المكونات الفعالة للسيستانش: طريقة فصل وتنقية جليكوسيدات فينيليثانويد

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com

عزل وتنقية جليكوسيدات فينيليثانويد من Cistanche Deserticola بواسطة كروماتوغرافيا عالية السرعة للتيار المعاكس

Li a، b، Rong Tsao b، *، Raymond Yang b، Chunming Liu a،

كريستوفر يونغ ب هونغهوي تشو ب

قسم الكيمياء ، جامعة تشانغتشون العادية ، تشانغتشون 130032 ، الصين

ب مركز غويلف لبحوث الأغذية ، الزراعة والأغذية الزراعية ، كندا ، 93 ستون رود ويست ، جيلف ، أونتاريو ، كندا N1G 5C9

وردت في 31 أيار / مايو 2007 ؛ وردت بصيغة منقحة في 16 أكتوبر / تشرين الأول 2007 ؛ قبلت في 29 أكتوبر 2007

الملخص:

خمسةجليكوسيدات فينيلثانويد(فغس) ،إشنكوسايدو cistanoside A و acteoside و isoacteoside و 20- acetylacteoside ، تم عزلها وتنقيتها منCistanche Deserticolaللمرة الأولى بواسطة كروماتوغرافيا عالية السرعة للتيار المعاكس (HSCCC) باستخدام نظامين ثنائي الطور ، أحدهما يتكون من أسيتات الإيثيل - إيثانول - ماء (5: 0. 5: 4.5 ، ت / ت / ت) وآخر من إيثيل أسيتات - ن - بيوتانول - إيثانول - ماء ({{1 0}}. 5: 0. 5: 0.1: 1 ، v / v / v / v). ما مجموعه 28.5 ملغ من إشنكوسايد ، 18.4 ملغسيستانوسيد أ، 14.6 مجمأكتيوسيد، تمت تنقية 30.1 مجم من isoacteoside و 25.2 مجم من 20- acetylacteoside من 1412 mg من مستخلص n- بيوتانول منCistanche Deserticola، كل منها بنقاوة تزيد عن 92.5 بالمائة كما هو محدد بواسطة HPLC. تم تحديد الهياكل من خلال وقت الاحتفاظ بها ، UV ، LC-ESI-MS في وضع الأيونات السالبة ، وتم تأكيدها من خلال تجارب الرنين المغناطيسي النووي. تمت مناقشة نمط تجزئة LC-ESI-MSn المميز للمركبات الخمسة ، ووجد أنه أداة محددة ومفيدة للغاية للتعرف الهيكلي للـ PhGs من هذا النبات الطبي المهم.

Crown حقوق النشر © 2007 تم النشر بواسطة Elsevier Ltd. جميع الحقوق محفوظة.

الكلمات الدالة:Cistanche Deserticola؛ فينيلثانويد.إشيناكوسايد؛ سيستانوسيد أ ؛أكتوسيد؛ إيزوكتيوسيد. 20- Acetylacteoside ؛ HSCCC ؛ LC – ESI-MS ؛ الرنين المغناطيسي النووي

1 المقدمة

Cistanche DeserticolaYC Ma هو دواء عشبي صيني معروف وقد استخدم على نطاق واسع في المستحضرات التقليدية المشابهة للمكونات الغذائية الوظيفية أو المكملات الغذائية اليوم (Wong، Li، Cheng، & Chen، 2006). المكونات النشطة بيولوجيًا الرئيسية في C. deserticola هيفينيليثانويدجليكوسيدات (PhGs) ، بما في ذلكإشنكوسايدو acteoside و isoacteoside و 20- acetylacteoside وسيستانوسيد أ(كوباياشي ، كاراساوا ، ومياسي ، 1984 ؛ كوباياشي وآخرون ، 1987). يتم توزيع PhGs على نطاق واسع في المملكة النباتية وقد تمت دراستها على نطاق واسع لوظائفها البيولوجية المختلفة مثل Hepoprotective (Xiong وآخرون ، 1998) ، ومضاد التكاثر ، ونشاط مضاد للألم (Schapoval et al. ، 1998) ، والأنشطة المضادة للأكسدة (Cheng). ، Wei، Guo، Ni، & Liu، 2005؛ He، Lau، Xu، Li، & But، 2000؛ Li، Wang، & Wang، 1997؛ Li، Wang، Zheng، Liu، & Jia، 1993؛ Wang، Jiang ، Wu، & Wang، 2001؛ Xiong، Kadota، Tani، & Namba، 1996) ، تحسين الوظيفة الجنسية (Xie & Wu، 1993؛ Zong، He، Wu، & Chen، 1996) ، والتأثير المهدئ (Lu، 1998) .

