استنساخ الجينات والتحديد الوظيفي والتحليل الهيكلي والتعبيري لسينثاز السكروز من Cistanche Tubulosa

خلاصة:يلعب سينسيز السكروز دورًا حاسمًا في مسار استقلاب السكر النباتي عن طريق تحفيز إنتاج الجلوكوز ثنائي فوسفات اليوريدين (UDP)، والذي يعمل بمثابة مانح جليكوزيل نشط حيويًا لعمليات التمثيل الغذائي المختلفة. في هذه الدراسة، تم استنساخ جين سينسيز السكروز المسمى CtSusسيستانش توبولوساوهو دواء صيني تقليدي معروف بغناهمحتوى جليكوسيدات متنوعة، بناءً على نتائج تحليل النسخ. كان إطار القراءة المفتوحة لـ CtSus يبلغ طوله 2 418 bp لترميز 805 من الأحماض الأمينية. كشف تحليل التسلسل عن المجالات المحفوظة المرتبطة بعائلة سينسيز السكروز النباتية في كل من المناطق الطرفية N والمحطة C لبروتين CtSus. أظهر التحليل الوراثي أن CtSus تشترك في علاقة تطورية وثيقة معسينسيز السكروزمن نباتات أخرى ضمن نفس الترتيب. تم إجراء التعرف الوظيفي لـ CtSus من خلال التحفيز التحفيزي للخلية الكاملة مع UGT71BD1، وهو إنزيم ناقل الجليكوزيل المميز. أظهرت النتائج أن إدخال CtSus عزز بشكل كبير معدل تحويل الغليكوزيل المحفز بواسطة UGT71BD1. تم تحقيق التعبير القابل للذوبان لـ CtSus في الإشريكية القولونية بشكل أكبر باستخدام ناقل التعبير pCold™ TF. أشارت المقايسة الأنزيمية في المختبر إلى نشاط CtSus لتحفيز تكوين الجلوكوز UDP في وجود السكروز وUDP. أظهرت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي أن أنماط التعبير لجين CtSus في أجزاء مختلفة من C. tubulosa ومزارع الخلايا المعلقة لـ C. tubulosa تحت ضغط الجفاف ترتبط بأنماط التراكم الملاحظة لجليكوسيدات الفينيل إيثانول، على التوالي. علاوة على ذلك، تم استكشاف الأحماض الأمينية الرئيسية وتفاعلاتها بين الإنزيم والركيزة بناءً على التنبؤ ببنية البروتين ونتائج الالتحام الجزيئي. بشكل عام، تحدد النتائج التي توصلنا إليها سينسيز السكروز CtSus المسؤول عن توريد الجلوكوز المتبرع النشط UDP أثناء التخليق الحيوي لمنتجات الجليكوسيد في C. tubulosa وقد وفرت أيضًا عنصرًا جينيًا يمكن استخدامه في بناء السلالة الهندسية لإنتاج منتجات الجليكوسيد.

الكلمات الرئيسية: سيستانش توبولوسا; سينسيز السكروز. جليكوسيدات. UDP- الجلوكوز. الحفز الأنزيمي

