تأثير مستخلصات Cistanche Tubulosa على الوظيفة الإنجابية للذكور في الجرذان المصابة بداء السكري المستحث بالستربتوزوتوسين-النيكوتيناميد-Ⅰ

1. مقدمة

داء السكري (DM) هو حالة تزداد فيهامستويات الجلوكوزفي الدم بسبب عدم كفاءة البنكرياس في إنتاج كمية كافية من الأنسولين، أو عدم قدرة الجسم على استخدامه بفعالية. ووفقا لمنظمة الصحة العالمية، ارتفع عدد الأشخاص المصابين بالسكري من 108 ملايين في عام 1980 إلى 422 مليونا في عام 2014 [1]. هناك أربع فئات رئيسية: مقدمات السكري (مرحلة ما قبل مرض السكري)، النوع الأول (حيث يفشل البنكرياس في إنتاج الأنسولين)، النوع الثاني (فشل الجسم في استخدام الأنسولين)، وسكري الحمل (الذي يحدث أثناء الحمل). يحدث الإجهاد التأكسدي بسبب عدم التوازن بين إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ومضادات الأكسدة [2] مما يؤدي في النهاية إلى حالة مرض السكري. وتشمل مضاعفات مرض السكري فشل الكلى، وتلف الأعصاب، والعمى، والسكتة الدماغية، والنوبات القلبية، وموت الجنين، والعقم. [1]. تشير الدراسات إلى أن نوى الحيوانات المنوية والحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) والميتوكوندريا قد تضررت بشكل كبير لدى مرضى السكري الذكور [3]. سيؤدي الإجهاد التأكسدي أثناء نقل الحيوانات المنوية إلى تغيير عملية الجهاز التناسلي الذكري [4،5].

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

يتم التحكم في عملية تكوين الحيوانات المنوية عن طريق محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدد التناسلية (HPG). يحفز الهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية (GnRH) الذي ينتجه منطقة ما تحت المهاد إنتاج الهرمون الملوتن (LH) والهرمون المنبه للجريب (FSH). تم العثور على خلايا لايديغ بجوار النبيب المنوي وإنتاج هرمون التستوستيرونتحت سيطرة LH. يحفز هرمون FSH إنتاج بروتين ربط المستضد (ABP) الذي يساعد على تمرير الهرمون الذكري. وبالتالي، فإن العقم ومشاكل أخرى تنشأ بشكل رئيسي بسبب الاضطرابات التي تحدث في محور HPG. إدارة مزيج من الستربتوزوتوسين والنيكوتيناميد يحفز مرض السكري في فئران التجارب. الستربتوزوتوسين هو مركب كيميائي سام للخلايا المنتجة للأنسولين في البنكرياس والنيكوتيناميد هو فيتامين قابل للذوبان في الماء يحمي الخلايا من التلف الكامل [6].

Cistanche tubulosa هو نوع من النباتات الصحراوية يُعرف أيضًا باسم "Rou Cong-Rong" [7]. وهو نبات طفيلي غير الكلوروفيلي ينمو بشكل رئيسي على جذر شجرة كالوتروبيس بروسيرا وينتشر على نطاق واسع في الأراضي القاحلة في قانسو وتشينغهاي وشينجيانغ ومنغوليا وإيران والهند. الاسم الشائع لـ Cistanche tubulosa هو "صفير الصحراء". وهو مقبول على نطاق واسع في الطب الصيني التقليدي وقد أطلق عليه اسم "جينسنغ الصحراء". يستخدم على نطاق واسع في المجال الطبي لعلاج نزف الدم المرضي، ونزف الرحم الغزير، وأمراض الكلى المزمنة، والإمساك، والعجز الجنسي، والعقم. المكونات الكيميائية لليتكون Cistanche tubulosa من جليكوسيدات فينيلثانويد غير المتطايرة(PHGs)، والقزحية، والقشور، والزيوت المتطايرة، والألديتول، والسكريات قليلة السكريات، والسكريات [8]. تظهر الدراسات ذلكechinacosideمن هذه العشبة تحمي الخلايا الليفية التالفة عن طريق تنظيم مستويات ROS [9]. ينتج هذا المركب أنشطة مضادة للأكسدة واسترخاء الأوعية الدموية ومضادة للالتهابات جنبًا إلى جنب مع الحماية العصبية والوقاية من هشاشة العظام [10،11].