بسبب الأنشطة الحيوية الهامة المذكورة أعلاه ، هناك حاجة ماسة إلى كميات كبيرة من المركبات النقية كمعايير مرجعية وللدراسات المختلفة في المختبر وفي الجسم الحي المتعلقة باستخدام الأدوية الصينية التقليدية. لذلك أصبحت الطرق الفعالة للعزل والتنقية والتوصيف الهيكلي للـ PhGs ضرورية. ومع ذلك ، يتطلب هذا العمل عادةً استخدام خطوات لونية متعددة الرسوم البيانية لتنظيف العينة وعزلها (Gross، Lahloub، Anklin، Schulten، & Sticher، 1988؛ Nishimura، Sasaki، Inagaki، Chin، Mitsuhashi، 1991؛ Ravn، Nishibe ، Sasahara، & Li، 1990؛ Shoyama، Matsumoto، & Nishioka، 1987) ، والتي عادة ما تؤدي إلى معدلات استرداد منخفضة بسبب الامتزازات التي لا رجعة فيها لـ PhGs على الدعامة الصلبة أثناء الفصل (Lei et al. ، 2001). في المقابل ، أصبح التحليل اللوني للتيار المعاكس عالي السرعة (HSCCC) بديلاً فعالاً لتقنيات الكروماتوغرافيا التقليدية لفصل بعض مواد الدكتوراة عن المستخلصات النباتية (Lei et al.، 2001؛ Li et al.، 2005). لي وآخرون. فصل بنجاحأكتيوسيدو 20- acetylacteoside من Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck باستخدام HSCCC (Lei et al.، 2001). أبلغ مؤلفو هذه الورقة سابقًا عن فصلأكتيوسيدو isoacteoside من Plantago psyllium L. بواسطة HSCCC (Li et al. ، 2005). ومع ذلك ، لم يتم نشر أي تقرير عن فصل وتنقية العديد من PhGs منCistanche Deserticolaباستخدام HSCCC. نظرًا لنقص المعايير ، تم تطوير طرق LC-MS واستخدامها كأداة تحليلية قوية للتوصيف السريع والتعرف على بعض PhGs في مستخلص النبات (Li et al. ، 2005 ؛ Wang et al. ، 2000).

في هذه الورقة ، أبلغنا عن طريقة HSCCC التي تم تطويرها لإعداد إشيناكوسيد ،سيستانوسيد أو acteoside و isoacteoside و 20- acetylacteoside منCistanche Deserticola. تم تحقيق توصيف وتحليل phgs المنفصلة عن طريق استخدام LC إلى جانب قياس الطيف الكتلي ESI في الخط وتجارب الرنين المغناطيسي النووي. يتم تقديم ومناقشة زمن الاستبقاء والوزن الجزيئي وأيونات الشظايا المميزة لخمس PHGs ومناقشتها في هذه الورقة. تظهر في الشكل 1 تراكيب مجموعات PhGs الخمسة المحددة في هذا التحقيق.

إشنكوسايدفي cistanche

2. التجريبية

2.1. المواد الكيميائية والكواشف

أكتوسيدتم شراؤه من Sigma – Aldrich (Oak- Ville ، ON) ، تم شراء echinacoside من ChromaDex (سانتا آنا ، كاليفورنيا). تم عزل Isoacteoside من P. psyllium L. (Li et al. ، 2005).Cistanche Deserticolaتم شراؤه من متجر Beijing TongRenTang Medicinal Store (الصين). كانت جميع المذيبات من فئة HPLC وتم شراؤها من Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown ، ON).

2.2. إعداد عينة

Cistanche Deserticolaتم استخراج (20 جم) خمس مرات عند درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة لكل منها 100 مل من 80 بالمائة من الإيثانول المائي. في كل مرة يتم ترشيح خليط الاستخلاص من خلال ورق Whatman رقم 1 لتر (Whatman International Ltd. ، ميدستون ، إنجلترا). تم تركيز لتر المركب إلى 100 مل في وسط مفرغ عند <40 درجة.="" تمت="" إزالة="" الدهن="" من="" المحلول="" المائي="" الناتج="" مرتين="" ،="" كل="" منهما="" 100="" مل="" من="" الهكسان="" ،="" ثم="" تم="" استخلاصها="" على="" التوالي="" لمدة="" 5="" مرات="" ،="" كل="" منها="" 100="" مل="" من="" البيوتانول.="" تم="" دمج="" طبقات="" n-="" بيوتانول="" وتركيزها="" حتى="" تجف="" في="" وسط="" مفرغ="" عند="" أقل="" من="" 40="" درجة="" ،="" مما="" أدى="" إلى="" 2.2="" جم="" من="" مستخلص="" n-="" بيوتانول.="" تم="" تخزين="" المستخلص="" عند="" درجة="" -20="" قبل="" فصل="">

2.3 إجراء فصل HSCCC

تم تنفيذ HSCCC التحضيري في نموذج كروماتوجرافي عالي السرعة للتيار المعاكس CCC {0} (Pharma-Tech Research، Baltimore، Maryland USA). يحتوي هذا الجهاز على ثلاثة ملفات تحضيرية ، متصلة في سلسلة (الحجم الإجمالي ، 325 مل). يمكن تنظيم سرعة دوران الجهاز بين 0 و 2000 دورة في الدقيقة. تم تجهيز نظام HSCCC بمضخة HPLC (Pharma-Tech Research ، بالتيمور ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، كاشف للأشعة فوق البنفسجية موديل 450 (Alltech ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مسجل L 120 E في السرير (Linseis Inc. ، Princeton Jct ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ومجمع الكسور (Advantec MFS Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية) وصمام حقن العينة مع حلقة عينة 10- مل.

