التحكم الانضباطي بوساطة كريسبري في مستوى التعبير الجيني باستخدام الحمض النووي الريبي (RNA) أحادي الدليل الهندسي في الإشريكية القولونية

خلاصة

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-أضعاف). مكنت هذه sgRNAs أيضًا من التنظيم المعياري مع تسلسلات الحمض النووي المستهدفة المختلفة. قمنا بتطبيق هذا النظام لإعادة توزيع التدفق الأيضي لإنتاج مشتقات الفيولاسين بنسبة يمكن التنبؤ بها وتحسين إنتاج اللايكوبين. سيساعد هذا النظام في تسريع عمليات تحسين التدفق في الهندسة الأيضية والبيولوجيا التركيبية.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

مقدمة

النوع الثاني من التكرارات المتناوبة القصيرة المتجمعة بانتظام (CRISPR)/النظام المرتبط بـ CRISPR (Cas) هو نظام انقسام الحمض النووي الموجه بالحمض النووي الريبي (RNA) ويتكون من CRISPR RNA (crRNA)، وCRISPR RNA المنشط (tracrRNA) وبروتين Cas9 (1). ،2). تم استخدام Cas9 من Streptococcus pyogenes على نطاق واسع في هندسة الجينوم نظرًا لخصائصه المميزة (3،4). يرتبط مركب بروتين spCas9 وtracrRNA وcrRNA بربط فاصل بروتوسبيسر الحمض النووي المستهدف المكمل للتسلسل المباعد المكون من 20 نيوكليوتيدات (nt) من crRNA في وجود 5'-NGG-3' نموذج مجاور لفاصل أولي (PAM) ) التسلسل (5،6). لتبسيط النظام، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي (RNA) ذو الدليل الخيميري الفردي (sgRNA) حيث يتم ربط crRNA وtracrRNA بواسطة رابط اصطناعي يسمى tetraloop (5). فهو يسمح باستبدال اثنين من RNAs المنفصلين بجزيء RNA واحد، مما يجعل النظام أكثر قابلية للإدارة. يستخدم أحد الأنظمة المعتمدة على كريسبر، وهو تداخل كريسبر (CRISPRi)، Cas9 (dCas9) غير النشط تحفيزيًا عن طريق استبدال أحماض أمينية معينة من كل مجال نوكلياز داخلي (7). يؤدي هذا التعديل إلى إنشاء مركب البروتين النووي الريبي (RNP) الذي يمكنه توجيه الحمض النووي المستهدف والارتباط به ويتداخل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) لمنع بدء النسخ أو الاستطالة (7). على النقيض من الضربة القاضية بواسطة نظام كريسبر/كاس9، يسمح كريسبر بالضربة القاضية العكسية للجينات عن طريق التعبير عن dCas9 أو sgRNA تحت مروج محفز، مما يسمح بمزيد من المرونة في تنظيم الجينات (7). لقد نجح نظام كريسبري في إسكات الجينات المستهدفة بشكل فعال مئات المرات (7،8). يتيح قمع الجينات الخاصة بالهدف إجراء تنميط ظاهري عالي الإنتاجية باستخدام مجموعة sgRNA على مستوى الجينوم (9) أو إعادة توجيه تدفق الكربون في البكتيريا المهندسة نحو المادة الكيميائية المستهدفة (10-12). بالإضافة إلى ذلك، تم إثبات تعدد إرسال CRISPRi في العديد من المضيفين باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب للتعبير بشكل ثابت عن sgRNAs المتعددة، بما في ذلك صفائف crRNA الطويلة، وتكامل مفتاح موطئ القدم، ومصفوفات sgRNA ذات الطول الإضافي غير المتكررة (13-16). تم استخدام هذه التقنيات لتثبيط جينات متعددة في وقت واحد لأداء مهام أكثر تعقيدًا، مثل تقليل الوسائط السامة أو منع المسارات المتنافسة في التخمر البكتيري (13،16-19). ومع ذلك، فإن القمع الكامل ليس مرغوبًا دائمًا في الهندسة الأيضية. يجب التحكم بدقة في مستويات التعبير الجيني لتحقيق نشاط الإنزيم الأمثل بين مسارات النمو والإنتاج، وتحقيق التوازن في تركيزات السلائف داخل الخلايا وتجنب تراكم المواد الوسيطة السامة (20-22). وقد تم تطوير تقنيات مختلفة لهندسة كفاءة القمع لكريسبري. تم التلاعب بعدة عوامل، مثل كمية البروتين sgRNA وdCas9 أو اختيار sgRNA. التحكم في تعبير dCas9 أو تعبير dCas9 و sgRNA باستخدام مروج محفز ينظم التعبير الجيني المستهدف بأكثر من 30-fold أو 300-fold، على التوالي (23،24). ومع ذلك، فقد لوحظ أن تعديل تركيز dCas9 يمكن أن يؤدي إلى كفاءة قمع غير متناسقة على الفواصل الأولية المختلفة (23). كما أن العدد المحدود من المروجين المحفزين المتاحين يشكل تحديات في التصميم على الرغم من الجهود العديدة (25). تتمثل الإستراتيجية الأخرى في إدخال أبتمر RNA خاص بالربيط في sgRNA، حيث يمكن لجزيء صغير مشابه أن يكشف المباعد، وبالتالي تمكين التحكم المعتمد على الجرعة في CRISPRi (26). يكون sgRNA الخاص بالربيطة مفيدًا في حالة توفر زوج مناسب من الليجند والأبتامير. تؤثر المسافة من موقع بدء النسخ واتجاه ربط dCas9 أيضًا على كفاءة CRISPRi (7). يمكن أن يؤدي ضبط المسافة بين موقع ربط sgRNA وموقع بدء النسخ إلى تحسين المسار في الهندسة الأيضية (17،27،28). تعمل كفاءة التهجين بين تسلسل المباعد والفاصل الأولي أيضًا على تغيير كفاءة الارتباط المعقدة لـ RNP (29-31). ولذلك، تم إدخال حالات عدم التطابق المصممة خارج منطقة البذور لتغيير الطاقة الحرة لتنويع كفاءة كريسبري (31،32). ومع ذلك، فإن تصميم sgRNA مطلوب لكل تسلسل مستهدف جديد، وتحقيق فرق كبير في الطاقة الحرة من خلال عدم التطابق فقط يمكن أن يكون أمرًا صعبًا. علاوة على ذلك، هناك احتمال لزيادة الارتباط خارج الهدف (33). ومع ذلك، فإنه لا يزال يقتصر على قمع التعبيرات الجينية المتعددة بدقة بطريقة معيارية بغض النظر عن التسلسل المستهدف. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير نظام CRISPRi قابل للضبط ينظم التعبير الجيني بدقة عالية وإمكانية التنبؤ. من خلال الفرز التكراري للخلايا المستندة إلى التألق لمكتبة sgRNA التي تستهدف رباعي الحلقات والمنطقة المحيطة بها، حققنا كفاءات في القمع النسخي تصل إلى 45- أضعاف حتى عند تغيير الحمض النووي المستهدف. يسمح هذا النظام بإعادة التوزيع المتوقع للتدفق الأيضي دون التلاعب بالجينوم المضيف أو المسارات الاصطناعية، مما يوفر أداة واعدة لتحسين المسارات الأيضية.

المواد والأساليب

السلالات البكتيرية والبلازميدات والكواشف

يتم سرد سلالات الإشريكية القولونية والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي S1. يتم سرد الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول التكميلي S2. يتم وصف إجراءات الاستنساخ في الطرق التكميلية. تظهر الجينات المستهدفة وتسلسلات الحمض النووي المستهدفة لنظام كريسبر في الجدول التكميلي S3. تم استخدام Mach1-T1R للاستنساخ العام. تم إنشاء المكتبة باستخدام NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). تم إجراء المزارع الروتينية لبناء البلازميدات والسلالات عند 37 درجة مئوية في مرق لوريا بيرتاني (LB) أو على طبق أجار LB يحتوي على مضادات حيوية مناسبة (34 جم/مل كلورامفينيكول، 50 جم/مل سبكتينومايسين). تم إجراء PCR باستخدام Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). تمت تنقية البلازميدات ومنتجات PCR باستخدام GeneAll® Exprep ™ Plasmid SV Kit وGel SV Kit (GeneAll Biotechnology). تم تحديث كفاءة القمع لطفرات sgRNA بين عشية وضحاها إلى OD6 00 من 0.05 واحتضانها حتى وصلت إلى قيمة تتراوح بين 0.6 و0.8. تم بعد ذلك تخفيف وسط الثقافة إلى OD600 بقيمة 0.05 مع 20 نانوغرام / مل من aTc واحتضانها لمدة 4 ساعات. تم قياس مضان مستعمرة واحدة عند 575 نانومتر / 616 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة Hidex Sense (Hidex)، وتم تحديد قيمة OD600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي Jenway 7300 (Jenway). تم حساب التألق النسبي كوحدات التألق لكل قيمة OD600، مع تعيين قيمة الكمبيوتر الشخصي على 100%.