شركة DICHEN CISTANCHE تزرع قواعدها في يوتيان، وهوتان، وشينجيانغ

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (شينك) ر. وايتهو نبات عشبي طفيلي معمر من جنس Cistanche في عائلة Orobanchaceae. إنها مادة طبية صينية تقليدية نادرة وثمينة، موطنها الأصلي شينجيانغ ومنغوليا الداخلية. إنه حلو ومالح ودافئ بطبيعته، وله وظائفتنغيم يانغ الكلى, يفيد الجوهر والدموترطيب الأمعاء وتخفيف الإمساك. ومن المعروف باسم "الجينسنغ الصحراوي"[1] وقد توصلت الأبحاث الحديثة إلى ذلكسيستانش توبولوسايتضمنمجموعة متنوعة من المكونات الكيميائيةمثلجليكوسيدات فينيليثانويد, تربين الأثير القزحيوجليكوسيداتها، والقشور وجليكوسيداتها، واسترات قليلات السكاريد، والسكريات المتعددة، والبوليولات، والسكريات القليلة، والستيرول وجليكوسيداتها، وجليكوسيدات أحادية التربين، والسكريات، والأحماض الأمينية والزيوت الطيارة [2،3]‎وخاصة مركبات الجليكوسيدات تعتبر من أهم المكونات النشطة. من بينها، تحتوي مركبات جليكوسيد الفينيليثانويد على أعلى محتوى في المادة الطبية الأصلية ولها مجموعة واسعة من الأنشطة الدوائية مثل الحماية العصبية ومكافحة الشيخوخة [4]. يتضمن التخليق الحيوي لمركبات الجليكوسيد المذكورة أعلاه خطوات متعددة من تفاعلات الارتباط بالجليكوزيل، والتي يتم تحفيزها بواسطةنقل الجليكوزيل في النباتات، وتوفير الجهات المانحة جليكوزيل النشطةضروري في هذه العملية. تشمل الجهات المانحة الشائعة للسكر النشط في الكائنات الحية ثنائي فوسفات اليوريدين (UDP)، وثنائي فوسفات الثيميدين (TDP)، وثنائي فوسفات الغوانوزين (GDP). من بينها، UDP-glucose هو المتبرع النشط الأكثر شيوعًا بالجليكوزيل في النباتات. لا يمكن التعرف عليه مباشرة بواسطة ناقلة الجلوكوزيل لتحفيز تفاعل نقل الجلوكوزيل فحسب، بل يمكن أيضًا استخدامه كمقدمة للمشاركة في تخليق أنواع أخرى من الجهات المانحة للجليكوزيل. على سبيل المثال، يمكن استخدام UDP-glucose كركيزة لتوليد UDP-rhamnose تحت تحفيز 4،6-ديهيدراتاز، 3،5-إيزوميراز و4-اختزال[5]؛ يمكن استخدام UDP- الجلوكوز كركيزة لتحفيز تخليق UDP-xylose من خلال هيدروجيناز UDP-glucose وسينسيز UDP-xylose؛ يمكن تحفيز UDP-xylose بشكل أكبر بواسطة UDP-xylose epimerase لتوليد UDP-arabinose[6]؛ UDP-glucose و UDP-galactose عبارة عن diastereomers ويمكن تحويلهما إلى بعضهما البعض من خلال Epimerase [7،8]. ولذلك، فإن تخليق UDP- الجلوكوز له تأثير مهم على توريد الجهات المانحة النشطة للجليكوزيل في النباتات وتعديل الغليكوزيل في المستقلبات الثانوية.

يمكن تحقيق تخليق الجلوكوز UDP في النباتات من خلال مسار سينسيز ومسار فسفوريلاز ومسار كيناز. من بينها، يمكن أن يحفز سينسيز السكروز بشكل مباشر التفاعل بين UDP والسكروز لتوليد UDP- الجلوكوز والفركتوز، بالإضافة إلى التفاعل العكسي [9]. بالمعنى الواسع، ينتمي سينسيز السكروز إلى فصيلة ناقلة الجليكوزيل -4 الفرعية، والتي تتضمن مجموعة متنوعة من ناقلات الجليكوزيل، مثل فوسفاتيز تخليق السكروز، وسينسيز تريهالوز، وفسفوريلاز تريهالوز [10]. تم التعرف على سينسيز السكروز لأول مرة في جنين القمح [11]. منذ ذلك الحين، حدد الباحثون مئات من جينات سينسيز السكروز من مجموعة متنوعة من النباتات مثل فول المونج (Vigna radiata)، والأرز (Oryza sativa)، والذرة (Zea mays)، وفول الصويا (Glycine max)، والخوخ (Amygdalus persica). إنهم يشاركون في عمليات التمثيل الغذائي المتعددة في النباتات، بما في ذلك نقل السكروز وتوزيعه، وتخليق النشا، وتخليق السليلوز وتكوين جدار الخلية، والإجهاد الحيوي وغير الحيوي، وما إلى ذلك، ويلعبون دورًا تنظيميًا رئيسيًا في تخصيص مصدر الكربون النباتي [12]. بالإضافة إلى ذلك، واستنادًا إلى دراسة الوظائف الفسيولوجية، استخدم الباحثون أيضًا سينسيز السكروز الذي تم الحصول عليه كعنصر جيني للتخليق الأنزيمي لمركبات الجليكوسيدات، وحققوا نتائج مثالية. على سبيل المثال، مسعدة وآخرون. [13] شارك في التعبير عن جين سينسيز السكروز AtSus-1 من نبات أرابيدوبسيس ثاليانا وجين ناقلة الغليكوزيل CaUGT2 من كاثارانثوس روزيوس في المختبر، واستخدم نظام إنزيم مزدوج أحادي الوعاء لتحفيز تفاعل الغليكوزيل في الكركمين، مما أدى إلى زيادة العائد من جليكوسيد الكركمين بنسبة 7 مرات. وفي الوقت نفسه، كانت كمية المتبرع بالجلوكوز UDP المستخدمة عُشر الكمية الأولية فقط.