تم رج خليط من أسيتات إيثيل - إيثانول - ماء (5: 0. 5: 4.5 ، حجم / حجم / حجم) بقوة في قمع فاصل واتركه يقف ويفصل عند درجة حرارة الغرفة. تم استخدام المرحلتين في HSCCC بعد أن وصلت إلى التوازن. كان العمود الملفوف بأكمله مملوءًا أولاً بالطبقة العليا ، والتي تعمل كمرحلة ثابتة. تم بعد ذلك ضخ الطبقة السفلية (الطور المتحرك) في نهاية رأس العمود بمعدل تدفق يبلغ 1.5 مل / دقيقة. تم ضبط سرعة الدوران على 1 0 5 0 دورة في الدقيقة. عينة (حوالي 230 مجم في كل مرة) مذابة في 8 مل من خليط إيثيل أسيتات - إيثانول - ماء (5: 0.5: 4.5 ، حجم / حجم / حجم) تم تحميلها في صمام الحقن بعد وصول النظام الهيدروديناميكي حالة توازن. تم اختيار نظام المذيبات ثنائي الطور هذا بناءً على عامل التقسيم (K) ، والذي كان 0.87 ، 1.11 ، و 1.32 لـأكتيوسيدو isoacteoside و 20 acetylacteoside على التوالي. كانت قيمة K هي نسبة التركيزات في الطبقتين العلوية والسفلية لنفس المركب كما تم تحديده بواسطة HPLC (الشكل 2). تمت مراقبة الفعالية من مخرج العمود بشكل مستمر بواسطة كاشف الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر وتم جمعها في أنابيب اختبار مع تجميع مجمع الكسر عند 4 دقائق لكل أنبوب.

2.4 شروط LC

تم استخدام جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي الثابت وكاشف صفيف الصمام الثنائي (DAD) لتحليل درجات الدكتوراة في مستخلص n- بيوتانول منCistanche Deserticolaوالكسور التي تم جمعها من فصل HSCCC. تم إجراء الفصل في عمود Phenomenex ODS-C18 (250 × 4.6 مم ، 5 لومن) بعمود حماية C18. يتكون الطور الثنائي المتحرك من الأسيتونيتريل (المذيب أ) والماء المحتوي على 2 في المائة من حمض الأسيتيك (المذيب ب). تم ترشيح جميع المذيبات من خلال أ

{0}. 45 ل.متر قبل الاستخدام. ظل معدل التدفق ثابتًا عند 1. 0 مل / دقيقة لإجمالي وقت تشغيل يبلغ 25 دقيقة. تم تشغيل النظام باستخدام برنامج التدرج اللوني: 0 - 2 0 min: 90٪ B to 60٪ B؛ 20-22 دقيقة: 60 بالمائة ب إلى 0 بالمائة ب ؛ و 22-25 دقيقة ، 0 بالمائة ب إلى 90 بالمائة ب. كان حجم حقن العينة 10 لتر. تم رصد قمم الاهتمام عند 320 نانومتر بواسطة كاشف DAD.

2.5 تجارب LC-ESI-MS

تم إجراء تجارب LC-MS باستخدام مطياف كتلة مصيدة الأيونات Finnigan LCQ DECA (Thermo Finnigan ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) المجهز بمصدر تأين بالرش الكهربائي (ESI). تم تحليل العينات بنفس الحالة الكروماتوجرافية. تم استخدام نموذج سلبي لجمع البيانات. تم ضبط معدلات غاز الغمد ومعدلات التدفق الإضافية عند 96 و 7 (وحدة عشوائية) ، على التوالي. تم ضبط الجهد الشعري عند 29 فولت وتم التحكم في درجة حرارته عند 350 درجة. تم ضبط جهد عدسة المدخل عند 40 فولت وتم ضبط سعة RF متعددة الأقطاب عند 540 فولت. تم التحكم في جهد إبرة ESI عند 4.5 كيلو فولت. كانت مجموعة العدسة الأنبوبية 16 فولت ، وكانت مجموعة العدسة متعددة الأقطاب 1 درجة 8.20 فولت وكانت مجموعة العدسة متعددة الأقطاب 2 o 10.5 فولت. تم ضبط جهد مضاعف الإلكترون على 980 فولت للكشف عن الأيونات.

