إن تعطيل نشاط RPX1 في نبات الأرابيدوبسيس يمنح مقاومة لبكتيريا Plutella Xylostella من خلال تراكم الهوموتيربين DMNT

خلاصة

تسبب آفة المحاصيل الحرشفية Plutella xylostella قيودًا شديدة على زراعة الكرنب. هنا، نبلغ عن دور جديد لـ RPX1 (مقاومة P. xylostella) في مقاومة هذه الآفة في Arabidopsis thaliana. يطرد طفرة rpx1-1 يرقات P. xylostella، ويؤدي التغذية على طفرة rpx1-1 إلى إتلاف بنية المصفوفة المحيطية بشدة في المعى الأوسط لليرقات، مما يؤثر سلبًا على نمو اليرقات والتشرنق. تنتج هذه المقاومة من تراكم مركبات الدفاع، بما في ذلك المونوتربين (3E) −4,8-ثنائي ميثيل-1,3,7-نوناترين (DMNT)، بسبب تنظيم PENTACYCLIC TRITERPENE SYNTHASE 1 (PEN1)، الذي يشفر إنزيم التخليق الحيوي الرئيسي DMNT. يؤدي غزو P. xylostella والإصابة إلى تحلل بروتين RPX1، مما قد يمنح استجابة سريعة للإصابة بالحشرات. لا يرتبط تعطيل RPX1 والإفراط في التعبير عن PEN1 بالمقايضات السلبية لنمو النبات ولكن إنتاج البذور أعلى بكثير من النوع البري في وجود الإصابة بـ P. xylostella. تقدم هذه الدراسة استراتيجية جديدة للتكاثر الجزيئي للنبات ضد P. xylostella.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

  الكلمات الدالة

مقاومة الآفات، التمثيل الغذائي الثانوي، الانبعاثات المتطايرة

1|مقدمة

لا تقلل الآفات الحشرية من إنتاجية المحاصيل فحسب، بل تؤثر أيضًا على جودة منتجات المحاصيل (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). من بينها، عثة الماس الظهر Plutella xylostella وهي آفة قشريات الأجنحة الضارة منتشرة على نطاق واسع وتتغذى على المحاصيل الصليبية مثل القرنبيط والملفوف، مما يسبب خسائر اقتصادية هائلة. حاليًا، في الإدارة الزراعية، حققت مكافحة الآفات باستخدام المواد الكيميائية الزراعية (مثل المبيدات الحشرية) نجاحًا كبيرًا وتم تطبيقها بكثافة، ولكن هذا النهج أصبح يمثل مشكلة بسبب التلوث البيئي المحتمل والتهديدات على صحة الإنسان (Shakeel et al., 2017). يتمثل النهج البديل لإنتاج المحاصيل في استخدام المحاصيل المعدلة وراثيًا ذات المقاومة المعززة للآفات، على سبيل المثال في التعبير النباتي لبكتيريا Bacillus thuringiensis (جوزاني وآخرون، 2017) أو غيرها من البروتينات السامة للحشرات غير المتجانسة (دوغلاس، 2018). لقد تم بذل جهود مكثفة لتحديد أساليب جديدة لمكافحة P. xylostella في الزراعة؛ ومع ذلك، تظل الجينات الفعالة والمبيدات الحشرية الطبيعية والبلازما الجرثومية المقاومة محدودة (Zhou & Jander, 2021). ومن خلال سباق التسلح المستمر مع الآفات الحشرية، طورت النباتات قدرات مختلفة لمكافحة هجمات الحشرات. وفقًا لذلك، تقوم النباتات بتصنيع صفائف من المستقلبات الدفاعية مثل البنزوكسازينويدات (Handrick et al., 2016; Varsani et al., 2019)، وبنزوات الميثيل (Feng & Zhang, 2017)، والسيروتونين (Lu et al., 2018) استجابةً لـ إصابة الآفات. يلعب حمض الجاسمونيك (JA)، والذي يُطلق عليه أيضًا "هرمون الجرح"، دورًا مركزيًا في العديد من استجابات الأضرار المرتبطة بالجرح والتي تبدأ بسبب الإصابة بالحشرات (Lortzing & Steppuhn، 2016). تشير الدلائل المتزايدة إلى أن JA يعمل بشكل تآزري و/أو متعارض مع الهرمونات النباتية الأخرى، مثل حمض الساليسيليك (SA) والإيثيلين (Costarelli et al., 2020; Ma et al., 2019). بالإضافة إلى الدفاعات المباشرة، تطلق النباتات المتضررة من هجمات الحشرات مركبات متطايرة مختلفة تجذب الأعداء الطبيعيين للحيوانات العاشبة (Gols, 2014). من هذه الخلطات المتطايرة المعقدة، مركبات الهوموتيربين (3E) −4,8-ثنائي ميثيل-1,3,7-نوناترين (DMNT) و(E, E) −4,8,12-تريميثيل-1,3,7، تم الإبلاغ عن 11-tridecatetraene (TMTT) في أنواع نباتية متعددة مثل الأرابيدوبسيس (Lee et al., 2010; Sohrabi et al., 2015)، والأرز (Li et al., 2018)، والذرة (Gouinguené et al., 2005). ؛ ريختر وآخرون، 2016) والقطن (ليو وآخرون، 2018). أشارت العديد من الدراسات أيضًا إلى أن DMNT يعمل كجزيء إشارة يحفز الدفاعات المضادة للحيوانات العاشبة أثناء التواصل بين النبات والنبات (Arimura et al., 2000; Meents et al., 2019). على سبيل المثال، بعد تعرضها للأضرار الناجمة عن مضغ الحشرات، تنبعث بعض البطاطا الحلوة من مادة DMNT، مما يؤدي إلى الحث النظامي لمثبط الأنزيم البروتيني في نباتات البطاطا الحلوة المجاورة ويجعلها غير قابلة للهضم بالنسبة للحشرات (Meents et al., 2019). وقد لوحظت نتائج مماثلة بالنسبة لنباتات الشاي (جينغ وآخرون، 2020). لقد وجدنا مؤخرًا أن DMNT يلعب دورًا في قتل يرقات P. xylostella عن طريق تعطيل حاجز المصفوفة المحيطية (PM) في المعى المتوسط ​​للحشرة (Chen et al.، 2021).

في النباتات العليا، تم توصيف مسارات التخليق الحيوي DMNT وTMTT بشكل جيد من خلال التحليلات الوراثية والكيميائية الحيوية العكسية. في الذرة، يتم إنتاج DMNT وTMTT من التحلل التأكسدي لـ (E) -nerolidol و(E، E) -geranyl linalool بواسطة اثنين من P450 monooxygenases، CYP92C5 وCYP92C6 (Richter et al.، 2016). في القطن، يكون جينان CYP (GhCYP82L1 وGhCYP82L2) مسؤولين عن تحويل (E) -nerolidol إلى DMNT و(E، E) -geranyl linalool إلى TMTT (Liu et al.، 2018). في جذور نبات الأرابيدوبسيس، يتم تحفيز DMNT من سلائف ترايتيربين ديول C30، الكانابيديول، بواسطة السيتوكروم P450 أحادي أوكسيجيناز المشفر بواسطة الجين الخاص بالجذر CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). قدمت دراسة باستخدام الخميرة ككائن حي نموذجي دليلاً على أن الكانابيديول يتم إنتاجه من 2،3-أوكسيدسكوالين بواسطة سينسيز الكانابيديول PEN1 (شيانغ وآخرون، 2006)، والذي يرتبط التعبير عنه بشكل تآزري مع CYP705A1 (Sohrabi et al. ، 2015). ومع ذلك، فإن تنظيم الجينات الرئيسية في التخليق الحيوي للـ DMNT لا يزال غير معروف إلى حد كبير. يشفر جين RPX1 الموصوف في هذه الدراسة لبروتين جديد مرتبط بالغطاء (CBP)، وهو عضو في عائلة جينات عامل بدء حقيقيات النواة 4E (eIF4E). في النباتات، تتكون عائلة eIF4E من eIF4E1 وeIF4E2 وeIF(iso)4E وnCBP، والتي تلعب أدوارًا أساسية في بدء ترجمة mRNA المعتمدة على الغطاء (Rhoads، 2009). يعد أفراد عائلة eIF4E هم المصادر الرئيسية للمقاومة المتنحية لفيروس البطاطس Y (PVY) - وهو العامل الممرض الأكثر ضررًا الذي يؤثر على محصول البطاطس وجودتها، كما أن استخدام تقنية CRISPR-Cas9 التي تستهدف جين eIF4E1 يوسع نطاق مقاومة فيروس البطاطس Y في Solanum tuberosum. (لوسيولي وآخرون، 2022). وبالمثل، فإن التحرير بوساطة كريسبر/كاس9 لأشكال الكسافا eIF4E الإسوية nCBP-1 وnCBP-2 يقلل من شدة وحدوث الأعراض الناجمة عن مرض الخط البني للكسافا (جوميز وآخرون، 2019). علاوة على ذلك، أظهرت الدراسات التي أجريت على الأرابيدوبسيس أن نقص nCBP يلعب دورًا في الحد من حركة الفيروسات النباتية من خلية إلى أخرى (Keima et al., 2017). ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن وظيفة nCBPs في الدفاع العاشبة. هنا، نحن نستخدم نهجًا تكامليًا لتوصيف جين الأرابيدوبسيس RPX1 وظيفيًا، والذي يلعب دورًا مهمًا في مقاومة النبات لـ P. xylostella. تشير نتائجنا إلى أن هدم RPX1 يؤدي إلى جينات معبر عنها تفاضليًا (DEGs) وتراكم المركبات. أحد الجينات المنتظمة هو PEN1، وهو مفتاح التخليق الحيوي لـ DMNT. تؤثر الإصابة بطفرة rpx1 وتراكم DMNT على بنية PM لـ P. xylostella وتتسبب في عيوب نمو اليرقات والموت. توضح الأدلة الإضافية أن غزو P. xylostella وإصابتها يؤدي إلى تحلل بروتين RPX1، والذي قد يؤدي بدوره إلى مقاومة النبات للحشرات.

2|المواد والأساليب

2.1|المواد النباتية وظروف النمو

تم طلب بذور الأرابيدوبسيس من مركز Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC، http://Arabidopsis.info/). تم تعقيم البذور سطحيًا، وزُرعت في وسط Murashige وSkoog (MS)، وتم تقسيمها إلى طبقات عند 5 درجات في غرفة النمو خلال فترة ضوئية قصيرة اليوم (8 ساعات ضوء، 16 ساعة ظلام) لمدة 3 أيام. تم بعد ذلك نقلهم إلى درجة حرارة 22 درجة في الدفيئة تحت فترة ضوئية طويلة اليوم (16 ساعة ضوء، 8 ساعات ظلام) مع صيانة عادية للنبات.