هدفت هذه الدراسة إلى معرفة تأثيرمستخلص السيستانش توبولوساتحتوي على ECH على الخلل الوظيفي التناسلي للفئران المصابة بداء السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين والنيكوتيناميد.

2. المواد والأساليب

2.1. مواد

تم شراء ECH وCTE من شركة Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan، تايوان). تم شراء المنتجات النهائية للجليكيشن المتقدمة (AGEs) من Biovision (سان فرانسيسكو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء خطوط الخلايا LC-540 وTM3 من معهد أبحاث وتطوير صناعة الأغذية (هسينشو، تايوان). تم شراء فئران ذكور Sprague-Dawley (SD) عمرها خمسة أسابيع من المركز الوطني لحيوانات المختبر (تايبيه، تايوان). تم شراء Feed Lab Diet® من شركة PMI Nutrition International, Inc. (تايبيه، تايوان). 2، 2- ثنائي فينيل -1- بيكريل هيدرازيل (DPPH) تم الحصول عليه من Sigma (St. Louis، MO، USA). تم أيضًا شراء الميثانول و4- (2- هيدروكسي إيثيل) -1- حمض البيبرازين إيثان سلفونيك (HEPES) من Sigma. تم الحصول على Eagle Medium / F12 وtrypsin-EDTA المعدل من Dulbecco من GIBCO (نيويورك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). 3-(4، 5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-yl)-2، 5-بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT)، ثنائي كلورو-ثنائي هيدرو-فلوريسئين ثنائي الأسيتات (DCFH-DA)، تم شراء ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ونيتروبلو تيترازوليوم (NBT) من سيجما. تم الحصول على مجموعات إنزيمية الجلوكوز من كيوكوتوسياكو، طوكيو، اليابان. تم شراء مجموعات الأنسولين ELISA من شركة Mercodia AB Inc.، Sylveniusgatan 8A (أوبسالا، السويد). تم الحصول على كاشف استخلاص بروتين الأنسجة T-PER من شركة Thermo Scientific (شيكاغو، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للإنسان / الفأر / الجرذ - kappa B NF-κB من شركة Santa Cruz Biotechnology، Santa Cruz، CA، USA. تم شراء مستقبلات مضادة للفأر / الفئران للمنتجات النهائية للجليكيشن المتقدمة (RAGE) والأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للإنسان / الفأر / الجرذ StAR والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للإنسان / الفأر / الجرذ Cytochrome P 450 17 A1 من جين تكس (ايرفين، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للإنسان / الفأر / الجرذ CYP11A1 من تقنية تشوير الخلية (بيفرلي ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء كاشف Easy-Blue من Invitrogen، Thermo Fisher Scientific (كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على Agarose وعلامة DNA 100 نقطة أساس من شركة Promega، Corporation (Madison، WI، USA). تم شراء مجموعة RNeasy Lipid Tissue Mini Kit من QIAGEN، Hilden، ألمانيا.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. طُرق

2.2.1. في التحليل المختبري

LC{{0}} وثقافة الخلايا TM3: تمت زراعة خطوط الخلايا LC-540 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في وسط محلول ملح إيرل المتوازن (EBSS) المكمل ببيكربونات الصوديوم (1.5 جم / لتر)، L- الجلوتامين (2 مم)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (0.1 مم)، بيروفات الصوديوم (1.0 مم)، ومصل الأبقار الجنيني (FBS) (10٪) في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5% (حاضنة ثاني أكسيد الكربون، نابكو 5410، تايوان). تمت زراعة خط الخلايا TM3 في وسط النسر المعدل (DMEM) في Dulbecco المكمل بالجلوكوز (4.5 جم / لتر)، بيروفات الصوديوم (0.5 مم)، L- الجلوتامين (2.5 مم)، بيكربونات الصوديوم (1.2 جم / لتر)، {{ 28}}(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض البيبرازين إيثان سلفونيك (HEPES، 15 ملم)، ومصل العجل الجنيني (FCS، 10%) أو مصل الحصان (5%) عند 37 درجة مئوية في 5% حاضنة ثاني أكسيد الكربون.

