الطفيليات والالتهابات والتلقيح في الخلايا الاصطناعية الدنيا

خلاصة: توفر الخلايا الاصطناعية الدنيا نموذجًا يمكن التحكم فيه وقابلاً للهندسة للعمليات البيولوجية. على الرغم من أنها أبسط بكثير من أي خلية طبيعية حية، إلا أن الخلايا الاصطناعية توفر هيكلًا لدراسة الأسس الكيميائية للعمليات البيولوجية الرئيسية. هنا، نعرض نظام الخلايا الاصطناعية مع الخلايا المضيفة، التي تتفاعل مع الطفيليات وتتعرض لعدوى متفاوتة الخطورة. نوضح كيف يمكن هندسة المضيف لمقاومة العدوى، ونتحقق من التكلفة الأيضية لتحمل المقاومة، ونعرض تلقيحًا يعمل على تحصين المضيف ضد مسببات الأمراض. يعمل عملنا على توسيع مجموعة أدوات هندسة الخلايا الاصطناعية من خلال إظهار التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض وآليات اكتساب المناعة. وهذا يجعل أنظمة الخلايا الاصطناعية أقرب خطوة إلى تقديم نموذج شامل للحياة الطبيعية المعقدة.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

مقدمة

خلال العقود العديدة الماضية، شهد مجال البيولوجيا التركيبية توسعًا كبيرًا، مما سمح ببناء خلايا اصطناعية تشبه وتشكل جوانب من الحياة البيولوجية الطبيعية. توفر نمذجة المسارات والسلوكيات الخلوية في الخلايا الاصطناعية العديد من المزايا مقارنة بالخلايا الحية مثل بيئة تفاعل أكثر بساطة وتحديدًا، والتحكم الكامل في التركيب البروتيني والكيميائي للخلية، والقدرة على تجزئة المسارات والعمليات البيولوجية المتداخلة، فضلاً عن الحفاظ على أنظمة بيولوجية مهمة غائبة في أنظمة التفاعل المختبري.1،2 وقد سمحت هذه الأصول الفريدة لتقنيات الخلايا الاصطناعية بالفعل بمحاكاة الظروف والمسارات البيولوجية داخل مفاعل حيوي في المختبر (خلية اصطناعية) وجلبت فهمًا أفضل العديد من مجالات الدراسة، بما في ذلك الازدحام الجزيئي، وديناميكيات البروتين الدهني، والحد الأدنى من التمثيل الغذائي، والعديد من الجوانب الهامة الأخرى للحياة البيولوجية.2 هذه الخلايا الاصطناعية الشبيهة بالحياة مع أصولها الفريدة أصبحت بسرعة نماذج أفضل وتلقي المزيد من الضوء على الأعمال الداخلية الغامضة للحياة الخلوية.6،7 ولا تقتصر هذه الاكتشافات على عمليات الخلية الواحدة؛ وقد أثبتت التفاعلات الهندسية بين مجموعات الجسيمات الشحمية أنها تقنية قوية أيضًا. على سبيل المثال، تم تطوير تصميم نظام خلوي اصطناعي يحاكي العلاقة بين المفترس والفريسة باستخدام الضوء كإشارة بين مجموعات الخلايا الاصطناعية هذه. وقد تم تطوير عمل معقد آخر يسمح بانتشار الإشارة عبر مصفوفة قطيرات الخلايا الاصطناعية، السماح للتألق بالانتشار بطريقة مكانية بين السكان. بالإضافة إلى تفاعلات الخلايا الاصطناعية مع الخلايا الاصطناعية، كانت هناك تطورات حديثة في واجهات الخلايا الحية الاصطناعية أيضًا. على سبيل المثال، ثبت أن الخلية الاصطناعية المصممة للتفاعل مع الخلية الجذعية العصبية قادرة على تحفيز التمايز العصبي بالإضافة إلى العمل كهيكل معمم قادر على التفاعل مع أنواع الخلايا الأخرى.10 كانت هناك تطورات لا حصر لها في التطوير انتشار الإشارة والخلايا الاصطناعية التي تعمل كواجهات، ويتم استكشاف الكثير منها في المراجعات التالية. 11-13 باختصار، هناك مجالات بحثية كاملة تهتم بمحاكاة تفاعلات المجموعات الخلوية في النظام النموذجي للخلايا الاصطناعية. وعلى الرغم من ذلك، لم تكن هناك دراسة تستخدم الخلايا الاصطناعية لنمذجة العدوى أو التطفل أو التلقيح. مثلما تُستخدم الخلايا الاصطناعية بشكل شائع لنمذجة العمليات البيولوجية المعقدة بطريقة مبسطة ومنضبطة، توجد إمكانية للتمكن من نمذجة هذه التفاعلات المعقدة بين الكائنات الحية. ويمكن رؤية أهمية ذلك في الدراسة الرائدة التي نجحت في إنتاج جزيئات العاثيات النشطة داخل منصة تعبير بروتينية خالية من الخلايا. 14 نحن نهدف إلى الارتقاء بهذا المفهوم إلى المستوى الكلي من خلال تصميم مجموعات من الخلايا الاصطناعية التي يمكنها إصابة بعضها البعض بشكل فعال واختطافها. جينوم الخلية المضيفة، تمامًا كما تفعل الفيروسات والطفيليات الحية. إن القدرة على تطبيق وهندسة الخلايا الاصطناعية لنمذجة سلوكيات المرض هذه ستوفر أداة قيمة للمجتمع العلمي.

في هذا العمل، نعرض نظامنا لنمذجة أمراض الخلايا الاصطناعية. لقد صممنا خلية مضيفة يمكن أن تتعرض للعدوى من المجموعة الثانية من الخلايا الاصطناعية الطفيلية، وقمنا بالتحقيق في المنافسة على الموارد، واختطاف الجينوم، وإعادة الاستخدام الأيضي الذي يحدث أثناء مثل هذه العدوى. نحن أيضًا نصمم طريقة تسمح بإنقاذ المضيف بعد الإصابة، بالإضافة إلى وسيلة للتلقيح تسمح للمضيف بمقاومة عدوى الخلايا الاصطناعية المسببة للمرض. باختصار، نقدم هيكلًا نموذجيًا جديدًا للأمراض والعدوى للخلايا الاصطناعية. مع هذه التكنولوجيا، يمكن البدء في استخدام الخلايا الاصطناعية كنماذج بدائية للأمراض والعدوى والتلقيح (الشكل 1).

الشكل 1. الطفيليات، والعدوى، ونظام التلقيح في الخلايا الدنيا الاصطناعية. (أ) "المضيف" عبارة عن خلية اصطناعية تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP). على سطح الغشاء الخارجي، يحمل المضيف علامات ssDNA. البروتينات الوحيدة المترجمة إلى مضيف صحي هي البروتينات الخاصة بالمضيف من البلازميدات التي تم تكوين المضيف بها. (ب) "الطفيلي" عبارة عن جسيم شحمي مملوء بالحمض النووي البلازميد الذي يشفر جينًا لبروتين mCherry الفلوري، ويتم تزيين سطح الجسيم الشحمي الطفيلي بعلامة ssDNA (مكملة للعلامة الموجودة على سطح المضيف). تبدأ "العدوى" باندماج الجسيمات الشحمية المضيفة والطفيلية، بوساطة علامات الحمض النووي التكميلية الموجودة على سطحها. بعد الإصابة، يعبر المضيف عن كل من جين المضيف الأصلي (GFP) وجين الطفيلي (mCherry). (ج) تبدأ "العدوى" بالجسيمات الشحمية "الممرضة" التي تحمل جين إنزيم التقييد MunI الذي يندمج مع الجسيمات الشحمية المضيفة. يتم التعبير عن الجين الممرض MunI بواسطة المضيف ويقوم إنزيم تقييد MunI بهضم الحمض النووي المضيف. يؤدي هذا إلى هضم الجينوم المضيف الأصلي، وتحويل معظم تعبير البروتين المضيف من GFP إلى البروتين المشفر للعامل الممرض، MunI. (د) "العدوى المميتة" هي اندماج الجسيم الشحمي المضيف (مع جينوم GFP) مع الجسيم الشحمي الممرض الذي يحتوي على الجين المشفر لـ aHL، وهو بروتين غشائي. بعد الإصابة، يعبر المضيف عن AHL، مما يخلق مسام غشائية، مما يتسبب في تسرب العناصر الغذائية للمضيف وإيقاف عملية التمثيل الغذائي للمضيف بشكل فعال. (هـ) "التحصين" هو حضانة المضيف باستخدام ssDNA الذي يحتوي على تسلسل متوافق مع علامات الاندماج الموجودة على سطح الجسيمات الشحمية المضيفة. يقوم الحمض النووي المحصن بإنشاء وحدة مزدوجة مع علامات الحمض النووي المضيف، مما يمنع تهجين oligos الحمض النووي الأخرى لهذه العلامات. وهذا يمنع اندماج أي جسيمات شحمية مسببة للأمراض في المضيف. هذا رقم إثبات للمفهوم، والرسوم البيانية مخصصة للأغراض التوضيحية، حيث تمثل الكميات النسبية للبروتين المعبر عنها من المضيف ومسببات الأمراض المختلفة. يتم توفير البيانات الحقيقية لكل نظام في الأرقام اللاحقة.