آثار Cistanche tubulosa-علاج الإمساك

فحص مكتبة sgRNA

تم استخدام نفس الطريقة الثقافية الموصوفة أعلاه. تم تخفيف وسائل الإعلام الثقافية إلى [الخلية]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

استخراج الحمض النووي الريبي

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام RNeasy Mini Kit (Qiagen) فقط عند استخدام miRNeasy Mini Kit (Qiagen) لتقدير sgRNA، بعد العلاج باستخدام RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) والتخزين عند -80 درجة مئوية. تم إجراء عملية هضم الحمض النووي على العمود باستخدام مجموعة DNase الخالية من RNase (Qiagen) أثناء عملية الاستخراج. تم التحقق من تلوث الحمض النووي من خلال PCR دون النسخ العكسي. تم تحديد تركيز ونقاء كل عينة باستخدام NanoDrop One (Thermo Scientific)، وتم تقييم الجودة باستخدام DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) على LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

تحليل RT-qPCR

تم الحصول على الاشعال لـ RT-qPCR إما من مخزون المختبر أو تم تصميمها باستخدام أداة Primer3Plus (34) وتم إدراجها في الجدول التكميلي S4. تم استخدام جين CysG كجين مرجعي (35) لجميع تجارب RT-qPCR. تم إنشاء منحنى قياسي بواسطة 10- أضعاف تمييع القالب من 107 نسخة/ لتر إلى 10−1 نسخة/ لتر. تم تحديد الحد الكمي عن طريق تركيب رقم النسخة ومعدل التضخيم الإيجابي على وظيفة السيني وحساب قيمة رقم النسخة الإيجابية بنسبة 95٪. تم تعريف النطاق الديناميكي الخطي على أنه أقل رقم نسخة يكون فيه تباين Cq المحسوب مرة أخرى أقل من 35٪. تم التحقق من صحة قيم Cq التي تزيد عن 30 أو تلك التي لم يتم تضخيمها في التحكم غير القالبي. تتوفر بيانات المنحنى القياسي في الجدول التكميلي S5 والشكل التكميلي S1. تم استخدام إجمالي 2.5 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) في تفاعل RT-qPCR سعة 10 لتر مع Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). تم إجراء RT-PCR في ثلاث نسخ على نظام StepOnePlus™ RealTime PCR (النظم البيولوجية التطبيقية) مع الخطوات التالية: (1) النسخ العكسي عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، يليه تمسخ الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ (2) 40 دورة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ و60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ (3) تحليل منحنى الذوبان عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، يليه منحدر من 60 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية بمعدل 0.3 درجة مئوية / دقيقة. تم تحديد القياس الكمي النسبي للحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام طريقة delta-deltaCt (36) وتم تحليله باستخدام برنامج StepOnePlus™ (النظم البيولوجية التطبيقية).

تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) وتحليل البيانات

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 استنادًا إلى FPKM (أجزاء لكل كيلو قاعدة من النصوص لكل مليون قراءة معينة). تم الحصول على الجينات المعبر عنها تفاضليًا من عتبة 1.5 (يعتمد على السجل 2-) و0.01 (قيمة q).

إنتاج وأخذ العينات من البروفيولاسين والبروديوكسي فيولاسين

لإنتاج الكمان والبرودوكسي فيولاسين، تم استخدام التركيبة المتوسطة التالية: 10.7 جم/لتر K2HPO4، 5.2 جم/لتر KH2PO4،1 جم/لتر NaCl، 1 جم/لتر NH4Cl، 1 جم/لتر MgSO4، { {17}}.2 جرام/لتر خلاصة الخميرة و1{{20}} جرام/لتر جلوكوز. تم تحديث وسائط الثقافة الليلية إلى OD600 من 0.1 وتم تربيتها حتى وصل OD600 إلى ما بين 0.6 و0.8. تم بعد ذلك تخفيف وسط الثقافة إلى OD600 بقيمة 0.1 واستكمل بـ 500 نانوغرام / مل aTc و 0.05 ملي مولار IPTG و 0.1 جم / لتر تريبتوفان إلى حجم نهائي قدره 5 مل. تم أخذ عينات من 300 لتر من وسائط الثقافة وطردها عند 14 000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق للحصول على حبيبة خلية لتحليل HPLC، وتم أخذ عينات من 300 لتر من وسائط الثقافة لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA).

تحليل HPLC

لتحليل مسار التخليق الحيوي للفيولاسين، تمت إعادة تعليق حبيبة الخلية في حجم الميثانول {{0}}، وصوتنة لمدة 5 دقائق، وطردها مركزيًا، وتصفيتها من خلال 0.22- م مرشح نايلون. اتبع تحليل HPLC الطريقة (42) باستخدام Poroshell 120 EC-C18، 4.6 × 150 مم، عمود 4 م (Agilent). تم استخدام مرحلتين متحركتين، A مع حمض الفورميك بنسبة 0.1% في DDW وB مع حمض الفورميك بنسبة 0.1% في الأسيتونيتريل، بمعدل تدفق قدره 0.6 مل/دقيقة مع ملف التدرج التالي: 95% A لمدة 1.5 دقيقة، والانحدار A من 95 % إلى 2% لمدة 4 دقائق، والحفاظ على 2% A لمدة دقيقتين، والارتقاء A من 2% إلى 95% لمدة 30 ثانية، والحفاظ على 95% A لمدة 10 دقائق. تم الكشف عن العينات باستخدام كاشف PDA، وتم تحديد منطقة HPLC عند 600 نانومتر للفيولاسين و610 نانومتر للبرودوكسي فيولاسين.

إنتاج الليكوبين وأخذ العينات

لإنتاج اللايكوبين، تم استخدام التركيبة المتوسطة التالية: 13.56 جم/لتر Na2HPO4،6 جم/لتر KH2PO4،2 جم NH4Cl، 1 جم NaCl، 2 مل من 1 M MgSO4، 0.1 مل من 1 M CaCl2 و4 جم/لتر من الجلوكوز (22). تم استخدام 27 جم/مل كلورامفينيكول و50 جم/مل سبكتينومايسين. تم تحديث وسائط الثقافة الليلية إلى OD600 من 0.1 إلى الحجم النهائي البالغ 5 مل. عندما يصل OD600 إلى ما بين 0.5 و0.6، تتم إضافة aTc إلى التركيز النهائي البالغ 500 نانوغرام/مل، وعندما يصل OD600 إلى ما بين 0.9 و1، تتم إضافة IPTG إلى التركيز النهائي البالغ 0.02 مم. تم استخلاص اللايكوبين باستخدام الأسيتون، كما هو موضح في المرجع (22). تم الحصول على تركيز اللايكوبين من الامتصاصية عند 475 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Jenway 7300 باستخدام منحنى قياسي. تم أخذ عينات من 300 لتر من وسائط الثقافة لاستخراج الحمض النووي الريبي.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

