكسج مقارنة بحالة السمية السامة كعنصر تحكم. تم تحديد ما مجموعه 4179 مجموعة بروتينية مميزة مع ببتيد فريد واحد على الأقل وبأوزان جزيئية تتراوح من 2 إلى 3900 كيلو دالتون ونقاط متساوية الكهرباء من 3.6 إلى 13. ولوحظ متوسط ​​تعبير بروتين أعلى في hAFS-EVs عند مقارنتها بـ hAFS-CM . تم إجراء محاذاة جميع قوائم البروتين التي تم الحصول عليها على أساس البروتينات المحددة. لكل حالة تجريبية ، تم إنشاء قائمة فريدة لتطبيع ومتوسط ​​[50] قيم تطابق طيف الببتيد (PSMs) المنسوبة إلى البروتينات ، والتي تمثل عدد أطياف الكتلة المخصصة لكل منها وتمثل بشكل غير مباشر وفرتها في العينات. تم الإبلاغ عن القائمة الكاملة للبروتينات المحددة في تركيبات hAFS-CM و have-EV في الجدول S1.

سمح تطبيق تحليل التمايز الخطي (LDA [51]) في هذه القائمة الرئيسية باستخراج بروتينات ذات دلالة إحصائية (Fratio أكبر من أو يساوي 4.5 و ** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 في تركيبات hAFS-CM و have-EV يتم النظر فيها بشكل منفصل. بينما تمت مشاركة حوالي 69.5 بالمائة و 69.9 بالمائة من البروتينات بين ظروف hAFS-EVs و hAFS-CM على التوالي ، ظهر المحتوى المتبقي حصريًا بنسب مختلفة ، تتراوح من 3.7 بالمائة إلى 13.4 بالمائة ، بين الصيغ.

لفحص التغييرات البروتينية كميًا ، تم إجراء تحليل تفاضلي خالٍ من الملصقات باستخدام برنامج MAProMa محلي الصنع وتطبيق خوارزميتين ، DAve (المتوسط ​​التفاضلي) و DCI (مؤشر الثقة التفاضلي ، الذي يمثل النسبة والثقة في التعبير التفاضلي ، على التوالي) ، على PSMs لكل بروتين واحد بين المصطلحين المقارنين. استخدام مرشحات صارمة لـ DAve و DCI لزيادة الثقة في تحديد الهوية والنظر في البروتينات ذات التباين الأكبر من تغيير أضعاف بمقدار 1.5 ، والمقارنات الزوجية بين f-hAFS-CM مقابل p-hAFS-CM و f-hAFS-EVs مقابل تم تصنيع p-hAFS-EVs وفقًا لمرحلة حمل الخلية. تم العثور على ما مجموعه 58 و 109 بروتينات معبرًا عنها بشكل تفاضلي في المقصورات التي تحتوي على CM و have-EV ، على التوالي ، (الشكل S1B ، C للحصول على تفاصيل محددة والجداول S 2- S3 في شكل ممتد). من بين هذه ، تم تنظيم 30 بروتينًا في f-hAFS-CM و 28 تم تنظيمها في p-hAFS-CM (الشكل S1B) ؛ وبالمثل ، نتج عن 44 بروتينًا متميزًا تنظيمها في f-have-EVs و 65 تم تنظيمها في p-hAFS-EVs (الشكل S1C). والجدير بالذكر أن البروتينات التي أدت إلى زيادة التنظيم في f-have يجب اعتبارها خاضعة للتنظيم المنخفض في p-has والعكس صحيح.

تم الإبلاغ عن القيم ؛ انظر الجدول S2 للحصول على القائمة الكاملة والمعلمات التفصيلية للبروتينات المبلغ عنها. (ج) تحليل إثراء العمليات البيولوجية للبروتينات المحددة بتردد لا يقل عن 2 في hAFS-CM الجنين (اللوحة اليسرى) وفترة ما حول الولادة have-CM (اللوحة اليمنى) وفقًا للتكييف المسبق لنقص الأكسجة في الخلية. استنادًا إلى أداة FunRich ، يتم عرض مصطلحات علم الجينات في المخططات الشريطية التي توضح النسبة المئوية للجينات المخصبة لكل فئة (أشرطة وردية لـ-have-CMnormo ، أشرطة أرجوانية لـ f-hAFS-CMhypor أشرطة زرقاء فاتحة لـ p-hAFS-CMnormo ، والكرات الزرقاء لـ p-hAFS-CMhypo).شراء cistancheفقط المصطلحات الأنطولوجية الجينية مع Bonferroni مصححة بـ * p<0.05 are="">

تم استخراج هذه المقالة من Int. J. مول. علوم. 2021 ، 22 ، 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms