السمية الزمنية الكلوية المختلفة لبروموبنزين ومستقلباته الوسيطة في الفئران

من المعروف أن بروموبنزين (BB) يشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان. لقد أثبتنا سابقا أن BB أظهر سمية كرونونسية ، أي تقلبات يومية في شدة السمية الكبدية المستحثة في الفئران. على الرغم من أن BB أظهر سمية كلوية خفيفة ، إلا أنه لم يلاحظ تذبذب يومي في هذه السمية. ويمكن أن يعزى ذلك إلى حقيقة أن السمية الزمنية الناجمة عن BB لوحظت فقط في الكبد وليس فيكلىوأن الضرر الناجم عن BB بارز في الكبد ، مما يخفي التذبذب اليومي في السمية الكلوية. لتأكيد هذين الاحتمالين ، درسنا التقلبات اليومية في السمية الكلوية بسبب مستقلبات BB الوسيطة التي تستهدفكلى3-بروموفينول، برومو هيدروكينون، و4-بروموكاتيكول. تم حقن الفئران ب 3-بروموفينول أو برومو هيدروكينون أو 4-بروموكاتيكول داخل الصفاق في ست نقاط زمنية مختلفة في اليوم (بتوقيت zeitgeber (ZT): ZT2 أو ZT6 أو ZT10 أو ZT14 أو ZT18 أو ZT22). تم رصد الوفيات لمدة 7 د بعد الحقن. كانت الفئران أكثر حساسية للسمية الحادة لهذه المستقلبات حول التعرض ZT14 (المرحلة المظلمة) من التعرض ل ZT2 (المرحلة الضوئية). علاوة على ذلك ، أظهرت الفئران التي تم إعطاؤها بجرعة غير قاتلة من 4-bromocatechol زيادات ذات دلالة في مستويات نيتروجين اليوريا في الدم في البلازما والكلويمالونديالدهيد عند التعرض ZT14. علاوة على ذلك ، تم تخفيف الجلوتاثيون بيروكسيديز -4 ، وهو مؤشر فيروبتوسيس ، عند التعرض ل ZT14. تشير هذه النتائج إلى أن سمية مستقلبات BB كانت أعلى أثناء التعرض للمرحلة المظلمة ، وتوضح السبب في عدم ملاحظة التباين النهاري للسمية الكلوية بواسطة BB في تقريرنا السابق هو أنالكلويضرركان مقنعا بسبب تلف كبدي شديد.

انقر لأقراص Cistanche tubulosa لأمراض الكلى

الكلمات الرئيسية برومو البنزين; التباين النهاري. إيقاع الساعة البيولوجية. السمية الزمنية.كلية

مقدمة

بروموبنزين (BB) هو كاشف صناعي عام يستخدم عادة كمادة خام لتخليق المستحضرات الصيدلانية والأصباغ والمبيدات الحشرية.1,2) BB هو ملوث عضوي يضر بالبيئة الطبيعية ويشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان. تشير إحدى الدراسات إلى أن BB يحفز سمية كبدية حادة وخفيفةالكلويالسمية في الفئران.3) على الرغم من أن BB نفسه ، وهو شكل غير مستقلب ، يمتلك سمية منخفضة ، إلا أن مستقلباته الوسيطة لها تأثيرات سامة على الكبد وكلى. CYP450s الكبدية ، مثل CYP1A2 و CYP1B1 و CYP2E1 ، استقلاب BB إلى أربعة مستقلبات: 3-بروموفينول (3-BrP) ، برومو هيدروكينون (BrHQ) ، 4-بروموكاتيكول (4-BrC) ، و BB-3,4-oxide. يظهر BB-3,4-oxide سمية كبدية عالية وتظهر المستقلبات الأخرى السمية الكلوية ، 4-6) مما يشير إلى أن هذه المستقلبات لها أعضاء مستهدفة مختلفة.