النتائج والمناقشة

في هذا العمل، نستخدم الكلمات: مضيف، طفيلي، عدوى، مميت، لقاح، وتلقيح، كل ذلك في سياق أنظمة الخلايا الاصطناعية غير الحية. ونعني بالعدوى "القاتلة" انخفاضًا ملحوظًا في الترجمة في عدد الخلايا الاصطناعية. تم إجراء جميع التجارب في هذا العمل على خلايا اصطناعية ليست حية، ولا تتكاثر ذاتيًا، ولا تتطور. هذا نظام نموذجي للخصائص والعمليات البيولوجية الطبيعية.

فوائد مكملات cistanche - زيادة المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

إصابة خلية اصطناعية بخلية اصطناعية طفيلية تخطف موارد المضيف.

لاختبار مفهوم نظام الخلايا الاصطناعية الذي يحاكي العدوى، بدأنا ببناء نظام نموذجي للطفيلي. لقد استخدمنا أبسط مفهوم ممكن للطفيل لإعادة تكوينه في هذا النظام الكيميائي الحيوي غير الحي: طفيل يختطف بعض موارد المضيف. في هذه الحالة، يتم تمثيل عملية التمثيل الغذائي للمضيف من خلال التعبير عن بروتين GFP، ويتم تمثيل الطفيلي عن طريق التعبير عن بروتين mCherry. بالنسبة لهذا النظام، استخدمنا الظاهرة الموضحة مسبقًا المتمثلة في إنتاج التعبير البروتيني الخطي الذي يعتمد على تركيز قالب الحمض النووي في TxTl.15،16 أولاً، شرعنا في العثور على تركيز البلازميد الإجمالي الأمثل الذي تتوافق فيه نسبة GFP وmCherry DNA مع نسبة التألق المرصود من هذه البروتينات. لقد قمنا بشكل تعسفي بتعيين الجين GFP باعتباره "المضيف" وجين mCherry باعتباره "الطفيلي". لا تشير هذه الأسماء إلى أي شيء خاص في هذه التجربة بالذات، ولكنها ستشير إلى المضيف والطفيلي في تجارب الخلايا الاصطناعية اللاحقة. هنا، نستخدم هذه الأسماء لتسهيل ربط تجارب إثبات المفهوم هذه بتجارب عدوى الخلايا الاصطناعية اللاحقة باستخدام نفس البلازميدات. نحن مختلطة البلازميدات GFP وmCherry، مع كل من الجينات تحت سيطرة المروج T7 بنسب بلازميد متفاوتة وتركيز البلازميد الكلي في العينات 1، 5، 10، أو 15 نانومتر (الشكل 2B). اتبعت النتائج العلاقة الخطية المتوقعة تقريبًا بين تركيز البلازميد وكثافة التألق المسجلة، مع أفضل تطابق بين نسب تركيز التألق والبلازميد التي لوحظت عند إجمالي 10 نانومتر بلازميد. تشير العلاقة المرصودة إلى أن البلازميدات، مع تشابه البروتينات في الحجم وتكوين الأحماض الأمينية (الشكل S1)، تتنافس على نفس مجموعة موارد TxTl للتعبير عنها. يؤدي تغيير التركيز النسبي للبلازميدات إلى تغييرات في كفاءة التعبير تتناسب تقريبًا مع نسبة البلازميدات. يشير هذا إلى أنه سيكون نموذجًا جيدًا لتقليد عدوى الطفيليات: سوف يتنافس جينوم الطفيلي (البلازميد mCherry) مع الجينوم المضيف (البلازميد GFP). بعد ذلك، قررنا اختبار حالة كان فيها أي من البلازميدات تحت سيطرة مروج أقوى، وبالتالي محاكاة سيناريو تخصيص الموارد المتحيز. للحفاظ على جانب المنافسة على الموارد في تجارب العدوى "الطفيلية" المستقبلية، أبقينا كلا الجينين تحت نفس مروج بوليميريز الحمض النووي الريبي (بوليميريز T7 RNA، T7 RNAP) ولكننا قمنا بتغيير قوته. استخدمنا مروجًا قويًا لـ T7 RNAP T7Max، والذي يُظهر عائد نسخ أعلى بكثير، مما يؤدي إلى عوائد ترجمة أعلى في المقابل، في TxTl.17 قمنا باختبار إعداد التفاعل المطابق لتلك الموصوفة سابقًا: اثنان من البلازميدات بنسب مختلفة، تم اختبارهما بمجموع نهائي متفاوت تركيزات البلازميد. كان أحد البلازميدات تحت سيطرة مروج T7Max القوي، بينما كان الآخر تحت سيطرة مروج T7 الكنسي. في كلتا الحالتين الاختباريتين، كان تعبير البلازميد T7Max قويًا بدرجة كافية بحيث لم يزد مضان البروتين من الجين الموجود تحت T7Max بشكل ملحوظ مع زيادة التركيز الإجمالي للبلازميد (الشكل 2 ج، 2 د). لا يبدو أنه يهم إذا كان T7Max هو الذي يقود GFP أو mCherry، فقد استجاب كلا البروتينين للمروج الأقوى بزيادة نسبية مماثلة. قدم هذا نموذجًا واعدًا للعدوى بطفيلي "أقوى" (طفيل يحمل جينًا تحت T7Max إلى مضيف تحت T7) ومضيف عكسي أقوى يقاوم الطفيلي الأضعف (مضيف يحمل جينوم تحت T7Max وطفيل يحمل جين T7). وبتشجيع من هذه التجارب التي أثبتت صحة المبدأ، انتقلنا إلى تجارب الخلايا الاصطناعية.

"العدوى" في جميع الحالات هي اندماج خلية اصطناعية مضيفة وطفيلية. يتم تسهيل الدمج عن طريق علامات الحمض النووي الموجودة على سطح الجسيمات الشحمية، باستخدام نظام الدمج المحفز للحمض النووي الموصوف سابقًا. 18 باختصار، تم إنشاء الخلايا الاصطناعية باستخدام الإشريكية القولونية TxTl داخل غشاء من POPC والكوليسترول، وتم تزيين النشرة الخارجية. مع الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل والمثبت على الغشاء عن طريق تعديل الكولسترول. إذا التقى زوج من الجسيمات الشحمية مع علامات تكميلية، فإن علامات الحمض النووي تهجن، مما يجمع الأغشية معًا ويبدأ اندماج الغشاء، والذي يتبعه خلط التجويف. في تجاربنا، الخلية الاصطناعية المضيفة هي الجسيمات الشحمية التي تحتوي على TxTl مع T7 RNAP بالإضافة إلى جينوم GFP المشفر بالبلازميد. مراقبة مضان GFP بمثابة وكيل "لصحة" عملية التمثيل الغذائي للمضيف. يحتوي الطفيل القادم على جينوم على شكل بلازميد يشفر mCherry، وهو نظام الترجمة الكامل، ولكن لا يوجد بوليميريز T7 RNA. وهذا يضمن أن أي تغييرات ملحوظة في استقلاب المضيف تكون نتيجة الجينات التي جلبها الطفيل وليس من اندماج الطفيل والجسيمات الشحمية المضيفة، مما يؤدي إلى إضعاف السيتوبلازم المضيف. تم إجراء تجارب الإصابة بالطفيليات باستخدام الغشاء المضيف المسمى بـ Marina Blue DHPE، وهي صبغة دهنية ذات غشاء أزرق. هذا سمح لنا بتطبيع مضان الجينات المضيفة والطفيليات المرصودة إلى مضان أزرق، وتطبيع النتائج إلى إجمالي كمية مضان غشاء المضيف الموجود في العينة. وهذا يفسر التخفيفات من الحجم الإجمالي للعينة بعد إضافة الجسيمات الشحمية الطفيلية. لم يتم تسمية أغشية الطفيليات بالفلورسنت. كانت جميع التجارب مصحوبة بعينة مراقبة، حيث كان هناك مجتمع واحد فقط هو المضيف، ولكن مع بلازميد mCherry، لإظهار الحد الأقصى النظري لمستويات التعبير mCherry إذا كان الجين الوحيد في المجتمع. في المجموعة الأولى من التجارب، قمنا بخلط المضيف والطفيلي مع الجينات الخاضعة لسيطرة محفز T7 العاديلذلك كانت جينات المضيف والطفيليات "قوية" على حدٍ سواء. قمنا بخلط المضيف مع الطفيلي بحيث أصبح الطفيلي يمثل 25 أو 50 أو 75% من إجمالي عدد الجسيمات الشحمية. في جميع الحالات، انخفض مضان GFP المضيف في وجود الطفيلي، مع الزيادة المقابلة في مضان الطفيلي mCherry (الشكل 2e). العينات التي تحتوي على الطفيلي فقط وبدون مضيف لم تنتج أي مضان من أي لون، كما هو متوقع. في جميع الحالات، لا يكون اندماج الجسيمات الشحمية بوساطة الحمض النووي فعالاً بنسبة 100٪؛ 18،19 لذلك، لم يكن الانخفاض النسبي في مضان المضيف والزيادة في مضان الطفيلي كبيرًا مثل القيمة النظرية المتوقعة بناءً على نسبة المضيف إلى الطفيلي. بمعنى آخر، لم تكن العدوى فعالة بنسبة 100%. كانت هذه الجودة المصادفة لنظام الاندماج الناجم عن الحمض النووي، في هذه الحالة، سمة مفيدة للنظام. كما هو الحال في حالة العدوى الطبيعية، فإن العدوى التي تتم بوساطة اندماج الخلايا الاصطناعية لم تؤثر على جميع العوائل ولم تجد جميع الطفيليات مضيفًا. بعد ذلك، قمنا بالتحقق من حالتين، حيث لم يكن المضيف والطفيلي متطابقين بشكل متساوٍ في قوة الجينوم الخاص بهما. في إحدى الحالات، كان الجينوم المضيف تحت سيطرة مروج T7 بينما كان جينوم الطفيلي تحت مروج T7Max (الشكل 2f)، وفي السيناريو المعاكس، كان الجينوم المضيف تحت T7Max وكان جينوم الطفيلي تحت مروج T7 (الشكل 2ز). في حالة المضيف الأضعف الذي هاجمه طفيلي أقوى، كانت الزيادة النسبية في مضان mCherry الطفيلي والانخفاض المقابل في مضان GFP المضيف أقوى بكثير مما كانت عليه في الحالة السابقة لمضيف وطفيل متطابقين بشكل متساوٍ. كما هو متوقع، عندما كان المضيف أقوى من الطفيلي، كان العكس صحيحًا: كانت مستويات مضان mCherry أقل وكان الانخفاض النسبي في مضان GFP أقل مما كان عليه في الحالة المتطابقة بالتساوي. وأفضل توضيح لذلك هو مقارنة نقطة بيانات واحدة في ظل نفس ظروف الإصابة: بنسبة 75% من الطفيليات. تؤدي مجموعات المضيف والطفيليات المتطابقة بالتساوي إلى مضان طفيلي أكبر قليلاً من المضيف. عندما يكون الطفيلي أقوى، يكون تألق الطفيلي أعلى بكثير من المضيف. وعندما يكون العائل أقوى، يكون تألق الطفيلي أقل قليلاً من العائل. تم تمييز نقاط البيانات المميزة هذه بنجمة صفراء في الشكل 2e−g. أجرينا تجربة التحكم لمضيف مصاب بطفيلي "عديم الأعراض"، وهو طفيلي يحمل بلازميد مع مروج T7 ولكن لا يوجد تسلسل لترميز البروتين (قمنا بإزالة كاسيت mCherry من البلازميد) (الشكل 2ح). يتناقص مضان GFP المضيف إلى الحد الأدنى عند مستويات الطفيليات الأعلى، مما يشير إلى أن بعض الكمية الصغيرة من موارد المضيف مخصصة لنسخ الحمض النووي الريبي القصير غير المشفر من بلازميد الطفيلي. تؤكد هذه البيانات أيضًا أن العبء الأيضي الرئيسي لعدوى الطفيلي على المضيف يكمن في استخدام الموارد الانتقالية، وليس النسخية. تتوافق هذه الملاحظة مع الملاحظات السابقة بأن الترجمة هي المورد الأكثر تنوعًا ومحدودًا في الأنظمة الخالية من الخلايا. بشكل عام، توفر هذه التجارب نموذجًا للعدوى بالطفيلي الذي يختطف الموارد الأيضية للمضيف، مع محاكاة سلوكيات الخلايا الاصطناعية جوانب العلاقة الطبيعية بين المضيف والطفيلي.

الشكل 2. العدوى الطفيلية تخطف موارد المضيف. (أ) يحتوي الجسيمات الشحمية للخلية الاصطناعية المضيفة على نظام ترجمة خالي من الخلايا وترميز البلازميد GFP. تم تزيين سطح المضيف بعلامات ssDNA. يحتوي الجسيم الشحمي الطفيلي على بلازميد يشفر mCherry، مع نظام ترجمة ولكن لا يوجد بوليميريز RNA (وبالتالي لا يستطيع الطفيلي التعبير عن mCherry). سطح الطفيلي مزين بعلامات ssDNA المكملة للعلامات الموجودة على سطح المضيف. تسهل علامات الحمض النووي اندماج الجسيمات الشحمية المضيفة والطفيلية ويعبر المضيف عن كل من GFP الجينومي الخاص به والجينوم الطفيلي الذي يحتوي على mCherry. ( ب − د ) إثبات مبدأ الجينوم المضيف (GFP) والطفيلي (mCherry) الذي يتنافس على نفس موارد الخلايا الاصطناعية. يتم إجراء هذه التجارب في محلول TxTl، وليس في الجسيمات الشحمية. تم خلط اثنين من البلازميدات، ترميز GFP وmCherry، بنسبة تشير إلى أيقونات البلازميد على يسار خريطة الحرارة، مع الإشارة إلى تركيز الحمض النووي الإجمالي للعينة في الصف أعلى خريطة الحرارة. تم قياس الإسفار في القنوات الخضراء (GFP) والحمراء (mCherry). تم اختبار كل بلازميد في نوعين مختلفين باستخدام محفزات ذات نقاط قوة مختلفة: مع T7 ومع مروج T7Max الأقوى. يتم توفير البيانات الفردية لجميع الخرائط الحرارية في الأشكال S2 − S4. يتم توفير دورات زمنية فردية تمثيلية للتعبير البروتيني لمضيف T7 والطفيلي في الأشكال S5−S7 ولطفيلي T7Max في الأشكال S8−S10. ( هـ - ز ) إصابة المضيف بالطفيلي. في كل تجربة، يتم خلط الجسيمات الشحمية المضيفة مع الجسيمات الشحمية الطفيلية. اندماج الطفيلي للمضيف يسلم الحمض النووي mCherry الطفيلي، والذي يتم التعبير عنه جنبا إلى جنب مع الحمض النووي GFP المضيف. تم اختبار نسب مختلفة من المضيف إلى الطفيلي، كما هو مبين من خلال الأيقونات الموجودة أسفل الرسوم البيانية الشريطية. أصيب الجينوم المضيف تحت مروج T7 بطفيل مع جينومه تحت لوحة مروج T7 (هـ) ومع طفيل مع جينومه تحت لوحة مروج T7Max (و)، تم تصنيع المضيف أيضًا بجينوم T7Max وأصيب مع الطفيلي مع لوحة الجينوم T7 ( ز ). يتم توفير دورات زمنية فردية تمثيلية للتعبير عن البروتين في الشكل S11. يتم توفير تجارب مماثلة بتركيزات الدهون الإجمالية الأعلى والأدنى في الشكل S12. يتم توفير آثار تنقية استبعاد الحجم التي توضح ثبات الحويصلة في الشكل S13. (ح) العدوى بطفيلي غير متوافق: يحمل الطفيلي مروج T7 لكن الحمض النووي غير مشفر. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM، n=3. يتم تطبيع قيم الإسفار في اللوحات (e−h) إلى مضان أزرق لصبغة الغشاء لتطبيع النتائج لتركيز الخلايا المضيفة. جميع سلاسل العينات التي تحمل علامة "مضيف GFP مصاب" هي تجارب، حيث يكون لدى المضيف والطفيلي علامات DNA تكميلية على السطح، مما يتيح اندماج الجسيمات الشحمية، وهو ما يسمى العدوى. تظهر العينات التي تحمل علامة "مضيف GFP صحي" سلسلة، حيث تم خلط المضيف والطفيلي بالنسب الموضحة، ولكن لم تحتوي على علامات اندماج تكميلية، مما يجعل العدوى مستحيلة. يشير الماس الموجود في اللوحات (e−h) إلى حالة إصابة معينة توضح بشكل أفضل الاختلافات في قوة تعبير المضيف والطفيلي في اللوحات (e−g) وفوائد مناعة المضيف في اللوحة (h). يرد في الشكل S14 مقارنة مباشرة بين قيم المضيف والطفيلي التي يشير إليها النجم. تظهر بيانات الإصابة بالطفيلي دون أي بلازميد في الشكل S15.

عدوى الخلية الاصطناعية يمكن أن تدمر الجينوم المضيف

كان الطفيل الموصوف أعلاه يعبر عن mCherry المشفر للجينوم باستخدام موارد المضيف، لكن المضيف حافظ على بعض من عملية التمثيل الغذائي الخاصة به واستمر في التعبير عن GFP على الرغم من العدوى. بعد ذلك، قررنا التحقيق في نظام تؤدي فيه العدوى إلى استيلاء الطفيلي بالكامل على عملية التمثيل الغذائي للمضيف عن طريق تدمير الجينوم المضيف (الشكل 3 أ). ولهندسة مثل هذا السيناريو، قمنا بدراسة ملخص إنزيم التقييد للبلازميد في TxTl. في تجارب إثبات المبدأ، تم التعبير عن إنزيم تقييد MunI في TxTl بدون الجسيمات الشحمية. تم خلط بلازميد MunI مع بلازميد GFP بنسب مختلفة. إذا كان البلازميد GFP لا يحتوي على مواقع تقييد MunI، فإن الانخفاض الطفيف نسبيًا في مضان GFP المرصود يمكن حسابه من خلال المنافسة الموصوفة مسبقًا بين البلازميدات اثنين على موارد TxTl. إذا كان البلازميد GFP لديه موقع تقييد MunI، فإن مضان GFP يتناقص بشكل ملحوظ، ويتم قياس النقصان بشكل متناسب مع كمية متزايدة من البلازميد ترميز MunI (الشكل 3ب). تمت مراقبة تعبير MunI عبر Western Blot وتم قياسه بشكل متناسب مع تركيز البلازميد (الشكل 3C).

