آثار توقيت استئصال الكلية المقابل والحالات الإقفارية على تليف الكلى بعد إصابة ضخ الدم بنقص تروية الكلى من جانب واحد

مقدمة

حدوثإصابة الكلى الحادلقد زاد مرض (AKI) بشكل كبير في جميع أنحاء العالم في السنوات الأخيرة [1]. يمكن أن يكون سبب AKI عن طريق زرع الأعضاء، وبعد العملية الجراحية تحت التروية، والنزيف، والجفاف، والصدمة والإنتان في الممارسة السريرية [2]. أظهرت الدراسات الوبائية والتجريبية الحديثة أن شدة وتواتر ومدة الإصابة بالقصور الكلوي الحاد ترتبط ارتباطًا وثيقًا بحدوث حالات لاحقة منفشل كلوي مزمن(كد). تليف الكلى بعد AKI يمكن أن يؤدي إلى مرض الكلى المزمن أو حتىمرض الكلى في المرحلة النهائية(ESKD) [3-5]، مما يعني أن AKI وCKD متلازمات مرتبطة [6]. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء التحول من AKI إلى CKD لا تزال مجهولة على الرغم من العديد من الدراسات التجريبية والسريرية. تعد النماذج الحيوانية أدوات مهمة لدراسة الآليات التي يؤدي من خلالها AKI إلى مرض الكلى المزمن. تعد إصابة نقص تروية الكلى (IRI) أحد الأسباب الرئيسية لـ AKI، وقد تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية للـ AKI الناجم عن IRI [7]، بما في ذلك نموذج IRI الثنائي (bIRI)، ونموذج IRI أحادي الجانب مع كلية مقابلة سليمة. ، نموذج uIRI مع استئصال الكلية المقابل المتزامن، ونموذج uIRI مع استئصال الكلية المقابل المتأخر.

يعتبر نموذج بيري أقل اتساقًا لأنه عندما تكون الإصابة الإقفارية في كلتا الكليتين خفيفة للغاية، لا توجد تغييرات تليفية كبيرة على المدى الطويل. عندما يكون AKI شديدًا جدًا، قد تموت الفئران في مرحلة الإصابة الحادة. علاوة على ذلك، فإن الاختلافات الصغيرة في إصابة الكليتين قد تؤدي إلى اختلافات كبيرة في أمراض الكلى المزمنة بعد بضعة أسابيع [8،9]. يشبه نموذج uIRI مع بضع الكلية المقابل المتزامن نموذج bIRI حيث تبقى الكلية المصابة فقط بسبب استئصال الكلية الجانبي الآخر [10]. في نموذج IRI مع وجود كلية مقابلة سليمة، يكون تليف الكلية الإقفارية شديدًا [11،12]. هذا النموذج متسق للغاية وموثوق به للمراقبة طويلة المدى من قبل الباحثين. ومع ذلك، نظرًا لوجود كلية غير تالفة في الجانب المقابل، لا يمكن استخدامه لتقييم معدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR)، والكرياتينين في المصل (SCr)، ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN) [11-14]. بالمقارنة مع نموذجي uIRI المذكورين أعلاه، فإن نموذج uIRI مع استئصال الكلية المقابل المتأخر يتغلب على هذه المشكلات ويمكن استخدامه لكل من الملاحظات طويلة المدى بعد مراقبة وظائف الكلى والكلى. لذلك، هذا النموذج مناسب لدراسة انتقال AKI-CKD [15].

انقر هنا للحصول على مستخلص سيستانشإصابة الكلى الحاد

ومع ذلك، فإن الحالات الإقفارية المختلفة والفاصل الزمني بين استئصال الكلية المقابل وUIRI قد يكون لها تأثيرات كبيرة على تطور وشدة مرض الكلى المزمن بعد القصور الكلوي الحاد. ركزت الدراسات السابقة على تأثير المدة الإقفارية على تليف الكلى بعد AKI ولم تهتم كثيرًا بدرجة حرارة الجسم الأساسية أثناء نقص التروية. على سبيل المثال، سكريبنيك وآخرون. [12] تم التحكم في درجة الحرارة الإقفارية عند 38 درجة مئوية عن طريق نظام حمام مائي، مع مدة إقفارية قدرها 30 دقيقة، وتمت إزالة الكلية السليمة المقابلة بعد 8 أيام من uIRI. أظهرت النتيجة أن الكلى الإقفارية شهدت تغيرات تليفية كبيرة بعد 28 يومًا من uIRI. مع نفس المدة الدماغية، شياو وآخرون. [8] أظهر أن تغييرات ليفية كبيرة حدثت بعد 11 يومًا من uIRI عندما تم التحكم في درجة الحرارة الإقفارية عند 37 درجة مئوية إلى 38 درجة مئوية وكان الفاصل الزمني بين uIRI واستئصال الكلية المقابل 10 أيام. بعض الباحثين، مثل كولومبارو وآخرون. [14] ولي وآخرون. [16] لم يذكروا درجة الحرارة الإقفارية في دراستهم.