2.6. الرنين المغناطيسي النووي لتحديد الهوية

تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي على مطياف Bruker Avance -600 (Bruker BioSpin Ltd. ، ميلتون ، كندا). تم إخضاع المركبين 2 و 5 فقط (لا توجد معايير متوفرة) لتجارب الرنين المغناطيسي النووي. تم إذابة العينات في CD3OD.

3. النتائج والمناقشة

3.1. فصل HSCCC

مستخلص n- بيوتانولCistanche Deserticolaتم تحليل الكسور المقابلة لكل ذروة معزولة بواسطة HSCCC بواسطة HPLC ، وتم إعطاء النتائج في الشكل 2. تم فصل خمسة مركبات رئيسية (قمم 1-5) واكتشافها مع أوقات الاحتفاظ عند 9.2 دقيقة ، 10.7 دقيقة ، 12.3 دقيقة و

13.3 دقيقة و 16.2 دقيقة على التوالي.

يعتمد فصل HSCCC الناجح إلى حد كبير على نظام مذيب مناسب من مرحلتين يوفر معامل تقسيم مثالي (K) حول 1 للمركب المطلوب. يجب أن ينتج عن مثل هذا النظام ثنائي الطور أيضًا وقت استقرار قصير إلى حد معقول (Chen، Games، & Jones، 2003؛ Foucault & Chevolot، 1998؛ Oka، Oka، & Ito، 1991). في تجربتنا ، اخترنا أربع سلاسل من أنظمة المذيبات وفقًا لقابلية ذوبان المركبات المستهدفة فيCistanche Deserticola. تم استخدام HPLC لقياس التركيز في كل مرحلة ، والتي من خلالها تم حساب قيم K للمركبات المستهدفة. نظامان ، إيثيل أسيتات - ن - بيوتانول - إيثانول - ماء (4: 0. 6: 0. 6: 5، v / v / v / v) وإيثيل أسيتات - ماء (1: 1 ، v / v) ، تم استخدامه سابقًا في HSCCC للفصلأكتيوسيدو 20- acetylacteoside fromC. الصلصاأكتيوسيد، و isoacteoside من P. Psyllium ، على التوالي (Lei et al. ، 2001 ؛ Li et al. ، 2005). على الرغم من أن النظام الأول كان له وقت استقرار قصير نسبيًا ، إلا أنه كان لديه أداء ضعيف في فصل PhGsCistanche Deserticola، بسبب قيم K المنخفضة للمركبين 1 و 2 ، وقيم K العالية للمركبات 3-5. كانت قيم K منخفضة جدًا للمركبات 1-4 في النظام الثاني ، ولكنها عالية جدًا للمركب 5 (الجدول 1). نظام معدل يحتوي على أسيتات إيثيل - إيثانول - ماء (5: {{1 {16}}}}. 5: 4.5 ، حجم / حجم / حجم) ، أعطى قيمة K مثالية للمركبات 3-5 عند 0.87 ، 1.11 ، و 1.32 ، على التوالي ، وأسفرت عن فصل جيد لهذه المركبات الثلاثة (الشكل 3 أ و ب). هذا النظام ، ومع ذلك ، أنتج

قيمة K صغيرة جدًا للمركبين 1 و 2 ، مما يتسبب في أن المركبين يشتركان في التصفية بالقرب من مقدمة المذيب (الكسر 1 في الشكل 3 أ). تعديل إضافي للنظام (إيثيل أسيتات - ن - بيوتانول - إيثانول - ماء (0. 5: 0. 5: 0. 1: 1، v / v / v / ت) رفعت قيم K للمركب 1 و 2 إلى 0. 52 و 0. 92 ، على التوالي ، وأدت إلى الفصل الكامل (الشكل 3 ج). يوضح الشكل 3 أ فصل HSCCC لـ a عينة تحتوي على 230 ملغ من خلاصة n- بيوتانولCistanche Deserticolaباستخدام إيثيل أسيتات - إيثانول - ماء (5: 0. 5: 4.5 ، حجم / حجم / حجم). تم تجميع الكسور التي تم ضبطها بواسطة HPLC لاحتواء المركبات 3 أو 4 أو 5 فقط بشكل منفصل ، وتم تجميع الأجزاء التي تحتوي على المركبات 3 و 4 وتجفيفها بالتجميد وإعادة تعريضها لـ HSCCC لمزيد من الفصل (الشكل 3 ب). أنتج فصل HSCCC المكون من خطوتين الموصوف أعلاه إجمالي 14.6 مجم ، 3 0. 1 مجم ، و 25.2 مجم من المركبات 3-5 من 1412 مجم من مستخلص البيوتانول. يوضح الشكل 3 ج فصل HSCCC لعينة تحتوي على مركبين 1 و 2 (الجزء 1 في الفصل الأول) باستخدام إيثيل أسيتات - ن - بيوتانول - إيثانول - ماء (0. 5: 0 .5 : 0.1: 1 ، v / v / v / v). تم الحصول على ما مجموعه 28.5 و 18.4 مجم من المركبات 1 و 2. كانت النقاء الكروماتوغرافي للمركبات المجففة بالتجميد 1-5 أكثر من 92.5 بالمائة ، والتي استخدمت مباشرة لتحليلات LC-ESI-MS و NMR.