النتائج والمناقشة

آثار الطفرات في sgRNA على كفاءة القمع لنظام كريسبر

يمكن لنظام CRISPRi قمع التعبير الجيني عندما يرتبط المركب الثلاثي dCas9-sgRNA-DNA معًا بقوة. لقد افترضنا أن كفاءة القمع لنظام CRISPRi يمكن تغييرها إلى مستوى معين عن طريق تعديل تكوين مجمع RNP. لقياس كفاءة القمع لنظام كريسبر، قمنا بتصميم نظام الإبلاغ عن مضان يعتمد على الدائرة الوراثية حيث يتم تحفيز dCas9 من S. pyogenes بواسطة أنهيدروتتراسيكلين (aTc)، ويتم التعبير عن كل من جينات المراسل (mCherry) ومتغيرات sgRNA بشكل أساسي (الشكل 1 أ). بمجرد إضافة aTc إلى الوسط، يمنع المركب الثلاثي dCas9 – sgRNA – DNA نسخ جين المراسل، ويشير مستوى التألق عكسيًا إلى كفاءة القمع لنظام كريسبر. يحتوي sgRNA على 96 نيوكليوتيدات (nt) في المجموع. ترتبط منطقة المباعد (أول 20 نقطة) بتسلسل الحمض النووي المستهدف، بينما تساهم المناطق الـ 76 الأخرى في التكوين المعقد والاستقرار. نظرًا لأن عدم التطابق في منطقة المباعد قد يفقد الخصوصية ويزيد من التأثيرات غير المستهدفة في النظام القائم على كريسبر (33،43)، فإن الحد الأقصى لطول sgRNA الذي يمكن هندسته هو 76 nts. في هذه الحالة، يجب الحصول على مكتبة بحجم 476 (1045 تقريبًا)، ولكنها كبيرة جدًا بحيث لا يمكن إنشاؤها. وبالتالي، فهو مطلوب لتضييق حجم المكتبة عن طريق تحديد مواقف محددة على سجرنا. لقد بحثنا أولاً في كيفية تأثير الطفرات في sgRNA في كل منطقة على القمع في نظام كريسبر. ذكرت دراسة سابقة أن الطفرات في حلقة الجذع 1 (sg mut01 وsg mut02) أدت إلى انخفاض كبير في نشاط نوكلياز Cas9، في حين أن الطفرات في حلقة الجذع 2 (sg mut03) أو حلقة الجذع 3 (sg mut04) لم يؤثر على نشاطه (44). إن sgRNA المعاد بناؤه (sg mut05) الذي يحتوي على طفرات في منطقة حلقة الجذع 1 ومناطق التكرار والرباعي والمضاد للتكرار والحلقة الجذعية 2 أدى أيضًا إلى انخفاض نشاط نوكلياز (44). ومع ذلك، في نظام CRISPRi، كان لجميع متغيرات sgRNA الخمسة تأثير ضئيل على كفاءة القمع مقارنةً بـ sgRNA من النوع البري (sg WT)، حيث يُظهر كل متغير مستوى مضان بنسبة 2-4٪ مقارنة بالتحكم الإيجابي بدون منطقة فاصل ( سان جرمان PC) (الشكل 1B). تشير هذه النتائج إلى أن تكوين مجمع dCas9-sgRNA أقل حساسية لتعديل التسلسل في منطقة حلقة الجذع 1 في نظام CRISPRi، على عكس نظام CRISPR/Cas9. لقد افترضنا أن إزالة المناطق المرتبطة باستقرار المجمع يمكن أن تكون نقطة انطلاق للتحكم في التعبير على مستويات متعددة بشكل أكبر. ولتحقيق هذه الغاية، قمنا ببناء sgRNA مبتورًا (sg trcSL1) يفتقر إلى الرابط، وحلقة الجذع 2، وحلقة الجذع 3. يحتوي هذا sgRNA المبتور على عدد قليل من المكونات وقد ثبت أنه يقلل بشكل كبير من نشاط نوكلياز في CRISPR/ نظام Cas9 (5,44). عند اختباره في نظام كريسبري، أظهر هذا المتحول المعيب مستوى مضان بنسبة 8٪ مقارنة بـ sg PC، مما يشير إلى أنه لا يزال بإمكانه الارتباط بـ dCas9 وقمع الجين محل الاهتمام عند مستوى معين حتى مع انخفاض الاستقرار المعقد الثلاثي (الشكل 1B). يشير التحليل الهيكلي لمجمع RNP إلى أن مناطق الرابط والحلقة الجذعية 2 والحلقة الجذعية 3 في sgRNA مسؤولة عن تثبيت المجمع من خلال تفاعلاتها مع مجال nuclease لـ dCas9، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في indel الكفاءة في نظام كريسبر/Cas9 (44). في المقابل، التكرار: منطقة مكافحة التكرار والحلقة الجذعية 1 من sgRNA تتفاعل بشكل أساسي مع مجال التعرف ومجال تفاعل PAM الخاص بـ dCas9 ولا تؤثر بشكل كبير على كفاءة indel في نظام CRISPR/Cas9 (44). تدعم هذه النتيجة الملاحظة التي تفيد بأن sg trcSL1 أظهر انخفاضًا كبيرًا في نشاط النيوكلاز في نظام CRISPR/Cas9 بينما يؤثر بشكل طفيف فقط على تقارب الارتباط في نظام CRISPRi.

الشكل 1. بناء النظام وتأثيره على كفاءة القمع بواسطة طفرة sgRNA. (أ) نظام البلازميدات للقياس الكمي لكفاءة القمع. يحتوي أحد البلازميد ذو أصل p15A على جين dCas9 تحت مروج محفز aTc وجين mCherry تحت مروج تأسيسي. يحتوي البلازميد الآخر ذو أصل cloDF13 على sgRNA من النوع البري أو المتحول تحت مروج تأسيسي. (ب) مضان نسبي لكل متحولة sgRNA (sg mut01 ∼ sg mut05 وsg trcSL1) وsg WT مقارنة مع sg PC. +1 إلى + 20 هي التسلسل الفاصل الذي يرتبط بجين mCherry. sg PC: sgRNA بدون فاصل كعنصر تحكم إيجابي، sg WT: sgRNA من النوع البري. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (ن=3). تم تحديد القيم P بواسطة اختبار t غير المقيد. ns: غير مهم، **P< 0.01