2.2|تجارب الاختيار (التفضيل) وعدم الاختيار والاختبارات الحيوية

تم شراء بيض P. xylostella من شركة Henan Jiyuan Baiyun (Cat: HJB004، التي تم تطويرها في عام 2009، وتم نشرها للبحث العلمي في بيئة خاضعة للرقابة) وتم تحضينها في غرفة نمو مضبوطة على 26 درجة، 16 ساعة ضوء / 8 ساعات مظلمة. بالنسبة لتجارب الاختيار، قمنا بنقل نباتات الأرابيدوبسيس عمرها 3 أسابيع (ثمانية نباتات برية ومتحولة، على التوالي) إلى خزانات اختبار تم توصيلها بكل طرف من طرفي أنبوب الاختبار الزجاجي، وتم تنفيذ الخطوات التجريبية المتبقية كما هو موضح سابقًا ( تشين وآخرون، 2021). تم استخدام يرقات العمر الرابع وتم تضمين 15 يرقة في كل تكرار تجريبي.

بالنسبة لتجربة عدم الاختيار، تم نقل النباتات البرية والمتحولة عمرها 3 أسابيع إلى أطباق بتري منفصلة وشبه مفتوحة تحتوي على نفس العدد من يرقات P. xylostella ذات الـ 15 ثانية. تم تنفيذ الخطوات اللاحقة كما هو موضح سابقًا (Chen et al.، 2021).

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

2.3|فحص طفرات نبات الأرابيدوبسيس المقاومة ضد P. xylostella

قمنا بجمع 179 طفرات إدخال T-DNA من الأرابيدوبسيس لفحص مقاومة P. xylostalle. نمت الطفرات على وسط MS وتم زرعها في أواني P7 (الحجم: 7 × 7 سم) تحت ظروف نمو طويلة اليوم (22 درجة، 16 ساعة ضوء / 8 ساعات داكنة). ولتجنب التأثير البيئي المحتمل، قمنا بنقل الأواني وتدويرها يوميًا. بالنسبة لفحص الطفرات الأولي، قمنا بإعداد نسختين متماثلتين من خلال زراعة كل طفرة في وعاءين، مع استخدام نباتات Col‐0 كعنصر تحكم. بعد أسبوعين من النمو بعد الزرع، تم إخضاع جميع الطفرات لاختبار تفضيل يرقات الطور الثالث P. xylostella من خلال مقارنتها مع Col‐0، كما هو موضح أعلاه. تم اعتبار الطفرات التي أظهرت تفضيلات يرقية مختلفة من Col‐0 طفرات مقاومة للمرشح أو حساسة وتم اختيارها لمزيد من التحقق التجريبي والدراسات الوظيفية.

2.4|بناء البلازميد والتحول الجيني

بالنسبة لبناء RPX1pro: RPX1، تم تضخيم منطقة الترميز الجينومي RPX1 بتسلسل أولي 1.6 كيلو بايت وتسلسل سفلي 1 كيلو بايت من PCR من الحمض النووي الجينومي المستخرج من Col‐0. تم استنساخ جزء الحمض النووي المجمع في ناقل pGreenII-0179 وتحويله إلى متحولة rpx1-1 باستخدام طريقة الغمس الزهري (Clough & Bent، 1998). لبناء RPX1pro: تم تضخيم RPX1-GFP ومروج RPX1 (1.6 كيلو بايت) ومنطقة الترميز و1 كيلو بايت 3′ تسلسلات غير مترجمة من PCR من الحمض النووي الجينومي Col‐0. تم تضخيم جزء GFP من بلازميد يحتوي على تسلسلات GFP. تم تجميع أجزاء الحمض النووي هذه في ناقل pGreenII-0179 باستخدام طريقة القطع والربط، ثم تم تحويلها إلى متحولة rpx1-1. بالنسبة إلى 35Spro: بناء RPX1-FLAG، تم تضخيم تسلسلات ترميز RPX1 PCR من نسخ عكسي لـ cDNA من Col‐0 mRNA. تم استنساخ جزء PCR في ناقل pCambia1300-FLAG باستخدام طريقة التسريب (Clontech) وتحويله إلى Col-0. 35Spro: PEN1، 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) و35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): تم تضخيم تسلسلات ترميز هذه الجينات بواسطة PCR من Col-0 cDNA، وربطها في ناقل pLGNL-35S. تم تصميم microRNA الاصطناعي (amiR) الذي يستهدف PEN1 كما هو موضح سابقًا (Schwab et al.، 2006)، وتم تضخيمه باستخدام البلازميد pRS300 كقالب، وتم ربطه في نسخة معدلة من ناقل pCambia1300m. يتم سرد كافة تسلسلات التمهيدي في المعلومات الداعمة: الجدول S1.

2.5|فحوصات نشاط الجلوتاثيون s-transferase (GST) والسيتوكروم P450 (CYP450) في يرقات P. xylostella

بعد تغذية يرقات P. xylostella من العمر الثاني بشتلات Col‐0 أو rpx1‐1 لمدة 72 ساعة، تم جمعها وطحنها إلى مسحوق ناعم في النيتروجين السائل. تم إجراء الاختبارات باستخدام GST (شركة Nanjing Jiancheng Biology Company، القط: A004) ومجموعات تحليل النشاط CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company، cat: P450)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. كان لكل اختبار ثلاث مكررات بيولوجية، وكل تكرار يتألف من 30 يرقات P. xylostella.

2.6|فحوصات سنفور

تم استخدام شتلات Col‐0 أو rpx1‐1 عمرها ثلاثة أسابيع لتغذية يرقات P. xylostella من الطور الثاني. تم إجراء الاختبار كما هو موضح سابقًا مع تعديلات طفيفة (Chen et al.، 2021). تم استخدام ستة مكررات بيولوجية، وتحتوي كل نسخة على 15 يرقات P. xylostella.

2.7|المراقبة المجهرية لهيكل PM من اليرقات

تم إجراء تحليل تشريحي لهيكل PM اليرقات وتحليل المقطع العرضي من البارافين لأمعاء اليرقات كما هو موضح سابقًا (Chen et al.، 2021).

2.8|تحليل التعبير الجيني وتسلسل النسخ (RNA-seq)

تمت زراعة شتلات Col-{{0}} وrpx1‐1 في ظل ظروف نمو طويلة اليوم (16 ساعة ضوء، 8 ساعات داكنة) عند 22 درجة. تم استخدام شتلات Col-0 وrpx1-1 عمرها أسبوعين لتسلسل النسخ. تحتوي كل عينة على ثلاث مكررات بيولوجية. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام مجموعة RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN، رقم الكتالوج: DP441). تم تصنيع cDNAs من النوع الأول عن طريق النسخ العكسي باستخدام نظام One-Step RT (Takara Bio) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تنفيذ qRT-PCR باستخدام الاشعال الخاص بالجينات المدرجة في المعلومات الداعمة: الجدول S1 على أداة Roche Light Cycler 480. تم تنفيذ بناء وتسلسل مكتبات RNA-seq باستخدام Biomarker (بكين، الصين) على منصة Illumina HiSeq. أخيرًا، استخدمنا edgeR لإجراء تحليل التعبير التفاضلي (تم تعيين عتبة الاختلاف الكبير:|log2foldchange|أكبر من أو يساوي 1، p <0.05). تم إجراء ثلاث مكررات بيولوجية لـ Col-0 وrpx1-1، وتم إدراج الجينات المعبر عنها تفاضليًا في مجموعة البيانات S1.

2.9|تحليل الاستخلاص واللوني للغاز وتحليل الطيف الكتلي (GC-MS) لـ DMNT و DMNT-2 H في الأرابيدوبسيس

تم إجراء استخراج وتحليل DMNT كما هو موضح سابقًا مع تعديلات طفيفة (Sohrabi et al.، 2015). في المقايسات، تم استخدام 2 غرام من شتلات نبات الأرابيدوبسيس عمرها 3 أسابيع لاستخراج وقياس DMNT.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|إعداد وتوصيف DMNT

تم تصنيع DMNT كما هو موضح سابقًا، مع تعديلات طفيفة (HJ Huang & Yang، 2007). باختصار، تم شحن دورق مستدير سعة 500 مل مزود بقضيب تحريك مغناطيسي مطلي بالتفلون بـ 1 جم (6.48 مليمول) من كحول الأليليك و50 مل من ثنائي كلورو ميثان. تم تقليب المحلول بقوة ومعالجته بـ 3.6 جم من ثاني أكسيد المنغنيز النشط، متبوعًا بإضافة 1-2 جم من المادة المؤكسدة كل 2-3 ساعات حتى اكتمال التفاعل. ثم تم استخدام المنتج لتوليد المركب المطلوب عبر تفاعل ذكي. تم تأكيد بنية ونقاء DMNT من خلال الطرق الطيفية بالرنين المغناطيسي النووي 1 H (NMR) و13C NMR.

2.11|علاج DMNT لـ P. xylostella

تم إجراء الاختبارات في أطباق بتري مغطاة بأفلام بلاستيكية شفافة ذات ثقوب متعددة. تم تخفيف DMNT في زيت البارافين (Sigma-Aldrich) إلى الجرعة المطلوبة (2.5 نانومول / لتر − 25 ميكرومول / لتر) وحقنه في العلف كما هو موضح في النص. تم إجراء جميع الاختبارات في ست مكررات بيولوجية، حيث تتكون كل نسخة من 15 يرقة. تم تسجيل نمو اليرقات عن طريق التوثيق الفوتوغرافي. تم استخدام العلف المحقون بنفس الحجم من مذيب زيت البارافين كعنصر تحكم.

2.12|قياس محتوى JA وSA في شتلات الأرابيدوبسيس

تم إجراء الاختبارات من قبل شركة Nanjing Convinced-test Technology Company. تم إصابة شتلات Col‐{{0}} وrpx1‐1 عمرها أسبوعين بـ 15 يرقات P. xylostella من نوع s-instar، مع شتلات غير موبوءة كعنصر تحكم. وضعنا يرقتين على كل نبات من مجموعة الإصابة للتأكد من إصابة جميع النباتات. بعد 24 ساعة، تم جمع عينات النباتات وتجميدها بسرعة في النيتروجين السائل لتحديد JA وSA. تم طحن العينات إلى مسحوق ناعم في النيتروجين السائل واستخلاصها باستخدام محلول استخلاص حمض الأيزوبروبانول والماء وحمض الهيدروكلوريك، متبوعًا بإضافة 8 ميكروليتر من حمض الساليسيليك المخفف (D-SA) وحمض ثنائي هيدرو الجاسمونيك (2HJA) (1 ميكروغرام) / مل لكل منهما) كمعايير داخلية. تمت بعد ذلك إضافة ثنائي كلورو ميثان، وتم خلط المحلول جيدًا على جهاز دوار لمدة 30 دقيقة. بعد الحصول على الطور العضوي السفلي عن طريق الطرد المركزي عند 13,{{1{{20}}}} دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، تم تجفيفه بالنيتروجين، ثم إعادة إذابته في الميثانول (0 .1% حمض الفورميك)، ثم يتم طرده بالطرد المركزي عند 13,000 جم لمدة 10 دقيقة. أخيرًا، تم ترشيح الطاف من خلال غشاء مرشح عضوي 0.22 ميكرومتر وتم تحليله بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء مقترنًا بقياس الطيف الكتلي (HPLC-MS/MS). تم تنفيذ جميع خطوات الاستخراج عند درجة 4 . تم تحديد هويات JA وSA بناءً على وقت الذروة للمواد المستهدفة ونسبة الكتلة إلى الشحن (m/z) للأيونات المقابلة. تم تركيب القياس الكمي لـ JA وSA باستخدام معادلة الانحدار الخطي التي تم الحصول عليها من المنحنيات القياسية الداخلية. للحصول على المنحنى القياسي الداخلي، تم تحضير المحاليل القياسية SA وJA ذات التدرجات 0.1، 0.2، 0.5، 2، 5، 20، 50، و200 نانوغرام / مل باستخدام الميثانول (0.1٪ حمض الفورميك) كمذيب، وتمت إضافة المحاليل القياسية الداخلية بتركيز نهائي قدره 20 نانوغرام / مل إلى المخطط الفعلي. تمت إزالة الشذوذات الخطية من معادلات المنحنيات القياسية. JA: ص=0.853 × + 0.00152 (ص=0.9958)؛ SA: ص=1.76 × + 0.0403 (ص=0.9936).