3.2 التعريف الهيكلي بواسطة LC-ESI-MS و NMR

تم تحقيق التحديد المبدئي للمركبات 1 و 3 و 4 من خلال أوقات الاحتفاظ المتطابقة والبيانات الطيفية للأشعة فوق البنفسجية مع تلك الموجودة في إشنكوسايد الأصيل ،أكتيوسيد، و isoacteoside (الشكل 2). كانت المركبات 2 و 5 غير معروفة ، ومع ذلك ، كانت أطياف الأشعة فوق البنفسجية لجميع المركبات الخمسة متشابهة للغاية ، مما يشير إلى سمات هيكلية متشابهة.

لمزيد من التحقيق في هياكل هذه المركبات الخمسة ، تمت تجربة تجارب LC-ESI-MSn وتظهر النتائج في الشكل 4 والجدول 2. أظهرت المركبات ذات الصلة بالقمم (1-5) في الشكل 2 أيونات جزيئية مكثفة منزوعة البروتونات [MH] - عند m / z 785 و 799 و 623 و 623 و 665 على التوالي في الوضع السلبي. كما لوحظت أيونات قاتمة [2MH] - للقمم 1-4 في الشكل 2. وقد أكدت هذه الأوزان الجزيئية للقمم 1-5 لتكون 786 و 800 و 624 و 624 و 666 على التوالي. قدمت بيانات LC-MSN (الجدول 2) معلومات هيكلية مفيدة للغاية لـ PhGs الخمسة ، مثل الخسارة المحايدة لـ

إجراء تجريبي: تم وزن 1 مجم تقريبًا من كل عينة في أنبوب اختبار سعة 10 مل حيث تمت إضافة 1 مل من كل مرحلة من نظام المذيبات ثنائي الطور الذي تمت معايرته مسبقًا. تم تغطية أنبوب الاختبار ورجه بقوة لمدة دقيقة واحدة ، وسمح له بالوقوف حتى ينفصل تمامًا. تم إخراج قسمة 100 لتر من كل طبقة وتبخيرها بشكل منفصل حتى تجف في وسط مفرغ عند<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

جزء الكافويل (162) ، وجزء الجلوكوز (162) ، وشق الرامنوز (146) ، وجذر الكافيين (14) ، ومجموعة COCH2 (42).

يظهر الشكل 4 أ في LC – ESI-MS لذروة 1. الأيون الجزيئي منزوع البروتونات [MH] - عند m / z 785 مع وفرة عالية وجزيئي منزوع البوتاسيوم

أيون [2M H] - عند m / z 1571 لوحظ في الوضع السلبي ، مما يشير إلى وزن جزيئي قدره 786 ، والذي كان هو نفسه من إشيناكوسيد. نتج عن مزيد من التحقيق في تجربة LC-MS2 للأيونات m / z 785 أيونًا رئيسيًا واحدًا عند m / z 623 (الشكل 4 ب) تم إنتاجه مباشرة من m / z 785 بفقدان جزء ca eoyl أو جزء hexose مثل [M 162 هـ] -. أظهر طيف LC-MS3 لـ m / z 623 أيونين رئيسيين عند m / z 477 و 461 ، وأيونات صغيرة عند m / z 315 و 179 (الشكل 3C ، الجدول 2). كانت الفروق الكتلية بين m / z 623 وشظية الأيونات m / z 477 و 461 146 و 162 ، على التوالي ، بما يقابل فقدان وحدة رامنوز وجزء جلوكوز أو جزء ملمس قهوة [M 162 H] -. فقدت أيونات m / z 623 أيضًا جزء كافويل وجزء من رامنوز لإنتاج أيونات m / z 315. تم إنتاج الأيون عند m / z 179 من انقسام جزء ca eoyl ، مع بقاء الشحنة السالبة على جزء من جزء ca-eoyl. أظهرت تجربة LC-ESI-MSN على إشنكوسايد الأصيل نفس نمط التجزئة. لذلك تم التأكيد على أن الذروة 1 هي إشنكوسايد.