في هذه الدراسة ، استهدفنا "علم السموم الزمني" كما اقترحنا سابقا العلاقة بين توقيت الإعطاء وشدة سمية المواد الكيميائية.7-9) أظهرت دراستنا السابقة تقلبات يومية ملحوظة في شدة الاستجابات السامة ل BB في الفئران ، أي أن الفئران كانت أكثر تحملا للإصابة الكبدية الناجمة عن BB أثناء التعرض للمرحلة المظلمة (2:00) مقارنة بالتعرض للمرحلة الضوئية (14:00).8) على الرغم من أن BB أظهر سمية كلوية خفيفة ، لم يلاحظ السمية الزمنية فيكلى. وبالتالي ، ربما لوحظت السمية الزمنية الناجمة عن BB فقط في الكبد وليس فيكلى. في دراستنا السابقة ، أظهر الستربتومايسين ، وهو مضاد حيوي معروف بالحث على السمية الكلوية المحددة ، تباينا نهاريا واضحا في السمية الكلوية المستحثة في الفئران.9) استنادا إلى البيانات المتاحة ، افترضنا أن السمية الزمنية الناجمة عن BB بارزة في الكبد وليس فيكلى، وبالتالي إخفاء السمية الزمنية في العضو الأخير. تحدث مستقلبات BB المتولدة من خلال مسارات التمثيل الغذائي المختلفة بتركيزات منخفضة وبالتالي قد تسهم في تلف كلوي لا يكاد يذكر. ونتيجة لذلك ، لا يمكن تقدير السمية الكلوية التي يسببها الأيض BB سريريا. في هذه الدراسة ، فحصنا التباين النهاري في السمية الكلوية للمستقلبات الوسيطة BB: 3-BrP و BrHQ و 4-BrC (الشكل 1).

المواد والأساليب

معاملة الحيوانات

تم شراء ذكور الفئران ICR من شركة Japan SLC Inc. (Shizuoka ، اليابان) وتم الحفاظ عليها في ظل ظروف قياسية لدرجة الحرارة التي يتم التحكم فيها (24 ± 1 درجة مئوية) ، والرطوبة (55± 5٪) ، والضوء (12: 12-h دورات الضوء / الظلام ، والأضواء مضاءة في 08: 00) ، مع حرية الوصول إلى الماء والغذاء. أجريت العلاجات التجريبية باستخدام عمرها 7 أسابيع. بعد الانتهاء من التجارب ، تم التضحية بالفئران الباقية على قيد الحياة باستخدام بنتوباربيتال. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات والتجارب بجامعة كينجو غاكوين.

البروتوكول التجريبي

وفيما يتعلق بفحص الوفيات، تلقت ذكور الفئران ICR البالغة من العمر 7 أسابيع حقنة واحدة داخل الصفاق (i.p) قدرها 500 مغ/كغ من 3-BrP، أو 180 مغ/كغ من BrHQ، أو 220 مغ/كغ من 4-BrC (بحجم 0.1 مل/10 غرام من وزن الجسم؛ طوكيو كاسي كورب، طوكيو، اليابان). يتم تحديد هذه الجرعة وفقا لقيمة LD50 في أوراق بيانات السلامة لكل مادة كيميائية. لحقن كل مستقلب ، تم تعيين الفئران إلى ست مجموعات من خمسة لكل منها. تم إعطاء مستقلبات BB في ست نقاط زمنية مختلفة (بتوقيت الساعة: 10:00 و 14:00 و 18:00 و 22:00 و 02: 00 و 06: 00) ، والتي وصفت بأنها أوقات zeitgeber (ZTs): ZT2 و ZT6 و ZT10 و ZT14 و ZT18 و ZT22 ، على التوالي. تلقت الفئران الضابطة نفس الحجم من المياه المالحة. تم رصد الوفيات لمدة 7 د بعد الحقن.

