تأثيرات إجمالي الجليكوسيدات في Cistanche Deserticola على الانتشار والاستماتة والتعبير عن بروتين خلايا HepG2 المرتبط بمسار تشوير الكاتينين / Wnt

FENG Duo1،2، WANG Jing2، JIANG Yong-jun3، ZHOU Shi-qi1، DUAN Hao1، GUO Yu1، ZHAO Jian1، YAN Wen-jie1، *

（1. مختبر بكين الرئيسي للمواد النشطة بيولوجيا والأغذية الوظيفية ، كلية الهندسة الكيميائية الحيوية ، جامعة بكين يونيون ، بكين 100023 ، الصين ؛ 2. معهد التنمية الغذائية والتغذية ، وزارة الزراعة والشؤون الريفية ، بكين 100081 ، الصين ؛ 3. Inner Mongolia Sankou Biotechnology Co.، Ltd. ، Ordos ، منغوليا الداخلية 017000 ، الصين）

خلاصة: لاستكشاف التأثير المثبط لـإجمالي جليكوسيداتCistanche Deserticola(TG) على خلايا HepG2 وآليتها. في هذا البحث ، تمت معالجة تركيزات مختلفة (0 ، 3.5 ، 10.5 ، 21 ، 31.5 ، 42 ميكروغرام / مل) من TG لمدة 24 ساعة على خلايا سرطان الكبد HepG2 ، وتم الكشف عن قابلية خلايا HepG2 للحياة باستخدام مقايسة CCK8 . تم استخدام طريقة التلوين المزدوج Hoechst33342 / PI و Annexin V-FITC / PI للكشف عن موت الخلايا المبرمج HepG2. تم الكشف عن ظاهرة هجرة الخلايا عن طريق مقايسة هجرة الخلايا. وفي الوقت نفسه ، تم الكشف عن تغييرات تقدم دورة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وتم اكتشاف تعبير -fetoprotein (AFP) و -catenin و Disheveled (Dsh) و GSK -3 بواسطة لطخة ويسترن. أظهرت النتائج أن TG يمكن أن يقلل من تكاثر خلايا HepG2 بطريقة تعتمد على التركيز ، مع بقاء الخلية بنسبة 31.04 في المائة فقط عندما كان TG 42 ميكروغرام / مل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي TG إلى إتلاف بنية الخلية وتحفيز موت الخلايا المبرمج ، ويمكن أن يصل معدل موت الخلايا المبرمج إلى 32.44٪ من خلال اكتشاف AV / PI ، علاوة على ذلك ، يمكن أن يعزز TG أيضًا نخر الخلية ، ويحد من هجرة الخلايا. كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعة المعالجة ومجموعة السيطرة. وفي الوقت نفسه ، يمكن لتركيز عالٍ من TG أن يوقف خلايا HepG2 في طور G2 / M. أخيرًا ، مقارنةً بالمجموعة الضابطة ، انخفض التعبير النسبي لـ -catenin و Dsh ، بينما زاد GSK -3 في المجموعات المعالجة بـ TG. في الختام ، يمكن أن يمنع TG نمو خلايا HepG2 من خلال التأثير على تقدم دورة الخلية ، وتعزيز موت الخلايا المبرمج ، والحد من هجرة الخلايا. قد تكون الآلية من خلال مسار إشارات Wnt / -catenin ، الذي نشط GSK -3 لتحطيم الكاتينين لتحقيق تثبيط سرطان الكبد.

الكلمات الدالة: Cistanche Deserticola؛ مجموع الجليكوسيدات. خلية HepG2 مكافحة الورم الكبدي. مسار إشارة Wnt / -Catenin

Cistanche Deserticola maينتمي إلى مادة متجانسة طبية وغذائية وهو نبات عشبي طفيلي معمر من Orobaceae.له تأثيرات مضادات الأكسدة ، ومكافحة التعب ، ومكافحة الشيخوخة ، ومكافحة الأورام ، وحماية الكبد ، وتنظيم الغدد الصماء ، وتحسين قدرة الذاكرة ، ومكافحة هشاشة العظام. إنه شائع مثل "الجينسنغ الصحراوي". بعد التأكد من أن Deserticola deserticola أصبح مادة طبية وغذائية متماثلة في عام 2018 ، اجتذب الكثير من الاهتمام. ولا يمكن أن يلعب دور التطبيق السريري للأدوية العشبية الصينية فحسب ، بل يؤثر أيضًا على تأثير التدخل الغذائي للغذاء.كما يظهر إمكانات كبيرة في تطوير منتجات جديدة طبيعية مضادة لسرطان الكبد [2-3]. أصبحت الأبحاث التغذوية والآثار الوظيفية لأطعمة Deserticola deserticola متعمقة بشكل متزايد [4].