بالنسبة إلى الذروة 2 ، أظهر LC-ESI-MS m / z 799 كأيون جزيئي منزوع البروتونات [MH] - و m / z 1599 كأيون قاتم له ، مما يوحي بوجود كتلة جزيئية تبلغ 800. أثناء تجارب MS2 ، أظهر m / z 799 أيونات شكلت ثلاث بنات

الأيونات عند m / z 637 و 623 و 475 (الجدول 1). تم إنتاج أيون في m/z 637 مباشرة من أيون الأصل من m/z 799 مرة أخرى بسبب فقدان محايد من ca- eoyl [m - 162 - h] - أو شحنة الجلوكوز [M - 162 - H] -. نتج الأيون عند m / z 623 من فقدان جذري CH2. تم تكوين الأيون عند m / z 475 من الفقد المحايد لكل من جزء ca eoyl [M 162 H] - وجزء الجلوكوز من أيون الأصل. أنتجت تجربة MS3 على m / z 637 ثلاثة أيونات عند m / z 619 و 491 و 475 ، وهو ما يقابل فقد ماء واحد ، ووحدة رامنوز ، وجزء جلوكوز ، على التوالي. أنتج أيون ابنة m / z 623 m / z 461 و 315 في دراسة MS3 ، والتي اتبعت نفس مسارات التجزئة مثل إشنكوسايد كما نوقش أعلاه. دعمت بيانات LC-ESI-MSN تحديدًا مؤقتًا للذروة 2 مثلسيستانوسيد أ.

كما أجريت تجارب LC-ESI-MS للقمم

3 و 4 (tR 12.49 و 13.46 دقيقة في الشكل 2). أظهر كلا القمتين نفس [MH] - أيون عند m / z 623 و dimer عند m / z 1247 في الوضع السالب (الجدول 1) ، مما يشير إلى أنهما من المحتمل أن يكون لهما أيزومرات بنفس الوزن الجزيئي لـ

624 ، نفسأكتيوسيدو isoacteoside. أظهرت أطياف MS2 لـ [MH] - أيونات أيضًا أيون ابنة واحدة من M/Z 461 ، والتي تشير إلى فقدان شحنة Ca -eoyl من أيون الأصل M/Z 623 (الجدول 1). تم الحصول على أطياف MS3 مماثلة للمركبين. بالنسبة للذروة 3 ، شكل طيف MS3 للأيون عند m / z 461 ثلاثة أيونات عند m / z 315 و 161 و 135. يتم تشكيل m / z 315 بعد فقد رامنوز كما تمت مناقشته سابقًا. تم إنتاج الأيون m / z 161 من انقسام جزء الكافيين ، متبوعًا بفقد إضافي لمياه واحدة ؛ بقيت الشحنة على جزء من جزء الكاويل. نشأ الأيون عند m / z 135 [agly- cone 18 H] - من انقسام الرابطة الجليكوسيدية عند موضع C1 مع فقد إضافي لمياه واحدة ، تاركًا الشحنة على جزء من جزء aglycone. اتبع طيف MS3 للقمة 4 نفس مسار التجزئة مثل الذروة 3 باستثناء الأيونات المفقودة عند m / z 135. تتوافق الأيونات الجزيئية وأنماط التجزئة لهذين المركبين مع بيانات الأدبيات حولأكتيوسيدو isoacteoside (Wang et al. ، 2000) ، على الرغم من العثور على أيون إضافي m / z 153 و

تم تعيينه كـ [aglycone H] - بواسطة Wang et al. (وانج وآخرون ، 2000). قد يكون هذا الأيون غير مستقر وفقد الماء ليعطي m / z 135 في تجربتنا. بناءً على بيانات MS وأوقات الاحتفاظ المتطابقة للقمتين 3 و 4 مع المعايير ، يتم تحديدها على أنهاأكتيوسيدو isoacteoside ، على التوالي.

يتم عرض بيانات LC-ESI-MS للذروة 5 في الجدول 2. كان الأيون الجزيئي المنزوع البروتونات [MH] - (m / z 665) هو الأيون الوحيد الموجود في الوضع السالب ، مما يشير إلى كتلة جزيئية تبلغ 666. لوحظ في m / z 623 و 503 و 461 في تجربة MS2 (الجدول 2). تم تشكيل أيونات الابنة عند m / z 623 و 503 مباشرة من الأيونات الأم عن طريق فقدان مجموعة COCH2 وجزء ca eoyl ، على التوالي. جاء أيون في m/z 461 من فقدان كل من ca -eoyl و coch2 legiety [m {15}} h] - من أيون الأصل. في تجربة MS ، أنتج m / z 623 m / z 461 ، وأنتج m / z 503 ثلاثة أيونات عند m / z 485 و 461 و 315. أعطى طيف MS3 للأيون الابنة m / z 461 أيونين عند 443 و 315. بمقارنة نمط تجزئة LC-MSN للذروة 5 مع المركبات الأخرى التي تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة ومع غيرها من المركبات المبلغ عنها (Li et al. ، 2005 ؛ Wang et al. ، 2000) ، خلصنا إلى أن القمة 5 كانت شديدة الارتباط من الناحية الهيكلية للتفاعل مع الاختلاف الوحيد هو وحدة COCH3 في موضع R3. لذلك تم إعطاء هوية مبدئية للقمة 5 كـ 20- أسيتيل لاكتوزيد (الشكل 1).