تحديد صلاحية الخليةإشيناكوسيد (ECH): 3-(4, 5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-yl)-2،5- تم استخدام كاشف بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) لفحص صلاحية الخلية. تم ضبط تركيز الخلية إلى 2 × 105 خلية / مل في صفيحة البئر 96-. بعد ذلك، تمت إضافة 20 ميكرولتر من ECH (مخفف في 2% من الوسط) وحضنت لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5%. لاحقًا، تمت إضافة 100 ميكرولتر من كاشف MTT واحتضانها لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية تحت ظروف مظلمة. تم قياس الامتصاص عند 570 نانومتر (قارئ ELISA، Dynatech MR5000، Kloten، Switzerland).

قابلية الخلية النسبية (٪)=[(عينة عند 570 نانومتر - فارغة عند 570 نانومتر)]/[(Acontrol عند 570 - فارغة عند 570)] × 100.

اختبار تخفيض Nitroblue Tetrazolium (NBT) وفحص 2،2- ثنائي فينيل -1- بيكريل هيدرازيل (DPPH): تم تعديل عدد الخلايا إلى 1 × 1 {{1 0}} 6 خلايا / مل. بعد ذلك، تمت إضافة 50 ملغم/مل من ECH، وريسفيراترول (RES)، والمنتجات النهائية لعملية التسكر المتقدمة (AGEs) (التحكم) وتم زراعتها بشكل مشترك لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، تمت إضافة 0.3 مل من محلول NBT (0.1 مجم/مل NBT، 5% FBS، و3% ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) المذاب في 10 مل DMEM) وحضنت عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 لمدة ساعة واحدة. بعد الطرد المركزي (عند 800 × جم لمدة 3 دقائق) تمت إزالة المادة الطافية وإضافة 200 ميكرولتر من DMSO ورجها لمدة 5 دقائق في مذبذب بالموجات فوق الصوتية (Delta Ultrasonic Cleaner D 200، Keelung، تايوان). تم قياس الامتصاصية عند 630 نانومتر. بالنسبة لفحص DPPH الجذري، تم أخذ Trolox (في 95٪ كحول) كمعيار. بعد ذلك، تم خلط 75 ميكرولتر من محلول DPPH بمقدار 0.5 مم مع 25 ميكرولتر من العينات وتم السماح له بالتفاعل عند درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم لمدة 30 دقيقة. تم رج الخليط وتم قياس الامتصاصية عند 517 نانومتر.

تحليل محتوى أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS): تم تعديل رقم الخلية إلى 2 × 105 خلية/مل في لوحة بئر 12- تحتوي على 2% FBS. بعد ذلك، تمت إضافة 50 ميكرولتر/مل من ECH وRES وAGEs إلى الطبق وحضنت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، 20،70 - تمت إضافة ثنائي كلوروفلوريسئين-ثنائي الأسيتات (DCFH-DA) وحضنت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي (400 × جم، 5 دقائق)، تمت إزالة المادة الطافية وتم غسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي بالفوسفات (PBS). بعد ذلك، تم تعليق الخلايا في 1 مل من PBS وتم تحديد مستويات ROS باستخدام مقياس التدفق الخلوي (Flow Cytometer، Becton Dickinson، CA، USA).

التحديد والتحليل الكمي للبروتين: تم استخلاص البروتينات باستخدام كاشف استخلاص البروتين (T-PER). تم ضبط كثافة الخلية إلى 2 × 105 خلية/مل في صفيحة بئر 12- و50 ميكرولتر/مل من ECH، وRES، ومستقبل لمضاد المنتج النهائي للجليكيشن المتقدم (RAGE)، وتمت إضافة AGEs واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تمت إضافة 400 ميكرولتر من T-PER، وكشط الخلايا، وطردها عند 125،000 × جم لمدة 20 دقيقة (4 ◦ مئوية). تم جمع الطاف وتخزينه عند -80 درجة مئوية (−80 درجة مئوية الفريزر، Nuaire، Plymouth، MN، USA) لمزيد من التحليل. تم استخدام مجموعة حمض البيكينكونيك (BCA) لتقدير كمية البروتين. بعد ذلك، تمت إضافة 10 ميكرولتر من محلول الخلية القياسي و200 ميكرولتر من كاشف BCA إلى أطباق البئر 8- وحضنت عند درجة حرارة 37 ◦ مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5% لمدة 30 دقيقة. تم قياس الامتصاصية عند 562 نانومتر. تم إجراء تحليل تحديد البروتين بواسطة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) - هلام بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) الكهربائي. تم تحضير العينات عن طريق إضافة محللة البروتين إلى المخزن المؤقت لتحميل البروتين وتم إجراء تحليل لطخة غربية للكشف عن البروتينات المحددة.