حياة الصحراء

في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن إصابة Cistanche deserticola بامتدادمضاد للورمتأثير. يي وآخرون. [5]اكتشفوا أن إشنسا المستخرج من ملح Cistanche deserticola يمكن أن يمنع تكاثر خلايا HepG2 عن طريق تقليل التعبير عن TREM2 ومنع مسار إشارة PI3K / AKT ؛ وجد بعض العلماء أن جليكوسيدات الفينيثانويد من Cistanche deserticola يمكن أن تمنع تكاثر خلايا HepG2 [6] ؛ Echinoside له تأثير مثبط معين على تكاثر سرطان الكلى 786- الخلايا O [7] وخلايا سرطان القولون SW480 [8] ؛ في دراسة أخرى ، ثبت أن جليكوسيدات الفينيثانويد من Cistanche deserticola تقلل من تلف الكبد في الفئران الحاملة للورم H22 ، وتحسن وظيفة المناعة عن طريق تقليل مستويات AFP ، مما يؤثر سلبًا على نمو الورم [9]. يمكن تمرير كل من Cistanche deserticola decoction [10] وعديد السكاريد [11] من خلال مسار إشارات Wnt / - Catenin الذي يحسن الأعراض السريرية لجرذان باركنسون ويلعب دورًا وقائيًا للأعصاب. بالإضافة إلى ذلك ، وجدت الدراسات أن القنفذية يمكن أن تمنع Wnt by / - مسار إشارات كاتينين يلعب دورًا مضادًا لسرطان الثدي [12] ؛ بالإضافة إلى ذلك ، يمكنه أيضًا تقليل عدد خلايا THP -1 في ابيضاض الدم الحاد البشري - تعبير بروتين Catenin [13]. طوال الوقت ، حظي مسار إشارات Wnt / - Catenin باهتمام كبير [14]. يُذكر أنه يمكن ملاحظته في 20 بالمائة - 35 بالمائة من حالات سرطان الكبد [15] - تنشيط Catenin. هناك أدلة متزايدة على أن مسار إشارات Wnt / - Catenin يلعب دورًا مهمًا في حدوث وتطور سرطان الكبد [16] ، ولكن ما إذا كان إجمالي جليكوسيدات Cistanche deserticola ينظم Wnt / - هناك تقارير قليلة عن التأثير المضاد للورم الكبدي. مسار إشارات كاتينين. تمت دراسة إجمالي جليكوسيدات مستخلص Cistanche Deserticola ، بما في ذلك جليكوسيدات الفينيثانويد والجليكوزيدات الأخرى [17] ، في هذه التجربة من خلال دراسة التكاثر والاستماتة والهجرة ومستويات التعبير البروتيني ذات الصلة لخلايا HepG2 التي يسببها إجمالي جليكوسيدات Cistanche deserticola (TG) ، لاستكشاف آلية TG المثبطة لسرطان الكبد ، وشرح الآلية المحتملة لـ TGs ضد سرطان الكبد ، لتوفير أساس علمي معين لزيادة إثراء التطبيق السريري لـ Cistanche deserticola في مجال سرطان الكبد.

الفينيثانول جليكوسيد هو العنصر النشط الرئيسي في Cistanche deserticola

1.المواد والطرق

1.1 المواد والأدوات

تم شراء خلايا HepG2 (سرطان الخلايا الكبدية البشرية) من مركز الخلايا التابع لمعهد الطب الأساسي ، جامعة بكين يونيون الطبية ، الصين.إجمالي جليكوسيداتمسحوق استخراج سيستانش(الكسر الكتلي أكبر من أو يساوي 75 في المائة ، جنبًا إلى جنب مع إشنكوسايد وحوض السباحة ، المقدم من شركة Inner Mongolia Sankou Biotechnology Co. ، Ltd.) تم حلها في وسط DMEM لتركيزات مقابلة من TG للتجارب اللاحقة.