تم تأكيد هياكل المركبين المحددين مبدئيًا ، الذروة 2 (مثل cistanoside A) والذروة 5 (مثل 20- acetyl- acteoside) من هياكلها بواسطة 1H NMR. التحولات الكيميائية وثوابت الاقتران لجميع البروتونات في المركبات 2 و 5 ، كما هو موضح في الجدول 3. ، مطابقة مع بيانات الرنين المغناطيسي النووي المبلغ عنها لـسيستانوسيد أو 20- acetylacteoside على التوالي (Kobayashi et al.، 1984، 1987). تم إجراء تجارب 2D NMR (علاقة طويلة المدى COZY و ROESY و CH) أيضًا في الدراسة الحالية وأكدت أيضًا على التعريف (البيانات غير معروضة).

فينيليثانويدجليكوسيدات في cistanche

4 - نتائج

في هذا البحث ، تم استخدام HSCCC بنجاح لعزل وتنقية إشنكوسايد ،سيستانوسيد أو acteoside و isoacteoside و 20- acetylacteoside من مستخلص n-butanol من C. لذلك فهي وسيلة مجربة للفصل شبه التحضيري للنشط بيولوجيًا. في هذه الأثناء ، تم فحص هياكل مجموعات PhG الخمسة في Cistanche deserticola عن طريق LC-ESI-MSN ؛ تم العثور على بعض السمات المميزة لـ PhGs ، والتي سمحت لنا بتحديد المجموعات الوظيفية في الهياكل. لذلك فإن طريقة LC – ESI-MSN هي أداة قوية للتعرف السريع علىفينيليثانويدسو جليكوسيداتهم فيهاCistanche Deserticolaمقتطفات ، خاصة عند إثباتها ببيانات الرنين المغناطيسي النووي.

إعتراف

يود المؤلفون أن يشكروا جون جو من مركز الرنين المغناطيسي النووي ، جامعة جيلف ، أونتاريو ، كندا لمساعدتها في تجارب الرنين المغناطيسي النووي. تم دعم هذا المشروع جزئيًا بتمويل من مقاطعة جيلين ، الصين (رقم 20060904).

مراجع

Chen ، LJ ، Games ، DE ، & Jones ، J. (2003). عزل وتحديد أربعة مكونات فلافونويد من بذور Oroxylum Indicum بواسطة كروماتوجرافيا عالية السرعة للتيار المعاكس. مجلة الكروماتوغرافيا أ ، 988 ، 95-105.

Cheng، XY، Wei، T.، Guo، B.، Ni، W.، & Liu، CZ (2005).Cistanche Deserticolaثقافات تعليق الخلية:فينيلثانويدالتوليف الحيوي للجليكوزيدات ونشاط مضادات الأكسدة. الكيمياء الحيوية العملية، 40، 3119-3124.

Foucault، AP، & Chevolot، L. (1998). كروماتوغرافيا التيار المعاكس: الأجهزة واختيار المذيبات وبعض التطبيقات الحديثة لتنقية المنتجات الطبيعية. مجلة الكروماتوغرافيا أ ، 808 ، 3-22.

جروس ، ج.أ. ، لهلوب ، إم إف ، أنكلين ، سي ، شولتن ، H.-R. ، وستيتشر ، أو. (1988). Teucrioside ، جليكوسيد فينيل بروبانويد من Teucrium Chamaedrys. كيمياء النبات ، 27 ، 1459-1463.

He، ZD، Lau، KM، Xu، HX، Li، PC، & But، PPH (2000).

نشاط مضادات الأكسدةفينيليثانويدجليكوسيدات من فرصة برانديسيا. مجلة علم الأدوية الإثنية ، 71 ، 483-486.

كوباياشي ، H. ، Karasawa ، H. ، & Miyase ، T. (1984). دراسات على مكونات Cistanchis Herba. ثالثا. عزل وهياكل جليكوسيدات فينيل بروبانويد الجديدة ،سيستانوسيد أب. النشرة الكيميائية والصيدلانية ، 32 ، 3009-3014.

كوباياشي ، H. ، Oguchi ، H. ، Takizawa ، N. ، Miyase ، T. ، Ueno ، A. ، Usmanghani ، K. ، et al. (1987). جديدفينيليثانويدجليكوسيدات منسيستانشخطاف tubulosa (Schrenk). نشرة FI الكيميائية والصيدلانية ، 35 ، 3309 - 3314.

Lei، L.، Yang، FQ، Zhang، TY، Tu، PF، Wu، LJ، & Ito، Y. (2001).

العزل التحضيري وتنقيةأكتيوسيدو 2-acetyl acteoside من Cistanches salsa (CA Mey) G. Beck بواسطة كروماتوغرافيا التيار المعاكس. مجلة الكروماتوغرافيا أ ، 912 ، 181-185.