بونجاروانج وآخرون. [14] قام ببناء نظام حفاز مقترن باستخدام سينسيز السكروز GmSuSy من فول الصويا وناقل الجليكوسيل OsUGT من الأرز. لقد حققوا تعديل الغليكوزيل للنوثوفاجين عن طريق إضافة كمية صغيرة فقط من UDP (1.0 مليمول·L-1) والسكروز. بالمقارنة مع التحفيز الإنزيمي الفردي لـ OsUGT، زاد إنتاج منتجات الغليكوزيل بثلاثة أوامر من حيث الحجم، من μmol·L-1 إلى mol·L-1.

يشير ثراء وتنوع مركبات الجليكوسيد في Cistanche tubulosa إلى أنها يجب أن تحتوي على سينسيز سكروز قوي يتعلق بتعديل الغليكوزيل في المستقلبات الثانوية، ولكن لم يتم الإبلاغ عن هذا الإنزيم في نباتات جنس Cistanche. في هذه الورقة، تم استخدام Cistanche tubulosa، وهي مادة طبية مدرجة في دستور الأدوية، كمادة. من خلال تحليل النسخ والتحليل المقارن للأجزاء المختلفة، تم استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية لاستخراج وتحديد جين سينسيز السكروز CtSus. تم إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية، والتحول الحيوي للخلية بأكملها، والتعبير والتنقية بدائية النواة، وتحليل النشاط التحفيزي للإنزيم في المختبر، وتحليل التعبير الجيني في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa وأنظمة زراعة الأنسجة النباتية تحت ضغط الجفاف لاستكشاف وظيفة CtSus وارتباطها مع التخليق الحيوي لمركبات الجليكوسيد في Cistanche tubulosa، مما يضع الأساس لدراسة مسار التخليق الحيوي لمركبات الجليكوسيد في Cistanche tubulosa.

المواد والأساليب

المواد تم جمع نباتات Cistanche tubulosa الطازجة من مدينة Hotan، في شينجيانغ، الصين، وتم إجراء التعرف البيولوجي بواسطة البروفيسور Tu Pengfei من جامعة بكين؛ تم إنشاء نظام زراعة الخلايا المعلقة Cistanche tubulosa بواسطة مجموعتنا البحثية في المرحلة المبكرة [15]؛ تم شراء E. coliFast-T1 من شركة Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.؛ تم شراء E. coli BL21 (DE3) من شركة Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.؛ تم شراء ناقلات pCold™ I وpCold™ TF من شركة Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.؛ تم شراء التحكم في الجلوكوز UDP من شركة Xi'an Qiyue Biotechnology Co., Ltd.، وتم شراء ركائز الإسكولين والريسفيراترول من شركة Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

تعمل شركة DICHEN CISTANCHE على إنشاء قواعد في هوتان بإقليم شينجيانغ

تم استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) وتوليف [كدنا] (RNA) وفقًا لتعليمات OMEGA RNA Plant Kit (Cat R 6827-01، Omega Bio-Tek). تم استخدام الترحيل الكهربي لهلام الاغاروز ومقياس الطيف الضوئي Nanodrop 2000 للكشف عن نقاء وتركيز وسلامة الحمض النووي الريبي (RNA). تم نسخ عينات الحمض النووي الريبي (RNA) المؤهلة بشكل عكسي باستخدام مجموعة النسخ العكسي TransScript® OneStep gDNA Removal وcDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02، Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) لتجميع السلسلة الأولى من cDNA.