مسحوق استخراج سيستانش

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Extract Protect Liver

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

تم شراء مصل بقري الجنين من Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ تم شراء الأجسام المضادة (محلول الجنتاميسين المختلط من البنسلين والستربتومايسين) ، وسيط DMEM-H ، ومجموعة أدوات الكشف عن الخلايا ودورة الخلية ، ومحلول أنكسين V-FITC / صبغ ، ومحلول الصبغة Hoechst 33342 / PI من Genview ؛ 0. تم ​​شراء مجموعة تحديد تركيز البروتين بنسبة 25 بالمائة من التربسين و BCA من شركة Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co.، Ltd؛ تم شراء الأجسام المضادة للأرانب المضادة للكاتينين من ABclonal ؛ تم شراء الجسم المضاد للأرنب المضاد لـ Dsh (ADAR1) من Bios ؛ تم شراء الأجسام المضادة لـ GSK3 للأرنب والأجسام المضادة لـ AFP من Affinity. حاضنة خلايا ثاني أكسيد الكربون (Innova CO -170) ، جهاز طرد مركزي مكتبي عالي السرعة بدرجة حرارة منخفضة (3K15 ، سيجما ، ألمانيا) ، أداة وضع العلامات على الإنزيمات متعددة الوظائف (INFINITE M NANO TECAN) ، مجهر مضان (C-SHG1 ، نيكون ، اليابان ) ، قياس التدفق الخلوي (FACSCALIBUR ، BD ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، جهاز الرحلان الكهربائي (EN027015 ، BIO-RAD ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، جهاز نقل الغشاء (043BR57802 ، BIO-RAD ، الولايات المتحدة الأمريكية).

1.2 الطريقة التجريبية

1.2.1 مرور الخلية

تمت زراعة خلايا HepG2 في وسط كامل DMEM يحتوي على 1 0 بالمائة من مصل بقري جنيني و 1 بالمائة أجسام مضادة ثلاثية (100 وحدة / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين ، وجنتاميسين) في حاضنة خلايا ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 بالمائة عند 37 درجة . بعد نمو الخلايا إلى نقطة التقاء 80 في المائة إلى 90 في المائة ، تم هضمها مع 0.25 في المائة من التربسين (- EDTA) وزُرعت بنسبة 1: 2 إلى 4. بعد 2-3 يومًا من نمو الخلايا ، النمو اللوغاريتمي تم أخذ خلايا المرحلة لثقافة فرعية أو تجارب لاحقة

1.2.2 تأثير TG على مورفولوجيا خلايا HepG2

تم أخذ خلايا HepG2 من مرحلة النمو اللوغاريتمي وتلقيحها في 24- لوحة بئر بتركيز خلية 5 لكل بئر × 1 0 4 قطع / مل ، بعد التصاق الخلايا بالجدار ، أضف TG إلى التركيز النهائي البالغ 0 ، 3.5 ، 10.5 ، 21 ، 31.5 ، 42 ميكروغرام / مل ، 0.5 مل لكل بئر ، تمت زراعته لمدة 24 ساعة ، ولاحظ مورفولوجيا الخلية لكل مجموعة تحت المجهر الضوئي.

1.2.3 تأثير TG على تكاثر خلايا HepG2

خذ خلايا HepG2 في مرحلة النمو اللوغاريتمي واضبط تركيز الخلية إلى 1 × 104 قطعة / بئر ، ملقحة في 96 لوحة جيدة ، مضيفة 100 قطعة لكل بئر μ 50. احتضان في حاضنة خلية. بعد أن تلتصق الخلايا بالجدار ، يتم علاجها بالعقاقير وفقًا لـ 1.2.2 أعلاه ، ولكل مجموعة ستة ثقوب مُعاد تقشيرها لمدة 24 ساعة. تم قياس معدل بقاء الخلية باستخدام طريقة CCK8 ، وتم قياس قيمة الامتصاص (OD) بطول موجة 450 نانومتر. تم حساب معدل بقاء الخلية ومعدل تثبيط الخلية باستخدام الصيغة التالية.