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

وبتشجيع من هذه النتائج، قمنا بإجراء تجربة عدوى باستخدام الخلايا الاصطناعية. حمل المضيف البلازميد GFP وحمل العامل الممرض البلازميد MunI. تم ضبط تركيز البلازميدات GFP وMunI على 2 مم، أي أقل بكثير من تركيز تشبع البلازميد لـ TxTl.21 كنا نعتزم البقاء تحت تركيز البلازميد الكلي الذي يكون فيه تعبير المضيف والطفيلي مرتفعًا بما يكفي للتنافس المباشر على الموارد المحدودة ( كما هو الحال في حالة الطفيلي البسيط الموصوفة أعلاه)، بدلاً من ذلك تهدف في الغالب إلى قياس تأثير إنزيم الطفيلي الذي يدمر الجينوم المضيف بشكل فعال. كما هو الحال في تجارب الطفيليات الموصوفة سابقًا، احتوى المضيف على بوليميريز TxTl وT7 RNA البكتيري، وكان العامل الممرض يحمل مستخلص الخلية فقط دون بوليميريز T7 RNA، وتم تمييز كل من المضيف والعامل الممرض بعلامات دمج الحمض النووي التكميلية. تمت تسمية الغشاء المضيف بـ Marina Blue DHPE لتطبيع نتائج التألق لتركيز الجسيمات الشحمية المضيفة. تم خلط المضيف والعامل الممرض بنسب متفاوتة، حيث كان العامل الممرض 25، 50، أو 75% من إجمالي السكان. انخفض تألق المضيف "المصاب"، حيث يحتوي المضيف والعامل الممرض على علامات اندماج تكميلية، مع زيادة كمية العامل الممرض. إن مضان GFP من المضيف "الصحي"، حيث لم يحتوي العامل الممرض على علامات اندماج تكميلية، لم ينقص في وجود أي كمية من مسببات الأمراض. العينات التي تحتوي على العامل الممرض فقط أدت إلى عدم وجود مضان قابل للقياس (الشكل ثلاثي الأبعاد). تم قياس كمية التعبير البروتيني MunI الممرض باستخدام تحليل اللطخة الغربية، مع البيانات الموضحة لسلسلة عينات المضيف المصاب (الشكل 3 هـ). بعد ذلك، قمنا بالتحقيق في العدوى في حالة وجود مضيف محصن ضد العامل الممرض: لم يكن لدى بلازميد GFP المضيف موقع تقييد MunI (الشكل 3f). انخفض مضان المضيف بعد الإصابة ولكنه لم يكن قريبًا من الأهمية كما هو الحال في الحالة السابقة للمضيف مع موقع MunI في الجينوم. تم التعبير عن بروتين مُمْرِض MunI بمستويات مماثلة لتجارب العدوى السابقة (الشكل 3ز)، لذلك كان الحمل الأيضي على المضيف مشابهًا. يحدث انخفاض مضان المضيف المصاب في هذه التجارب بسبب اختطاف بعض موارد المضيف بواسطة العامل الممرض الذي يعبر عن MunI، ولكن نظرًا لأن تركيز البلازميد الإجمالي أقل بكثير مما كان عليه في تجارب مسببات الأمراض البسيطة السابقة، فإن انخفاض مضان المضيف يكون أقل أهمية. تؤكد هذه التجربة أيضًا أن الانخفاض في مضان المضيف مع موقع MunI (الشكل ثلاثي الأبعاد) كان سببه الدورات الزمنية للتعبير عن البروتين الواردة في الشكل S22. (ز) تم تتبع تعبير MunI عن طريق تحليل اللطخة الغربية من خلال تجربة العينات الموضحة في سلسلة "GFP المصابة" في اللوحة (و). تشير أشرطة الخطأ في جميع اللوحات إلى SEM، n=3. يتم تطبيع قيم التألق في اللوحات (د، و) إلى التألق الأزرق لصبغة الغشاء المستخدمة لتطبيع النتائج لتركيز الخلايا المضيفة. يتم تطبيع الإسفار في اللوحة (ب) إلى 0 ملي بلازميد MunI لكل سلسلة عينات. تسلط الرموز الماسية الموجودة في اللوحات (د، و) الضوء على حالة معينة توضح بشكل أفضل الاختلافات في الاستجابات للعدوى من مضيف معرض للوحة مسببات الأمراض (د) ومحصن ضد لوحة مسببات الأمراض (و). جميع سلاسل العينات التي تحمل علامة "GFP مصابة" هي عبارة عن تجارب، حيث كان لدى المضيف والعامل الممرض علامات الحمض النووي التكميلية على السطح، مما يتيح اندماج الجسيمات الشحمية، وهو ما يسمى العدوى. تُظهر السلسلة التي تحمل عنوان "GFP صحي" عينات، حيث تم خلط المضيف ومسببات المرض بالنسب الموضحة ولكن لم تحتوي على علامات اندماج تكميلية، مما يجعل العدوى مستحيلة.

الشكل 3. العدوى تدمر الجينوم المضيف وتختطف موارد المضيف. (أ) تحتوي الخلايا المضيفة على ترميز البلازميد GFP، مع موقعين لتقييد MunI؛ يحتوي العامل الممرض على بلازميد يشفر إنزيم تقييد MunI. بعد اندماج المضيف ومسببات الأمراض، يعبر المضيف TxTl عن إنزيم تقييد MunI، الذي يقوم بعد ذلك بهضم جينوم المضيف. (ب) تجارب إثبات المبدأ للعدوى: تم إعداد البلازميد GFP مع أو بدون مواقع تقييد MunI. تم خلط البلازميد GFP مع البلازميد MunI وتم تسجيل تعبير GFP. تم إجراء هذه التجارب في محلول TxTl بدون الجسيمات الشحمية. يظهر في الشكلين S16 وS17 إثبات مبدأ تجربة العدوى، مع إضافة إنزيم MunI خارجيًا بدلاً من التعبير عنه في TxTl. يتم توفير الدورات الزمنية التمثيلية للتعبير البروتين في الشكل S18. ( ج ) تمت مراقبة تعبير MunI عن طريق تحليل لطخة غربية؛ تم قياس شدة نطاق MunI في نفس العينات مثل نتائج التألق الموضحة في اللوحة (ب) لسلسلة "موقع MunI الغائب". يتم توفير لطخة غربية تمثيلية لإنزيم تقييد MunI في الشكل S19. ( د ) مضان GFP للمضيف الممزوج بالجسيمات الشحمية المسببة للأمراض بالنسبة الموضحة تحت الرسم البياني للبيانات. يحتوي بلازميد GFP المضيف على موقعين لتقييد MunI. يتم توفير الدورات الزمنية التمثيلية للتعبير البروتيني في الشكل S2 0. يتم توفير بيانات تجارب العدوى باستخدام علامات الدمج غير المتوافقة في الشكل S21. (هـ) تم تتبع تعبير MunI عن طريق تحليل اللطخة الغربية من خلال تجربة العينات الموضحة في سلسلة "GFP المصابة" في اللوحة (د). ( و ) مضان GFP للمضيف الممزوج بالجسيمات الشحمية المسببة للأمراض بالنسبة الموضحة تحت الرسم البياني للبيانات. GFP المضيف ليس لديه مواقع تقييد MunI، مما يمنحه مناعة ضد البروتين الممرض. يتم توفير دورات زمنية تمثيلية للتعبير عن البروتين في الشكل S22. (ز) تم تتبع تعبير MunI عن طريق تحليل اللطخة الغربية من خلال تجربة العينات الموضحة في سلسلة "GFP المصابة" في اللوحة (و). تشير أشرطة الخطأ في جميع اللوحات إلى SEM، n=3. يتم تطبيع قيم التألق في اللوحات (د، و) إلى التألق الأزرق لصبغة الغشاء المستخدمة لتطبيع النتائج لتركيز الخلايا المضيفة. يتم تطبيع الإسفار في اللوحة (ب) إلى 0 ملي بلازميد MunI لكل سلسلة عينات. تسلط الرموز الماسية الموجودة في اللوحات (د، و) الضوء على حالة معينة توضح بشكل أفضل الاختلافات في الاستجابات للعدوى من مضيف معرض للوحة مسببات الأمراض (د) ومحصن ضد لوحة مسببات الأمراض (و). جميع سلاسل العينات التي تحمل علامة "GFP مصابة" هي عبارة عن تجارب، حيث كان لدى المضيف والعامل الممرض علامات الحمض النووي التكميلية على السطح، مما يتيح اندماج الجسيمات الشحمية، وهو ما يسمى العدوى. تُظهر السلسلة التي تحمل عنوان "GFP صحي" عينات، حيث تم خلط المضيف ومسببات المرض بالنسب الموضحة ولكن لم تحتوي على علامات اندماج تكميلية، مما يجعل العدوى مستحيلة.

يمكن أن تكون إصابة الخلية الاصطناعية "مميتة"، مما يؤدي إلى استنفاد موارد الخلية المضيفة، ويمكن "معالجة" مثل هذه العدوى لإنقاذ وظيفة الإنقاذ.