2.2.2. في تحليل الجسم الحي

تصميم نموذج الحيوان: تم شراء ستون فئران سبراغ داولي (SD) يبلغ عمرها أسبوعًا من المركز الوطني لحيوانات المختبر (تايبيه، تايوان). تم إيواء كل فأر على حدة في أقفاص مطهرة من الفولاذ المقاوم للصدأ تحت درجة حرارة يمكن التحكم فيها (23 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة (40-60٪) مع دورة إضاءة مدتها 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة. تم توفير الطعام والماء حسب الرغبة. تم تدجين كل فأر في الأسبوع الأول وتم إعطاؤه النظام الغذائي لقوارض المختبر 5001 كنظام غذائي رئيسي. اتبعت جميع الإجراءات معايير لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (موافقة IACUC رقم 101026) التابعة لجامعة تايوان الوطنية للمحيطات، تايوان. بعد التدجين، تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين: المجموعة الضابطة (Con) التي تم تغذيتها بنظام غذائي معملي 5001، ومجموعة مرضى السكري التي تم تغذيتها بنظام غذائي عالي الدهون (HFD، 40٪) للتجربة بأكملها. بعد إطعامها بـ HFD لمدة 4 أسابيع، تم حقن فئران المجموعة المصابة بالسكري بالستربتوزوتوسين (65 مجم / كجم) (STZ) للحث على داء السكري (DM). في غضون 15 دقيقة من حقن STZ، تم حقن النيكوتيناميد (230 ملغم / كغم من وزن الجسم). بعد أسبوع من الحقن، تم إجراء اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) لتحديد الحث الناجح لمرض السكري (DM). بعد ذلك تم تقسيم الحيوانات إلى ست مجموعات: مجموعة السيطرة (المغذية على علف مختبري 5001)؛ مجموعة DM (DM + 45% HFD)؛ مجموعة DMR (DM + روزيجليتازون: 0.571 مجم/كجم من وزن الجسم) + 45% HFD؛ مجموعة DME1 (DM + CTE: 80 مجم/كجم من وزن الجسم) + 45% HFD؛ مجموعة DME2 (DM + CTE: 160 مجم/كجم من وزن الجسم) + 45% HFD؛ ومجموعة DME4 (DM + CTE: 320 مجم/كجم من وزن الجسم) + 45% HFD. تم أخذ روزيجليتازون (RSG) كعنصر تحكم إيجابي. تم استخدام ثلاث جرعات من CTE (80 و 160 و 320 ملغم / كغم) وفقًا لتوصية إرشادات التقييم الوظيفي للأغذية الصحية التابعة لإدارة الغذاء والدواء في تايوان (TFDA). أعطيت العلاجات حتى نهاية التجربة. تم التضحية بجميع فئران التجارب بعد 6 أسابيع. تم طرد الدم المجمع من الفئران عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم فحص الطاف لإجراء التحليل التالي:

تحديد إجمالي الجلوكوز والدهون الثلاثية والكوليسترول: تم إجراء تحديد الجلوكوز بواسطة مجموعات إنزيمية الجلوكوز. بعد ذلك، تمت إضافة 20 ميكرولتر من عينات بلازما الدم إلى الكواشف وحفظها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم تحديد إجمالي الدهون الثلاثية وتركيز الكوليسترول الكلي باستخدام مجموعات إنزيمية الدهون الثلاثية والكوليسترول. ثم تمت إضافة 10 ميكرولتر من بلازما الدم إلى الكواشف وأجريت التجربة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس الامتصاصية عند 510 نانومتر.