لتحليل الاختلافات اليومية فيالكلويالإصابة، تم إعطاء ذكور الفئران ICR البالغة من العمر 7 أسابيع (5-9 فئران) حقنة i.p. من 165 ملغم / كغم من 4-BrC في ZT2 أو ZT14. تلقت الفئران الضابطة نفس الحجم من المياه المالحة كما هو موضح أعلاه. تم قتل الحيوانات الرحيم باستخدام البنتوباربيتال ، وتم جمع عينات البلازما الخاصة بهم بعد 24 ساعة من الحقن. تم تخزين عينات البلازما التي تم الحصول عليها عند -80 درجة مئوية. الكلىمن جميع الحيوانات تم حصادها وتخزينها في -80 درجة مئوية.

مستويات نيتروجين اليوريا في الدم في البلازما (BUN) ، الأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST) ، ومالونديالدهيد الكلوي (MDA)

تم تحديد مستويات BUN و AST في البلازما باستخدام اختبار BUN Wako و transaminase CII-Test Wako (FUJIFILM Wako Chemicals ، أوساكا ، اليابان) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.8) Totalالكلويتم قياس مستويات MDA عن طريق فحص الصفائح الدقيقة اللونية (Oxford Biomedical Research ، MI ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.8)

تحليل اللطخة الغربية

عينات البروتين (50 ميكروغرام) المستخرجة منكلىتم فصلها عن طريق 10٪ من كبريتات الصوديوم دوديسيل - بولي أكريلاميد هلام الكهربائي الكهربائي .10) كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة على النحو التالي (جميعها مخففة 1: 1500): البروتين المتفاعل مع مستقبلات الفئران (RIP) 1 الجسم المضاد أحادي النسيلة ، والجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر RIP3 ، والفأر الجلوتاثيون بيروكسيديز 4 (GPX4) الجسم المضاد أحادي النسيلة (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ الأرنب المشقوق caspase-3 الجسم المضاد متعدد النسيلة (تكنولوجيا إشارات الخلايا) ؛ والفأر β الأكتين الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (المختبرات الطبية والبيولوجية المحدودة ، أيتشي ، اليابان).

التحليل الإحصائي

أجريت مقارنات متعددة باستخدام اختبار توكي-كرامر لما بعد المخصصات. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج SPSS 25.0 (شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية). النتائج مع p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

النتائج والمناقشة

في هذه الدراسة ، قارنا السمية الزمنية لثلاثة مستقلبات وسيطة BB (3-BrP و BrHQ و 4-BrC) التي من المعروف أنها تحفزالكلويسمية. لقد حققنا أولا في فعالية وقت الحقن على الوفيات الناجمة عن الأيض الوسيط BB. ويبين الشكل 2 عدد الحيوانات الباقية على قيد الحياة ومتوسط وقت البقاء على قيد الحياة (MST) 7 د بعد الحقن. عندما تم إعطاء 3-BrP في ZT10 و ZT14 ، ماتت جميع الفئران (0٪) في غضون 4 ساعات (الشكل 2A). في المقابل ، عندما تم إعطاء 3-BrP في ZT6 و ZT22 ، نجت ثلاثة فئران (60٪) ؛ عند إعطائها في ZT2 و ZT18 ، كان عدد الفئران الباقية على قيد الحياة واحدا واثنين (20 و 40٪) ، على التوالي. بعد إدارة BrHQ ، لوحظ موت الفئران فقط في غضون 4 ساعات بعد الإدارة في جميع مجموعات ZT. في الساعة 7 د بعد الإدارة ، لم تنجو أي فئران في مجموعات ZT14 و ZT18 ونجا ثلاثة (60٪) في مجموعات ZT2 و ZT6. في مجموعتي ZT10 و ZT 22 ، كان عدد الفئران الباقية على قيد الحياة اثنين وواحد (40 و 20٪) ، على التوالي (الشكل 2B). بعد إعطاء 4-BrC ، ماتت جميع الفئران في غضون 3 د عند تناولها في ZT14 أو ZT18 (0٪) ونجا واحد أو اثنين فقط (20 أو 40٪) في مجموعات ZT الأخرى (الشكل 2C). كان MST متسقا تقريبا مع عدد الفئران الباقية على قيد الحياة في جميع المجموعات (الشكلان 2D-F). تشير هذه النتائج إلى السمية الزمنية القاتلة للمستقلبات الوسيطة BB الثلاثة. بعد تناوله في ZT14 (المرحلة المظلمة) ، أظهرت جميع المستقلبات الثلاثة سمية عالية. ومن المثير للاهتمام أن أنماط السمية الزمنية لمستقلبات BB هذه تختلف عن تلك الموجودة في BB نفسها ، أي أن الفئران المعرضة ل BB في المرحلة المظلمة كانت لديها حساسية أقل للسمية.8) لقد أبلغنا سابقا أن الستربتومايسين ، الذي يظهر السمية الكلوية ، كان شديد السمية بعد التعرض للمرحلة المظلمة وأقل سمية بعد التعرض للمرحلة الضوء.9) هذه النتائج للدراسات السابقة لا تتناقض مع نتائج هذه الدراسة ، مما يشير إلى أن الاختلافات في سمية BB والمستقلبات الوسيطة BB الثلاثة تعزى إلى أعضائها المستهدفة. يستهدف BB الكبد ، في حين تستهدف مستقلباته الوسيطةكلى.