2.13|تحليل نقل DMNT في الأرابيدوبسيس

تم إذابة DMNT في DMSO وإضافته إلى وسط MS بدون الجلوكوز. تم نقل نباتات الأرابيدوبسيس البالغة من العمر ثلاثة أسابيع إلى أنابيب الاختبار وتم غمر جذورها في وسط MS باستخدام DMNT أو DMSO (التحكم). لمنع التلوث، تمت تغطية أنابيب الاختبار بطبقتين من البارافيلم، وتم عمل ثقب صغير في الفيلم، من خلاله تم وضع جذور النباتات في وسط MS لمزيد من النمو. بعد 24 ساعة، تمت إزالة جذور النباتات المعالجة واستخدمت أوراقها لتغذية P. xylostella، ثم تم تحليل معدلات بقاء اليرقات والتشرنق. تم تكرار نفس التجربة باستخدام وسط نمو يحتوي إما على 2 DMNT المسمى H أو DMSO كعنصر تحكم. بعد 24 ساعة من الحضانة، تم جمع الأوراق ومعالجتها لتحليل GC-MS. لاستبعاد احتمال أن يتطاير DMNT من وسط DMNT إلى الأجزاء الهوائية ويتسبب في تلوث التتبع، تم إنشاء مجموعة مراقبة بنفس الطريقة، ولكن تم دفن جذور النباتات بقطن رطب ولم يتم غمرها في وسط DMNT. بعد 24 ساعة، تم حصاد الأجزاء الجوية لإجراء مزيد من الاختبارات الحيوية أو الكشف عن DMNT باستخدام GC-MS.

فوائد cistanche tubulosa-تقوية جهاز المناعة

2.14|استخراج البروتين وتحليل التطعيم المناعي لـ RPX1 في الأرابيدوبسيس بعد الإصابة بـ P. xylostella وعلاجات الجرح

قمنا بإعداد نوعين من العلاجات على RPX1pro المعدل وراثيًا: RPX1 ‐ GFP و 35 Spro: RPX1 ‐ FLAG Arabidopsis شتلات: غزو P. xylostella وجرحه. بالنسبة للإصابة باليرقات، قمنا بزراعة شتلات نبات الأرابيدوبسيس لمدة أسبوعين وقمنا بإطعامها ليرقات الطور الثاني (ضع يرقة واحدة على الأقل على كل شتلة)، وبعد 15-120 دقيقة، تمت إزالة اليرقات، وتم اختيار الشتلات المصابة وحصادها مزيد من التجارب. لتقليد الجرح، استخدمنا إبرة حقنة 1 مل لإنشاء ثقب في كل ورقة نبات الأرابيدوبسيس. بعد 15-120 دقيقة من النمو، تم جمع الشتلات.

لتحديد ما إذا كانت النباتات المصابة بـ P. xylostella يمكن أن تحفز تدهور RPX1، قمنا بإصابة شتلات Col‐0 بـ P. xylostella لمدة 15−120 دقيقة واختبرنا تأثيرها على RPX1-GFP في النباتات المعدلة وراثيًا. تم طحن جميع العينات إلى مسحوق في النيتروجين السائل، ثم تم خلط كميات متساوية من Col-0 المصابة وغير المصابة بشكل منفصل مع نفس الكمية من أنسجة RPX1-GFP وحضنت في محلول عند 4 درجة لمدة 15 دقيقة. أخيرًا، تم الطرد المركزي للخليط، وتم إخضاع الطاف لتحليل النشاف المناعي. لتحليل اللطخة الغربية، تم استخلاص البروتينات الكلية باستخدام محلول استخلاص البروتين [50 مليمول/لتر Tris-HCl pH8.0، 2.5 مليمول/لتر EDTA pH8.0، 150 مليمول/لتر NaCl، 1/1000 IGPAL ( حجم/حجم)، 10% جلسرين (حجم/حجم)، 7% 2-ميركابتوإيثانول (حجم/حجم)، 1 مليمول/لتر PMSF و1 × كوكتيل مثبط البروتيناز (روش)]. تم بعد ذلك استخدام مستخلص البروتين لفصل PAGE وتحليل النشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP (Roche، التخفيف: 1/1000) وFLAG (Abcam، التخفيف: 1/2000). تم التقاط الصور باستخدام نظام تحليل التألق الكيميائي Tanon 5200.

3|نتائج

3.1|لقد أدى متحول Arabidopsis rpx1 إلى تحسين مقاومة P. xylostella

لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة P. xylostella، قمنا بجمع 179 طفرات من نبات الأرابيدوبسيس وقمنا بتنميتها في دفيئة خاضعة للرقابة. بعد أسبوعين من عملية الزرع، أجرينا اختبار تفضيل ليرقات P. xylostella من الجيل الثالث، استجابةً لكل نوع Col-0 متحولة وبرية. في تجربة الفحص هذه، أظهر 15 طفرة تأثيرات مختلفة على تفضيل اليرقات (البيانات غير معروضة)، وتم اختيار واحد منهم لهذه الدراسة وتم تعيينه على أنه rpx1‐1 (مقاومة P. xylostella). يشفر RPX1 لبروتين جديد مرتبط بالغطاء (nCBP) (Ruud et al.، 1998). كان طفرة إدخال T-DNA هي SALK_131503، وتم تدمير التعبير الجيني لـ RPX1 بشكل ملحوظ مقارنةً بالنوع البري Col‐0 (الشكل 1 أ، المعلومات الداعمة: الشكل S1a، المعلومات الداعمة: الجدول S1). عند زرعها في مكان قريب، أظهرت نباتات rpx1‐1 مستوى أقل بكثير من الضرر الذي تسببه يرقات P.xylostella مقارنة بالنباتات البرية (المعلومات الداعمة: الشكل S1b).

الشكل 1: يؤدي تعطيل RPX1 إلى منح مقاومة لبكتيريا Plutella xylostella في الأرابيدوبسيس. ( أ ) التركيب الجيني لـ RPX1 (At5g1811 0). تشير المربعات البرتقالية إلى الإكسونات والخطوط الصلبة تمثل الإنترونات والمناطق غير المترجمة. يقع إدخال T-DNA في SALK_131503، المسمى rpx1‐1، على الإكسون الرابع. ( ب ) تتحرك يرقات P. xylostella بشكل تفضيلي نحو خطوط التكميل من النوع البري Col-0 وRPX1 (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1، RPX1com)، مقارنة بـ rpx1‐ 1. (ج) مقارنة Col- 0 وrpx1‐1 وأوراق RPX1com موبوءة بـ P. xylostella. ( د ) تأثرت يرقات P. xylostella بشدة بـ rpx1‐1، مقارنةً بتلك الموجودة في النوع البري Col‐0 وخطوط RPX1com، فيما يتعلق بمكانة اليرقات وحجمها ولونها. ( هـ ، و ) تظهر يرقات P. xylostella التي تتغذى على rpx1-1 ارتفاع معدلات الوفيات ( e ) وانخفاض معدلات التشرنق ( f ) مقارنة بخطوط Col- 0 البرية و RPX1com. ( ز، ح ) زادت يرقات P. xylostella التي تتغذى على نباتات rpx1-1 من أنشطة الجلوتاثيون S-transferase (GST، g) والسيتوكروم P450 (CYP450، h)، بينما في يرقات RPX1com التي تغذيها، لم تظهر الأنشطة أي اختلاف عن تلك التي تتغذى على يرقات RPX1com. على العقيد-0. في (b، e – h)، يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± sem وتشير الحروف المختلفة في كل معاملة إلى وجود فرق كبير (تحليل التباين أحادي الاتجاه، n=3 لـ b، g، h، n {{ 36}} لـ ه، و).

لتحديد الآلية الكامنة وراء مقاومة rpx1‐1 لغزو P. xylostella، أجرينا اختبارات التفضيل وعدم الاختيار. في تجارب التفضيل، تم وضع يرقات P. xylostella في مركز أنبوب الاختبار الزجاجي على مسافة متساوية من شتلات Col‐0 وrpx1‐1، بعد 10–6{{11} } دقيقة، تم تجميع عدد أكبر بكثير من اليرقات على الجانب Col‐0 من تلك الموجودة على الجانب rpx1‐1 (الشكل 1 ب). في تجارب عدم الاختيار، قمنا بتغذية شتلات Col-0 وrpx1-1 بشكل منفصل ليرقات P. xylostella ولاحظنا أن Col-0 فقد أنسجة الأوراق أكثر من متحولة rpx1-1 (الشكل 1 ج). للتأكد من أن RPX1 هو الجين المسبب للمقاومة المرصودة، قدمنا ​​بنية تكميلية لـ RPX1 في متحولة rpx1‐1. كانت خطوط تكملة RPX1 هذه (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1، RPX1com) عرضة للإصابة بـ P. xylostella، كما هو محدد بواسطة اختبارات التفضيل وعدم الاختيار (الشكل 1 ب، ج)، والتي تشير إلى أن RPX1 متورط في مقاومة الأرابيدوبسيس لـ P. إكسيلوستيلا.