في الصيغة ، تحتوي المجموعة الفارغة فقط على سائل CCK8 ، بينما تحتوي المجموعة الضابطة على مجموعة معالجة 0 ميكروغرام / مل ، المجموعة التجريبية: 3.5 ، 10.5 ، 21 ، 31.5 ، 42 ميكروغرام / مل.

1.2.4 تأثير TG على دورة خلية HepG2

خذ خلايا طور النمو اللوغاريتمي واضغط 5 × A كثافة خلية من 105 خلايا لكل بئر تم تلقيحها في صفيحة من ستة آبار ، وتم وضع نظام 2 مل لكل بئر يحتوي على 5 × 105 خلايا في صندوق زراعة وتعرضت للعلاج الدوائي كما هو موضح في 1.2.2 أعلاه. بعد الثقافة ، أجريت العمليات اللاحقة وفقًا لتعليمات المجموعة.

1.2.5 تأثير TG على هجرة خلايا HepG2:

حدد خلايا مرحلة النمو اللوغاريتمي وضعها على لوحة من ستة آبار. تمت إزالة نظام سعة 2 مل لكل بئر يحتوي على 6 × 1 0 5 خلايا عندما كان التصاق الخلية وتجميع الخلايا أعلى من 90 بالمائة. إجراء العلاج من تعاطي المخدرات وفقًا للبند 1.2.2 أعلاه. عند 0 ساعة ، حدد عشوائيًا 5 مجالات رؤية تحت المجهر للصور الفوتوغرافية ، وضعها في الحاضنة لمزيد من الزراعة لمدة 24 ساعة ، والتقط صورًا تحت المجهر البصري ، واستخدم برنامج Image J لتحليل منطقة خدش الخلايا ، وحساب معدل الهجرة وفق الصيغة التالية (2) [18].

1.2.6 Hoechst 33342 / PI طريقة تلطيخ مزدوج للكشف عن موت الخلايا المبرمج

حدد خلايا طور النمو اللوغاريتمي ووضعها على لوحة بئر {0} ، مع نظام 0.5 مل يحتوي على 3 × 104 خلايا تمت معالجتها بالعقاقير وفقًا لـ 1.2.2 أعلاه ، و 1 مل من المخزن المؤقت لتلطيخ الخلايا تمت إضافة 5 ميكرولتر من صبغة Hoechst و 5 ميكرولتر من محلول صبغ LPI للتلطيخ. احتضان في الظلام على درجة 37 لمدة 7-10 دقيقة ، خذ 24- لوحة ثقب ، بللها ببرنامج تلفزيوني ، والتقط الصور باستخدام مجهر مضان للمراقبة.

1.2.7 الكشف عن موت الخلايا المبرمج لخلايا HepG2 عن طريق التلوين المزدوج لـ Annexin V-FITC / PI

حدد خلايا طور النمو اللوغاريتمي ووضعها على صفيحة من ستة آبار ، مع نظام 2 مل لكل بئر يحتوي على 2 × 105 خلية تم علاجها بالأدوية وفقًا لـ 1.2.2 أعلاه ، وتم إجراء العمليات اللاحقة وفقًا لتعليمات المجموعة ، إضافة 5 ميكرولتر من الملحق V-FITC و 5 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI تم تحضينه عند 4 درجات في الظلام ثم وضعه على قياس التدفق الخلوي للكشف عن موت الخلايا المبرمج.

1.2.8 تأثير TG على تعبير البروتين في خلايا HepG2

اضغط على 2 × 106 خلية / خلية تمت معالجتها بالأدوية وفقًا لـ 1.2.2 أعلاه ، باستخدام 80 ميكرولتر محلول (RIPA: PMSF =100: 1) بروتينات المحللة ، ثم باستخدام SDS-PAGE الكهربائي لفصل كل عينة بروتين (50 عينة لكل بئر ميكروغرام) أكمل نقل البروتين إلى غشاء PVDF في حمام جليدي ، باستخدام 1 × نظف الشريط بمحلول منظم TBST ، وأغلق طاولة اهتزاز BSA ببطء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ، وأضف جسمًا مضادًا (AFP ، GSK3) بالتناسب ، - Catenin ، Dsh) ، احتضن في 4 درجات طوال الليل ، ثم حضن غشاء PVDF مع الجسم المضاد الثانوي المخفف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. يستخدم GAPDH كمرجع داخلي. بعد تطوير وتثبيت غشاء PVDF ، لاحظ التغيرات في التعبير البروتيني المستهدف [6].