تغيير كفاءة التكوين المعقدة للتحكم في التعبير متعدد المستويات

Tetraloop عبارة عن رابط اصطناعي يربط بين crRNA وtracrRNA في نظام CRISPR-Cas9 (5). أظهر التركيب البلوري للمجمع الثلاثي، المكون من dCas9 وcrRNA وtracrRNA، أن رباعي الحلقات والمناطق المحيطة به 5 و3 لها اتصال قليل مع dCas9 (44). في الوقت نفسه، تعتبر مناطق التكرار: المناطق المضادة للتكرار والحلقة الجذعية 1 حاسمة بالنسبة للمجمع الوظيفي (44). نظرًا لأنه لا يتفاعل بشكل مباشر مع dCas9، فقد تم استكشاف رباعي الحلقات والمناطق المحيطة به كمواقع محتملة لهندسة sgRNA بمكونات إضافية، مثل دمج تسلسلات الأبتمر لتجنيد بروتينات إضافية في sgRNA (45،46). من المعقول أن تؤدي الطفرات في هذه المنطقة إلى تنويع التقارب الملزم بين sgRNA وdCas9 دون تعطيل المجمع بالكامل. تم إنشاء مكتبة عشوائية 12- mer (4 nt من منطقة tetraloop و 4 nt من 5 و 3 مناطق جانبية، على التوالي) باستخدام sg trcSL1 كقالب لزيادة خفض كفاءة التكوين المعقد بين sgRNA و dCas9 (الشكل 2A) ). طبقنا استراتيجية فرز من خطوتين للحصول على طفرات sgRNA المختلفة التي تغطي كفاءة القمع بين sg WT (حالة القمع الكاملة) وsg PC (الحالة غير القمعية). قمنا بتقسيم المكتبة الأصلية إلى مكتبات أصغر بنطاقات مختلفة لكثافة الفلورسنت، ثم حددنا بشكل فردي مضان كل متغير sgRNA من المكتبة الأصغر. كان توزيع مضان المكتبة الأصلية التي تم الحصول عليها عن طريق قياس التدفق الخلوي مطابقًا تقريبًا لتوزيع sg PC (الشكل 2B). ومع ذلك، بعد ثلاث خطوات فرز متتالية، كان لدى كل مكتبة (عالية ومتوسطة ومنخفضة) 63٪ ​​و24٪ و14٪ من مستويات الفلورسنت المتوسطة مقارنة بجهاز الكمبيوتر الشخصي، على التوالي (الشكل 2B). تم عزل اثنين وثمانين مستعمرة من هذه المكتبات الصغيرة، مع مستويات مضان تتراوح من 8٪ إلى 104٪ (الشكل 2C). تشير هذه النتائج إلى أن رباعي الحلقات المتحور والمنطقة المحيطة به من sgRNA يمكن أن يعدل التقارب الملزم بين dCas9 وsgRNA لمختلف كفاءات القمع. أظهر التحليل الكمي للنسخ العكسي PCR (RT-qPCR) لـ 10 طفرات sgRNA (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10، الجدول التكميلي S6) مع إشارات مضان مختلفة بين sg WT و sg PC بين 82 مستعمرة sgRNA أن مستويات التألق زادت خطيًا مع زيادة نصوص mCherry ، مما يشير إلى أن نظام CRISPRi الخاص بنا يتحكم في التعبير الجيني على المستوى النسخي (الشكل التكميلي S2). يستخدم نظام CRISPRi القابل للضبط لدينا sgRNAs المُصممة هندسيًا، والتي يمكنها تحقيق ما يصل إلى 45-أضعاف التحكم في القمع، مما يسمح بضبط كفاءة القمع دون تغيير كميات dCas9 أو sgRNA. من المزايا الملحوظة لنظامنا أنه يمكنه ضبط كفاءة القمع من خلال متغيرات sgRNA محددة دون احتمال حدوث عواقب غير مقصودة، على الرغم من الحاجة إلى استنساخ إضافي. علاوة على ذلك، يشير منحنى النمو إلى أن نظامنا لا يفرض عبئًا خلويًا كبيرًا (الشكل التكميلي S3). علاوة على ذلك، أظهر RNA-Seq على ثلاثة متغيرات sg trcSL1 بمستويات متفاوتة من كفاءة القمع أنه تم تغيير التعبير عن 51 إلى 83 جينًا، على عكس الجينات الـ 262 التي تم تغييرها في sg WT (الشكل التكميلي S4). تشير هذه النتائج إلى أن متغيرات sg trcSL1 كان لها تأثيرات بعيدة عن الهدف أقل من نظام CRISPRi التقليدي. وهو ذو أهمية خاصة في تطبيقات الهندسة الأيضية، حيث غالبًا ما يتضمن تحسين المسارات الأيضية معالجة جينات متعددة. إن القدرة على ضبط التعبير الجيني دون التسبب في آثار جانبية سلبية يمكن أن تؤدي إلى تسريع عملية التحسين بشكل كبير وتحسين الكفاءة والإنتاجية العامة للنظام.

الشكل 2. هيكل مكتبة سجرنا وفحص المكتبة. (أ) سقالة sgRNA المستخدمة في هذه الدراسة. 12-تم تحوير mer الذي يحتوي على رباعي الحلقات والتسلسل المرافق له بشكل عشوائي من sg trcSL1 للحصول على مكتبة sgRNA. (ب) توزيع الإسفار الذي تم الحصول عليه من قياس التدفق الخلوي قبل الفرز (يسار) وبعد (يمين). يحتوي كل توزيع على 100,000 خلية. (ج) مضان المستعمرات المفردة التي تم الحصول عليها من (ب). تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (ن=2).

آثار كمية dCas9 وsgRNA على كفاءة القمع

وبما أن تعديل كمية dCas9 أو sgRNA يمكن أن يغير كفاءة القمع لنظام CRISPRi (23,24)، فمن الضروري دراسة تأثير كمية dCas9 وsgRNA على كفاءة القمع. اختبرنا أداء نظامنا في ظل ظروف مختلفة عن طريق تغيير كميات dCas9 وsgRNA باستخدام عشرة طفرات sgRNA (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10). تم استخدام ثلاثة تركيزات مختلفة (20، 100، و 500 نانوغرام / مل) من المحفز للتعبير عن dCas9. مقارنةً بمستوى dCas9 mRNA عند استخدام 20 نانوغرام / مل من المحفز، تمت زيادته بمقدار 15- أضعاف (100 نانوغرام / مل) و22- أضعاف (500 نانوغرام / مل) (الشكل التكميلي S5A) ). هناك مخاوف بشأن الإفراط في التعبير عن dCas9 نظرًا لأن المستوى العالي من dCas9 قد يكون سامًا للخلايا (47،48) أو في بعض الأحيان لا (49). ومع ذلك، انخفض معدل النمو بأقل من 10% عند استخدام ما يصل إلى 500 نانوغرام/مل من aTc، وفقًا لمنحنيات النمو بتركيزات محفزة مختلفة (الشكل التكميلي S6). وهذا يشير إلى أن كمية dCas9 لم يكن لها تأثير سام على الإشريكية القولونية في ظل الظروف المختبرة. تم تغيير كفاءة القمع بشكل هامشي عندما تم التعبير عن كمية مختلفة من dCas9 (الشكل 3A). كان متسقًا مع دراسة سابقة أن نظام CRISPRi وصل إلى أقصى قدر من كفاءة القمع عند [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

الشكل 3. توصيف ونمطية نظام كريسبري القابل للضبط. (أ) مضان نسبي تحت تركيزات مختلفة من ATc (20، 100، و 500 نانوغرام / مل). (ب) الأسفار النسبية تحت المروجين المختلفة (J23100 وUPJ23119). (C) مضان نسبي تحت protospacers مختلفة. يشير المحور السيني إلى الفلورسنت النسبي لـ mCherry، ويشير المحور y إلى الفلورسنت النسبي لـ lacI33-mCherry (الأحمر) وaraC33-mCherry (الأزرق). تمت إضافة 33 نقطة أساس من التسلسلات الإضافية من lacI وaraC إلى نهاية 5- نهاية mCherry (56). (د) الطاقة الحرة لـ 12-مير والفلورة النسبية. تشير الخطوط المتقطعة إلى فاصل تنبؤي بنسبة 95% وتشير الخطوط الصلبة إلى خط الانحدار. لا يمكن الحصول على قيمة dG لـ sg trcSL1c2 باستخدام mFold وبالتالي يتم استبعادها من التحليل. (أ – د) تشير جميع أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (ن=3).