3.2|يتأثر نمو يرقات P. xylostella سلبًا بطفرة rpx1-1

للتحقيق في الاستجابة الفسيولوجية لـ P. xylostella للتغذية باستخدام طفرات rpx1‐1، قمنا بفحص تطور اليرقات بعد التغذية بنباتات عمرها 3 أسابيع من خطوط Col‐0 وrpx1‐1 وRPX1com. أظهرت اليرقات التي تغذت على نباتات rpx1‐1 تطورًا شديد الخطورة من حيث حجم الجسم. كان لون جسم اليرقات مختلفًا أيضًا عن لون اليرقات التي تتغذى على نباتات Col‐0. ومع ذلك، لم نلاحظ مثل هذه التغييرات في اليرقات التي تتغذى على شتلات RPX1com (الشكل 1 د). أظهر التحليل المظهري الإضافي أن يرقات P. xylostella التي تتغذى على rpx1-1 كانت لديها معدل وفيات أعلى بشكل ملحوظ ومعدلات تشرنق أقل من تلك التي تتغذى على Col-0 أو RPX1com (الشكل 1 هـ، و). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت اليرقات التي تم تغذيتها بـ rpx1‐1 أنشطة إنزيمية أعلى لـ GST وCYP450، وهي مؤشرات حيوية لتلف الأعضاء أو الأنسجة (Cheng et al., 2018; Mikstacki et al., 2015)، مقارنة بتلك الموجودة في Col-0 وRPX1com (الشكل 1ز، ح)، مما يشير إلى أن أنسجة اليرقات قد تتعرض للإصابة بسبب تغذية rpx1-1.

3.3|تتضرر يرقات المعى الأوسط لـ P. xylostella بعد التغذية بنباتات rpx1‐1

لاحظنا أن اليرقات التي تتغذى على rpx1-1 تستهلك أنسجة نباتية أقل وتنتج برازًا أقل بكثير من تلك التي تتغذى على النوع البري Col-0; ولذلك، افترضنا أن عملية هضم اليرقات التي تتغذى على rpx1-1 قد تتأثر. للتحقق مما إذا حدث تسرب في أمعاء اليرقات التي تم تغذيتها بـ rpx1‐1، أجرينا "اختبار Smurf". قامت اليرقات التي تغذت بخطوط Col‐0 وRPX1com من النوع البري بتبرز الصبغة، ولم تترك أي صبغة بصريًا في جسم اليرقات، في حين احتفظت اليرقات التي تغذت على rpx1‐1 بكمية كبيرة من الصبغة في جسم اليرقات. المعى المتوسط ​​والأنسجة المحيطة بها، وتحولت اليرقات إلى اللون الأزرق (الشكل 2 أ). أظهر التحليل الكمي لليرقات الزرقاء ('Smurf') واليرقات الطبيعية ('no Smurf') أن تغذية نباتات rpx1-1 أدت إلى ظهور أكثر من ثلاثة أضعاف من الأفراد "Smurf" مقارنة بأولئك الذين تم تغذيتهم بالنوع البري Col-{{ 14}} أو RPX1com (الشكل 2 ب). تشير هذه النتائج إلى أن تغذية rpx1‐1 يمكن أن تسبب آفات ونفاذية أعلى في الأمعاء الوسطى لليرقات.

3.4|تتضرر المصفوفة المحيطة بـ P. xylostella عن طريق تغذية شتلات rpx1-1

قمنا أيضًا بتشريح وعزل المصفوفة المحيطية (PM) من اليرقات التي تتغذى على شتلات Col‐{{0}} وrpx1‐1 وRPX1com للتحليل الهيكلي تحت المجهر المجسم. بالمقارنة مع PM السليمة والراسخة لليرقات التي تتغذى على Col‐0 وRPX1com، أظهرت اليرقات التي تتغذى على rpx1‐1 خصائص الضرر وكانت رقيقة وفضفاضة ومتقطعة (الشكل 2C – f). لمزيد من تأكيد خصائص الضرر PM، حصلنا على مقاطع عرضية من عينات اليرقات. كشفت نتائج تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE) أن PM لليرقات التي تتغذى على Col-0 كانت سميكة وسليمة وأن هناك مساحة خارج الرحم (ES) بين PM وخلايا البشرة في المعى المتوسط ​​(الشكل 2 ز). على النقيض من ذلك، تعطلت بشدة PM في الأمعاء الوسطى لليرقات التي تتغذى على rpx1-1، وكانت محتويات الأمعاء قريبة من جدار الأمعاء (لا يوجد، الشكل 2ح). عندما تم تغذية اليرقات مع شتلات RPX1com، لم يتم تغيير PM وES بشكل كبير (الشكل 2i، ي). تؤكد هذه النتائج أن ضربة قاضية RPX1 أضرت بـ PM من يرقات P. xylostella.

3.5|تراكم محتوى DMNT في rpx1‐1 يمنح مقاومة ليرقات P. xylostella

لاستكشاف ما إذا كانت ضربة قاضية RPX1 تعيد تشكيل مستقلبات نبات الأرابيدوبسيس وتؤدي إلى مقاومة يرقات P. xylostella، قمنا بمقارنة المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) المنبعثة من نباتات rpx1‐ 1 والنباتات البرية من النوع Col‐0. تم تجميع أربعة مركبات عضوية متطايرة (هيكسانول، 3-إيثيل-5ميثيل، أوكتانس، 2،6-ديميثيل، نونان، 2،6-ديميثيل، و DMNT) بشكل تفاضلي بين rpx1-1 وCol-0 (الشكل 3 أ). لمزيد من تشريح الآلية الجزيئية لـ rpx1-1 في مقاومة P. xylostella، أجرينا تحليل RNA-seq. بالمقارنة مع Col‐0، أظهر المتحول rpx1‐1 211 جينًا معبرًا عنه تفاضليًا (DEGs) (المعلومات الداعمة: مجموعة البيانات S1). أشار تحليل تخصيب KEGG إلى أن هذه DEGs تنتمي إلى أكثر من 2 0 من المسارات الأيضية المختلفة، بما في ذلك التخليق الحيوي لسيسكيتربينويد وترايتيربينويد، واستقلاب حمض ألفا لينولينيك، ومسارات استقلاب التيروزين (الشكل 3 ب، المعلومات الداعمة: الجدول S2). والجدير بالذكر أن المسار الأكثر إثراءً كان هو التخليق الحيوي للسيسكويتيربينويدات والترايتربينويدات، والذي يتكون من ثلاثة DEGs: At4g15340، At5g42600، وAt5g48010 (الشكل 3 ب، المعلومات الداعمة: الشكل S2a-c). تم الإبلاغ عن أن At4g15340 يشفر لـ PEN1، وهو عبارة عن سيكلاز أوكسيدوسكوالين الذي يحول 2،3-أكسيدسكوالين إلى أرابيديول ويؤدي إلى تخليق DMNT النشط بيولوجيًا عبر CYP705A1 (Field & Osbourn، 2008؛ Sohrabi et al.، 2015). يشفر At5g42600 للمعدن سينسيز 1 (MRN1)، وهو مكون رئيسي في التخليق الحيوي للمعادن. يشفر At5g48010 لسينثاز الثاليانول (THAS)، وهو إنزيم يشارك في التخليق الحيوي للثاليانول. تم الإبلاغ عن مشاركة Marneral و thalianol في صيانة تطوير المصنع (Field & Osbourn، 2008؛ Go et al.، 2012) (المعلومات الداعمة: الشكل S3). درسنا الأدوار المحتملة لـ MRN1 وTHAS في مقاومة الحشرات من خلال التحقيق في معدلات التفضيل والوفيات والتشرنق لـ P. xylostella عن طريق إطعامهم بشتلات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيًا التي تزيد من تعبير MRN1 (35Spro: MRN1) وTHAS (35Spro: THAS) (دعم المعلومات: الشكل S4a،b). لم يتم اكتشاف فرق كبير بين الجينات المحورة والنوع البري Col-0 (المعلومات الداعمة: الشكل S4c-n)، مما يشير إلى أن مقاومة الحشرات لـ rpx1-1 لا تعتمد على الأرجح على هذين الجينين.

الشكل 2: يؤدي تعطيل نشاط RPX1 إلى إتلاف بنية المصفوفة المحيطية (PM) في الأمعاء الوسطى لليرقات. ( أ ) صور تمثيلية لليرقات التي تتغذى بخطوط Col‐0 وrpx1‐1 وRPX1com تظهر احتباس الصبغة، كما يتضح من مظهرها الأزرق، مثل شخصية الرسوم المتحركة Smurf. (ب) يظهر القياس الكمي للنتائج في (أ). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± sem؛ تشير الحروف المختلفة إلى وجود فرق كبير (تحليل التباين أحادي الاتجاه، n=6). ( ج - و ) البنية التحتية PM لليرقات التي تتغذى على خطوط Col- 0 ( c ) و rpx1 ‐ 1 ( d ) وخطوط RPX1com ( e، f ). لاحظ أن PM لليرقات التي يتم تغذيتها بـ Col‐0 وRPX1com ممتلئة وسليمة، ولكن PM لليرقات التي يتم تغذيتها بـ rpx1‐1 تكون رقيقة وحساسة ومتقطعة في بعض المناطق. ( g - j ) يُظهر المقطع العرضي وتلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين تلف PM من اليرقات التي تتغذى بخطوط Col-0 (g) أو rpx1‐1 (h) أو RPX1com (i، j). [يمكن الاطلاع على الشكل الملون على موقع wileyonlinelibrary.com]

يشير إثراء التخليق الحيوي للتربينويد في تحليل KEGG (الشكل 3 ب) والتراكم التفاضلي لـ DMNT المكتشف في rpx1-1 (الشكل 3 أ) إلى أن DMNT قد يكون أحد المركبات المشاركة في مقاومة النبات لـ P. xylostella. على غرار التقارير السابقة التي بالكاد اكتشفت DMNT من خلال تحليل GC-MS في Col‐0 (Liu et al., 2018; Sohrabi et al., 2015)، يمكننا اكتشاف كميات ضئيلة من DMNT في Col-0 غير المصابة (الشكل 4 أ، ب). في المقابل، تم إثراء مستويات DMNT بدرجة عالية (~ 8 نانوغرام / جرام) في rpx1‐1، وأظهرت خطوط RPX1com مستويات منخفضة جدًا من DMNT، مماثلة لتلك الموجودة في نباتات Col‐0 (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، عند الإصابة بـ P. xylostella، زادت مستويات DMNT (~ 20 نانوغرام / جم) في rpx1‐1، وهو أعلى من ذلك الموجود في خطوط Col‐0 وRPX1com (الشكل 4). . قمنا بتصنيع DMNT في المختبر باستخدام طريقة معدلة (Chen et al., 2021). تمشيًا مع الملاحظات السابقة (Chen et al., 20}21)، قام DMNT بقمع نمو P. xylostella، كما يتضح من التفضيل (2.5 ميكروليتر/لتر) وأداء عدم الاختيار (0.25–25 ميكروليتر/لتر) ( المعلومات الداعمة: الشكل S5a،b). علاوة على ذلك، كشفت نتائج تلطيخ HE أن PM ليرقات التحكم كانت سميكة وسليمة (المعلومات الداعمة: الشكل S5c)، في حين أن PM لليرقات المعالجة بـ 2.5 ميكرومول / لتر DMNT لمدة 48 ساعة كانت رقيقة ومتقطعة في بعض المناطق (المعلومات الداعمة: الشكل S5d). مجتمعة، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن طفرة rpx1-1 تسبب تراكم DMNT، مما يساهم في قتل يرقات P. xylostella في نبات الأرابيدوبسيس. JA وSA عبارة عن مستقلبات ثانوية نباتية ترتبط ارتباطًا وثيقًا بالإجهاد الحيوي. لتحديد ما إذا كانت هذه المواد تساهم في مقاومة الحشرات لـ rpx1‐1، قمنا بفحص مستويات JA وSA لـ Col-0 وrpx1‐1 قبل وبعد الإصابة بـ P. xylostella. في ظل الظروف غير المعالجة، لم يكن هناك اختلاف كبير في مستويات JA وSA بين نباتات rpx1-1 وCol-0 (المعلومات الداعمة: الشكل S6)، وزادت مستويات كلا الهرمونين بشكل ملحوظ عند 24 ساعة بعد الإصابة بـ P. xylostella. . على وجه الخصوص، بعد الإصابة، كان محتوى SA أقل بشكل ملحوظ في rpx1-1 مقارنة بـ Col-0، في حين كان محتوى JA أعلى بكثير في rpx1-1 منه في Col-0 (المعلومات الداعمة: الشكل S6).