Li ، L. ، Tsao ، R. ، Liu ، ZQ ، Liu ، SY ، Yang ، R. ، Young ، JC ، et al. (2005). عزل وتنقيةأكتيوسيدو isoacteoside من Plantago psyllium L. بواسطة كروماتوغرافيا عالية السرعة للتيار المعاكس. مجلة الكروماتوغرافيا أ ، 1063 ، 161-169.

Li، LL، Wang، XW، & Wang، XF (1997). بيروكسيد Antilipid والعمل المضاد للجليكوزيدات في عشبة Cistanches. مجلة الصين للمواد الطبية الصينية ، 22 ، 364–367.

Li، J.، Wang، PF، Zheng، RL، Liu، ZM، & Jia، ZJ (1993). حماية جليكوسيدات فينيل بروبانويد من Pedicularis ضد انحلال الدم التأكسدي في المختبر. بلانتا ميديكا ، 59 ، 315-317.

لو ، MC (1998). دراسات على تأثير المسكناتCistanche Deserticolaمجلة علم الأدوية الإثنية ، 59 ، 161–165.

نيشيمورا ، هـ ، ساساكي ، هـ ، إيناغاكي ، إن ، تشين ، إم ، وميتسوهاشي ، هـ. (١٩٩١). تسعة جليكوسيدات كحول فينيثيل من Stachys szeboldzz. كيمياء النبات ، 30 ، 965-969.

Oka، F.، Oka، H.، & Ito، Y. (1991). بحث منهجي عن أنظمة مذيبات مناسبة ثنائية الطور للكروماتوغرافيا عالية السرعة للتيار المعاكس. مجلة الكروماتوغرافيا ، 538 ، 99-108.

رافن ، هـ ، نيشيب ، س ، ساساهارا ، إم ، ولي ، إكس (1990). مركبات الفينول من بلانتاجو اسياتيكا. كيمياء النبات ، 29 ، 3627-3631.

Schapoval، EES، Winter de Vargas، MR، Chaves، CG، Bridi، R.، Zuanazzi، JA، & Henriques، AT (1998). الأنشطة المضادة للالتهابات ومضادة للألم من المستخلصات والمركبات المعزولة من Stachytarpheta cayennensis. مجلة علم الأدوية الإثنية ، 60 ، 53-59. شوياما ، واي. ، ماتسوموتو ، إم ، ونيشيوكا ، آي (1987). جليكوسيدات الفينول من جذور Rehmannia glutinosa Var المريضة. بوربوريا. كيمياء النبات ، 26 ، 983-986.

Wang، XW، Jiang، XY، Wu، LY، & Wang، XF (2001). تأثير الكسح من جليكوسيداتCistanche Deserticolaعلى الجذور الحرة وحمايتها من تلف الحمض النووي الناجم عن OH في المختبر. مجلة علم الأدوية الصيني ، 36 ، 29-31.

Wang ، YM ، Zhang ، SJ ، Luo ، GA ، Hu ، YN ، Hu ، JP ، Liu ، L. ، Zhu ،

Y. ، و Wang ، HJ (2000). تحليلفينيليثانويدجليكوسيدات في مستخلص الأعشاب Cistanchis بواسطة LC / ESI-MS / MS. أكتا فارماسيوتيكا سينيكا ، 35 ، 839-842.

Wong، C.-C، Li، H.-B.، Cheng، K.-W.، & Chen، F. (2006). مسح منهجي للنشاط المضاد للأكسدة في 30 نباتًا طبيًا صينيًا باستخدام مقايسة الطاقة المضادة للأكسدة للحد من الحديد. كيمياء الغذاء ، 97 ، 705-711. Xie ، JH ، & Wu ، CF (1993). تأثير المستخلص الإيثانولي منCistanche Deserticolaعلى محتويات النواقل العصبية أحادية الأمين في الفئران

مخ. الأدوية الصينية التقليدية والعشبية ، 24 ، 417-419.

Xiong، Q.، Hase، K.، Tezuka، Y.، Tani، T.، Namba، T.، & Kadota، S. (1998). النشاط الوقائي للكبدفينيليثانويدسمنCistanche Deserticola. بلانتا ميديكا ، 64 ، 120-125.

Xiong، QB، Kadota، S.، Tani، T.، & Namba، T. (1996). التأثيرات المضادة للأكسدة من phenylethanoids منCistanche Deserticola. النشرة البيولوجية والصيدلانية ، 19 ، 1580-1585.

Zong، G.، He، W.، Wu، GL، & Chen، LH (1996). مقارنات بينCistanche DeserticolaYC Ma وسيستانشأنبوبي (Schenk) Wight على بعض الأنشطة الدوائية. مجلة الطب الصيني التقليدي ، 21 ، 436-438.