نمطية نظام CRISPRi القابل للضبط

إن نهجنا الذي يستخدم متغيرات sgRNA محددة للحفاظ على مستوى تعبير معين للحمض النووي المستهدف لديه القدرة على استخدامه كنظام معياري. لإثبات جدوى نظام CRISPRi القابل للضبط لاستهداف فواصل أولية مختلفة، قمنا ببناء جينات اندماج (lacI{{0}}mCherry وaraC33-mCherry) عن طريق إضافة 33 نقطة أساس من التسلسلات من lacI وaraC إلى 5 -نهاية mCherry (56). يحتوي جينوم E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) على نسختين من تسلسل المباعد الأولي لـ lacI33- mCherry ونسخة واحدة لـ araC33-mCherry. ومع ذلك، لا تحتوي تسلسلات الكروموسومات هذه على تسلسلات PAM، وبالتالي، لا يمكن استهدافها بواسطة مجمع dCas9-sgRNA (43). عندما تم تصميم siRNAs لاستهداف كل protospacer، تم الحفاظ على كفاءة القمع باستمرار لجميع protospacers من lacI33، وaraC33، وmCherry (الشكل 3C). تشير هذه النتائج إلى أن نظام CRISPRi القابل للضبط لدينا يمكنه تنظيم التعبير الجيني بشكل فعال عند مستوى معين بغض النظر عن تسلسل المباعد الأولي. أحد التفسيرات المحتملة للعلاقة الملحوظة بين تكوين مركب RNP وكفاءة القمع هو التغير في الطاقة الحرة عند تكوين المجمع. يحتوي رابط رباعي الحلقات الاصطناعي والمنطقة المحيطة به على زوجين أساسيين A: U وG: C Watson-Crick وزوج أساسي غير Watson-Crick من A: G (44). نظرًا لأن ربط crRNA وtracrRNA ضروريان للتكوين المعقد، فإن الطفرات التي تستهدف tetraloop ستؤثر على تقارب الارتباط بين dCas9 وsgRNA. يمكن حساب هذا التقارب من فرق الطاقة الحرة بين الحالات المحدودة وغير المحدودة. ومع ذلك، فإن حساب الطاقة المجانية للدول المتاخمة يمثل تحديًا (57). لقد افترضنا أن الهيكل العام واستقرار الحالة المقيدة لا يتغيران نظرًا لأن sgRNAs التي تم فرزها من المكتبة لم تعطل وظيفتها تمامًا. علاوة على ذلك، فإن رباعي الحلقات والمنطقة المحيطة بها ليس لها اتصال يذكر مع dCas9 (44). ولذلك، فإن تقارب الارتباط بين dCas9 وsgRNA سوف يتأثر بشكل رئيسي باستقرار الهيكل الثانوي للرباعي الحلقة وتسلسله المرافق. بناءً على هذه الفكرة، قمنا بحساب الطاقة الحرة للحلقة الرباعية والتسلسلات المحيطة بها باستخدام القالب (58). يتم تعريف الفرق في الطاقة الحرة للطي بسبب الطفرات على أنه الفرق بين الطاقة الحرة للتسلسلات المتحورة والنوع البري. يمكن حسابها مباشرة من الطاقة الحرة لطي الطفرات نظرًا لأن طاقة طي تسلسل النوع البري ثابتة عند -4.3 كيلو كالوري/مول. مع زيادة الطاقة الحرة للطي، زادت إشارة الأسفار (الشكل 3D). كانت كفاءة القمع أعلى عندما كانت طاقة الطي في المنطقة المحتوية على رباعي الحلقات قريبة من أو أقل من 0 كيلو كالوري / مول وانخفضت خطيًا عندما تجاوزت طاقة الطي 0 كيلو كالوري / مول. تشير هذه الملاحظة إلى أن كفاءة التكوين المعقد بين dCas9 وsgRNA يتم تحديدها من خلال البنية الثانوية لمنطقة رباعي الحلقات، مما يساعد في تفسير نمطية نظامنا. تم قياس كفاءة القمع لـ 85 sgRNA إضافي بتسلسلات مختلفة 12- من المكتبة لمزيد من التحقق من صحة هذه العلاقة. أظهر أيضًا الارتباط الذي لوحظ من متغيرات sg trcSL1 (الشكل ثلاثي الأبعاد والجدول التكميلي S7) ، مما يشير إلى أن رابط tetraloop يلعب دورًا حاسمًا في تكوين مجمع RNP وأن الطفرات في هذه المنطقة يمكن أن تؤثر على كفاءة نظام CRISPR. بالإضافة إلى ذلك، تظهر هذه العلاقة إمكانية التصميم القائم على الكمبيوتر لمتغيرات sgRNA مع كفاءة القمع المطلوبة.

تطبيق نظام كريسبري القابل للضبط لإعادة توزيع التدفق في المسار الحيوي للفيولاسين في الإشريكية القولونية

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-fold) مقارنة بالجينات الأخرى عند حسابها من المنحنيات القياسية. في المقابل، ظل التعبير عن الإنزيمات الأخرى غير المنظمة في مسار الكمان (vioA، وvioB، وvioE) دون تغيير. تشير هذه النتائج إلى أن نظامنا يمكنه استهداف وتعديل التعبير عن الجينات الفردية على وجه التحديد دون التأثير على الجينات الأخرى في المسار. لم يكن القياس الكمي المباشر للكهروضوئية وPDV ممكنًا بسبب عدم وجود معايير متاحة تجاريًا لتحليل HPLC. وهكذا قمنا بقياس التتر في وحدات تعسفية باستخدام منطقة الذروة HPLC. وصل عيار المنتج إلى الحد الأقصى عند 8 ساعات بعد الحث ثم انخفض تدريجياً (الشكل التكميلي S8)، ربما بسبب تحويل المنتج إلى منتجات جانبية أخرى، مثل الكروموفيريدان، بواسطة آلية غير معروفة (42،64). أشارت القمم البسيطة المرصودة على طيف HPLC إلى وجود منتجات جانبية ثانوية إضافية. أظهرت الأبحاث السابقة أن لوغاريتم عيار كل منتج في وحدات عشوائية يمكن التنبؤ به من خلال مجموعات خطية من قوة المروج لكل جين مشارك في مسار التخليق الحيوي للكمان (42). وكان نموذج الانحدار الخطي السجل هذا صالحًا أيضًا في نظامنا، وارتبطت زيادة نسخ vioD بزيادة إنتاج الطاقة الكهروضوئية (الشكل 4B). من المعروف أن هندسة المروج أو 5 -UTR لكل جين مشارك في مسار التخليق الحيوي للكمان مكّن من إعادة توزيع التدفق وتحسين المسار (65،66). يمكن أن يعمل نظامنا كطريقة بديلة توضح التحكم في النسخ دون التلاعب بالمروجين المشاركين في المسار باستخدام sgRNAs الاصطناعية، وهي قصيرة ويمكن تجميعها بطرق من خطوة واحدة. يتيح الفحص من خلال نظام CRISPRi القابل للضبط إعادة توجيه المسار بتدفق يمكن التنبؤ به قبل التلاعب مباشرة بسلالات المضيف أو أشرطة الجينات، مما قد يؤدي إلى تسريع العملية.

تطبيق نظام كريسبري القابل للضبط لموازنة تدفق الكربون في الإشريكية القولونية المنتجة لليكوبين

يتطلب الإنتاج الفعال للمركبات القيمة في الهندسة الأيضية موازنة تدفق الكربون. مسار ميثيل إريثريتول 4-فوسفات (MEP) هو مسار استقلابي يستخدم سلائف بسيطة مثل البيروفات وغليسرالدهيد 3-فوسفات (GAP) لإنتاج كتل بناء الأيزوبرنويد، وثنائي ميثيل أليل بيروفوسفات وبيروفوسفات إيزوبنتينيل (67،68) . تقوم هذه الجزيئات بتصنيع بيروفوسفات جيرانيل، والذي يتم تحويله إلى بيروفوسفات فارنيسيل (FPP) (67،68). يتم تصنيع اللايكوبين، وهو كاروتينويد ذو قيمة عالية مع خصائص مضادة للأكسدة قوية وتطبيقات متنوعة في مختلف الصناعات (69)، من FPP عبر سلسلة من التفاعلات الأنزيمية من crtE وcrtB وcrtI (الشكل 4C) (22،70). يعد سلائف GAP ضروريًا ليس فقط لمسار MEP ولكن أيضًا لمسار تحلل السكر (22). لقد ثبت أن انخفاض التعبير عن جين الفجوة A، الذي يشفر إنزيم هيدروجيناز فوسفات الجليسرالديهايد -3- (GAPDH) في مسار تحلل السكر، يعزز إنتاج اللايكوبين عن طريق زيادة تجمع GAP (22). لذلك، استهدفنا الفجوة بخمسة متغيرات، بما في ذلك ثلاثة متغيرات sg trcSL1 (sg trcSL1c2، وsg trcSL1c5، وsg trcSL1c6) التي أظهرت كفاءة قمع مختلفة، وsg PC، وsg WT. ومع ذلك، فإن الفجوة A هي جينة أساسية لا يمكن القضاء عليها بالكامل (71،72). لم تنجح محاولات كبح الفجوة A باستخدام تقنية CRISPRi التقليدية باستخدام sg WT حتى مع انخفاض التسرب لـ dcas9 تحت مروج tet (73). من ناحية أخرى، تم تحقيق قمع متعدد المستويات للتعبير الجيني لـ GapA باستخدام نظام CRISPRi القابل للضبط بدون عيوب في النمو وأدى إلى زيادة بمقدار 2.7-أضعاف مع sg trcSL1c6 في إنتاج اللايكوبين مقارنة بسلالة تعبر بشكل كامل عن جين GapA بعد 15 ساعة من الزراعة (الشكل 4D والشكل التكميلي S9). تم الإبلاغ عن أن 10% فقط من التعبير الطبيعي لجين الفجوة A يؤدي إلى زيادة تجمع GAP دون تغيير كبير في المستقلبات النهائية في مسار تحلل السكر، مثل 2- فسفوجليسيرات و3- فسفوجليسيرات ( 22). تُظهر هذه النتائج مجتمعة أن تقنية CRISPRi القابلة للضبط يمكنها كبح التعبير الجيني بدقة على مستويات متعددة دون هندسة الكروموسوم.