الشكل 3: مقارنة المركبات المتطايرة والتعبير الجيني المخصب تفاضليًا بين Col‐0 وrpx1‐1. ( أ ) تم اكتشاف المركبات المتطايرة المخصبة تفاضليًا في Col-0 و rpx1-1 بواسطة طريقة قياس الطيف الكتلي للغاز (GC-MS). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± sem؛ تشير العلامات النجمية إلى وجود فرق كبير (*p < 0.05، **p < 0.01، اختبار t غير متزاوج ثنائي الذيل). ( ب ) التحليل النسخي لـ Col-0 و rpx1-1. تحليل KEGG لإثراء المسار من الجينات المعبر عنها بشكل مختلف بين Col-0 ومتحول rpx1-1. ويرتبط أحد المسارات المخصبة (السهم الأحمر) بالتخليق الحيوي للسيسكيتربينويد والترايتيربينويد ويتكون من ثلاثة جينات، كما هو موضح في الشكل. [يمكن الاطلاع على الشكل الملون على موقع wileyonlinelibrary.com]

3.6|ينظم RPX1 تراكم DMNT بالاعتماد على PEN1

للتحقيق في مساهمة PEN1 في تراكم DMNT المنظم لـ rpx1-1، أنشأنا بنية تحتوي على miRNA اصطناعي (PEN1amiR) وقمنا بتحويله إلى طفرات rpx1-1. لقد أنشأنا أيضًا بنية تعبير زائد PEN1، والتي تم تحويلها إلى Col‐0 (35pro: PEN1/Col‐{{10}}). أظهر تحليل التعبير الجيني أن PEN1 قد تم تدميره (4-7 طيات) في PEN1amiR/rpx1‐1 مقارنةً بـ rpx1-1، وتم التعبير عنه بشكل مفرط (~ 2.5 مرة) في 35Spro: PEN1 مقارنة مع Col‐0 (الشكل 5 أ). في هذه الخطوط المعدلة وراثيا، لم يتأثر التعبير عن RPX1 بضربة قاضية PEN1 أو الإفراط في التعبير (الشكل 5 ب). عند الإصابة بـ P. xylostella لمدة 6-24 ساعة، تم تنظيم تعبير PEN1 بشكل ملحوظ في Col‐0 وrpx1‐1، وتم تحقيق تعبير PEN1 أعلى بكثير في rpx1‐1 بعد 24 ساعة من الإصابة (الشكل 5 ج). . بعد ذلك، قمنا بقياس محتوى DMNT في Col‐0، وrpx1‐1، وPEN1amiR/rpx1‐1، و35Spro: PEN1/Col‐{{50}}. بدون الإصابة بـ P. xylostella، أنتج rpx1‐1 مستويات أعلى من DMNT مقارنة بـ Col‐0 (الشكل 5d,e,f,k,l)، وعندما تم تدمير PEN1 بواسطة microRNA الاصطناعي في rpx1‐1 (PEN1amiR) /rpx1‐1)، تم ضبط مستويات DMNT، مما أظهر مستوى أقل بكثير من ذلك الموجود في rpx1‐1 (الشكل 5 د، ز، ح، م، ن). عند الإصابة باليرقات، تم تنظيم مستويات DMNT في شتلات Col-0 وrpx1-1 بشكل كبير، ولكن في شتلات PEN1amiR/rpx1-1، لا يمكن تحفيز مستوى DMNT وكان أقل بكثير من ذلك في rpx1-1 (الشكل 5 د). g، h، m، n)، مما يشير إلى أن PEN1 قد يلعب دورًا مهمًا في التخليق الحيوي DMNT المنظم بواسطة RPX1، كما هو موضح في المعلومات الداعمة: الشكل S3. تمشيا مع هذا، تم تراكم DMNT بشكل كبير في 35Spro: شتلات PEN1 / Col-0 (الشكل 5 د، ط، ي، س، ع).

الشكل 4: يؤدي فقدان RPX1 إلى زيادة تراكم ثنائي ميثيل -1،3،7 - نوناترين (DMNT). ( أ ) التحليل اللوني للغاز - قياس الطيف الكتلي (GC-MS) لـ DMNT في خطوط Col-0 وrpx1‐1 وRPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1‐1). يظهر معيار DMNT في الأسفل. ( ب ) تحليل كروماتوجرافي أيوني إجمالي (TIC) لـ DMNT تم التقاطه من Col‐0 وrpx1‐1 وRPX1com. (ج) يزيد محتوى DMNT في متحولة rpx1‐1 ولكنه يعود إلى مستويات النوع البري في النباتات المعدلة وراثيا RPX1com. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± sem؛ تشير الحروف المختلفة إلى وجود اختلاف كبير (تحليل التباين أحادي الاتجاه، n=3). [يمكن الاطلاع على الشكل الملون على موقع wileyonlinelibrary.com]

3.7|يساهم PEN1 في قتل P. xylostella في rpx1‐1

بالنظر إلى ملاحظة أن ضربة قاضية PEN1 يمكن أن تخفف من تراكم DMNT الناجم عن تعطيل RPX1 (الشكل 5) ، أجرينا اختبارات حيوية على ضربة قاضية PEN1 والإفراط في التعبير عن نبات الأرابيدوبسيس المعدل وراثيًا لإثبات دوره البيولوجي. لقد وجدنا أن يرقات P. xylostella لم تظهر أي تفضيل لنباتات amiR-PEN1/rpx1‐1 مقارنة مع Col‐0 (المعلومات الداعمة: الشكل S7). وفي الوقت نفسه، أظهرت يرقات P. xylostella التي تم تغذيتها بـ PEN1-amiR/rpx1-1 معدل وفيات أقل بشكل ملحوظ ومعدلات تشرنق أعلى من rpx1-1، في حين أظهرت اليرقات التي تم تغذيتها بـ 35Spro: PEN1/Col‐0 معدل وفيات أعلى وانخفاض التشرنق معدلات من تلك التي يتم تغذيتها بـ Col-0 (الشكل 6 أ، ب). تمشيًا مع هذه النتائج، أظهر "اختبار Smurf" وتجارب القطع الإضافية أن PEN1-amiR/rpx1-1 كان لديه أمعاء طبيعية وسليمة وPM مقارنة باليرقات التي تتغذى على rpx1-1 (الشكل 6 ج، د، ز، ح). والإفراط في التعبير عن PEN1 تسبب في أضرار جسيمة في الأمعاء الوسطى و PM في يرقات P. xylostella (الشكل 6 ج ، د ، ط ، ي). تشير هذه النتائج إلى أن ضربة قاضية PEN1 يمكن أن تمنع التأثيرات السلبية على نمو اليرقات الناتجة عن تعطيل RPX1، وبالتالي تلعب دورًا مهمًا في التأثير السام الناجم عن rpx 1-1- على يرقات P. xylostella.

3.8|ينقل DMNT من الجذور إلى الأجزاء الهوائية من الأرابيدوبسيس 

تم الإبلاغ عن أن PEN1 يتم التعبير عنه بشكل أساسي في جذور الأرابيدوبسيس (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (المعلومات الداعمة: الشكل S8a)، والذي يختلف عن النتائج التي أظهرتها الأجزاء الجوية من rpx1‐1 سمية P. xylostella بطريقة تعتمد على PEN1 (الشكل 6). لذلك، قمنا بصياغة فرضية بديلة: تقوم النباتات بتصنيع DMNT بشكل رئيسي في الجذور وتنقله إلى الأجزاء الهوائية، حيث تعزز مقاومة الحشرات. لاختبار هذه الفرضية، أجرينا اثنين من فحوصات النقل DMNT. في الاختبار الأول (الشكل 7 أ)، قمنا بحضانة جذور شتلات الأرابيدوبسيس عمرها 3- 3- أسبوع في وسط نمو نبات سائل يحتوي على 2.5 ميكرومول/لتر DMNT، باستخدام DMSO كعنصر تحكم. بعد الاستزراع لمدة 24 ساعة، قمنا باستئصال أوراق نبات الأرابيدوبسيس وعرضناها على يرقات P. xylostella. بالمقارنة مع التحكم في DMSO، تسببت أوراق النباتات المعالجة بـ DMNT في ارتفاع معدل وفيات اليرقات بشكل ملحوظ وانخفاض معدلات التشرنق مقارنة بالتحكم (الشكل 7 ب، ج). في التجربة الثانية التي تهدف إلى الحصول على مزيد من التحقق المستقل من نقل DMNT، قمنا بتسمية DMNT بـ 2 H وأضفنا DMNT-2 H إلى وسط نمو النبات السائل. بعد 24 ساعة من الحضانة، تم إثراء DMNT-2 H بدرجة عالية في الأوراق (الشكل 7 د – ط). لاستبعاد احتمال أن يتطاير DMNT من وسط النمو السائل إلى الهواء ويلوث الأجزاء الهوائية للنبات، قمنا بإعداد تحكم متوازي، والذي تم إجراؤه بنفس الطريقة كما في الشكل 7 أ، فيما عدا أن جذور الأرابيدوبسيس لم تكن مغمورة في السائل متوسطة النمو. أظهرت النتائج أنه لم يتم اكتشاف DMNT-2H في الأجزاء الهوائية للنباتات (المعلومات الداعمة: الشكل S8b،c). وبالتالي، فإننا نقترح أن ينتقل DMNT من الجذور، حيث يتم إنتاجه، إلى أوراق الأرابيدوبسيس، حيث يسبب موت الآفات.