تعدين جينات سينسيز السكروز واستنساخ جينات CtSus تم استخدام تسلسل الأحماض الأمينية لمركب Arabidopsis thaliana sucrose Synthase AtSus1 المحدد وظيفيًا (رقم وصول GenBank: AED92894.1)[16] كقالب. تم فحص جينات سينسيز السكروز من بيانات النسخ لـ C. tubulosa عن طريق محاذاة تسلسل Blastp المحلي، جنبًا إلى جنب مع شرح الجين النسخي، وتحليل FPKM (وفرة التعبير الجيني) وتحليل بيانات النسخ المقارن. تم تصميم الاشعال المحددة بناءً على معلومات تسلسل الجينات المرشحة المقدمة من بيانات نسخة الجيل الثاني من C. tubulosa (الجدول 1). تم استخدام C. tubulosa [كدنا] كقالب وتم إجراء تضخيم PCR للجين المستهدف باستخدام إنزيم PCR عالي الدقة (Cat P 505- d1، Nanjing Novozymes Biotech Co.، Ltd.). تمت تنقية منتج تضخيم PCR باستخدام FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Cat DC 201-01، Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) ثم تم استنساخه وفقًا لمجموعة الاستنساخ السريع (Cat C 112-01، Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) مع ناقل الاستنساخ pCE2 TA / Blunt-Zero وفقًا لتعليمات التشغيل، وتم نقله إلى خلايا Fast-T1 المختصة، وتم تربيته طوال الليل عند 37 درجة. تم استخراج البلازميد وتقديمه إلى شركة Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. لتحديد التسلسل.

الجدول 1: تسلسل النيوكليوتيدات من الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة. qPCR: تفاعل البوليميرازين الكمي في الوقت الحقيقي

تحليل المعلوماتية الحيوية لسينثاز السكروز CtSus من Cistanche tubulosa

تم استخدام البرنامج عبر الإنترنت ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) لتحليل الخواص الفيزيائية والكيميائية للبروتين؛ تم استخدام البرنامج عبر الإنترنت TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) للتنبؤ ببنية الغشاء للبروتين؛ تم استخدام برنامج SOPMA عبر الإنترنت (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) من أجل التنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين. تم استخدام البرنامج عبر الإنترنت SMART (http://smart.embl.de/) للتنبؤ بالمجال المحفوظ لتسلسل الأحماض الأمينية للبروتين؛ تم استخدام برنامج DANMAN لمقارنة تسلسلات الأحماض الأمينية لـ CtSus مع تلك الخاصة بمركبات السكروز من الأنواع الأخرى؛ تم إنشاء شجرة النشوء والتطور من خلال التحليل العنقودي باستخدام طريقة ربط الجوار باستخدام البرنامج MEGA11، مع تكرار التمهيد بمقدار 1,000 مرة.

تحليل تعبير CtSus في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa وتحت ضغط الجفاف

تم تصميم بادئات PCR الكمية الفلورية في الوقت الحقيقي لـ CtSus والجين المرجعي الداخلي DNAj باستخدام برنامج DNAMAN [17] (الجدول 1). تم تحليل مستوى التعبير النسبي لجين CtSus في الخلايا المعلقة لـ Cistanche tubulosa في أجزاء مختلفة من Cistanche tubulosa وتحت ضغط الجفاف بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم إجراء تحليل PCR الكمي للفلورة في الوقت الحقيقي باستخدام مجموعة TransStart® Top Green qPCR SuperMix (Cat AQ 131-01، Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). اعتمد برنامج التضخيم طريقة من خطوتين: 94 درجة لمدة 30 ثانية؛ 94 درجة لمدة 5 ثوان، 60 درجة لمدة 30 ثانية، تتكرر لمدة 40 دورة؛ تم تشغيله على نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي Bio-Rad CFX Connect ™ (مختبر Bio-Rad، هرقل، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام طريقة 2–ΔΔCT لتحليل التعبير النسبي لجين CtSus في مجموعات تجريبية مختلفة. تم استخدام GraphPadPrism 9 لتحليل الأهمية ورسم رسم بياني شريطي.