إجمالي الجلوكوز/الدهون الثلاثية/الكوليسترول في البلازما (مجم/ديسيلتر)=(عينة − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200.

عينة: امتصاص عينات الدم، Ablank: قيمة الامتصاص للمجموعات بدون عينة، قياسي: قيمة الامتصاص للكاشف القياسي، 200: الكواشف القياسية بتركيز 200 ملغم/ديسيلتر.

تقييم نموذج الأنسولين والليبتين والتوازن - تحديد مقاومة الأنسولين (HOMA-IR):تم تحديد مستوى الأنسولين بواسطة مجموعات الأنسولين ELISA. هنا، 25µتمت إضافة لتر من بلازما الدم إلىالكواشف، وتم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر. تم تحديد إجمالي محتوى اللبتين باستخداممجموعة المقايسة المناعية لإنزيم اللبتين.ثم 100µتم تحليل لتر من البلازما والامتصاصيةتم قياسه عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ELISA. تم إجراء التجربة بأكملها وفقًا لـتعليمات الشركة المصنعة. تم تحديد قيمة HOMA-IR من نموذج التوازنمعادلة التقييم=تركيز الأنسولين في بلازما الصيام (مجم/مل)× الجلوكوز في البلازما الصيامالتركيزات (مليمول/لتر)/22.5.

بيروكسيد الدهون في البلازما: هنا، {{0}}. تم ​​خلط 5 مل من بلازما الدم مع 1 مل من الكاشف (15%، وزن/حجم حمض ثلاثي كلورو أسيتيك في 0.25 N حمض الهيدروكلوريك (HCl) ) و 0.375%، وزن/حجم حمض الثيوباربيتوريك في 0.25 N حمض الهيدروكلوريك) ووضعها في حمام مائي (حمام مائي، BUCHI 461، زيورخ، سويسرا) عند 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد، تمت إضافة 1 مل من n- بيوتانول، ورج بقوة، وطرد عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق. تم جمع الطاف وقياس الامتصاصية عند 532 نانومتر [12].

تركيز المالونديالدهيد (MDA) (نانومتر/مل)=[(عينة عند 532 نانومتر - فارغة عند 532 نانومتر)/ (معيار عند 532 نانومتر - فارغة عند 532 نانومتر)] × 5.

قياسي عند 532 نانومتر - فارغ عند 532 نانومتر)] × 5. تحديد مستويات هرمون التستوستيرون في البلازما وهرمون اللوتين (LH): تم استخدام مجموعة ELISA التستوستيرون لقياس مستوى هرمون التستوستيرون في بلازما الدم. تم استخدام مجموعة RIA لتحديد تركيز LH. بعد ذلك، تمت إضافة 50 ميكرولتر من البلازما واستندت الحسابات إلى تركيز الهرمون LH-RP-3 (قياسي). تم إجراء الخطوات الإضافية وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

تحديد عامل نخر الورم (TNF) - والإنترلوكين -6 (IL-6) التركيز: تم تخفيف الجسم المضاد الذي تم التقاطه 250 مرة في المخزن المؤقت للطلاء، وأضيف إلى 96- طبق جيد (100 ميكرولتر/جيد)، ويُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. تم استنشاق المادة الطافية وغسلها خمس مرات باستخدام محلول الغسيل (مرة واحدة PBS، 0.05% توين 20). بعد الحضانة (ساعة واحدة) مع 200 ميكروغرام من مادة مخففة للفحص، تم غسل الخلايا 5 مرات باستخدام محلول غسيل وتمت إضافة 100 ميكرولتر من المحلول القياسي TNF أو عينات الاختبار إلى كل بئر واحتضانها لمدة ساعتين. بعد الغسيل، تمت إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المكتشفة IL-6- واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم استنشاق المادة الطافية وغسلها 5 مرات. بعد ذلك، تمت إضافة 480 ميكرولتر من إنزيم أفيدين-فجل بيروكسيديز (HRP) واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم استنشاق المادة الطافية وغسلها خمس مرات باستخدام محلول غسيل. ثم تمت إضافة 100 ميكرولتر من محلول الركيزة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في وقت لاحق، تمت إضافة 50 ميكرولتر من محلول التوقف (1M حمض الفوسفوريك) إلى كل بئر وتم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لإصلاح الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

تحليل الحيوانات المنوية ومعلمات الخصية

جمع عينات الحيوانات المنوية: تم إجراء جمع عينات الحيوانات المنوية وفقًا للطريقة المذكورة سابقًا في [13]. تم جمع الحيوانات المنوية من طاف واستخدامها لمزيد من التحليل.