الشكل 5: يساهم PEN1 بدور مهم في تراكم ثنائي ميثيل -1،3،7-نوناترين (DMNT) في rpx1-1. ( أ ) تحليل تعبير PEN1 في Col‐0، rpx1‐1، ضربة قاضية PEN1 في خلفية rpx1‐1 (PEN1-amiR/rpx1‐1) وتعبير PEN1 الزائد (35Spro:PEN1/Col‐{{2{{ 22}}}}) سطر. ( ب ) تعبير RPX1 في Col‐{{30}}، rpx1‐1، PEN1‐amiR/rpx1‐1 و35Spro:PEN1/Col‐0. ( ج ) يتم التعبير عن تعبير PEN1 عن طريق غزو Plutella xylostella في Col‐0 وrpx1‐1. ( د ) مقارنة تراكم DMNT بين Col‐0 وrpx1‐1 وPEN1‐amiR/rpx1‐1 و35Spro:PEN1/Col‐0. ( ه - ي ) التحليل اللوني للغاز - قياس الطيف الكتلي (GC-MS) للمواد المتطايرة المنبعثة من Col-0 (e)، rpx1‐1 (f)، PEN1-amiR/rpx1‐1 (g، h) و35Spro: خطوط PEN1/ Col‐0 (i, j). ( k - p ) TIC لـ DMNT تم التقاطها من Col-0 (k)، rpx1‐1 (l)، PEN1-amiR/rpx1‐1 (m، n) و35Spro: خطوط PEN1/Col-0 (o، p) المقابلة للبيانات الموجودة في ( ه - ي ). في (أ-د)، يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± sem؛ تشير الحروف المختلفة إلى وجود اختلاف كبير (تحليل التباين أحادي الاتجاه، n=3). [يمكن الاطلاع على الشكل الملون على موقع wileyonlinelibrary.com]

3.9|يتحلل RPX1 بسبب غزو P. xylostella وعلاجات الجروح

لقد أظهرنا أنه تم تنظيم تعبير PEN1 في شتلات rpx1‐1 ونبات الأرابيدوبسيس المصابة بيرقات P. xylostella (الشكل 5 أ، ج)، مما يزيد من احتمال استجابة RPX1 أيضًا للإصابة باليرقات. للتحقق من صحة هذا التوقع، قمنا بدراسة الاستجابة المحتملة لـ RPX1 لغزو P. xylostella. أظهر تحليل التعبير الجيني أنه تم التعبير عن RPX1 في أنسجة مختلفة (المعلومات الداعمة: الشكل S9a)، ولكن لم يكن هناك استجابة كبيرة للإصابة باليرقات لمدة 6-24 ساعة (المعلومات الداعمة: الشكل S9b). لذلك، قمنا بفحص مستويات البروتين RPX1 في RPX1pro: النباتات المعدلة وراثيا RPX1-GFP عن طريق إجراء التطعيم المناعي. أظهرت النتائج أنه بدون الإصابة باليرقات، كان RPX1-GFP مستقرًا خلال 0-12{{40}} دقيقة؛ في المقابل، بعد الإصابة باليرقات لمدة 15 دقيقة، بدأ RPX1-GFP في التدهور؛ بعد 12 دقيقة، انخفض بروتين RPX1 ‐ GFP بشكل مستمر إلى ما يقرب من 6٪ من نقطة وقت البداية (الشكل 8 أ، المعلومات الداعمة: الشكل S1 0 أ). كعنصر تحكم، في شتلات الأرابيدوبسيس التي تحتوي على الجينات المحورة GFP، كان GFP مستقرًا نسبيًا بعد الإصابة باليرقات (الشكل 8 ب). لاستبعاد التأثير المحتمل لعلامة GFP على استقرار RPX1، أنشأنا نباتات RPX1 معدلة وراثيًا بعلامة FLAG (35Spro: RPX1-FLAG) لإجراء تجارب الإصابة باليرقات، والتي أظهرت نتائج متسقة مفادها أن RPX1-FLAG يمكن أيضًا أن يتحلل بواسطة اليرقات. الإصابة، على غرار RPX1-GFP (الشكل 8C). غالبًا ما تسبب الإصابة بالحشرات جروحًا في النباتات، وقد يحاكي الضرر الجسدي جزئيًا عملية تغذية الحشرات العاشبة. لإثبات ما إذا كان الجرح يمكن أن يؤدي إلى تدهور RPX1، استخدمنا إبرة لإنشاء ثقوب في أوراق النبات لتقليد الجرح ووجدنا أن RPX1-GFP يتحلل بعد 3 0 دقيقة من المعالجات (الشكل 8 د، المعلومات الداعمة: الشكل S10 ب). لفهم سبب تدهور RPX1 بشكل أفضل عند الإصابة بـ P. xylostella، قمنا بحضانة أنسجة النباتات المعدلة وراثيا RPX1-GFP معًا في محلول لمدة 15 دقيقة مع محلول Col-0، الذي أصيب بـ P. xylostella لمدة 15-120 دقيقة. أو أنسجة Col-0 بدون إصابة. أظهر التحليل المناعي أن مستوى RPX1-GFP من العينات المحتضنة بـ Col-0 المصابة مسبقًا كان أقل بكثير من تلك التي تحتوي على Col-0 غير المصابة (الشكل 8 هـ)، مما يشير إلى أن غزو P. xylostella تسبب في بعض العوامل أو الإشارات في Col-0 قد يؤدي ذلك إلى تدهور RPX1.

3.10|تمنح طفرة rpx1‐1 ميزة في تطوير النبات وتكاثره

السمة المشتركة للاستجابات الدفاعية الخاصة بالحيوانات العاشبة هي المفاضلة بين مقاومة الآفات ونمو النبات وتكاثره (Li et al., 20}18). لتحديد ما إذا كان النمط الوراثي في ​​موضع RPX1 يخضع لمثل هذه المقايضات، قمنا بمقارنة إنتاج البذور في طفرات Col‐{{10}} وrpx1‐1. في غياب الإصابة بـ P. xylostella، كان إنتاج البذور لكل نبات مشابهًا بين النمطين الوراثيين (المعلومات الداعمة: الشكل S11). على النقيض من ذلك، فإن تعريض نباتات rpx1‐1 وCol-0 عمرها 3 أسابيع للإصابة بـ 15 s-instar P. xylostella لمدة 72 ساعة فقط قلل من إنتاجية البذور النهائية لـ Col-0 بثلاثة أضعاف، في حين لم يتأثر إنتاج البذور في rpx1-1 بشكل كبير. علاوة على ذلك، كان إنتاج بذور RPX1com مشابهًا لذلك الخاص بـ Col-0، ولكنه أقل بكثير من إنتاج rpx1-1، مما يشير إلى أن تعطيل RPX1 يمنح ميزة في إنتاج البذور عند الإصابة باليرقات (المعلومات الداعمة: الشكل S11). قمنا أيضًا بتقييم إنتاج البذور في 35Spro: PEN1 الأرابيدوبسيس المعدل وراثيًا ولاحظنا أن الإفراط في التعبير عن PEN1 أنتج إنتاجًا أعلى للبذور في ظل الظروف الموبوءة باليرقات وغير الموبوءة (المعلومات الداعمة: الشكل S11). تشير هذه النتائج إلى أن طفرة rpx1‐1 والتعبير الأعلى لـ PEN1 يمنحان مقاومة لـ P. xylostella في غياب مقايضة النمو المرتبطة عادةً، مما يسلط الضوء على إمكانات RPX1 وPEN1 في برامج التربية الجزيئية التي تهدف إلى تحسين إنتاج المحاصيل.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

4|مناقشة

تؤدي الآفات إلى انخفاض كبير في إنتاجية وجودة المحاصيل الزراعية، مما يجعل حماية النباتات أولوية وهدفًا طويل المدى للمزارعين والمربين. في هذه الدراسة، حددنا الأرابيدوبسيس المتحول rpx1‐1، والذي أظهر مقاومة عالية لـ P. xylostella، وهي آفة حرشفية الأجنحة مهمة للمحاصيل. كشف تحليلنا أن طفرة rpx1‐1 أدت إلى ارتفاع مستويات نسخة PEN1، وتراكم DMNT، وتحسين مقاومة النبات ضد الآفات. لقد أظهرنا أيضًا أن بروتين RPX1 يمكن أن يتحلل بسبب الإصابة باليرقات وعلاج الجروح.

الشكل 6: يساهم PEN1 في تعزيز مقاومة rpx1‐1 لـ Plutella xylostella. (أ، ب) التحوير PEN1-amiR يخفف بشكل كبير من مقاومة الإصابة بـ rpx1-1 لـ P. xylostella، في حين أن 35Spro: PEN1 يعزز تأثير المقاومة، كما يتضح من معدلات الوفيات (أ) ومعدلات التشرنق (ب) ليرقات P. xylostella . ( ج ) صور تمثيلية لليرقات التي تتغذى على Col-0، وrpx1‐1، وPEN1-amiR/rpx1‐1، و35Spro: شتلات PEN1 تظهر احتباس الصبغة، كما يتضح من مظهرها الأزرق، مثل الرسوم المتحركة Smurf شخصية. ( د ) نتائج القياس الكمي للصور الموضحة في (ج). ( ه - ي ) يُظهر المقطع العرضي وتلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين تلف PM من اليرقات التي تتغذى على Col-0 (e)، rpx1‐1 (f)، PEN1-amiR/rpx1‐1 (g، h) و35Spro: شتلات PEN1 (i، j). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​± sem؛ تشير الحروف المختلفة في كل معاملة إلى وجود اختلاف كبير في (أ، ب، د) (تحليل التباين أحادي الاتجاه، ن=6). [يمكن الاطلاع على الشكل الملون على موقع wileyonlinelibrary.com]

في اختبارات عدم الاختيار، أظهر متحولة rpx1-1 مقاومة كبيرة لغزو P. xylostella (الشكل 1C). على العكس من ذلك، أظهرت يرقات P. xylostella التي تتغذى على نباتات rpx1-1 آلامًا تنموية سلبية شديدة (الشكل 1 د، هـ). تُعزى هذه الأنماط الظاهرية إلى تعطيل RPX1، لأن خطوط تكامل RPX1 (RPX1com) حساسة مثل النوع البري Col‐0 (الشكل 1ج-ه)، مما يدعم الاستنتاج القائل بأن RPX1 متورط في مقاومة الآفات. بالإضافة إلى قتل اليرقات، كان للطفرة rpx1-1 أيضًا تأثير طويل المدى على نمو اليرقات، بما في ذلك التشرنق (الشكل 1f)، مما أدى إلى انخفاض تكاثر الآفة.