فحصنا بعد ذلك تأثير وقت الحقن على شدة سمية الأعضاء باستخدام جرعة غير قاتلة من 4-BrC (165 مجم / كجم). كما لوحظ الموت المبكر في غضون 4 ساعات مع حقن 3-BrP و BrHQ ، الموصوفة أعلاه ، اخترنا فقط 4-BrC للتجارب اللاحقة. للراحة التجريبية ، اخترنا ZT2 و ZT14 كأوقات حقن. في مجموعة ZT2 ، لم يتم زيادة مستوى البلازما من BUN ، وهو مؤشر على السمية الكلوية ، بعد التعرض ل 4-BrC. ومع ذلك ، تم زيادة مستوى BUN بشكل ملحوظ في مجموعة ZT14 (الشكل 3A). بالتوازي مع BUN ، قمنا بقياس مستوى AST في البلازما ، وهو مؤشر على السمية الكبدية. وجدنا أن إدارة 4-BrC لم تؤثر على مستويات AST في البلازما في كل من ZT2 و ZT14 (الشكل 3B) ، مما يشير إلى أن 4-BrC كانت سامة فقط لكلى. بالإضافة إلى ذلك ، قدرنا مستويات MDA كمؤشر للإجهاد التأكسدي فيكلى. إدارة 4-BrC زيادة بشكل ملحوظ مستوى MDA الكلوي في مجموعات ZT14 و ZT2. ومع ذلك ، كان مستوى MDA في مجموعة حقن ZT2 أقل بشكل ملحوظ من ذلك الموجود في مجموعة ZT14 (الشكل 3C).

حتى الآن ، تم الإبلاغ عن مسارات موت الخلايا المختلفة مثل موت الخلايا المبرمج ، وموت الخلايا ، و ferroptosis.11) بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن موت الخلايا الناجم عن 4-BrC يتم بوساطة رئيسية عن طريق النخر.6) للتحقيق في نوع موت الخلايا الناجم عن 4-BrC ، قمنا بتحليل مستويات البروتينات المتعلقة بموت الخلايا: كاسباز-3 المشقوق لموت الخلايا المبرمج ، RIP1 / RIP3 لاستئصال الميت ، و GPX4 لداء الفيروبتوسيس. لم تلاحظ أي تغييرات واضحة في مستويات caspase-3 و RIP1 و RIP3 المشقوقة في أي مجموعة ، مما يشير إلى أن موت الخلايا المبرمج و necroptosis لا يسببه 4-BrC (الشكل 4). في المقابل ، لوحظ انخفاض في مستوى GPX4 بعد إعطاء 4-BrC في ZT14 (الشكل 4). لم نلاحظ النخر الكلوي الناجم عن 4-BrC عن طريق التحليل النسيجي المرضي (البيانات غير معروضة). هذا يشير إلى أن تركيز 4-BrC المستخدم في هذه الدراسة تسبب في تلف كلوي خفيف ولم يؤد إلى النخر. من هذه النتائج ، يمكن اقتراح أن 4-BrC يسبب ferroptosis ، مما يدل على التباين النهاري.