أظهرت تجارب الطفيليات ومسببات الأمراض المذكورة أعلاه أنه يمكن استخدام الخلايا الاصطناعية كنموذج للعدوى، حيث يقوم العامل الممرض باختطاف موارد المضيف. بعد ذلك، قررنا دراسة السيناريو الذي تتسبب فيه العدوى في توقف عملية التمثيل الغذائي للمضيف عن العمل بعد التعبير عن البروتين الممرض. في هذه الحالة، يكون العامل الممرض مشابهًا للعدوى ببكتيريا تعبر عن سم قاتل مطروحًا منه جانب التكاثر للمضيف أو الطفيلي نظرًا لأن هذه الخلايا الاصطناعية لا تتكاثر (الشكل 4 أ). لهندسة هذا النظام، اخترنا الهيموليزين (aHL)، وهو سم طبيعي وبروتين غشائي يستخدم على نطاق واسع في هندسة الخلايا الاصطناعية لإنشاء مسام غشائية غير محددة. السم، وتم تخصيص البروتين لاحقًا لهندسة نقل الغشاء وإطالة عملية التمثيل الغذائي للخلايا الاصطناعية. 24 هنا، نعود إلى استخدام aHL لدوره الطبيعي باعتباره سمًا ضارًا تنتجه العدوى. مثال آخر بارز يتعلق بهندسة الخلايا الاصطناعية لاستخدام سمية AHL للتسبب في موت الخلايا الطبيعية يأتي من تطبيق الخلايا الاصطناعية كتقنية لعلاج السرطان. 25 وكدليل على المبدأ، أثبتنا أن التعبير عن تركيز عالٍ من AHL في حويصلات الخلايا الاصطناعية يؤدي إلى تسرب محتوى الخلية وانخفاض كبير في التعبير عن GFP داخل الخلية. يمكن عكس هذا التأثير إذا كان الجزء الخارجي من الجسيمات الشحمية يحتوي على جميع الجزيئات الصغيرة اللازمة لـ TxTl (الشكل 4 ب). في نظامنا النموذجي للمضيف والممرض، يحتوي المضيف على بلازميد مشفر GFP ويحتوي الممرض على بلازميد مشفر لـ aHL. يشبه كل تصميم تجارب العدوى سيناريوهات الطفيليات ومسببات الأمراض الموصوفة أعلاه، حيث لا يحمل العامل الممرض T7 RNAP وكل من المضيف والعامل الممرض مزينان بعلامات دمج الحمض النووي. ومن المثير للاهتمام، أننا لاحظنا أنه عند تركيزات مسببات الأمراض المنخفضة (يكون العامل الممرض 25 أو 50٪ من إجمالي السكان)، يتناقص مضان المضيف قليلاً فقط. ومع ذلك، فإن زيادة تركيز مسببات الأمراض إلى 75٪ يؤدي إلى انخفاض كبير في مضان GFP المضيف (الشكل 4C). نتوقع أن تكون هذه النتيجة ناجمة عن التسرب البطيء نسبيًا للعناصر الغذائية من الخلايا الاصطناعية بتركيز أقل من AHL. تم قياس مضان GFP فقط بعد 12 ساعة من الحضانة ويعتبر GFP بروتينًا مستقرًا للغاية. لذلك، من الممكن أنه في حالة انخفاض تركيزات AHL (انخفاض كمية مسببات الأمراض)، كان تسرب العناصر الغذائية الناجم عن AHL بطيئًا بدرجة كافية بحيث تراكم الخلايا المضيفة كميات كبيرة من GFP قبل أن تصبح تأثيرات التسرب الناجم عن AHL معوقة للخلايا المضيفة. عملية التمثيل الغذائي. لفصل نتائج التنافس البسيط على الموارد بين جينومات المضيف والطفيليات، أجرينا تجارب "العدوى بالإنقاذ" حيث احتوى المخزن المؤقت الخارجي على جميع الجزيئات الصغيرة التي تشكل طاقة TxTl، والأحماض الأمينية، ومخاليط الملح. تم إعداد هذا بشكل مشابه لحالة "المغذيات الخارجية" التي تم اختبارها في الشكل 4ب. كان الانخفاض في مضان المضيف في هذه التجارب مشابهًا لعينات "العدوى دون إنقاذ" السابقة بمستويات 25 و50% من العامل الممرض. كان انخفاض مضان المضيف بنسبة 75٪ من العامل الممرض أصغر بكثير من الانخفاض الملحوظ في العينات دون الإنقاذ (الشكل 4 د). يبدو أن الاختلاف الكبير في نتائج تجربة 75% من الطفيلي، مع نقاط البيانات في لوحات الشكل 4 (ج، د) المظللة بنجمة، يدعم فرضيتنا القائلة بأن تركيزات aHL الأعلى تسبب ضررًا مبكرًا في التفاعل. عند تركيز أقل لمسببات الأمراض، يكون التسرب بطيئًا بدرجة كافية بحيث يتراكم المضيف GFP (كما رأينا مع أو بدون مغذيات الإنقاذ)، لذلك يتناقص مضان GFP المرصود بعد الإصابة في الغالب بسبب التنافس على الموارد. في تركيزات أعلى من مسببات الأمراض، يتناقص مضان GFP في العينات ذات العناصر الغذائية الخارجية في الغالب بسبب المنافسة على الموارد. تثبت هذه التجارب أننا قادرون على هندسة خلايا اصطناعية لنمذجة العدوى، مما يؤدي إلى نتيجتين مختلفتين: العقوبة الأيضية للعدوى نفسها (انخفاض GFP بسبب المنافسة على الموارد) وعدوى أكثر "فتكا" ناتجة عن إلغاء التعبير البروتيني للمضيف. وبتشجيع من هذه الملاحظة، قررنا أن ندرس نظامًا تستطيع فيه الخلايا الاصطناعية أن تقاوم بفعالية العدوى المسببة للأمراض، وأن نتحقق من العقوبة الأيضية لمثل هذه الاستجابة.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

الخلايا الاصطناعية يمكنها الدفاع ضد العدوى باستخدام استراتيجية مستوحاة من البكتيريا

مستوحاة من الوظيفة المعروفة لتقييد النوويات الداخلية لحماية البكتيريا من الحمض النووي الغريب، سعينا إلى استخدام هذه الاستراتيجية داخل الخلايا الاصطناعية. قمنا بتوسيع نظام الطفيلي المعروض في الشكل 2: بالإضافة إلى GFP، أضفنا البلازميد المحتوي على MunI إلى المضيف. ويحتوي الطفيلي على mCherry، كما في التجارب السابقة. يحتوي البلازميد mCherry على موقع تقييد MunI (الشكل 5 أ). أولاً، أجرينا تجارب إثبات المبدأ لتقييم الحمل الأيضي للتعبير عن MunI على المضيف. في تجارب TxTl غير المغلفة هذه، قمنا بمراقبة التعبير عن GFP والتعبير عن mCherry، كل منهما ممزوج بكمية متزايدة من البلازميد MunI أو EcorI. كانت جميع الجينات تحت سيطرة نفس مروج T7. كان لجين GFP موقع تقييد EcorI ولكن ليس موقع تقييد MunI، وكان جين mCherry يحتوي على موقع تقييد MunI ولكن ليس موقع تقييد EcorI. عندما تم خلط بلازميد إنزيم التقييد مع بلازميد بروتين فلوري دون موقع التعرف على إنزيم التقييد هذا، انخفض تعبير البروتين الفلوري بشكل متناسب مع زيادة بلازميد إنزيم التقييد، مما يشير إلى التنافس بين البلازميدين على موارد TxTl، كما هو موضح سابقًا لـ GFP وmCherry في الشكل 2. وكانت هذه الأزواج غير المقطوعة GFP مع MunI (الشكل 5B) وmCherry مع EcorI (الشكل 5e). عندما تم إقران بروتين فلوري مع إنزيم تقييد قادر على قطع الجين الخاص بذلك البروتين الفلوري، انخفض التألق بشكل ملحوظ إلى مستويات الخلفية تقريبًا عند تركيزات بلازميد إنزيم التقييد الأعلى. وكانت هذه الأزواج القطع GFP مع EcorI (الشكل 5C) وmCherry مع MunI (الشكل 5D). وأشار هذا إلى انخفاض في الأسفار بشكل ملحوظ بما يتجاوز المنافسة البسيطة على الموارد وعلى غرار سيناريو العدوى الموضح في الشكل 3. إن تعبير MunI في وجود GFP يقلل من تعبير GFP. إذا استخدمنا GFP كبديل لعملية التمثيل الغذائي "الأساسي" للمضيف، فيمكن اعتبار MunI بمثابة حمل استقلابي على المضيف.