الشكل 7: ينتقل ثنائي ميثيل -1،3،7 - نوناترين (DMNT) من جذور نبات الأرابيدوبسيس إلى الأوراق. (أ) رسم توضيحي لفحص نقل DMNT باستخدام شتلات الأرابيدوبسيس. تم إذابة DMNT في وسط سائل Murashige وSkoog. بعد 24- ساعة من الاستزراع، تم استئصال الجذور، واستخدمت الأوراق لتغذية يرقات Plutella xylostella لتسجيل معدل الوفيات ومعدل التشرنق. (ب، ج) DMNT، المنقول من الجذور إلى الأوراق، يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات (ب) وانخفاض معدلات التشرنق (ج) ليرقات P. xylostella. ( د - و ) يتم نقل 2 DMNT المسمى H (DMNT-2 H) من الجذر إلى الأوراق. تم إذابة DMNT-2 H في وسط MS سائل كما في (أ) لمدة 24 ساعة، ثم تم حصاد الأوراق لتحليل GC-MS (هـ). تم استخدام DMSO كعنصر تحكم (د). يظهر معيار DMNT-2 H كمرجع (f). (ز – ط) TIC لـ DMNT-2 H تم الحصول عليه أثناء فحوصات النقل الموضحة في (d – f). يتم عرض البيانات على أنها متوسط ​​± sem، في (b، c) n=6، وتظهر القيم p بجوار أعمدة الرسم البياني للإشارة إلى اختلاف كبير (اختبار t غير متزاوج ثنائي الذيل). لاحظ أنه تم تضمين المزيد من عناصر التحكم في فحوصات النقل في المعلومات الداعمة: الشكل S8. [يمكن الاطلاع على الشكل الملون على موقع wileyonlinelibrary.com]

علاوة على ذلك، أشارت اختبارات التفضيل إلى أن طفرات Col-{{0}} من النوع البري وrpx1‐1 قد تنبعث منها مركبات متطايرة مختلفة؛ أحدها هو DMNT، وهو فعال في صد الآفات (الأشكال 1 ب، 3 أ، المعلومات الداعمة: الشكل S5 أ). بناءً على النتائج المذكورة أعلاه، نقترح أن تراكم DMNT في rpx1‐1 هو أحد أسباب التسمم الحشري. تم الإبلاغ عن تورط مسارات إشارات JA وSA في مقاومة الحشرات (Costarelli et al., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). في هذه الدراسة، بعد 24 ساعة من تغذية الحشرات، زاد محتوى JA وSA في كل من طفرات Col-0 وrpx1-1، وكانت الزيادة في محتوى SA في rpx1-1 أقل بكثير من تلك الموجودة في Col-0، بينما كانت الزيادة في محتوى JA أعلى بكثير (المعلومات الداعمة: الشكل S6)، مما يشير إلى أن JA وSA قد يلعبان أيضًا أدوارًا مهمة في مقاومة rpx1‐1 لـ P. xylostella. لذلك، نقترح أن كلا من التأثيرات المباشرة وغير المباشرة لـ rpx1‐1 تساهم في تعزيز مقاومة نبات الأرابيدوبسيس ضد الحشرات.

الشكل 8: يحدث تحلل البروتين RPX1 عن طريق غزو Plutella xylostella وعلاجات الجروح. (أ) RPX1-GFP من RPX1pro: تتحلل النباتات المعدلة وراثيا RPX1‐ GFP عند الإصابة بـ P. xylostella لمدة 15−120 دقيقة. (ب) كعنصر تحكم في (أ)، GFP نفسها من 35Spro: لا تظهر النباتات المعدلة وراثيا GFP أي تدهور عند الإصابة باليرقات. (ج) علم RPX1 من 35Spro: تتحلل النباتات المعدلة وراثيا ذات علم RPX1 عند الإصابة باليرقات. (د) RPX1-GFP من RPX1pro: تتحلل النباتات المعدلة وراثيا RPX1-GFP بمقدار 15-120 دقيقة من علاج الجرح. (هـ) RPX1-GFP من RPX1pro: تتحلل النباتات المعدلة وراثيا RPX1-GFP عندما يتم تحضين الأنسجة في محلول مع أنسجة نباتات Col-0 التي أصيبت بـ P. xylostella لمدة 15-120 دقيقة. تُظهر القيم الموجودة أسفل نطاقات النشاف المناعي وفرة البروتين النسبية التي تم قياسها باستخدام ImageJ. وقد تكررت كل هذه التجارب ثلاث مرات على الأقل، وتظهر النتائج التمثيلية. يتم عرض المزيد من البيانات التجريبية مع الخطوط المعدلة وراثيا المستقلة في المعلومات الداعمة: الشكل S10. [يمكن الاطلاع على الشكل الملون على موقع wileyonlinelibrary.com]

نقدم عدة خطوط من الأدلة توضح كيف يساهم تراكم DMNT بوساطة PEN {{0}} في وظائف RPX1 في مقاومة النبات لـ P. xylostella. تم التعرف على PEN1، وهو جين رئيسي ينتمي إلى مسار التخليق الحيوي لسيسكويتيربينويد وترايتيربينويد، من تحليل KEGG لبيانات RNA-seq من متحولة rpx1-1 (الشكل 3 ب)، مما يوفر رابطًا بين RPX1 وPEN1 وDMNT (Sohrabi et al. ، 2015). دعمًا لـ DMNT كأحد المركبات المسببة التي تقتل يرقات الآفات، تراكم DMNT أعلى في طفرات rpx1‐1 مقارنةً بـ Col‐0 (الشكل 3 أ)، ولكن تم عكس المستوى في خطوط RPX1com إلى Col‐0 ( الشكل 4 أ-ج). بالإضافة إلى ذلك، يمكن لـ DMNT المُصنَّع كيميائيًا أن يصد ويقتل يرقات P. xylostella (المعلومات الداعمة: الشكل S5a، b)، وهو ما يتماشى مع نتائج rpx1‐1 (الشكل 1b، e). علاوة على ذلك، أنتجت النباتات المعدلة وراثيًا التي تزيد من تعبير PEN1 أكثر من أربع مرات من DMNT في Col-0 ومنحت مقاومة مماثلة لـ P. xylostella مثل rpx1‐1 (الأشكال 5d وi وj وo وp و6).

الأهم من ذلك، أن تقليل مستويات نسخة PEN1 في rpx1‐1 يمنع التخليق الحيوي DMNT (الشكل 5 د، ز، ح، م، ن) ويخفف من تأثير القتل على يرقات P. xylostella، التي تكون عرضة للإصابة بـ P. xylostella (الشكل 6 أ، ب). ). تشير هذه النتائج المجمعة إلى أن طفرة PEN1 يمكن أن تمنع وظيفة تعطيل RPX1 في مقاومة الآفات. تسبب آفة RPX1 زيادة في وفرة PEN1 (الشكل 5 أ)، ومع ذلك فإن كيفية تنظيم RPX1 لـ PEN1 والتوسط في عملية التخليق الحيوي DMNT تحتاج إلى مزيد من الدراسات. نظرًا لأنه من المتوقع أن يكون RPX1 بروتينًا جديدًا مرتبطًا بالغطاء ينتمي إلى عائلة eIF4E (Rhoads، 2009؛ Ruud et al.، 1998)، فمن الممكن أن يؤثر RPX1 على PEN1 من خلال التأثير على استقرار mRNA أو كفاءة ترجمة البروتين، وهو ما سيكون عاملاً مهمًا. الموضوع في الدراسة المستقبلية. علاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه لا يزال من الممكن تحفيز مستويات DMNT إلى مستوى أعلى عن طريق غزو P. xylostella في متحولة rpx1‐1 (الشكل 5 د)، مما يشير إلى أنه قد تكون هناك بعض المسارات الأخرى التي تنظم تراكم DMNT بشكل مستقل عن RPX1. تم اكتشاف DMNT في مجموعة واسعة من الأنواع النباتية، مثل الأرابيدوبسيس (Sohrabi et al.، 2015)، والقطن (Liu et al.، 2018) والذرة (Richter et al.، 2016). بالإضافة إلى ذلك، فهو يمنح حماية غير مباشرة ضد الآفات العاشبة عن طريق جذب الحيوانات المفترسة، مما يسمح للنباتات بإزالة تهديدات الآفات (Kappers et al., 2005; Lee et al., 2010; Li et al., 2018). لقد أبلغنا مؤخرًا أنه يمكن أن يصد ويقتل يرقات P. xylostella عن طريق إتلاف PM في الأمعاء الوسطى لليرقات (Chen et al.، 2021). هنا، وجدنا أن بنية PM يمكن أن تتضرر بشدة عندما يتم تغذية اليرقات بالشتلات rpx1 ‐ 1 أو PEN1 المفرطة التعبير (الأشكال 2c – j و6i، j). تتوافق هذه النتائج مع النتائج التي توصلت إليها تجارب علاج DMNT التي وصفناها سابقًا (Chen et al., 2021)، مما يدعم مرة أخرى الاقتراح القائل بأن تراكم DMNT في rpx1‐1 قد يكون أحد العوامل التي تساهم في تنافر الآفات وموتها. ينتمي RPX1 إلى عائلة الجينات eIF4E (Rhoads، 2009) ويشارك في حركة الفيروسات النباتية من خلية إلى أخرى (Keima et al.، 2017). ومع ذلك، ما إذا كان تراكم DMNT يرتبط بالمقاومة الفيروسية في النباتات لا يزال غير واضح. يتم التعبير عن PEN1 على وجه التحديد في جذور نبات الأرابيدوبسيس، حيث يحفز التخليق الحيوي لـ DMNT (Sohrabi et al.، 2015).

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

باستمرار في هذه الدراسة، اكتشفنا تعبير PEN1 عاليًا في الجذور وتعبيرًا منخفضًا جدًا في الأوراق (المعلومات الداعمة: الشكل S8a). لاحظنا أن أوراق الطفرة rpx1‐1 كانت سامة ليرقات P. xylostella (الشكل 1)، مما يشير إلى أن تراكم DMNT ومقاومة الآفات المرتبطة بها في الأوراق لا يمكن تفسيره ببساطة من خلال تعبير PEN1 الدقيق في هذه الأنسجة. بمعنى آخر، وجدنا أن DMNT يمكن نقله من جذور النباتات إلى الأجزاء الهوائية، كما هو موضح من خلال فحوصات نقل DMNT وتحليل GC-MS لمستخلصات الأوراق من النباتات المحتضنة بـ DMNT-2 H في جذورها (الشكل 7). إن كيفية نقل هذا المركب داخل النباتات غير واضحة، وقد يكون هذا موضوعًا لمزيد من البحث. تتمتع النباتات بالقدرة على تحمل هجمات الحشرات ومكافحتها بطرق مختلفة. هنا، من خلال إجراء تحليل مناعي لـ RPX1pro: RPX1-GFP و35Spro: النباتات المعدلة وراثيا RPX1-FLAG، وجدنا أنه عند الإصابة بـ P. xylostella، يمكن أن يتحلل بروتين RPX1 بسرعة (الشكل 8 أ، ج، المعلومات الداعمة: الشكل S10a)، في حين أن ، على مستوى التعبير mRNA، ظل RPX1 غير متأثر (المعلومات الداعمة: الشكل S9b). حاليًا، لا تزال كيفية تحلل بروتين RPX1 غير واضحة، لكن بياناتنا تشير في المقام الأول إلى أن آلية تحلل البروتين قد تكون متورطة في مسارات الإشارة للجرح (الشكل 8 د، المعلومات الداعمة: الشكل S10 ب).