عدد الحيوانات المنوية وحركة الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية غير الطبيعية: تم حساب عدد الحيوانات المنوية باستخدام مقياس الهيموكيتومتر ومحلول التريبان الأزرق. بعد ذلك، تم خلط 100 ميكرولتر من سائل الحيوانات المنوية بمحلول التريبان الأزرق وتم حساب عدد الحيوانات المنوية وحركتها والحيوانات المنوية غير الطبيعية باستخدام مقياس الكريات والمجهر [14].

تخفيض نيترو بلو تيترازوليوم NBT وبيروكسيد الدهون في الحيوانات المنوية والخصية: تم تحليل بيروكسيد الدهون وتقليل NBT وفقًا لنفس الإجراء لتحليل البلازما.

تحديد نشاط ديسموتاز الفائق أكسيد (SOD) ونشاط كاتالاز: تم تحليل نشاط ديسموتاز الفائق أكسيد (SOD) باستخدام مجموعة RANSEL. هنا، تمت إضافة {{0}}.0 5 مل من متجانسات الخصية إلى 1.7 مل من محلول التفاعل (0.05 ملي مولار زانثين، 0.025 ملم 2-({ {9}}يودوفينيل)- 3-(4-نيتروفينول)-5-كلوريد فينيل تيترازوليوم (INT)). بعد الخلط، تمت إضافة 0.25 مل من أوكسيديز الزانثين (80 وحدة / لتر) وتم التفاعل عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. تم قياس الامتصاصية عند 505 نانومتر. تم تحديد تركيز البروتين في جناسة الخصية بواسطة مجموعة فحص البروتين Bio-Rad DC وتم حساب نشاطه المحدد (بروتين U / mg). تم تحديد نشاط الكاتلاز (CAT) وفقًا للطريقة التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا [15].

تلطيخ H&E (الهيماتوكسيلين والأيوسين).

تنقع الخصية في 10% من الفورمالين لمدة 24 ساعة وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. كانت الأنسجة صغيرة الحجم ومثبتة على الشريحة. بعد التثبيت (95% ميثانول + 5% حمض أسيتيك)، تم غمر الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق، وغسلها بالماء الجاري لمدة 5 دقائق، ثم نقعها في 50%، و70%، و90% من الكحول لمدة 3 دقائق. دقيقة واحدة. بعد ذلك، تم تلطيخ الشرائح بالأيوسين لمدة 10 ثوانٍ ونقعها في كحول 100% لمدة دقيقة واحدة حتى تتلاشى. وأخيرًا، تم نقع الشريحة في الزيلين لمدة دقيقة واحدة. وفي وقت لاحق، تم تجفيف الشريحة بالهواء وإغلاقها. تم وضع الأنبوب الملون في مجهر تباين الطور المقلوب (مجهر فرق الطور المقلوب، أوليمبوس CK -2، طوكيو، اليابان) لمراقبة التشكل.

تحليل منطقة ما تحت المهاد

تم تحديد الفأر KISS1، ومستقبل البروتين G (GPR) 54، ومثبط إشارات السيتوكين 3 (SOCS -3)، وتسلسل الجينات Sirtuin 1 (SIRT1) من قاعدة بيانات الجينات NCBI (المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية). وتم تصميم برايمر محدد باستخدام Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). يتم سرد الاشعال المستخدمة في التجربة في الجدول 1.