الشكل 4. المضيف عرضة للعدوى "القاتلة"، ولكن يمكن إنقاذ المضيف. (أ) يحتوي المضيف على بلازميد GFP، ويحتوي العامل الممرض على بلازميد يشفر قناة غشاء الهيموليزين (aHL). بعد الإصابة، يقوم المضيف بالتعبير عن AHL، مما يخلق مسام في الغشاء، مما يتسبب في تسرب العناصر الغذائية ويؤدي إلى انخفاض في النشاط الأيضي للمضيف. (ب) إثبات مبدأ AHL الذي يعبر عن المضيف (لا توجد عدوى، تم إنشاء مضيف باستخدام كل من 5nM GFP والكمية المشار إليها من بلازميد aHL). تم تحضين المضيف في مخزن مؤقت مع أو بدون العناصر الغذائية (جميع مكونات مزيج الطاقة والملح والأحماض الأمينية المستخدمة لإعداد نظام الترجمة الخالي من الخلايا المضيفة). تم تحديد التركيز الأمثل لمغذيات الإنقاذ بشكل تجريبي، كما هو موضح في الشكل S23. (ج) إصابة المضيف بالعامل الممرض، بكميات متفاوتة من العامل الممرض لكل خلية مضيفة. تم قياس تسرب الجزيئات الصغيرة من الخلايا "السليمة" و"المصابة" مباشرة باستخدام صبغة جزيء صغير، وتظهر البيانات في الشكلين S24 وS25. (د) تظهر التجارب المشابهة لهذه في اللوحة (ج)، ولكن المخزن المؤقت الخارجي يحتوي على مغذيات جزيئية صغيرة مماثلة للظروف التجريبية "المغذيات الخارجية" الموضحة في اللوحة (ب). تشير أشرطة الخطأ في جميع اللوحات إلى SEM، n=3. يتم تطبيع قيم التألق في اللوحات (b−d) إلى التألق الأزرق لصبغة الغشاء المستخدم لتطبيع الإشارة لتركيز الخلايا المضيفة. تسلط الرموز الماسية الموجودة في اللوحات (ج، د) الضوء على حالة معينة توضح بشكل أفضل الاختلافات في الاستجابة للعدوى من مضيف بدون لوحة العناصر الغذائية الخارجية (ج) والمحصنة ضد العامل الممرض بسبب وجود لوحة العناصر الغذائية الخارجية (د). بالنسبة للوحات (ج، د)، فإن سلسلة "GFP المصابة" هي المضيف المنصهر مع العامل الممرض الذي يحمل بروتين AHL، و"GFP الصحي" هو المضيف المندمج مع العامل الممرض الذي لا يحمل أي بلازميد.

ننتقل إلى تجارب العدوى، وخلط المضيف (مع البلازميدات GFP وMunI) مع الطفيلي (مع البلازميد mCherry). كما سبق، قمنا بدراسة السيناريوهات التي تحتوي على كمية متزايدة من الطفيليات بين السكان (الشكل 5f). خلقت السيطرة الإيجابية على mCherry الذي يعبر عن المضيف فقط (مع EcorI بدلاً من MunI لموازنة الحمل الأيضي) معيارًا للحد الأقصى النظري للبروتين الممرض الذي يمكن التعبير عنه في المضيف (الشكل 5f). مع زيادة كمية الطفيلي، انخفض مضان GFP للمضيف، ولكن الانخفاض في مضان المضيف المصاب كان أصغر بكثير من انخفاض تعبير GFP الذي لوحظ في التجارب السابقة مع نفس الطفيل. يمكن مقارنة GFP ومضان mCherry الطفيلي لهذا المضيف المصاب الذي يعبر عن MunI (نقطة البيانات المسماة بنجمة في الشكل 5f) مباشرة مع مضيفي العدوى المشابهين دون MunI (نقطة البيانات المسماة بنجمة في الشكل 2e). في المضيف الذي يعبر عن MunI، بدأ GFP المضيف بمستوى أقل تمامًا بينما كان يتمتع بصحة جيدة (نظرًا لأن بعض الموارد يتم تحويلها إلى التعبير عن MunI) ولكن بعد الإصابة، يكون انخفاض مضان المضيف أقل أهمية بكثير، وينتج المضيف بروتين mCherry طفيلي أقل بكثير مما كانت عليه في حالة عدم تعبير المضيف عن موني. توضح هذه التجربة فائدة إنفاق المضيف لبعض الموارد على الدفاع ضد الطفيليات. يمكن اعتبار هذا النظام نموذجًا كيميائيًا حيويًا بسيطًا للغاية للكائنات التي تنتج البروتينات للدفاع ضد العدوى المستقبلية أو حتى العوامل البيئية الضارة. يكون المضيف في الأصل أقل قوة (إذا أخذنا تعبير GFP كمعيار لصحة المضيف)، ولكن في حالة الإصابة بالعدوى، فإن الموارد الإضافية التي ينفقها المضيف على التعبير عن البروتينات الدفاعية تؤتي ثمارها، مما يوفر الحماية ضد الطفيلي المسبب للعدوى. لذلك، في هذه الخلية الاصطناعية البسيطة غير الحية، قمنا بإعادة تشكيل مثال لسباق التسلح البيولوجي الأساسي.

الشكل 5. الخلايا المضيفة تدافع ضد العدوى. (أ) تحتوي الخلايا المضيفة على اثنين من البلازميدات: أحدهما يشفر GFP (بدون موقع تقييد MunI) والآخر يشفر إنزيم تقييد MunI (جين "مقاومة الطفيليات"). يحتوي الطفيلي على بلازميد mCherry، في نظام مشابه للتجارب الموضحة في الشكل 2. وتتوسط العدوى عن طريق الاندماج عبر علامات الحمض النووي على سطح المضيف والطفيلي. بعد الإصابة، يتم هضم بلازميد mCherry الذي أدخله الطفيلي بواسطة إنزيم تقييد MunI الخاص بالمضيف. ( ب - هـ ) قياس التكلفة الأيضية للتعبير عن مقاومة الطفيليات. يتم إجراء التجارب في نظام TxTl كبير الحجم، وليس مغلفًا في الحويصلات. في كل تجربة، تم خلط بلازميد البروتين الفلوري (GFP أو mCherry) مع بلازميد إنزيم التقييد (MunI أو EcorI) عند النسبة المشار إليها على المحور السيني لتركيز البلازميد الكلي البالغ 10 مم. لدى GFP موقع تقييد EcorI ولكن ليس موقع MunI، وmCherry لديه موقع MunI ولكن ليس موقع تقييد EcorI. خط الاتجاه هو دليل مرئي ولكنه ليس مناسبًا للبيانات. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM، n=3. يتم توفير تجارب التحكم باستخدام إنزيمات التقييد النقية، بدلاً من التعبير عنها من البلازميد، في الشكل S26. تم أيضًا قياس ثبات الجسيمات الشحمية مع زيادة كمية البلازميد الطفيلي، كما هو موضح في الشكل S27. (و) إصابة المضيف بكمية متزايدة من الطفيليات. "مضيف GFP صحي" هو تعبير عن GFP من الخلايا المضيفة المندمجة مع الطفيلي دون أي بلازميد. "المضيف GFP المصاب" هو المضيف المندمج مع الطفيلي الذي يحمل mCherry. مضان أحمر هو مضان mCherry من الطفيلي المندمج مع المضيف (تتوفر فقط البيانات من المضيف المصاب. عينات المضيف السليمة لم تحمل بلازميد mCherry). تشير أشرطة الخطأ في جميع اللوحات إلى SEM، n=3. يتم تطبيع قيم الإسفار إلى مضان أزرق لصبغة الغشاء المستخدم لتطبيع النتائج لتركيز الخلايا المضيفة. يشير الرمز الماسي إلى التعبير عن بروتين الطفيلي في ظل ظروف عدوى معينة، ويمكن مقارنته مباشرة بنقطة البيانات الموضحة بنجمة في الشكل 2 هـ، وهي تجربة تحت نفس الظروف، ولكن مع افتقار المضيف إلى جين مقاومة MunI.