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن المستقلبات الوسيطة BB المستحثة بالسمية الزمنية فيكلية. في المقابل ، أظهرت نتائجنا السابقة السمية الكلوية الناجمة عن BB. ومع ذلك ، لم تتغير السمية الزمنية الكلوية بين المرحلة الضوئية والمرحلة المظلمة.8) على الرغم من أن السبب الحاسم للفرق بين الأبحاث السابقة والحالية غير واضح بعد ، إلا أننا نعتقد أنه حدث لإخفاء السمية الزمنية الكلوية عن طريق إحداث إصابة كبدية شديدة. في التجربة المستقبلية ، نحتاج إلى قياس الكميات المتراكمة من كل مستقلب وسيط BB لأن هذه الكميات قد تتغير حسب CYP و / أو مستويات الإصابة.

تظهر العديد من العوامل البيولوجية إيقاعا الساعة البيولوجية في مستويات تعبيرها. على سبيل المثال، أبلغ شو وآخرون عن تباين نهاري في التعبير الجيني الكبدي المضاد للأكسدة في الفئران.12) الجلوتاثيون (GSH) هو أحد مضادات الأكسدة التي تعتبر حاسمة للحفاظ على الصحة والحماية من المركبات السامة. تم الإبلاغ عن أن كلا من 4-BrC و 3-BrP يستنفدان مستوى GSH الكلوي.4,13) تم اقتراح Ferroptosis في عام 2012 كشكل من أشكال موت الخلايا الناجم عن الإيلاستين ، والذي يمنع استيراد السيستين ، مما يؤدي إلى استنفاد GSH وتعطيل GPX4.14) أظهرت نتائجنا أن GPX4 تم قمعه فقط في ZT14 بواسطة 4-BrC. لذلك ، قد ترتبط البروتينات أو الجينات المرتبطة ب GSH بالسمية الزمنية.

في الختام ، توضح دراستنا الحالية أن BB يحفز تلف الكلى وكذلك تلف الكبد من خلال مستقلباته ، مثل 3-BrP و BrHQ و 4-BrC. السبب في عدم ملاحظة التباين النهاري للسمية الكلوية بواسطة BB في تقريرنا السابق هو أن الضرر الكلوي كان مقنعا بسبب تلف كبدي قوي.

مراجع

1) لاو SS ، الرهبان TJ. مساهمة بروموبنزين في فهمنا الحالي للسميات المستحثة كيميائيا. علوم الحياة ، 42 ، 1259-1269 (1988).

2) تشاو H ، تشنغ ن ، هي L ، بينغ G ، ليو Q ، ما تي ، تساو W. آثار الكبد من العسل من Apis cerana فابريسيوس على تلف الكبد الناجم عن برومو البنزين في الفئران. J. Food Sci. ، 83 ، 509-516 (2018).

3) Vedi M, Sabina EP. تقييم إمكانات الحماية من الكبد والكلية للويثافيرين A على الإصابة الناجمة عن البروموبنزين في الفئران البيضاء السويسرية: احتمال تورط خلل الميتوكوندريا والاشتعال. Cell Biol. Toxicol., 32, 373–390 (2016).

4) دانكوفيتش DA ، بيلينغز RE. دور 4-بروموفينول و 4-بروموكاتيكول في ارتباط برومو البنزين التساهمي والسمية في خلايا كبد الفئران المعزولة. السموم. Appl. Pharmacol., 79, 323–331 (1985).