علاوة على ذلك، تسبب P. xylostella المصاب مسبقًا بتدهور RPX1-GFP في نباتات مختلفة (الشكل 8e)، مما يشير إلى أن الإصابة بـ P. xylostella قد تسبب تراكم الإشارات في النباتات التي يمكن أن تؤدي بدورها إلى تدهور RPX1. سيكون من المثير للاهتمام معرفة هوية الإشارات في المستقبل. تعد هذه الخاصية الخاصة بتدهور RPX1 مهمة للنباتات، مما قد يؤدي إلى تراكم DMNT ويوفر استجابة سريعة لأضرار الآفات (المعلومات الداعمة: الشكل S3). غالبًا ما تأتي زيادة تحمل النبات للآفات على حساب اللياقة البدنية. إن ملاحظة أن طفرة rpx1‐1 تؤدي إلى تعزيز المقاومة (الشكل 1) وزيادة إنتاج البذور (المعلومات الداعمة: الشكل S11) في الأرابيدوبسيس دون مقايضات كبيرة توفر وسيلة واعدة لهندسة المحاصيل ذات المقاومة الأعلى للآفات. على سبيل المثال، يعد تحرير الجينوم عبر CRISPR-Cas9 أداة قوية لتحسين المحاصيل (Yang et al., 2017) التي تسمح بإدخال طفرات في RPX1 وربما توسع تطبيقاتها لتشمل محاصيل مختلفة.

مراجع

Arimura، G.، Ozawa، R.، Shimoda، T.، Nishioka، T.، Boland، W. & Takabayashi، J. (2000) المواد المتطايرة المستحثة بالأعشاب تثير جينات الدفاع في أوراق فول ليما. الطبيعة، 406، 512-515.

تشن، C.، تشن، H.، هوانغ، S.، جيانغ، T.، وانغ، C.، تاو، Z. وآخرون. (2021) يحمي DMNT المتطاير النباتات بشكل مباشر ضد Plutella xylostella عن طريق تعطيل حاجز المصفوفة المحيطية في المعى المتوسط ​​للحشرة. إي لايف، 10، e63938.

تشينغ، X.، هو، J.، لي، J.، تشين، J.، وانغ، H.، ماو، T.، وآخرون. (2018) تلف الغدة الحريرية والاستجابة النسخية لإزالة السموم من الجينات المرتبطة بالإنزيمات في بومبيكس موري تحت التعرض للفوكسيم. الغلاف الكيميائي، 209، 964-971.

Clough، SJ & Bent، AF (1998) تراجع الأزهار: طريقة مبسطة للتحول بوساطة Agrobacterium لـ Arabidopsis thaliana. مجلة النبات، 16، 735-743.

Costarelli، A.، Blanchet، C.، Ederli، L.، Salerno، G.، Piersanti، S.، Rebora، M. et al. (2020) حمض الساليسيليك الناجم عن تغذية الحيوانات العاشبة يعادي دفاعات النبات التي تتوسط حمض الجاسمونيك ضد هجوم الحشرات. إشارات النبات وسلوكه، 15، e1704517.

دوغلاس، AE (2018) استراتيجيات لتعزيز مقاومة المحاصيل للآفات الحشرية. المراجعة السنوية لبيولوجيا النبات، 69، 637-660.

Feng، Y. & Zhang، A. (2017) العطر الزهري، بنزوات الميثيل، هو مبيد حشري أخضر فعال. التقارير العلمية، 7، 42168.

Field، B. & Osbourn، AE (2008) التجميع المستقل للتنويع الأيضي لمجموعات الجينات الشبيهة بالأوبرون في نباتات مختلفة. العلوم، 320، 543-547.

Go، YS، Lee، SB، Kim، HJ، Kim، J.، Park، HY، Kim، JK et al. (2012) تحديد سينسيز المعدنية، وهو أمر بالغ الأهمية للنمو والتنمية في نبات الأرابيدوبسيس. مجلة النبات، 72، 791-804.

Gols، R. (2014) الدفاعات الكيميائية المباشرة وغير المباشرة ضد الحشرات في إطار متعدد العناصر. النبات والخلية والبيئة، 37، 1741-1752.

Gomez، MA، Lin، ZD، Moll، T.، Chauhan، RD، Hayden، L.، Renninger، K.، et al. (2019) التحرير المتزامن لـ CRISPR/Cas9 لأشكال الكسافا eIF4E الإسوية nCBP-1 وnCBP-2 يقلل من شدة أعراض مرض الخط البني للكسافا وحدوثه. مجلة التكنولوجيا الحيوية النباتية، 17، 421-434.

Gouinguené، S.، Pickett، JA، Wadhams، LJ، Birkett، MA & Turlings، TCJ (2005) الاستجابات الفيزيولوجية الكهربية الهوائية لثلاثة دبابير طفيلية على المواد المتطايرة التي تسببها اليرقة من الذرة (Zea mays) والقطن (Gossypiumherbaceum) واللوبيا (فينيا أونغويكولاتا). مجلة البيئة الكيميائية، 31، 1023-1038.

هاندريك، V.، روبرت، CAM، أهيرن، KR، تشو، S.، ماتشادو، RAR، Maag، D. وآخرون. (2016) التخليق الحيوي لمركبات الدفاع البنزوكسازينويد 8-O-ميثيل في الذرة. الخلية النباتية، 28، 1682-1700.

هوانغ، إيه سي، جيانغ، تي، ليو، واي إكس، باي، واي سي، ريد، جيه، تشو، بي وآخرون. (2019) تقوم شبكة التمثيل الغذائي المتخصصة بتعديل الكائنات الحية الدقيقة لجذر الأرابيدوبسيس بشكل انتقائي. العلوم، 364، eaau6389.

Huang، HJ & Yang، WB (2007) تخليق الموينوسينول ونظائره باستخدام BT-sulfone في أوليفينات Julia-Kocienski. رسائل رباعي الاسطح، 48، 1429-1433.

Jing، T.، Du، W.، Gao، T.، Wu، Y.، Zhang، N.، Zhao، M. et al. (2020) يلعب DMNT الناجم عن الحيوانات العاشبة والمحفز بواسطة CYP82D47 دورًا مهمًا في تحفيز مقاومة الحيوانات العاشبة المعتمدة على JA في نباتات الشاي المجاورة. النبات والخلية والبيئة، 44، 1178-1191.

Johnson، SN & Züst، T. (2018) تغير المناخ والآفات الحشرية: المقاومة ليست عديمة الجدوى؟ الاتجاهات في علوم النبات، 23، 367-369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: مبيد حشري ناجح ذو سمات وأخبار بيئية جديدة. علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والتكنولوجيا الحيوية، 101، 2691-2711.

Kappers، IF، Aharoni، A.، van Herpen، TWJM، Luckerhoff، LLP، Dicke، M. & Bouwmeester، HJ (2005) الهندسة الوراثية لاستقلاب terpenoid تجذب الحراس الشخصيين إلى الأرابيدوبسيس. العلوم، 309، 2070-2072.

كيما، تي، هاجيوارا كومودا، واي، هاشيموتو، إم، نيريا، واي، كوينوما، إتش، إيوابوتشي، إن، وآخرون. (2017) يحد نقص eIF4E isoform nCBP من حركة فيروس نباتي من خلية إلى أخرى يشفر بروتينات الكتلة الجينية الثلاثية في الأرابيدوبسيس ثاليانا. التقارير العلمية، 7، 39678.

Lee، S.، Badieyan، S.، Bevan، DR، Herde، M.، Gatz، C. & Tholl، D. (2010) يتم تصنيع المواد المتطايرة المستحثة بالأعشاب والزهرية أحادية التربين بواسطة إنزيم P450 واحد (CYP82G1) في الأرابيدوبسيس . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم، 107، 21205-21210.

لي، ب.، فورستر، سي.، روبرت، كام، زوست، تي.، هو، إل.، ماتشادو، رار، وآخرون. (2018) التطور المتقارب للتحول الأيضي بين مقاومة المن واليرقة في الحبوب. التقدم العلمي، 4، eaat6797.

ليو، D.، هوانغ، X.، جينغ، W.، An، X.، تشانغ، Q.، تشانغ، H. وآخرون. (2018) تحديد وتحليل وظيفي لاثنين من إنزيمات P450 من Gossypium hirsutum المشاركة في التخليق الحيوي DMNT وTMTT. مجلة التكنولوجيا الحيوية النباتية، 16، 581-590.

Lortzing، T. & Steppuhn، A. (2016) إشارات الجاسمونات في النباتات تشكل بيئة التفاعل بين النبات والحشرة. الرأي الحالي في علم الحشرات، 14، 32-39.

لو، H.، لوه، T.، فو، H.، وانغ، L.، تان، Y.، هوانغ، J.، وآخرون. (2018) مقاومة الأرز للآفات الحشرية بوساطة قمع التخليق الحيوي للسيروتونين. نباتات الطبيعة، 4، 338-344.

Lucioli، A.، Tavazza، R.، Baima، S.، Fatyol، K.، Burgyan، J. & Tavazza، M. (2022) استهداف CRISPR-Cas9 لجين eIF4E1 يوسع طيف مقاومة فيروس البطاطس Y في Solanum الحدبة L. السيرة الذاتية. مرغوب فيه. الحدود في علم الأحياء الدقيقة، 13، 873930.

Ma، F.، Yang، X.، Shi، Z. & Miao، X. (2019) الحديث المتبادل الجديد بين استجابات مسار حمض الإيثيلين وحمض الياسمين لحشرة ماصة خارقة في الأرز. عالم النبات الجديد، 225، 474-487.

Meents، AK، Chen، SP، Reichelt، M.، Lu، HH، Bartram، S.، Yeh، KW et al. (2019) يحفز DMNT المتطاير بشكل منهجي الدفاع المباشر ضد الحيوانات العاشبة المستقل عن الجاسمونات في أوراق نباتات البطاطا الحلوة (Ipomoea Batatas). التقارير العلمية، 9، 17431.

Mikstacki، A.، Zakerska-Banaszak، O.، Skrzypczak-Zielinska، M.، Tamowicz، B.، Szalata، M. & Slomski، R. (2015) Glutathione S-transferase كمؤشر سمية في التخدير العام: علم الوراثة و وظيفة كيميائية حيوية. مجلة التخدير السريري، 27، 73-79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: أفراد عائلة جدد، شركاء ملزمون جدد، أدوار جديدة. مجلة الكيمياء البيولوجية، 284، 16711-16715.

ريختر، A.، شاف، C.، تشانغ، Z.، ليبكا، AE، تيان، F.، كولنر، TG وآخرون. (2016) توصيف مسارات التخليق الحيوي لإنتاج الهوتروبينات المتطايرة DMNT وTMTT في زيا ميس. الخلية النباتية، 28، 2651-2665.

Ruud، KA، Kuhlow، C.، Goss، DJ & Browning، KS (1998) تحديد وتوصيف بروتين جديد مرتبط بالغطاء من نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا. مجلة الكيمياء البيولوجية، 273، 10325-10330.