بناء ناقلات التعبير بدائية النواة والتعبير غير المتجانس لجين CtSus بناءً على نتائج تسلسل الجينات، تم تصميم بادئات محددة تحتوي على أذرع تماثل المتجهات ومواقع التقييد (الجدول 1) لتضخيم PCR. تم إنشاء الجين المستهدف CtSus في متجهات التعبير pET-28a وpET-24b وpCold™ I وpCold™ TF باستخدام تقنية الاستنساخ السلس باستخدام ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01 ، نانجينغ نوفوجين للتكنولوجيا الحيوية المحدودة). تم استخراج البلازميدات الخاصة بنواقل التعبير المؤتلف التي تم إنشاؤها بنجاح وتحويلها إلى خلية Transetta المختصة بالتعبير عن الإشريكية القولونية (DE3). تم استزراع الخلايا في وسط سائل LB يحتوي على 50 ميكروغرام·مل-1 كبريتات كاناميسين (مع pET-28a وpET-24b كمتجهات تعبير) أو 1{{ 22}}0 ميكروجرام·مل-1 أمبيسلين (مع pCold™ I وpCold™ TF كمتجهات تعبير) و50 ميكروجرام·مل-1 كلورامفينيكول، على التوالي، عند 37 درجة و200 دورة · دقيقة{{ 15}} مع الرج حتى تصل قيمة A600 للمحلول البكتيري إلى 0.4-0.6. أضف الأيزوبروبيل-بيتا-دثيوجالاكتوبرانوسيد (IPTG) بتركيز نهائي قدره 0.5 مليمول · لتر -1 للحث على التعبير البروتيني. احتضان في شاكر درجة حرارة ثابتة عند 23 درجة (مع pET-28a وpET-24b كمتجهات تعبير) أو 15 درجة (مع pCold™ I وpCold™ TF كمتجهات تعبير)، 180 دورة· دقيقة-1 لمدة 16 ساعة (مع pET28a وpET-24b كمتجهات تعبير) أو 24 ساعة (مع pCold™ I وpCold™ TF كمتجهات تعبير)، ثم اجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي.

المخزن المؤقت للتحلل (20 مليمول·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0.5 mol·L-1 كلوريد الصوديوم، 20 مليمول·L{{10} } تمت إضافة إيميدازول، 3% جلسرين، 100 مليمول · لتر -1 فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل، 1 مجم · مل -1 ليسوزيم، الرقم الهيدروجيني 7.4)، وتم تكسير الخلايا لمدة 8 دقائق وطردها مركزيًا. تم أخذ الطاف والراسب على التوالي. تم امتصاص الطاف بواسطة عمود تقارب HisTrap FF (Cat 17531901، Cytiva) المملوء بحشو Ni Sepharose 6 Fast Flow لامتصاص البروتين المستهدف الذي يحتوي على علامته. بعد الشطف بتركيزات مختلفة من الإيميدازول، تم أخذ كل جزء للكشف عن SDS-PAGE (الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم). تم تجميع الأجزاء التي تحتوي على البروتين المستهدف، وتركيزها بالطرد المركزي وتحليتها بواسطة أنبوب الترشيح الفائق (ميليبور)، وتخزينها في المخزن المؤقت [يحتوي على 50 مللي مول · لتر -1 تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 0.2 مول · لتر {{ 30}}NaCl، 1 ملي مول · لتر -1 ديثيوثريتول، 3% جلسرين] لتفاعلات التحفيز الأنزيمي اللاحقة في المختبر.

CtSus تحفيز الخلية الكاملة تم تحويل بلازميد pCold™ I-CtSus والتعبير البلازميد pET-28a-UGT71BD1[18] الخاص بناقل الجليكوزيل UGT71BD1، والذي تم تحديده من قبل مجموعة البحث سابقًا، في وقت واحد إلى التعبير المختص. الإشريكية القولونية ترانسيتا (DE3). تم اختيار البكتيريا المؤتلفة الإيجابية التي تحتوي على كل من جينات CtSus وUGT71BD1 وتلقيحها في وسط LB (وسط النمو) الذي يحتوي على 50 ميكروغرام·مل-1 كبريتات كاناميسين، 100 ميكروغرام ·مل-1 أمبيسلين و50 ميكروجرام·مل-1 كلورامفينيكول بنسبة 1:100 (V/V). تمت زراعة المزرعة عند 37 درجة حتى أصبحت قيمة A600 للمحلول البكتيري 0.4-0.6، ثم تمت إضافة IPTG بتركيز نهائي قدره 1 مليمول · لتر -1. استمرت الثقافة عند 15 درجة و180 دورة · دقيقة -1 لمدة 24 ساعة. تم الطرد المركزي للثقافة عند 4 درجة و 4 000 r·min-1. جمع الخلايا. قم بتطعيم الخلايا المجمعة في وسط M9 (وسط التخمير) بنسبة 40 مل من وسط الاستنبات لكل جرام من البكتيريا، وأضف 75 ميكرومول · لتر -1 سكروز و 25 ميكرومول · لتر -1 إيسكوليتين (1) أو ركائز ريسفيراترول (2) لمجموعات التفاعل. مواصلة اهتزاز الثقافة لمدة 24 ساعة، الطرد المركزي عند 4000 × جم، 4 درجة لمدة 30 دقيقة، إضافة الميثانول لكسر الراسب بالموجات فوق الصوتية، إضافة 2 أضعاف حجم الميثانول إلى طاف، الطرد المركزي عند 4000 × جم، 4 درجة لمدة 30 دقيقة، خذ المادة الطافية واجمعها، وتبخر المذيب تحت ضغط منخفض، وأعد الذوبان في الميثانول، وقم بالتصفية من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر، واكتشف منتج التفاعل باستخدام كروماتوجرافيا سائل عالي الأداء Agilent 1260. تم استخدام CAPCELL PAK C18 COLUMN (250 مم × 4.6 مم، 5 ميكرومتر) كعمود تحليلي، وتم استخدام 0.1٪ من ماء حمض الفورميك (A) والميثانول (B) كمرحلة متنقلة، وكان تدرج الشطف: {{61 }} دقيقة، 30%-90% ب؛ 25-27 دقيقة، 90%-100% ب؛ 27-33 دقيقة، 100% B. كانت معلمات قياس الطيف الكتلي هي أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة، والمسح الكامل التلقائي متعدد المراحل MS1 وMS2 وMS3.