استخلاص حمض الريبونوكليك (RNA) من منطقة ما تحت المهاد. تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) من منطقة ما تحت المهاد في الدماغ باستخدام مجموعة RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. تم قياس mRNAs التي تم الحصول عليها كميا عن طريق النسخ العكسي (RT) وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تم تخزين الحمض النووي المجاملة الذي تم الحصول عليه من تحليل RT عند -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقًا. تم إخضاع الحمض النووي المستخرج لتحليل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام بوليميريز طق. بعد ذلك، تم أخذ 5 إلى 10 ميكرولتر من منتج PCR وتحليلها بواسطة الرحلان الكهربائي على مادة غروانية أجار بنسبة 1.5%. تم التقاط الصورة باستخدام نظام التصوير UVP BioDoc-It. تم أخذ حمض الديوكسي ريبونوكلييك التكميلي (cDNA) المكتوب عكسيًا وتم إجراء PCR باستخدام IQ SYBR Green Supermix Kit. وتم تحليلها لاحقًا باستخدام برنامج النظام البصري iQTM 5. تم استخلاص البروتينات باستخدام كاشف استخلاص البروتين (T-PER). بعد ذلك، تمت إضافة 20 ملغ من جناسة الخصية إلى 400 ميكرولتر من T-PER وطردها مركزيًا (جهاز طرد مركزي عالي السرعة، Hettich CR-12، توتلينجن، ألمانيا) عند 4 ◦C (125,000× g ) لمدة 20 دقيقة. كانت الطريقة التالية مشابهة لـ "تحديد وتحليل البروتين الكمي" في التحليل المختبري.

2.3. التحليل الإحصائي

تم التعبير عن النتائج التجريبية على أنها الانحراف المعياري المتوسط ​​(المتوسط ​​± SD) وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج حلول المنتجات والخدمات الإحصائية (SPSS) 11.0، IBM، Armonk، New York، NY، USA. تم تحليل الاختلافات بين المجموعتين عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). تم تحليل المقارنات المتعددة لمجموعات مختلفة بواسطة اختبار دنكان بقيمة p <0.05 كمستوى معنوي.

3. النتائج

3.1. في التحليل المختبري

3.1.1. مقارنة الأنشطة المضادة للأكسدة لـ ECH وCTE وRES

طويلة المدى حيعد الإجهاد التأكسدي العالي والالتهاب المزمن من الأسباب الرئيسية لمرض السكريالمضاعفات [16]. تحتوي CTEs على مختلفجليكوسيدات الفينيليثانويد مثل إشيناكوسيد(ECH) والأكتيوسيد، مع إمكانية النشاط المضاد للأكسدة [17]. DPPH الكسح الجذريتم إجراء الفحص لتقييم نشاط مضادات الأكسدة لـ ECH. ترولوكس وريسفيراترول(3،5،4'-trihydroxystilbene، RES) تم أخذها كعنصر تحكم قياسي وإيجابي على التوالي. كما هو مبينفي الشكل1، أظهرت ECH نشاطًا أفضل في الكسح الجذري وكان النشاط أعلى بكثيرمقارنة بالتحكم الإيجابي (RES).

3.1.2. صلاحية الخلية لـ ECH على خلايا LC -540 وTM3 Leydig

تم إجراء اختبار MTT لتقييم صلاحية الخلية لتركيزات مختلفة من ECH. أظهرت خلايا LC-540 خلايا Leydig وخلايا TM3 Leydig أكثر من 80% من الحيوية بعد معالجتها بـ ECH (الشكل 2). بالمقارنة مع التركيزات الأخرى، أظهر تركيز 100- ميكرومتر (تخفيفات 100 ميكرومتر في 2% FBS) من ECH قابلية أفضل للخلايا في خلايا TM3 Leydig. أشارت النتيجة إلى أن زيادة تركيز ECH لا يساهم بأي سمية كبيرة للخلايا.

3.1.3. تأثير ECH على إنتاج الأكسيد الفائق الناتج عن AGE بواسطة فحص NBT في LC-540 وخلايا TM3 Leydig