1.3 تحليل البيانات

تم إجراء تحليل أهمية عامل واحد ANONA باستخدام SPSS 25. 0 برنامج إحصائي للتعبير عنه ؛ تم تحليل البيانات التجريبية لقياس التدفق الخلوي باستخدام Flowjo؛ استخدم Graphpad Prism 8. 0. 2 للرسم. ص<0.05 indicates a statistically significant difference, while P<0.01 indicates a highly significant difference.

2.النتائج والتحليل

2.1 تأثير TG على مورفولوجيا خلايا HepG2

الشكل 1 خلايا hepg2 المعالجة بتركيزات مختلفة من tg لمدة 24 ساعة (200x)

أثناء عملية موت الخلايا المبرمج ، أولاً وقبل كل شيء ، سوف ينخفض ​​حجمه تدريجياً ويتشوه ، وبعد ذلك ستخضع الخلايا الملتصقة ببطء لعمليات مثل الانكماش ، والتقريب ، والسفك ، وتضخم الكروموسوم داخل الخلايا. ستخضع بعض النوى للكسر والتهميش وتشكيل حويصلات موت الخلايا المبرمج. كما لوحظ في الشكل 1 و 3.5 و 10.5 μ عندما عولجت خلايا HepG2 بجم / مل TG ، انخفض حجم الخلية تدريجيًا ؛ ثم لاحظ بصريًا 21 ميكرومتر عند جم / مل ، بدأت النواة في الانكماش وأصبح الحجم أصغر ؛ واحد وثلاثون فاصلة وخمسة ميكرولتر عند جم / مل ، كانت الخلايا مصحوبة بحطام عائم وخلوي ؛ اثنان وأربعون ميكرولتر عند جم / مل ، يتمزق غشاء الخلية تمامًا ، وتخضع الخلايا للتحلل ، ويحدث النخر ، وتكون الحدود غير واضحة. الخلايا في حالة من الانهيار والموت الوشيكين.

2.2 تأثير TG على تكاثر خلايا HepG2

الشكل 2 الشكل 2 تأثير TG على تكاثر خلايا HepG2

ملاحظة: * تمثل نفس 0 μ وكان الاختلاف كبيرًا عند جم / مل (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

كما يتضح من الشكل 2 ، بعد 24 ساعة من العلاج بتركيزات مختلفة من TG ، يقتصر انتشار خلايا HepG2 على درجات متفاوتة. بالمقارنة مع معدل بقاء الخلية في المجموعة الضابطة ، يُظهر معدل بقاء الخلية في المجموعة العلاجية اتجاهًا هبوطيًا بتركيز متزايد ، وهو 96.95 بالمائة ، 92.59 بالمائة ، 92.78 بالمائة ، 77.24 بالمائة ، 31.04 بالمائة ، والتركيز 3.5 ، 10.5 و 21 على التوالي μ لم يكن هناك فرق كبير في جم / مل وكان الانخفاض صغيرًا ، بينما كان 31.5 بالمائة ميكروجرام / مل و 42 ميكرولتر عند جم / مل ، كان هناك فرق كبير (P<0.01), with an IC50 of 37.77 after TG treatment μ g/mL. CCK8 test results indicate that when TG concentration is 21 μ When the concentration is above g/mL, the inhibitory effect on HepG2 cells is better.