5) Lau SS و Monks TJ و Gillette JR. تحديد 2-bromohydroquinone كمستقلب لبروموبنزين و o-bromophenol: الآثار المترتبة على السمية الكلوية الناجمة عن برومو البنزين. ج. فارماكول. Exp. Ther., 230, 360–366 (1984).

6) راش GF ، نيوتن JF ، مايتا K ، كو CH ، هوك JB. السمية الكلوية لمستقلبات بروموبنزين الفينول في الفأر. علم السموم ، 30 ، 259-272 (1984).

7) ميورا N، يوشيوكا H، نيشيموري A، Ohtani K، Hasegawa T، هوانج GW، Ikeda M، Nonogaki T. تحليلات متعددة الاتجاهات للسمية الزمنية الكبدية الناجمة عن الكادميوم وفي الفئران. ي. السموم. العلوم ، 42 ، 597-604 (2017).

8) يوشيوكا H ، نونوغاكي T ، فوكويشي N ، شينوهارا Y ، هوانج GW ، Ohtani K ، Miura N. السمية الزمنية للإصابة الكبدية الناجمة عن البروموبنزين في الفئران. ي. السموم. العلوم ، 42 ، 251-258 (2017).

9) يوشيوكا H ، توميناغا S ، شينوهارا Y ، هوانج GW ، مايدا T ، ميورا N. السمية الزمنية للإصابة الكلوية الناجمة عن الستربتومايسين في الفئران. Biol. Pharm. Bull. ، 43 ، 53-58 (2020).

10) يوشيوكا H ، Ichimaru Y ، Fukaya S ، Nagatsu A ، Nonogaki T. يتم التوسط في التأثير المقوي للأسيتامينوفين وسمية الكبد الناجمة عن رابع كلوريد الكربون عن طريق تنشيط بروتين تفاعل المستقبلات في الفئران. السموم. Mech. Methods, 28, 615–621 (2018).

11) كيم EH ، وونغ SW ، مارتينيز J. نخر ومرض مبرمج: نحن نقاطع البرمجة العادية الخاصة بك لتجلب لك necroinflamation. يختلف موت الخلية ، 26 ، 25-40 (2019).

12) شو YQ، تشانغ D، جين T، تساي دي جي، وو Q، لو Y، ليو J، كلاسن مؤتمر نزع السلاح. التباين النهاري للتعبير الجيني الكبدي المضاد للأكسدة في الفئران. PLOS ONE, 7, e44237 (2012).

13) الرهبان TJ ، Hinson JA ، Gillette JR. Bromobenzene و p-bromophenol السمية والارتباط التساهمي في الجسم الحي. علوم الحياة ، 30 ، 841-848 (1982).

14) ديكسون SJ ، ليمبرغ KM ، لامبريشت MR ، Skouta R ، Zaitsev EM ، Gleason CE ، Patel DN ، Bauer AJ ، Cantley AM ، Yang WS ، Morrison B 3rd ، Stockwell BR. Ferroptosis: شكل يعتمد على الحديد من موت الخلايا غير الاستئصالية. خلية، 149، 1060–1072 (2012).

هيروكي يوشيوكا، أ، ب، # سارة توميناغا، أ، # ماي نيشيكاوا، ياسورو شينوهارا، ماكوتو ناكاو، ماساي يوشيكاوا، توهرو مايدا،*، أ ونوبوهيكو ميورا*، ج

كلية الصيدلة، جامعة كينجو غاكوين؛ 2-1723 أوموري، مورياما-كو، ناغويا 463-8521، اليابان: ب مركز البحوث القحفية الوجهية، مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في هيوستن، كلية طب الأسنان. 1941 East Road, Houston, TX 77054, U.S.A.: AND CDepartment of Health Science, جامعة يوكوهوما للصيدلة; 601 مومونو تشو، توتسوكا-كو، يوكوهاما 245-2006، اليابان. تم استلامه في 30 أغسطس 2020 ؛ تم قبوله في 25 أكتوبر 2020

لمزيد من المعلومات: Ali.ma@wecistanche.com