الشكل 6. التلقيح يوفر الدفاع ضد العدوى. (أ) يحتوي المضيف على بلازميد GFP. العامل الممرض في هذه التجارب هو أحد مخططات العدوى الثلاثة الموضحة في هذه الورقة: طفيلي (كما هو موضح في الشكل 2)، أو عامل ممرض مع إنزيم تقييد MunI الذي يهضم جينوم GFP الخاص بالمضيف (كما هو موضح في الشكل 3)، أو العامل الممرض تحمل قناة الغشاء AHL مما يسبب تسرب العناصر الغذائية من المضيف (كما هو موضح في الشكل 4). في كل حالة، يحتوي المضيف والعامل الممرض على علامات دمج الحمض النووي التكميلية. قبل إدخال العامل الممرض، يتم "تلقيح" المضيف: يتم تحضينه مع قليلات ssDNA الزائدة المكملة لعلامات الحمض النووي الاندماجي على سطح المضيف (علامات مماثلة لتلك الموجودة على العامل الممرض مطروحًا منها شاردة الكوليسترول المستخدمة لتثبيت العلامة على غشاء الممرض). يؤدي التلقيح إلى أن تصبح علامات الاندماج الموجودة على سطح المضيف مزدوجة، مما يجعل الاندماج مع العامل الممرض مستحيلاً. (ب) إثبات مبدأ خطة التطعيم. يتم دمج مجموعة الجسيمات الشحمية التي تحمل GFP تحت سيطرة مروج T7 RNA، ولكن بدون بوليميريز T7 RNA، مع الجسيمات الشحمية التي تحتوي على بوليميريز T7 RNA. لا يمكن التعبير عن بروتين GFP إلا إذا اندمجت المجموعتان. تم "تلقيح" أحد شريكي الخلط أو كليهما عن طريق الحضانة باستخدام علامة DNA المتوافقة مع علامات الاندماج الموجودة على سطح الجسيمات الشحمية، مما يجعل علامات الاندماج مزدوجة الجديلة وبالتالي غير متوافقة مع الاندماج. يظهر الشكل S28 دورة زمنية تمثيلية للتعبير عن البروتين. توجد تجارب التحكم دون أي علامات دمج في الشكل S29، ويتم توفير عناصر التحكم مع علامات الاندماج غير المتوافقة في الشكل S30. تم إنشاء تركيز التلقيح بشكل تجريبي، وتظهر البيانات في الشكل S31. ( ج ) تجارب العدوى الطفيلية. تم دمج مضيف يحمل GFP مع طفيلي يحمل mCherry، كما هو موضح في الشكل 2. تم خلط المضيف والطفيلي مع نسبة متفاوتة من المضيف إلى الطفيلي؛ تم تلقيح الخلايا المضيفة (مع علامات دمج الحمض النووي المزدوجة غير المتوافقة مع الاندماج) أو لم يتم تلقيحها (وبالتالي عرضة للاندماج مع الطفيلي). تم الإبلاغ عن مضان mCherry فقط للعينات التي لم يتم تلقيح المضيف فيها لأنه لم يكن هناك مضان mCherry قابل للقياس في عينات المضيف الملقحة. تم اختبار التلقيح المعكوس عن طريق تلقيح الطفيل بدلاً من المضيف، كما هو موضح في الشكل S32. (د) تجارب العدوى مع الجينوم المضيف المعرض للعامل الممرض الذي يحمل إنزيم تقييد MunI، كما هو موضح في الشكل 3. تمثل سلسلة البيانات المصابة مضيفًا بدون تلقيح، وتمثل سلسلة البيانات الملقحة عينات مع المضيف المحتضن مع oligos التلقيح، وبالتالي ليست عرضة للاندماج مع العامل الممرض. (هـ) تجارب العدوى مع العامل الممرض الذي يحمل جين AHL، تؤدي إلى تسرب قنوات AHL للعناصر الغذائية من الخلايا المضيفة بعد الإصابة، كما هو موضح في الشكل 4. تمثل سلسلة البيانات المصابة المضيف دون تلقيح وتمثل سلسلة البيانات الملقحة عينات مع المضيف المحتضن مع oligos التلقيح، وبالتالي ليس عرضة للاندماج مع العامل الممرض. تشير أشرطة الخطأ في جميع اللوحات إلى SEM، n=3. يتم تطبيع قيم الإسفار في اللوحات (c−e) إلى مضان أزرق لصبغة الغشاء المستخدم لتطبيع النتائج لتركيز الخلايا المضيفة. بعض البيانات الموضحة في هذا الشكل هي تجارب مع إعداد مماثلة للتجارب الموضحة في الأشكال السابقة (كما هو موضح في كل تسمية توضيحية). تكررت هذه التجارب لهذا الرقم لإنتاج البيانات باستخدام نفس الدفعة من TxTl لمقارنة النتائج مباشرة، والقضاء على التباين من دفعة إلى دفعة لتحضيرات TxTl.

تلقيح الخلايا الاصطناعية يمنع العدوى.

في المثال الموصوف أعلاه، أظهرنا أن المضيف يدافع ضد تأثير جينوم العامل الممرض عن طريق التعبير عن بروتين إضافي. بعد ذلك، سألنا عما إذا كان من الممكن وضع نموذج لسيناريو، حيث يجعل بعض التدخل مضيفًا معرضًا سابقًا للعدوى محصنًا ضد العدوى في المقام الأول. أطلقنا عليه نموذج التلقيح. وبينما ندرك أن هذا أبعد ما يكون عن القياس المثالي، فإن الجانب الذي ركزنا عليه هو أن الخلية الاصطناعية المضيفة لا تنفق أي موارد على توليد المناعة. في نموذج التحصين الخاص بنا، قمنا بتصميم علاج يحول الخلية الاصطناعية المضيفة المعرضة للعدوى إلى خلايا لا يمكنها الاندماج مع العامل الممرض. يعتمد نظام دمج الخلايا الاصطناعية المستخدم في هذه الورقة على علامات الحمض النووي المفردة الذين تقطعت بهم السبل للحث على اندماج الغشاء الشحمي. للتطعيم ضد الانصهار مع العامل الممرض، قمنا باحتضان الخلايا التي تحتوي على قليل نيوكليوتيد الحمض النووي المكمل لنسبة ضئيلة من الانصهار على سطح الخلايا (الشكل 6 أ). أولاً، كنا بحاجة إلى التأكد من أن التلقيح عن طريق الحضانة بمادة ضئيلة مكملة تعمل على إلغاء الاندماج. في تجارب إثبات المبدأ، تم إعداد مجموعتين من الجسيمات الشحمية: مجموعة سكانية واحدة لديها TxTl مع البلازميد الذي يشفر GFP تحت سيطرة مروج T7 والسكان الآخرون لديهم TxTl وT7 RNA بوليميريز ولكن لا يوجد بلازميد. بعد اندماج هاتين المجموعتين، تم خلط بلازميد GFP مع بوليميريز T7 RNA وتعبير GFP المستحث. إذا كان لدى المجموعتين علامات اندماج مفردة ومكملة، فقد حدث اندماج وتم اكتشاف مضان GFP. إذا تم تحضين إحدى المجموعتين أو كليهما مع قليل النوكليوتيد المكمل لعلامة الاندماج، لم يحدث اندماج الجسيمات الشحمية ولم يتم التعبير عن GFP (الشكل 6 ب). بعد إنشاء نظام التلقيح، شرعنا في تقديم التلقيح لحماية الخلايا الاصطناعية المضيفة في ثلاثة من سيناريوهات العدوى الموصوفة سابقًا في هذا العمل. أولاً، استخدمنا سيناريو الطفيلي الموصوف في الشكل 2. تم تلقيح الخلايا المضيفة، التي تحتوي على جينوم GFP، بمادة قليلة مكملة لعلامة الانصهار على سطح المضيف، وتم خلط المضيف مع طفيلي mCherry. قمنا بخلط المضيف مع الطفيلي بنسب مختلفة. في ظل جميع ظروف العدوى، كان مضان mCherry الطفيلي غير قابل للكشف إذا تم تلقيح المضيف ولم ينخفض ​​مضان GFP للمضيف الملقّح. أظهرت تجارب التحكم مع المضيف غير الملقّح انخفاضًا في تعبير GFP المضيف وزيادة في إشارة الطفيلي mCherry، كما هو متوقع (الشكل 6 ج). بعد ذلك، قمنا بتطبيق نظام التلقيح على حالة مضيف مصاب بمسببات الأمراض يحمل إنزيم تقييد MunI المشفر للجينوم القادر على هضم جينوم GFP الخاص بالمضيف، كما هو الحال في التجارب الموضحة في الشكل 3. ولم يظهر المضيف الملقّح انخفاضًا. في مضان GFP بعد الخلط مع كميات متزايدة من مسببات الأمراض، في حين أصيب المضيف غير الملقّح وانخفض مضان GFP المضيف بشكل متناسب مع الكمية المتزايدة من مسببات الأمراض (الشكل 6 د). كان التلقيح فعالاً أيضًا ضد مسببات مرض AHL. لم تظهر المضيفات الملقحة أي انخفاض في التألق عند الاختلاط مع العامل الممرض، في حين انخفض مضان GFP الخاص بالمضيف غير الملقّح بشكل ملحوظ مع الإصابة (الشكل 6 هـ). في جميع الحالات، كان إجراء التلقيح البسيط هذا، وهو احتضان المضيف باستخدام نسبة ضئيلة من الحمض النووي مكملة بنسبة ضئيلة من الاندماج على سطح المضيف، كافيًا لإلغاء قدرة الخلايا الاصطناعية المسببة للأمراض على إصابة الخلايا المضيفة. ولذلك، أظهرنا نموذجًا فيزيائيًا وكيميائيًا بسيطًا للتدخل الذي يحمي الخلايا المضيفة من العدوى.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

الاستنتاجات

في هذه الورقة، نعرض طرق استخدام الخلايا الاصطناعية الدنيا لنموذج العدوى الطفيلية والمسببة للأمراض. وكان الدافع وراء عملنا ذو شقين. أردنا هندسة سلوك معقد يشبه الحياة في خلايا اصطناعية، مما يسهل هدف هندسة الخلايا الاصطناعية التي تشبه إلى حد كبير الخلايا الحية الطبيعية. أردنا أيضًا الاستفادة من نظام الخلايا الاصطناعية البسيط الذي يمكن التحكم فيه لنمذجة الخصائص الأساسية لعمليات العدوى والتلقيح والمقاومة. في حين أن الخلايا الاصطناعية لا تتطور أو تتكاثر ذاتياً، فإن هذا النظام يسمح بدراسة ديناميات العدوى في نموذج بسيط وسهل التحليل. نأمل أن تساعد مبادئ العدوى الموضحة هنا في إنشاء نماذج عملية وقابلة للتطبيق لمسببات الأمراض المختلفة وتخفيف العدوى. سلطت دراسة نظام الخلايا الاصطناعية المبسط الضوء على التفاعلات الأساسية بين الطفيلي والعامل الممرض. في حين أن الخلايا الاصطناعية ليست (بعد) على قيد الحياة، وليس لديها القدرة على الخضوع للتطور الدارويني، فإن هذا النظام يسمح لنا بمراقبة تفاعلات مسببات الأمراض والمضيف دون القدرة على تطوير مناعة طبيعية أو تغيير ضراوة مسببات الأمراض. في حين أن ديناميات العدوى المضيفة المقدمة هنا تستخدم الخلايا الاصطناعية القائمة على البكتيريا، فإن هذا النظام لا يقتصر بطبيعته على TxTl البكتيري. بل سيكون من الممكن تخيل استخدام النظام المعروض هنا لنمذجة ديناميكيات العدوى في المجموعات السكانية التي تشبه النظم البيئية الطبيعية، مع الاستفادة من البساطة المتأصلة في الخلايا الاصطناعية للتحكم الكامل ودراسة التفاعلات بين مختلف أعضاء المجموعات السكانية الكبيرة.