2.3 تأثير TG على دورة خلية HepG2

الشكل 3 الشكل 3 آثار تركيزات مختلفة من TG على دورة الخلية لخلايا HepG2

كما هو مبين في الشكل 3 ، بعد 24 ساعة من العلاج بتركيزات مختلفة من TG ، وجد أنه مع زيادة التركيز ، تنخفض طور G 0 / G1 تدريجيًا ، وهو ما يمثل 59.9 بالمائة ، 56.7 بالمائة ، 56 بالمائة ، 54 في المائة و 33.4 في المائة و 29.1 في المائة على التوالي ، مع انخفاض كبير ؛ كانت نسبة المرحلة S 14.3 بالمائة و 15.8 بالمائة و 16.8 بالمائة و 18.7 بالمائة و 25.1 بالمائة و 27.6 بالمائة على التوالي بدرجات متفاوتة من الزيادة ؛ 3. 5-21 مقارنة بمجموعة التحكم (23.88 بالمائة) μ عند جرام / مل ، فإن مرحلة G2 / M لها تغير طفيف ، حيث تمثل 25.85 بالمائة و 24.92 بالمائة و 25.33 بالمائة على التوالي. عندما يكون TG 31.5 ميكروغرام / مل و 42 ميكرولتر عند جم / مل ، فإنه يزيد بشكل ملحوظ ، 37.89 بالمائة و 39.42 بالمائة على التوالي. وجد هذا الاختبار أن TG بتركيزات منخفضة (3. 5-21 ميكروغرام / مل) ، لا يمنع انقسام الخلايا وتكاثرها بالطريقة الرئيسية التي تؤثر على دورة الخلية ، وبتركيزات عالية (31.5 ميكروغرام / مل و 42 ميكروغرام / مل) يمكن أن يؤدي إلى توقف الخلية في طور S و G2 / M ، وبالتالي يمنع تكاثر الخلايا. في الوقت نفسه ، عندما يكون TG 31.5 ميكروغرام / مل و 42 ميكرولتر عند جم / مل ، زاد subG1 أيضًا ، وهو ما يتوافق مع البحث الذي أجراه Sun Qian et al. [19] أن مشتقات الأرتيميسينين يمكن أن تزيد من ذروة subG1 لخلايا HepG2 بتركيزات عالية. ووجد أيضًا أنه مع زيادة تركيز مادة الأرتيميسينين ، تزداد نسبة خلايا الطور G2 / M. تشير نتائج دورة الخلية إلى أن TG قد يعزز تثبيط تقدم دورة الخلية ، وبالتالي يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج.

2.4 تأثير TG على هجرة الخلايا HepG2

الشكل 4 الشكل 4 آثار تركيزات مختلفة من TG على هجرة الخلايا HepG2

ملاحظة: * تمثل نفس 0 μ وكان الاختلاف كبيرًا عند جم / مل (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

يعد ورم خبيث الخلايا السرطانية أحد مفاتيح علاج السرطان ، كما أن تكرار السرطان يرتبط ارتباطًا وثيقًا به. من أجل التحقيق فيما إذا كان TG يمكن أن يمنع هجرة خلايا HepG2 ، تم استخدام طريقة الصفر لمراقبة هجرة الخلايا. كما هو مبين في الشكل 4 ، مع زيادة تركيز TG ، تقل حركة الحركة 24- تدريجيًا ، ويكون تأثير التثبيط واضحًا. التنقل 14.82 في المائة ، 13.42 في المائة ، 12.66 في المائة ، 10.11 في المائة ، 8.46 في المائة ، 7.24 في المائة ، أظهر 21 ميكروغرام / مل اختلافات كبيرة (P<0.05), 31.5 μ G/mL and 42 μ G/mL showed a significant difference (P<0.01). The results of this experiment indicate that TG can inhibit the migration of liver cancer cells, thereby limiting the metastasis of cancer to other tissues.