وفي الوقت نفسه، قام عدد قليل من الأشخاص بالبحث في تأثير الفاصل الزمني بين استئصال الكلية المقابل وUIRI في هذا النموذج، مما أدى إلى نتائج متباينة على نطاق واسع بين المختبرات المختلفة، والتي أثرت أيضًا بشكل كبير على التجارب اللاحقة. في هذه الدراسة، قمنا بدراسة آثار العوامل الرئيسية التي تؤثر على تليف الكلى بعد AKI، بما في ذلك الفاصل الزمني بين استئصال الكلية المقابل وUIRI، ودرجة حرارة الجسم الأساسية أثناء نقص التروية، والمدة الدماغية. نحن نهدف إلى توفير مرجع لعمل نموذج حيواني مناسب لدراسة انتقال AKI CKD

المواد والأساليب النماذج الحيوانية

تم تزويد فئران ذكور C57BL/6J (عمرها من 8 إلى 10 أسابيع، ووزنها حوالي 22 جرامًا؛ شركة GemPharmatech Co., Ltd.، نانجينغ، الصين) بإمكانية الوصول المجاني إلى الغذاء والماء في مركز التجارب الحيوانية بجامعة شانشي الطبية. كانت ظروف التكاثر على النحو التالي: الرطوبة 40-70٪، درجة الحرارة 23 مئوية، فئة نظافة الهواء 7، دورة الضوء / الظلام 12- ساعة في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض، تغذية تشعيع Co60، والمياه النقية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الخاصة بهذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بالمستشفى الثاني بجامعة شانشي الطبية (رقم الأخلاق: DW2022028).

البروتوكولات

مع الأخذ في الاعتبار أن فترات نقص التروية، ودرجات حرارة الجسم الأساسية أثناء نقص التروية، وتوقيت استئصال الكلية غير المصابة في الجانب المقابل قد يكون لها جميعًا تأثيرات على شدة التهاب المفاصل الروماتويدي والتليف الكلوي اللاحق، قمنا بدراسة تأثيرات العوامل الثلاثة المذكورة أعلاه بشكل فردي، مع تثبيت العاملين الآخرين. أجريت ثلاث تجارب على النحو التالي.

البروتوكول 1: لمراقبة تأثير الفاصل الزمني بين استئصال الكلية المقابل وUIRI على وظائف الكلى وتليف ما بعد AKI، تم تثبيت الوقت الإقفاري للكلية اليسرى عند 24 دقيقة وتم تثبيت درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 درجة مئوية أثناء الكلى. نقص التروية في هذه الأثناء. تم إجراء استئصال الكلية اليمنى في اليوم 7 واليوم 10 واليوم 14 على التوالي (ن=8 لكل مجموعة) بعد IRI للكلية اليسرى. لقد حددنا مدة نقص التروية واستئصال الكلى بناءً على نتائج الدراسات السابقة [8،10،12،15] ونتائجنا قبل التجريبية. انظر الشكل 1(أ-ج) للاطلاع على بروتوكول الدراسة.

البروتوكول 2: لمراقبة تأثير درجة حرارة الجسم الأساسية أثناء نقص التروية على انتقال AKI-CKD، تم تثبيت الوقت الإقفاري للكلية اليسرى عند 24 دقيقة، وتمت إزالة الكلية اليمنى بعد 14 يومًا من IRI في الكلية اليسرى. تم التحكم في درجة حرارة الجسم الأساسية عند 36 درجة مئوية، 36.5 درجة مئوية، 37 درجة مئوية، 37.5 درجة مئوية، و 38 درجة مئوية، على التوالي (ن=8 لكل مجموعة). انظر الشكل 1(د) للاطلاع على بروتوكول الدراسة.