الشكل 4. تطبيق نظام كريسبري الانضباطي لمسار التخليق الحيوي للفيولاسين. (أ) مسار التخليق الحيوي للفيولاسين وبناء البلازميد. تم استنساخ خمسة جينات (vioA، وvioB، وvioC، وvioD، وvioE) المسؤولة عن إنتاج الكمان في dCas9- معبرًا عن البلازميد. يتم إنتاج أربعة منتجات رئيسية (فيولاسين، بروفيولاسين، ديوكسي فيولاسين، و بروديوكسي فيولاسين). تم استنساخ sg WT لـ vioC وخمسة متغيرات sg trcSL1 (sg trcSL1c2 و sg trcSL1c5 و sg trcSL1c6 و sg trcSL1c8 و sg trcSL1c9) لـ vioD، والتي تظهر كفاءات قمع مختلفة، في البلازميد الآخر. Trp: L-تريبتوفان، V: فيولاسين، PV: بروفيولاسين، PDV: بروديوكسي فيولاسين، DV: ديوكسي فيولاسين، PDVA: حمض بروتوديوكسي فيولاسينيك، PVA: حمض بروتوفيولاسينيك. (ب) العلاقة بين النصوص vioD، ومضان mCherry، وعيار PDV وPV. يشير المحور x إلى الحمض النووي الريبي vioD النسبي الذي تم الحصول عليه من RT-qPCR، ويشير المحور y على اليسار إلى مضان mCherry النسبي من الشكل 3، ويشير المحور y على اليمين إلى نسبة منطقة HPLC. تم تعيين العينات ذات أعلى قيمة vioD RNA إلى 100٪ للتطبيع. (ج) مسار التخليق الحيوي لليكوبين وبناء البلازميد. تم استنساخ ثلاثة جينات (crtE، crtB، crtI) المسؤولة عن إنتاج اللايكوبين في dCas9- الذي يعبر عن البلازميد. تم استهداف غابا بمتغيرات sg trcSL1 (sg trcSL1c2، sg trcSL1c5، sg trcSL1c6) وتم استنساخ sg PC في البلازميد الآخر. Glc: جلوكوز، GAP: جليسرالديهيد 3-فوسفات، 1،3-BPG: 1،3-بيسفوسفوجليسيرات، DMAPP: ثنائي ميثيل أليل بيروفوسفات، IPP: بيروفوسفات إيزوبنتينيل، FPP: بيروفوسفات فارنيسيل. (د) العلاقة بين نصوص الفجوة، ومضان mCherry، وإنتاج اللايكوبين. يشير المحور x إلى الفجوة النسبية RNA التي تم الحصول عليها من RT-qPCR، ويشير المحور y على اليسار إلى مضان mCherry النسبي من الشكل 3، ويشير المحور y على اليمين إلى عيار اللايكوبين. (ب، د) تشير جميع أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (ن=3).

خاتمة

لقد صممنا نظام CRISPRi قابل للضبط يمكنه التحكم بدقة في التعبير الجيني عند المستوى المطلوب. ومن خلال تحوير رباعي الحلقات والمنطقة المحيطة به، يمكن للحمض النووي الريبوزي sgRNA الاصطناعي الذي يستهدف تسلسلات المباعد الأولي المختلفة أن ينظم الجين عند مستوى معين. لقد نجحنا في تطبيق هذا النظام لإعادة توجيه التدفق الأيضي للاهتمام في مسار التخليق الحيوي للكمان لإنتاج مشتقات الإندول بنسبة يمكن التنبؤ بها. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أن استخدام CRISPRi القابل للضبط أدى إلى زيادة قدرها 2.7- أضعاف في إنتاج اللايكوبين، مما يسلط الضوء على تعدد استخدامات نظامنا لتحسين إنتاج مركبات قيمة أخرى. سيعمل هذا النظام على تسريع عمليات تحسين التدفق قبل التعامل بشكل دائم مع المعلومات الوراثية للمضيف، مثل استبدال المروج أو 5-تسلسلات UTR.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

مراجع

1. سابرانوسكاس، آر، غازيوناس، جي، فريمو، سي، بارانغو، آر، هورفاث، بي. و سيكسنيز، V. (2011) يوفر نظام Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas مناعة ضد الإشريكية القولونية. دقة الأحماض النووية، 39، 9275-9282.

2. غازيوناس، جي.، بارانغو، آر.، هورفاث، بي. و سيكسنيز، V. (2012) يتوسط مجمع البروتين النووي الريبوزي Cas9-crRNA انقسامًا محددًا للحمض النووي من أجل المناعة التكيفية في البكتيريا. بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية، 109، E2579 – E2586.

3. Cong, L., Ran,FA, Cox, D., Lin,S., Barretto, R., Habib,N., Hsu, PD, Wu,X., Jiang, W., Marraffini, LA وآخرون . (2013) هندسة الجينوم المتعددة باستخدام أنظمة كريسبر/كاس. العلوم، 339، 819-823.

4. ران، إف إيه، هسو، بي دي، رايت، جيه، أغاروالا، في، سكوت، دا، وتشانغ، إف. (2013) هندسة الجينوم باستخدام نظام كريسبر-كاس9. نات. بروتوك، 8، 2281-2308.

5. جينيك، إم، تشيلينسكي، كيه، فونفارا، آي، هاور، إم، دودنا، جيه إيه، وشاربنتير، إي. (2012) نوكلياز الحمض النووي المزدوج الموجه بالحمض النووي الريبي (RNA) القابل للبرمجة في المناعة البكتيرية التكيفية. العلوم، 337، 816-821.

6. أندرس، سي.، نيووهنر، أو.، دورست، أ. و جينيك، M. (2014) الأساس الهيكلي للتعرف على الحمض النووي المستهدف المعتمد على PAM بواسطة نوكلياز Cas9. الطبيعة، 513، 569-573.

7. Qi,LS, Larson, MH, Gilbert,LA, Doudna,JA, Weissman,JS, Arkin,AP and Lim,WA (2013) إعادة استخدام كريسبر كمنصة موجهة بالحمض النووي الريبوزي (RNA) للتحكم في تسلسل محدد للتعبير الجيني. الخلية، 152، 1173-1183.

8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weissman,JS and Qi,LS (2013) تداخل كريسبر (CRISPRi) للتحكم في تسلسل محدد للتعبير الجيني. نات. بروتوك، 8، 2180-2196.

9. ماكجلينسي، نيوجيرسي، ميتشام، ZA، رينو، كيه كيه، مولر، آر، باوم، آر. وIngolia,NT (2021) تتيح مكتبة دليل التداخل بتقنية كريسبر على نطاق الجينوم إمكانية التنميط المظهري الشامل في الخميرة. بي إم سي جينوميكس، 22، 205.

10. يون، ج. وWoo,HM (2018) هندسة التمثيل الغذائي بوساطة كريسبر لبكتيريا Corynebacterium glutamicum لإنتاج الزبدات المتجانسة. التكنولوجيا الحيوية. بيونج، 115، 2067-2074.

11. Cleto,S., Jensen,JV, Wendisch,VF and Lu,TK (2016) الهندسة الأيضية لبكتيريا Corynebacterium glutamicum مع تداخل كريسبر (CRISPRi). ايه سي اس سينث. بيول، 5، 375-385.

12. تشانغ، جي كيو، رن، XN، ليانغ، XH، وانغ، YQ، فنغ، DX، تشانغ، YJ، زيان، M. وZou,HB (2021) تحسين الإنتاج الميكروبي للأحماض الأمينية: من الأساليب التقليدية إلى الاتجاهات الحديثة. التكنولوجيا الحيوية. بيبروك. ه، 26، 708-727.

13. Kim,SK, Seong,W., Han,GH, Lee,DH and Lee,SG (2017) القمع المتعدد الإرسال الموجه بالتداخل بتقنية كريسبر لجينات المسار المتنافسة الداخلية لإعادة توجيه التدفق الأيضي في الإشريكية القولونية. ميكروب. حقيقة الخلية., 16, 188.