2.5 Hoechst 33342 / PI طريقة تلطيخ مزدوج للكشف عن موت الخلايا المبرمج

الشكل 5 تأثير تركيزات مختلفة من TG على Hoechst 33342 / PI في خلايا HepG2

تم إجراء تلطيخ نووي باستخدام Hoechst 33342 للكشف عن تكاثف الكروماتين [20]. أظهرت الخلايا الطبيعية انخفاضًا في اللون الأزرق ، وأظهرت الخلايا المبرمجية اللون الأزرق / الأحمر المنخفض ، وأظهرت الخلايا النخرية زرقاء منخفضة / حمراء عالية. كما يتضح من الشكل 5 ، مقارنة بمجموعة التحكم ، في مجموعة معالجة TG ، لوحظ تركيز الكروماتين والتجزئة النووية. في الوقت نفسه ، عندما كان TG عند 3. 5-21 ، لوحظ أن μ في نطاق g / mL ، زاد التألق الأزرق تدريجياً ، مما يشير إلى أن TG يمنع بشكل أساسي تكاثر الخلايا من خلال موت الخلايا المبرمج بتركيزات منخفضة ؛ وما يزيد عن 21 ميكرومتر عند جم / مل ، يزداد التألق الأحمر ، مما يشير إلى أن TG يتلف ويدمر بنية الخلية بشكل أساسي لقتل الخلايا بتركيزات أعلى. تشير نتائج هذه التجربة إلى أن العلاج باستخدام TG يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج ونخر خلايا HepG2.

2.6 الملحق V-FITC / PI تلطيخ مزدوج لاكتشاف تأثير TG على موت الخلايا المبرمج HepG2

الشكل 6 تأثير TG على تلطيخ AV / PI المزدوج لخلايا HepG2

ملاحظة: * تمثل نفس 0 μ وكان الاختلاف كبيرًا عند جم / مل (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

لتحديد تأثير تحفيز موت الخلايا المبرمج لـ TG على خلايا HepG2 ، استخدمنا طريقة التلوين المزدوج Annexin V-FITC / PI لتلطيخ خلايا HepG2. كما هو موضح في الشكل 6 ، مع زيادة التركيز ، يُظهر معدل موت الخلايا المبرمج اتجاهًا تصاعديًا ، 0 ، 3.5 ، 21 ، 41 μ. كانت معدلات موت الخلايا المبرمج للجرام / مل 5.63 بالمائة ، 7.65 بالمائة ، 10.93 بالمائة ، و 32.44 في المائة ، على التوالي ، بطريقة تعتمد على الجرعة. أظهرت النتائج أن TG يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق تدمير سلامة غشاء خلايا HepG2. تتوافق هذه النتيجة مع نتائج تلطيخ AV / PI لخلايا HepG2 التي ناقشها Qi Xinxin et al. [6].

2.7 تأثير TG على التعبير البروتيني في خلايا HepG2

الشكل 7 الشكل 7 تعبير البروتين في خلايا HepG2 تعامل بتركيزات مختلفة من TG

ملاحظة: * تمثل نفس 0 μ وكان الاختلاف كبيرًا عند جم / مل (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

يستخدم ألفا فيتوبروتين (أ ف ب) كعلامة مصل لتشخيص وفعالية اختبار سرطان الكبد الأولي [21]. كما يتضح من الشكل 7 ، مقارنةً بالمجموعة الضابطة ، انخفض مستوى التعبير عن AFP في مجموعة العلاج ، مما يشير إلى أن TG يمكن أن يمنع حدوث سرطان الكبد إلى حد ما ، لكن احتمال عكس سرطان الكبد ضئيل جدًا . بالإضافة إلى ذلك ، Dsh - انخفض مستوى Catenin خطيًا مع زيادة تركيز الدواء ؛ GSK -3 زادت تدريجيًا ، ولكن ليس بطريقة تعتمد على الجرعة. لذلك ، يُفترض أن TG يمكن أن ينظم التعبير النسبي Dsh - Catenin و GSK -3 ، عبر مسار الإشارات الكلاسيكي Wnt / - Catenin للحث على موت الخلايا المبرمج في خلايا HepG2.

3 .المناقشة والاستنتاج

يعد سرطان الكبد من أكثر الأورام الخبيثة شيوعًا في الصين ، كما أنه من بين الأمراض الثلاثة الأولى من حيث الوفيات[22]. تشمل طرق العلاج الرئيسية لسرطان الكبد الاستئصال الجراحي وزرع الكبد والعلاج الكيميائي والعلاج المناعي [23-25]. يُذكر أنه في عام 2016 ، كان معدل الإصابة بسرطان الكبد في الصين 9.57٪ ، وكان معدل الوفيات مرتفعًا مثل 13.92٪ [26]. "نظرًا للأعراض غير المحددة لسرطان الكبد المبكر ، بمجرد ظهور الأعراض ، تكون في الغالب في المرحلتين المتوسطة والمتأخرة. لذلك ، يكون الناس أكثر نشاطًا في استخدام الطب الصيني التقليدي لعلاج سرطان الكبد [27]." يعتقد الناس أن المركبات الطبيعية لديها أقل سمية جزيئية وأثبتت فائدتها في علاج سرطان الكبد ، لذا فهم يقومون بفحص المركبات الطبيعية الجديدة بحثًا عن سرطان الكبد.