البروتوكول 3: لمراقبة تأثير فترات نقص تروية الكلى على الانتقال من AKI إلى CKD، تم تثبيت درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 درجة مئوية أثناء نقص التروية، وتمت إزالة الكلية اليمنى بعد 14 يومًا من IRI في الكلية اليسرى. لقد اخترنا هذه النقطة الزمنية لأن تليف الكلى، والذي كان التغيير النموذجي بعد القصور الكلوي الحاد إلى مرض الكلى المزمن، كان واضحًا جدًا وفقًا للتقارير [8،10،12،15] ونتائجنا السابقة للتجربة. تم التحكم في الوقت الإقفاري للكلية اليسرى عند 21 دقيقة و24 دقيقة و27 دقيقة و30 دقيقة على التوالي (ن=8 لكل مجموعة). انظر الشكل 1(E) للاطلاع على بروتوكول الدراسة.

تم الموت الرحيم لجميع الفئران في 8 أسابيع بعد IRI للكلية اليسرى. تم تخزين جزء من أنسجة الكلى اليسرى عند 70 درجة مئوية لتحليل RT-PCR اللاحق وتحليل اللطخة الغربية، وتم تثبيت الجزء الآخر في الفورمالين المحايد لتحليل الأنسجة. تم جمع عينات الدم عن طريق الجيب المداري الخلفي لإجراء الاختبارات البيوكيميائية.

الشكل 1. بروتوكولات الإصابة بنقص التروية وضخه من جانب واحد (uIRI) مع تأخر استئصال الكلية المقابل. (A–C): تعرضت الكلية اليسرى إلى IRI في اليوم 0، وتم إجراء استئصال الكلية اليمنى في نقاط زمنية مختلفة (اليوم 7، اليوم 1 0، واليوم 14) مع المدة الإقفارية ثابت عند 24 دقيقة مع درجة حرارة الجسم الأساسية ثابتة عند 37 درجة مئوية أثناء نقص تروية الكلى. (D): تم إخضاع الكلية اليسرى لـ IRI في اليوم 0، وتم إجراء استئصال الكلية اليمنى تحت درجات حرارة الجسم الأساسية المختلفة (36 درجة مئوية، 36.5 درجة مئوية، 37 درجة مئوية، 37.5 درجة مئوية، و 38 درجة مئوية) مع نقص تروية الدم. تم تثبيت وقت الكلية اليسرى عند 24 دقيقة، وتمت إزالة الكلية اليمنى بعد 14 يومًا من إجراء IRI للكلية اليسرى. (E): تعرضت الكلية اليسرى إلى IRI في اليوم 0، وتم إجراء استئصال الكلية اليمنى في فترات إقفارية مختلفة (21 دقيقة، 24 دقيقة، 27 دقيقة، و 30 دقيقة) مع درجة حرارة الجسم الأساسية ثابتة عند 37 درجة مئوية أثناء الكلى نقص التروية، وتمت إزالة الكلية اليمنى بعد 14 يومًا من إزالة IRI للكلية اليسرى. تم تقييم وزن الكلى ووظائف الكلى والإصابة النسيجية في الكلى وتليف الكلى حتى اليوم 56.