الكشف عن CtSus في النشاط التحفيزي للإنزيم المختبري تعرض البروتين المؤتلف الذي تم الحصول عليه بواسطة تحليل كروماتوجرافيا تقارب العمود HisTrap FF المذكور أعلاه لإزالة العلامة الطرفية باستخدام العامل Xa. كان نظام هضم الإنزيم كما يلي: تم ضبط البروتين المؤتلف إلى تركيز 1 مجم · مل -1، وتم إضافة 1 ميكرولتر من العامل Xa إلى 50 ميكرولتر من البروتين المؤتلف في محلول مؤقت من 20 مليمول · لتر -1 تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 100 مليمول · لتر -1 كلوريد الصوديوم، و2 مليمول · لتر -1

CaCl2 عند 23 درجة لمدة 6 ساعات. كان نظام التفاعل 100 ميكرولتر. تم إخضاع منتج نظام هضم الإنزيم لفصل البروتين الثانوي بواسطة تحليل كروماتوجرافي تقارب HisTrap FF للحصول على البروتين المستهدف مع إزالة العلامة من أجل تفاعلات تحفيز الإنزيمات اللاحقة في المختبر. كان نظام التفاعل الإنزيمي كما يلي: 10mmol·L-1 UDP، 100 mmol·L-1 سكروز، 50 mmol·L-1 MgCl2، 60 ميكروغرام من بروتين CtSus، Tris-HCl (pH) (الشكل 7.0) مكمل إلى 100 ميكرولتر، وتفاعل في حمام مائي عند 30 درجة لمدة 6 ساعات، وتم تنفيذ طرق ما بعد المعالجة وتحليل HPLC كما هو موضح في المرجع [19].

تم استخدام التنبؤ بالبنية ثلاثية الأبعاد وتحليل الالتحام الجزيئي لبروتين CtSus AlphaFold2 للتنبؤ بالبنية ثلاثية الأبعاد لبروتين CtSus [20]. تمت هدرجة جزيء الليجند وشحنه باستخدام برنامج AutoDock Tools 1.5.6. تم الحصول على جيب ربط الركيزة عن طريق المواءمة مع بروتين القالب AtSus1 (PDBID 3S28). تم ضبط السلاسل الجانبية لبقايا الأحماض الأمينية حول التجويف لتكون مرنة.

تم ضبط مربع الشبكة على 40 × 40 × 40 Å3، وكان تباعد الشبكة 0.375 Å. تم إجراء الالتحام الجزيئي في AutoDock Vina [21]. تم استخدام برنامج PyMOL 2.0 لتصور النموذج بأفضل تقارب (kcat·mol-1)

).

التحليل الإحصائي تم استخدام GraphPad Prism 9 للتحليل الإحصائي. تم التعبير عن البيانات التجريبية على أنها الانحراف المعياري المتوسط. تم استخدام اختبار t للمقارنة بين مجموعتين، وتم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه للمقارنة بين مجموعات متعددة. واعتبر الفرق ذا دلالة إحصائية عندما يكون P < 0.05.