14. إليس، إن إيه، كيم، بي، تونغ، جي. و Machner,MP (2021) أداة تداخل كريسبر المتعددة لاستجواب جينات الفوعة في البكتيريا الفيلقية الرئوية. مشترك. بيول.، 4، 157.

15. سيو، خ وتشين، دبليو. (2019) gRNA ذو موطئ قدم منظم لوظيفة CRISPR-Cas9 القابلة للبرمجة. نات. الكيمياء. بيول، 15، 217-220.

16. Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR and Salis,HM (2019) القمع المتزامن للجينات البكتيرية المتعددة باستخدام صفائف sgRNA طويلة جدًا غير متكررة. نات. التكنولوجيا الحيوية.، 37، 1294-1301.

17. تيان، تي، كانغ، جي دبليو، كانغ، أ. و Lee,TS (2019) إعادة توجيه التدفق الأيضي عبر القمع التوافقي المتعدد بوساطة كريسبر لإنتاج الأيزوبنتينول في الإشريكية القولونية. ايه سي اس سينث. بيول، 8، 391-402.

18. غوتام، آر.، سيبولد، جي إم، مولر، بي.، ويل، تي.، فايس، تي.، هاندريك، آر. و Eikmanns، BJ (2019) نظام تداخل كريسبر بسيط ثنائي الحث لاستهداف الجينات المتعددة في Corynebacterium glutamicum. البلازميد، 103، 25-35.

19. ياو، إل.، سينجيك، آي.، أنفيلت، جي. وهدسون، EP (2016) قمع الجينات المتعددة في البكتيريا الزرقاء باستخدام كريسبري. ايه سي سي سينث. بيول، 5، 207-212.

20. ليم، إتش جي، نوه، إم إتش، جيونج، جيه إتش، بارك، إس. و Jung,GY (2016) إعادة التوازن الأمثل 3- لمسار إنتاج حمض الهيدروكسي بروبيونيك من الجلسرين في الإشريكية القولونية. ايه سي اس سينث. بيول، 5، 1247-1255.

21. يانغ، واي، لين، واي، لي، إل، لينهاردت، آر جيه ويان، واي. (2015) تنظيم استقلاب malonyl-CoA عبر RNAs المضاد للتحسس الاصطناعي لتعزيز التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية. متعب. المهندس، 29، 217-226.

22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK and Jung,GY (2016) إعادة توازن السلائف الدقيقة لإنتاج الأيزوبرنويدات من خلال التحكم الدقيق في تعبير الفجوة في الإشريكية القولونية. متعب. المهندس، 38، 401-408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL وJun,S. (2016) tCRISPRi: التحكم في التعبير الجيني القابل للضبط والعكس بخطوة واحدة. الخيال العلمي. النائب، 6، 39076.

24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG and Carothers,JM (2018) التعبير المنظم عن sgRNAs يضبط CRISPRi في E. coli. التكنولوجيا الحيوية. ج.، 13، هـ1800069.

25. Kim,NM, Sinnott,RW and Sandoval,NR (2020) أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على عامل النسخ والأنظمة المحفزة في البكتيريا غير النموذجية: التقدم الحالي والاتجاهات المستقبلية. العملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية.، 64، 39-46.

26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. وآخرون. (2019) التحكم في CRISPR-Cas9 باستخدام sgRNAs المنشط والمعطل ليجند. نات. كوميون، 10، 2127.

27. فيريرا، آر، سكريكاس، سي، هيدين، أ، سانشيز، بي جيه، سيورز، في، نيلسن، جيه. و ديفيد، ف. (2019) الضبط الدقيق لاستقلاب الكربون المركزي بمساعدة النموذج في الخميرة من خلال التنظيم القائم على dCas9-. ايه سي اس سينث. بيول، 8، 2457-2463.

28. سو، T.، Guo، Q.، Zheng، Y.، Liang، Q.، Wang، Q. و تشي، س. (2019) الضبط الدقيق لـ hemB باستخدام CRISPRi لزيادة 5- إنتاج حمض أمينوليفولينيك في الإشريكية القولونية. أمام. ميكروبيول، 10، 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . وآخرون. (2017) يكشف تحديد خصوصية الحمض النووي الريبي (RNA) ذو الدليل الواحد عن عدم تطابق التسلسل الأساسي الحساس. الخيال العلمي. النائب، 7، 40638.

30. جيانغ، دبليو، بيكارد، دي، كوكس، دي، تشانغ، إف. ومارافيني، لوس أنجلوس (2013) التحرير الموجه بالحمض النووي الريبوزي (RNA) للجينومات البكتيرية باستخدام أنظمة كريسبر-كاس. نات. التكنولوجيا الحيوية.،

31، 233-239. 31. فان جيستل، جيه.، هوكينز، جي إس، تودور، إتش. وجروس، كاليفورنيا (2021) خط أنابيب حسابي لتصميم دليل RNA لعدم تطابق CRISPRi. ستار بروتوك، 2، 100521.

32. هوكينز، JS، Silvis، MR، Koo، BM، Peters، JM، Osadnik، H.، Jost، M.، Hearne، CC، Weissman، JS، Todor، H. وجروس، كاليفورنيا (2020) يكشف Mismatch-CRISPRi عن العلاقات المتباينة بين التعبير واللياقة البدنية للجينات الأساسية في الإشريكية القولونية والبكتيريا العصوية الرقيقة. نظام الخلية.، 11، 523-535.

33. Fortin,J.-P., Tan,J., Gascoigne,KE, Haverty,PM, Forrest,WF, Costa,MR and Martin,SE (2019) استهداف الجينات المتعددة والتسامح غير المتطابق يمكن أن يربك تحليل الجينوم- شاشات كريسبر مجمعة واسعة. الجينوم بيول.، 20، 21.

34. روزن، س. و سكاليتسكي، H. (2000) Primer3 على WWW للمستخدمين العامين ولمبرمجي الأحياء. طرق مول. بيول، 132، 365-386.

35. تشو، ك.، تشو، إل.، ليم، كيو.، زو، آر.، ستيفانوبولوس، جي. وToo,HP (2011) جينات مرجعية جديدة لقياس الاستجابات النسخية للإشريكية القولونية للإفراط في التعبير عن البروتين بواسطة PCR الكمي. بي إم سي مول. بيول.، 12، 18.

36. Livak,KJ and Schmittgen,TD (2001) تحليل بيانات التعبير الجيني النسبي باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي وطريقة 2(-Delta Delta C(T)). الطرق، 25، 402-408.

37. أندروز، س. (2010) FastQC: أداة لمراقبة الجودة لبيانات التسلسل عالية الإنتاجية. v0.11.9 إد.

38. لانجميد، بي.، ترابنيل، سي.، بوب، إم. وسالزبرغ، إس إل (2009) محاذاة فائقة السرعة وفعالة في الذاكرة لتسلسلات الحمض النووي القصيرة مع الجينوم البشري. الجينوم بيول.، 10، R25.

39. Danecek,P., Bonfield,JK, Liddle,J., Marshall,J., Ohan,V., Pollard,MO, Whitwham,A., Keane,T., McCarthy,SA, Davies,RM وآخرون. (2021) اثني عشر عامًا من SAMtools وBCFtools. جيجاساينس، 10، جياب008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ and Pachter,L. (2010) يكشف تجميع النص وتقديره الكمي بواسطة RNA-Seq عن النصوص غير المشروحة والتبديل الإسوي الشكل أثناء تمايز الخلايا. نات. التكنولوجيا الحيوية.، 28، 511-515.

41. ترابنيل، سي.، هندريكسون، دي جي، سوفاجو، إم.، جوف، إل.، رين، جيه إل وباشتر، إل. (2013) التحليل التفاضلي لتنظيم الجينات في دقة النسخ باستخدام RNA-seq. نات. التكنولوجيا الحيوية.، 31، 46-53.