مراجع

(1) التطبيقات. ماطر. اليوم 2016، 19، 516−532.

(2) جاوت، نيوجيرسي؛ Adamala، KP إعادة تكوين عناصر الخلية الطبيعية في الخلايا الاصطناعية. حال. بيول. 2021، 5، رقم 2000188.

(3) تان، سي؛ سوراب، س. بروشيز، النائب؛ شوارتز، ر. ليدوك، P. الازدحام الجزيئي يشكل التعبير الجيني في الأنظمة النانوية الخلوية الاصطناعية. نات. تكنولوجيا النانو. 2013، 8، 602−608.

(4) جلانتز، ST؛ بيرلو، EE؛ تشاو، من خلال واجهات الأغشية الاصطناعية الشبيهة بالخلايا لفحص التفاعلات الديناميكية بين البروتين والدهون، الطبعة الأولى؛ شركة إلسفير، 2019؛ المجلد. 622.

(5) تشاو، ج.؛ تشانغ، Y.؛ تشانغ، العاشر. لي، C.؛ دو، ه.؛ سوندرسكوف ، إس إم . مو، دبليو؛ دونغ، م. هان، إكس. محاكاة التمثيل الغذائي الخلوي في الخلايا الاصطناعية: النقل الجزيئي الشامل عبر الغشاء من خلال اندماج الحويصلة. شرجي. الكيمياء. 2022, 94, 3811−3818.

(6) داميانو، ل.؛ ستانو، P. حول "الشبه بالحياة" للخلايا الاصطناعية. أمام. بيونج. التكنولوجيا الحيوية. 2020، 8، العدد 953.

(7) صالحي الريحاني، أ.؛ سيس، O.؛ إيلاني، واي. تحاكي الخلايا الاصطناعية كنماذج مبسطة لدراسة بيولوجيا الخلية. إكسب. بيول. ميد. 2017، 242، 1309−1317.

(8) تشاكرابورتي، ت.؛ Wegner، SV إشارة من خلية إلى خلية من خلال الضوء في مجتمعات الخلايا الاصطناعية: المفترس المتوهج يجذب الفريسة. ايه سي اس نانو 2021, 15, 9434−9444.

(9) دوبين، أ؛ Simmel، إشارات FC والتمايز في دوائر الجينات المختبرية القائمة على المستحلب والمتعددة الأجزاء. نات. الكيمياء. 2019, 11, 32−39.

(10) توبارلاك، التطوير التنظيمي؛ زاسو، J.؛ بريدي، س.؛ سيرا، ماريلاند؛ ماتشي، P.؛ كونتي، L.؛ باوديت، M.-L.؛ منسي، الخلايا الاصطناعية SS تقود التمايز العصبي. الخيال العلمي. حال. 2020، 6، رقم eabb4920.

(11) روبنسون، AO؛ فينيرو، أوم؛ Adamala، KP نحو الحياة الاصطناعية: اتصالات الخلايا الاصطناعية المحاكاة الحيوية. العملة. رأي. الكيمياء. بيول. 2021, 64, 165−173.

(12) سميث، جي إم؛ شودري، ر. بوث، إم جيه يتحكم في اتصالات الخلايا الخلوية الاصطناعية. أمام. مول. بيوسسي. 2022، 8، رقم 1321.

(13) إيلاني، واي. التواصل بين الخلايا الحية والخلايا الاصطناعية كحدود ناشئة في علم الأحياء الاصطناعي. أنجو. الكيمياء، كثافة العمليات. إد. 2021, 60, 5602− 5611.

(14) روستاد، م.؛ إيستلوند، أ. جاردين، ب. Noireaux، V. تخليق TXTL الخالي من الخلايا للبكتيريا المعدية T4 في تفاعل أنبوب اختبار واحد. موالفة. بيول. 2018, 3, رقم ysy002.

(15) مارشال، ر.؛ Noireaux, V. النمذجة الكمية للنسخ والترجمة لـ All-E. نظام خالي من الخلايا القولونية. الخيال العلمي. النائب 2019، 9، العدد 11980.

(16) جاراميلا، ج.؛ مارشال، ر. روستاد، م. Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: منصة للبيولوجيا الاصطناعية الخالية من الخلايا. ايه سي اس سينث. بيول. 2016، 5، 344−355.

(17) ديش، سي؛ كاش، ب. ساتو، دبليو؛ شارون، J.؛ أوفدمبرينك، L.؛ جاوت، نيوجيرسي؛ هيلي، J.؛ ستوكس، ك؛ إنجلهارت، الإمارات العربية المتحدة؛ أدامالا، نظام النسخ KP T7Max. 2021، 1−28.

(18) جاوت، نيوجيرسي؛ جوميز جارسيا، J .؛ هيلي، JM. كاش، ب. هان، س. إنجلهارت، الإمارات العربية المتحدة؛ أدامالا، KP الانصهار القابل للبرمجة والتمايز بين الخلايا الاصطناعية الدنيا. ايه سي اس سينث. بيول. 2022, 11, 855− 866.

(19) ستنجل، ج.؛ زان، ر. هوك، F. الانصهار القابل للبرمجة الناتج عن الحمض النووي لحويصلات الفوسفوليبيد. ج. صباحا. الكيمياء. شركة نفط الجنوب. 2007, 129, 9584− 9585.

(20) تشيزوليني، ف.؛ فورلين، م. يه مارتن، ن.؛ بيرلوفا، ج.؛ سيتشي، D.؛ منسي، الترجمة الخالية من الخلايا أكثر تنوعًا من النسخ. ايه سي اس سينث. بيول. 2017، 6، 638−647.

(21) شين، ج.؛ Noireaux، V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: التطبيق على دوائر الجينات الاصطناعية والخلايا الاصطناعية. ايه سي اس سينث. بيول. 2012، 1، 29−41.

(22) نويروكس، ف.؛ Libchaber، A. مفاعل حيوي للحويصلة كخطوة نحو تجميع الخلايا الاصطناعية. بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 2004، 101، 17669−17674.

(23) أدامالا، كاي بي؛ مارتن ألاركون، دا؛ جوثري هونيا، KR؛ Boyden، ES تفاعلات الدائرة الوراثية الهندسية داخل وبين الخلايا الاصطناعية الدنيا. نات. الكيمياء. 2017، 9، 431−439.

(24) نويروكس، ف.؛ بار زيف، ر. جودفروي، J.؛ سلمان، ه.؛ Libchaber، A. نحو خلية اصطناعية تعتمد على التعبير الجيني في الحويصلات. فيز. بيول. 2005, 2, ص1−ص8.

(25) كرينسكي، ن.؛ قدوري، م.؛ زنجر، أ.؛ شاينسكي رويتمان، J .؛ جولدفيدر، م.؛ بنهار، أنا. هيرشكوفيتز، د.؛ شرودر، أ. الخلايا الاصطناعية تصنع البروتينات العلاجية داخل الأورام. حال. ماتر الرعاية الصحية. 2018، 7، رقم 1701163.

(26) كوون، واي سي؛ جيويت، MC طرق تحضير عالية الإنتاجية للمستخلص الخام لتخليق بروتين قوي خالٍ من الخلايا. الخيال العلمي. ممثل 2015، 5، رقم 8663.

(27) صن، ZZ؛ هايز، كاليفورنيا؛ شين، J.؛ كاشيرا، ف؛ موراي، آر إم؛ Noireaux, V. بروتوكولات لتنفيذ نظام التعبير الخالي من الخلايا TXTL القائم على الإشريكية القولونية للبيولوجيا الاصطناعية. جي فيس. إكسب. 2013، 79، 1−15.

(28) فوجي، إس؛ ماتسورا، T.؛ سونامي، ت.؛ نيشيكاوا، T.؛ كازوتا، Y.؛ Yomo، T. عرض Liposome للاختيار في المختبر وتطور بروتينات الغشاء. نات. بروتوك. 2014، 9، 1578−1591.

(29) لوفلر، بي إم جي؛ ريس، O.؛ رابي، أ.؛ أوخولم، آه؛ تومسن، RP. كجيمس، J.؛ Vogel، S. سلسلة اندماج الجسيمات الشحمية المبرمجة بالحمض النووي. أنجو. الكيمياء، كثافة العمليات. إد. 2017, 56, 13228−13231.