تسبب AGEs ضررًا مؤكسدًا في الجسم بسبب أكسدة الجلوكوز وتكوين الجذور الحرة مثل O2- وجذور الهيدروكسيل ومجموعات الكربونيل [18]. بعد تحفيزها بـ 50 ميكروغرام/مل من AGEs، تمت معالجة خلايا LC -540 (الشكل 3 أ) وTM3 (الشكل 3 ب) باستخدام ECH وRES (5 ميكرومتر و10 ميكرومتر لكل منهما). أظهرت النتائج زيادة إنتاج أنيون فوق الأكسيد في المجموعة الضابطة (AGEs المحفزة)، ولكن انخفض إنتاج أنيون فوق الأكسيد بعد مجموعة التحكم (AGEs المحفزة)، ولكن انخفض إنتاج أنيون فوق الأكسيد بعد إنتاج فوق الأكسيد وحمايته. الخلايا من الأضرار التأكسدية. في حالة خلايا LC-540، أظهرت 10 ميكرومتر ECH نشاطًا مشابهًا تقريبًا مع المجموعة الطبيعية. انخفض إنتاج الأكسيد الفائق في كلتا الخليتين مع زيادة تركيز كل من ECH وRES.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. تأثير ECH على إنتاج H2O2 في خلايا LC المحفزة بالعمر -540 خلايا Leydig

تم إجراء اختبار DCFH-DA للكشف عن وجود الأنواع المؤكسدة. بعد دخولها إلى الخلايا، تتأكسد صبغة الفلورسنت DCFH-DA بواسطة H2O2 داخل الخلايا وتشكل ثنائي كلوروفلوريسئين (DCF). كما هو مبين في الشكل 4، كانت هناك زيادة كبيرة في إنتاج H2O2 داخل الخلايا في المجموعة المحفزة بالعمر (التحكم) في حين أن إضافة 10 ميكرومتر ECH وRES قلل بشكل كبير من إنتاج H2O2 في الخلايا. أدت إدارة 10 ميكرومتر ECH إلى حوالي 47.1% فقط من إنتاج H2O2، وهو أقل بكثير مما كان عليه في المجموعة الضابطة.

3.1.5. تأثير ECH على مستويات التعبير البروتيني RAGE وNF-inB في خلايا LC-540 المحفزة بالعمر

تم إجراء تحليل لطخة غربية لتأكيد وجود RAGE في خلايا LC-540 Leydig. تم عرض تأثير ECH على مستويات التعبير البروتيني RAGE (الشكل 5 أ) وNF-κB (الشكل 5 ب) في خلايا Leydig المحفزة بواسطة AGEs في الشكل 5. وأظهرت النتائج أن تركيز 50 ميكروغرام / مل من AGEs تسبب في زيادة RAGE وNF- تعبير κB في خلايا LC-540 Leydig وتركيز 10 ميكرومتر من ECH وRES قلل بشكل كبير من تعبير RAGE وNF-κB. كان التعبير عن NF-inB أقل بكثير في RES وECH مقارنة بمضادات RAGE. لذلك، أكدت النتائج أن ECH خفض مستوى الالتهاب عن طريق خفض مستوى RAGE وNF-κB.

3.1.6. تأثير ECH على مسار تخليق التستوستيرون في خلايا LC -540 المحفزة بالعمر.

تعتمد عملية تكوين الحيوانات المنوية والعقم عند الذكور على وجود هرمون التستوستيرون. كما هو مبين في الشكل 6، فإن تعبيرات بروتينات StAR (الشكل 6 أ) وCYP11A1 (الشكل 6 ب) وCYP17A1 (الشكل 6 ج) وHSD 17 3 (الشكل 6 د) انخفضت بشكل ملحوظ في LC المحفز بالعمر {{11 }} خلايا ليديج (المجموعة الضابطة). تمت زيادة تعبيرات بروتينات StAR وCYP11A1 وCYP17A1 وHSD17 3 بشكل ملحوظ عند إضافة مضاد RAGE وRES وECH. وشوهد التعبير المتزايد عن بروتينات StAR وCYP11A1 في كل من المجموعتين المعالجتين بـ ECH وRES. كان مستوى التعبير عن CYP17A1 مشابهًا تقريبًا في مجموعتي RES وECH. كانت تعبيرات بروتين HSD17 3 في خلايا Leydig المعالجة بـ ECH أعلى بكثير من تلك الموجودة في الخلايا المعالجة بمضادات RES وRAGE. تشير زيادة التعبير عن بروتينات StAR وCYP11A1 وCYP17A1 وHSD17 3 إلى الإنتاج الطبيعي لهرمون التستوستيرون.