42. Lee,ME, Aswani,A., Han,AS, Tomlin,CJ and Dueber,JE (2013) تحسين مستوى التعبير لمسار متعدد الإنزيمات في غياب اختبار عالي الإنتاجية. دقة الأحماض النووية، 41، 10668-10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. وآخرون. (2013) خصوصية استهداف الحمض النووي لنواة Cas9 الموجهة بالحمض النووي الريبي (RNA). نات. التكنولوجيا الحيوية.، 31، 827-832.

44. نيشيماسو، إتش، ران، إف، هسو، بي، كونرمان، إس، شحاتة، إس، دوهماي، إن، إيشيتاني، آر، تشانغ، إف. و نوريكي، O. (2014) التركيب البلوري لـ Cas9 في المركب مع دليل RNA والحمض النووي المستهدف. الخلية، 156، 935-949.

45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO and Skok,JA (2016) تتيح سقالات CRISPR-dCas9 وsgRNA التصوير المباشر ثنائي اللون لتسلسلات الأقمار الصناعية وتكرار المواقع الفردية المخصب. نات. كوميون، 7، 11707.

46. ​​خسروي، س.، شينديل، بي.، جلاديلين، إي.، دونيمان، إف.، روتن، تي.، بوشتا، إتش. و هوبين، أ. (2020) تطبيق الأبتمرات يحسن التصوير المباشر القائم على كريسبر للتيلوميرات النباتية. أمام. علم النبات، 11، 1254.

47. Nielsen,AA and Voigt,CA (2014) الدوائر الجينية متعددة المدخلات CRISPR/Cas التي تربط بين الشبكات التنظيمية المضيفة. مول. النظام. بيول، 10، 763.

48. Lee,YJ, Hoynes-O'Connor,A., Leong,MC and Moon,TS (2016) التحكم القابل للبرمجة في التعبير الجيني البكتيري باستخدام 44، 2462–2473.

49. فيجورو، أ.، أولديوورتيل، إي.، كوي، إل.، بيكارد، د. و فان تيفلين، S. (2018) يؤدي ضبط قدرة dCas9 على منع النسخ إلى تمكين ضربة قاضية قوية وصامتة للجينات البكتيرية. مول. النظام. بيول.، 14، e7899.

50. تشانغ، واي، شانغ، إكس، لاي، إس، تشانغ، جي، ليانغ، واي. و ذهب. (2012) تطوير وتطبيق نظام التعبير المحفز للأرابينوز من خلال تسهيل امتصاص المحفز في Corynebacterium glutamicum. تطبيق. البيئة. ميكروبيول، 78، 5831-5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. و Keasling,JD (2018) عزل وتوصيف الطفرات الجديدة في أصل pSC101 التي تزيد من عدد النسخ. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens,J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. و بولين، T. (2020) بلازميد تعبير قابل للضبط قابل للضبط لـ L-arabinose لبكتيريا حمض الأسيتيك Gluconobacter oxydans. تطبيق. ميكروبيول. التكنولوجيا الحيوية.، 104، 9267-9282.

53. نجوين، تي تي، نجوين، إن إتش، كيم، واي.، كيم، جي آر، وبارك، إس. (2021) التوصيف في الجسم الحي لنظام المروج المحفز لـ 3- هيدروجيناز الهيدروكسي بروبيونيك في Pseudomonas denitrificans. بيوتيتشنول بيوبروك إي، 26، 612-620.

54. مكارتي، إن إس، جراهام، إي، ستودينا، إل. و ليديسما أمارو، ر. (2020) تقنيات كريسبر المتعددة لتحرير الجينات وتنظيم النسخ. نات. كوميون، 11، 1281.

55. يان، س. و Fong,SS (2017) دراسة تأثيرات الارتباط النسخي والضوضاء في المختبر باستخدام المروجين التأسيسيين مع تسلسل عناصر UP في الإشريكية القولونية. جي بيول. المهندس، 11، 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. و Jung,GY (2013) التصميم التنبؤي لمنطقة بدء ترجمة mRNA للتحكم في كفاءة ترجمة بدائيات النواة. متعب. المهندس، 15، 67-74. 57. كابيل، ك.، جارموسكايتي، آي.، فايدياناثان، بي بي، جرينليف، دبليو جيه، هيرشلاج، د. و داس، ر. (2019) اختبارات عمياء للتنبؤ بتقارب ارتباط بروتين الحمض النووي الريبي (RNA). بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية، 116، 8336-8341.

58. زوكر، م. (2003) خادم الويب Mfold للتنبؤ بطي الحمض النووي وتهجينه. دقة الأحماض النووية، 31، 3406-3415.

59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. و شيه، X. (2021) إعادة توزيع تدفق استقلاب الكربون المركزي لإنتاج فعال للتريبتوفان في الإشريكية القولونية. التكنولوجيا الحيوية. بيونج، 118، 1393-1404.

60. ياو، آر، لي، جيه، فنغ، إل، تشانغ، إكس. و هو، ه. (2019) (13) الهندسة الأيضية الموجهة لتحليل التدفق الأيضي للإشريكية القولونية لتحسين إنتاج الأسيتول من الجلسرين. التكنولوجيا الحيوية. الوقود الحيوي، 12، 29.

61. دوران، ن. و Menck,CF (2001) Chromobacterium violaceum: مراجعة للمنظورات الدوائية والصناعية. الحرجة. القس ميكروبيول، 27، 201-222.

62. Balibar,CJ and Walsh,CT (2006) في التخليق الحيوي في المختبر للفيولاسين من L-التريبتوفان بواسطة إنزيمات VioA-E من Chromobacterium violaceum. الكيمياء الحيوية، 45، 15444-15457.

63. Gwon,DA, Seok,JY, Jung,GY and Lee,JW (2021) التطور المختبري التكيفي بمساعدة المستشعر الحيوي لإنتاج الكمان. كثافة العمليات. جيه مول. العلوم، 22، 6594.

64. سانشيز، سي، برانا، إيه إف، منديز، سي. و Salas,JA (2006) إعادة تقييم مسار التخليق الحيوي للفيولاسين وعلاقته بالتخليق الحيوي للإندولوكربازول. الكيمياء. السيرة الذاتية. الكيمياء، 7، 1231-1240.

65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ and Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a النهج التوافقي لتحقيق التوازن النسخي للمسارات الأيضية. الخيال العلمي. النائب، 5، 11301.

66. تشانغ، واي.، تشن، إتش.، تشانغ، واي.، يين، إتش.، تشو، سي. و وانغ، Y. (2021) هندسة RBS المباشرة لمجموعة الجينات الاصطناعية الحيوية لتحقيق إنتاجية فعالة للكمان في الإشريكية القولونية. ميكروب. حقيقة الخلية.، 20، 38.

67. هنتر، WN (2007) المسار غير الميفالونات للتخليق الحيوي لسلائف الأيزوبرنويد. جي بيول. كيم، 282، 21573-21577.

68. رومير، م. (1999) اكتشاف مسار مستقل عن الميفالونات للتخليق الحيوي للأيزوبرنويد في البكتيريا والطحالب والنباتات العليا. نات. همز. النائب، 16، 565-574.

69. مولر، إل.، كاريس-فيرات، سي.، لوي، جي. و بوم، V. (2016) الليكوبين ودوره المضاد للأكسدة في الوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية – مراجعة نقدية. الحرجة. القس علوم الغذاء. نوتر، 56، 1868-1879.

70. ميورا، واي، كوندو، كيه، سايتو، تي، شيمادا، إتش، فريزر، بي دي وميساوا، إن. (1998) إنتاج الكاروتينات اللايكوبين، بيتا كاروتين، وأستازانتين في الخميرة الغذائية Candida utilis. تطبيق. البيئة. ميكروبيول، 64، 1226-1229.

71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA and Henderson,IR (2018) الجينوم الأساسي للإشريكية القولونية K{ {2}}. مبيو، 9، ه02096-17.

72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL and Mori,H. (2006) بناء طفرات الإشريكية القولونية K-12 داخل الإطار، ذات جين واحد: مجموعة Keio. مول. النظام. بيول.، 2، 2006.0008.

73. بيرترام، ر. و هيلين، W. (2008) تطبيق مثبط تيت في تنظيم الجينات بدائية النواة والتعبير عنها. ميكروب. التكنولوجيا الحيوية.، 1، 2-16.