إجراء جراحي

قبل الجراحة، صامت جميع الفئران لمدة 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الماء وتم حقنها بـ 3٪ بنتوباربيتال صوديوم 5 0 ملغم / كغم داخل الصفاق. أثناء التخدير، تم الحفاظ على درجة حرارة المستقيم عند 36 درجة مئوية، 36.5 درجة مئوية، 37 درجة مئوية، 37.5 درجة مئوية، أو 38 درجة مئوية، على التوالي، في مجموعات تجريبية مختلفة. لتحقيق ذلك، تم وضع الفأر مع ظهره على وسادة التدفئة (CW{{10}}، BARBAROUS GROWTH، Zhejiang، China) في وضع مع تمديد رأسه ورقبته لضمان بقاء مجرى الهواء لديه دون عائق، وتغطى العيون بشاش ملحي دافئ لتجنب الجفاف أثناء العملية. بعد التخدير، تم حلق الشعر الموجود على الجزء الخلفي الأيسر من الفأرة باستخدام ماكينة قص الشعر. تم بعد ذلك مسح الجلد الموجود في منطقة الجراحة باستخدام مسحة كحول بنسبة 75٪. بشكل عام، تنخفض درجة حرارة جسم الفأر بعد حلاقة الشعر. تم إجراء العملية الجراحية عندما أصبحت درجة حرارة الجسم الأساسية ثابتة، الأمر الذي قد يستغرق حوالي 15 دقيقة. ويمكن رؤية الكلية اليسرى عن طريق قطع الجلد الظهري الأيسر 0.5 سم بجوار خط الوسط و0.5 سم عند الحافة السفلية للقفص الصدري للماوس. ثم قمنا بعصر البطن الأيسر بيد واحدة لإخراج الكلية اليسرى من تجويف الجسم، ورفعنا الكلية بملقط منحني غير حاد (مع الحرص على تجنب إتلاف الكلية)، وفصلنا عنيق الكلية وثبتناها بسرعة، ووضعنا المشبك. الكلى تحت الجلد لإبقائها دافئة ورطبة. تميز نقص التروية الناجح بتغير تدريجي في لون الكلى من الأحمر إلى الأرجواني الداكن، والذي استمر 21 دقيقة، 24 دقيقة، 27 دقيقة و 30 دقيقة على التوالي، في مجموعات تجريبية مختلفة. تغير لون الكلى مرة أخرى إلى اللون الأحمر خلال 2-5 دقائق بعد تحرير المشبك. ثم قمنا بإغلاق تجويف البطن بغرز متعددة الطبقات. تم شق الجلد والعضلات الظهرية اليمنى في اليوم 7، واليوم 10، واليوم 14 بعد uIRI، على التوالي، في مجموعات تجريبية مختلفة، وتم استئصال الكلية اليمنى. ثم أغلق الجرح بغرز عادية. بعد كل عملية جراحية، تم حقن 500 لتر من المحلول الملحي داخل الصفاق للتعويض عن فقدان السوائل أثناء الجراحة. في الوقت نفسه، تم الاحتفاظ بالماوس على وسادة التدفئة لمدة 2-3 ساعات تقريبًا حتى اكتسب وعيه الكامل قبل نقله إلى قفص السكن. لم تقم المجموعة الوهمية بربط عنيق الكلى، وكانت بقية العمليات الجراحية هي نفس تلك الخاصة بمجموعة uIRI. تم إجراء جميع العمليات الجراحية بواسطة نفس الشخص الذي يتمتع بخبرة تزيد عن عامين في تشغيل هذا النموذج.

فحص وظائف الكلى

تم قياس مستويات SCr بواسطة مجموعة الكرياتينين (Jaffe Method، 100020170، Biosino Biotechnology and Science). تم قياس مستويات BUN بواسطة مجموعة اليوريا (طريقة نزع هيدروجين اليورياز-الغلوتامات والتكنولوجيا الحيوية والعلوم في Biosino).

فحص وزن الكلى

بعد التبول، تم قياس أوزان الجسم للفئران بمقياس إلكتروني دقيق. تم شطف الكلى الطازجة ثلاث مرات بمحلول ملحي مبرد مسبقًا، ثم تم مسح الماء الزائد الموجود على الكلى باستخدام ورق الترشيح. تم تقشير كبسولات الكلى على الجليد وتم وزن الكلى على الفور. تم حساب نسبة وزن الكلى إلى وزن الجسم لتقييم وزن الكلى المصحح بالملجم / جرام.

تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE) وإصابة الكلى

تم تجفيف أنسجة الكلى المحايدة المثبتة بالفورمالين بشكل روتيني، ودمجها في البارافين، وتقسيمها (3 ميكرومتر)، وصبغها بـ HE لمراقبة تلف أنسجة الكلى. تم التقاط عشرة حقول تم اختيارها عشوائيًا من قشرة الكلى في كل قسم باستخدام المجهر الضوئي بتكبير 400. سجل اثنان من علماء الأمراض إصابة الكبيبة وأنابيب الكلى بشكل منفصل. تم تسجيل الإصابة الأنبوبية على مقياس {{20}}–4 باستخدام المعايير التالية [17]: 0، لا توجد إصابة؛ 1، يؤثر على 1-25% من مساحة الكلى. 2، يؤثر على 26-50% من مساحة الكلى؛ 3، يؤثر على 51-75% من مساحة الكلى؛ و4، يؤثر على 75-100% من مساحة الكلى. تم تقييم درجة الإصابة الأنبوبية بشكل شبه كمي عن طريق حساب مساحة الإصابة الأنبوبية الكلوية. تم تقييم الإصابة الكبيبية وتسجيلها على مقياس من 0 إلى 4 وفقًا للنسبة المئوية لمساحة توسع مسراق الكبيبة أو التصلب باستخدام المعايير التالية [17]: 0، الكبيبات الطبيعية؛ 1، 1–25% من المساحة المصابة؛ 2، 26-50% من المنطقة مصابة؛ 3، 51-75% من المنطقة مصابة؛ و4، 76-100% من المنطقة مصابة. درجة الضرر الكبيبي النهائية ¼ 0 (% كبيبات من الدرجة 0) þ 1 (% كبيبات من الدرجة 1) þ 2 (% كبيبات من الدرجة 2) þ 3 (% كبيبات من الدرجة 3) þ 4 (% كبيبات من الدرجة 4). وسجل أكثر من 50 الكبيبات في الماوس.

تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان

تم تجفيف أنسجة الكلى المحايدة المثبتة بالفورمالين بشكل روتيني، ودمجها في البارافين، وتقسيمها (3 ميكرومتر)، وصبغها بثلاثي الألوان الخاص بماسون لمراقبة تليف الكلى. في شرائح ماسون ثلاثية الألوان، تم التقاط عشرين حقلاً غير متداخل من قشرة الكلى تحت تكبير 200. تم استخدام برنامج تحليل الصور Image-Pro Plus للقياس والتحليل التلقائي. تم استخدام النسبة المئوية للمنطقة الليفية لمعرفة مستوى التليف الخلالي الكلوي [8].

RT-PCR

تم استخراج إجمالي mRNA من أنسجة الكلى لكل مجموعة بواسطة Trizol وتم قياس تركيزه، ثم تم تحويله إلى cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). تم استخدام طريقة مضان Taqman (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) لقياس تعبيرات RNA فيبرونكتين (FN) والكولاجين I (COL-I) في أنسجة الكلى. تم استخدام بادئات محددة لـ FN (للأمام: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 والعكس: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30)، وCOL-I (للأمام: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} والعكس: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (مقدمة من شركة Sangon Biotech Co., Ltd.، شنغهاي، الصين). شروط التضخيم هي كما يلي: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 40 دورة؛ 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ، و65 درجة مئوية لمدة 5 ثوانٍ، و95 درجة مئوية/5 درجة مئوية. بعد تحليل منحنيات التضخيم ومنحنيات الذوبان للمنتجات، تم تحديد مستويات mRNA النسبية بواسطة طريقة CT المقارنة (2-DDCt) مع 18SrRNA (للأمام: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 والعكس: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30) كمرجع داخلي.

لطخة غربية

تم استخدام المخزن المؤقت لتحلل مقايسة الترسيب المناعي الراديوي (RIPA) لتحلل أنسجة الكلى وتم تحديد تركيز البروتين بواسطة طريقة BCA. تم استخدام الفصل الكهربائي الهلامي المتدرج لفصل البروتينات من 50 لتر من العينات. ثم تم نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز. بعد حجب 5٪ من الحليب الخالي من الدسم لمدة ساعتين، تم تنظيف الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر للأرنب ضد الأكتين العضلي الملساء (a-SMA) (1: 1000، رقم 19245، تقنية تشوير الخلية )، FN (1:1000، No.ab2413، ABCam)، أو COL-I (1:1000، No.72026، تكنولوجيا تشوير الخلية)، على التوالي. في اليوم التالي، تم إعادة تدفئة الأغشية عند درجة حرارة الغرفة لمدة 0.5 ساعة. بعد غسلها باستخدام TBST، تم تحضين الأغشية بـ HRP Conjuged AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H þ L) (1: 1000، رقم BA1054، BOSTER Biological Technology) لمدة ساعتين. بعد غسلها باستخدام TBST مرة أخرى، تم صبغها باستخدام كاشف التألق الكيميائي ECL عالي الحساسية لتصور الكتل المناعية. تم قياس b-actin على نفس الغشاء مثل المرجع الداخلي. تم تحديد تعبيرات البروتين عن طريق قياس التعبيرات النسبية للبروتينات المستهدفة مقابل ب-أكتين.

البيانات والتحليل الإحصائي

يتم التعبير عن جميع البيانات التي تم فحصها على أنها الانحراف المعياري المتوسط. تم الوصول إلى المقارنات بين المجموعتين عن طريق اختبار t مستقل. تم الوصول إلى المقارنات بين مجموعات متعددة عن طريق تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه عندما يكون توزيع البيانات طبيعيًا، ويكون التباين متجانسًا، وتم استخدام Welch ANOVA لتقييم الأهمية الإحصائية عندما كان التباين غير متجانس، متبوعًا باختبار توكي اللاحق لإجراء مقارنات متعددة. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية بواسطة برنامج GraphPad Prism 8.0. تم اعتبار p <0.05 ذات دلالة إحصائية.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

انقر هنا للحصول على مستخلص سيستانش عضوي طبيعي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% أكتيوسايد للكلى