يمكن أن تمنع الجليكوسيدات الكاملة لـ Cistanche deserticola خلايا سرطان الكبد في المرحلة المبكرة من سرطان الكبد

في السنوات الأخيرة ، آثار متعددةCistanche Deserticolaجذبت الكثير من الاهتمام وأصبحت تدريجيًا واحدة من النقاط الساخنة في تطوير الغذاء الصحي والأبحاث الدوائية. أكدت تجارب مورفولوجيا الخلية وتجارب CCK -8 أن تركيزًا معينًا من TG يمكن أن يدمر مورفولوجيا الخلية ويمنع نمو خلايا HepG2 وتكاثرها ، ويتناسب التركيز بشكل مباشر مع معدل تثبيط الخلية.

تشير دورة الخلية إلى العملية الكاملة التي تخضع لها الخلية من اكتمال الانقسام الفتيلي إلى نهاية الانقسام التالي. وهي مقسمة إلى مرحلتين: الطور البيني والانقسام. يستخدم قياس التدفق الخلوي الأصباغ الفلورية لتمييز طور G 0 / G1 ، ومرحلة S ، ومرحلة G2 / M. من خلال اكتشاف دورة الخلية ، وجد أنه بعد العلاج بتركيزات مختلفة من TG ، وجد أنه عند التركيزات العالية من TG (31.5 ميكروغرام / مل و 42 ميكروغرام / مل) يمكن أن تمنع الخلايا من التواجد في طور G2 / M ويؤثر على نشاط خلايا HepG2 ، مما يؤدي إلى تسمم الخلايا ، وبالتالي تثبيط تكاثر الخلايا. أثناء تطور السرطان ، تغزو الخلايا السرطانية من الأورام الأولية الأنسجة الطبيعية المجاورة ، وتنتقل إلى مواقع بعيدة ، وتشكل مستعمرات جديدة. تشير التقديرات إلى أن ما مجموعه 90 في المائة من الوفيات المرتبطة بالسرطان ترجع إلى ورم خبيث [28]. يشارك مسار إشارات Wnt في عملية تحول الخلايا الظهارية إلى اللحمة المتوسطة وتحول الخلايا اللحمية إلى الخلايا الظهارية لتعزيز ورم خبيث السرطان. في سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، ترتبط المستويات العالية من - Catenin بتحسين ورم خبيث وسوء التشخيص [29]. في هذه الدراسة ، وجد أن معدل هجرة خلايا HepG2 المعالجة بـ TG لمدة 24 ساعة انخفض تدريجياً مع زيادة التركيز ، بطريقة تعتمد على التركيز.يشير هذا إلى أن TG يمكن أن يتحكم في هجرة الخلايا السرطانية ويمنع انتشار السرطان بشكل أكبر ، ربما من خلال تقليل مسار إشارات Wnt - التعبير عن Catenin.بشكل عام ، تبدو النوى المصابة أصغر ؛ يركز بعض الكروماتين أو يتجمع في الأطراف ، بينما يتميز البعض الآخر بخصائص نموذجية مثل تفتيت الكروماتين النووي وتشكيل أجسام أبوطوزية [30-31]. Hoechst 33342 هي صبغة فلورية زرقاء يمكنها اختراق غشاء الخلية ولها سمية منخفضة للخلايا. وجدت بعض الدراسات أن الخصائص المورفولوجية للخلايا الأبوطوزية ، بما في ذلك التخثر النووي والتفتت ، قد لوحظت في خلايا HepG2 الملطخة بـ Hoechst 33342 [32]. في هذه التجربة ، وجد أنه بعد 24 ساعة من علاج TG ، زادت نسبة الخلايا التي تحتوي على تجلط الكروماتين والشظايا النووية الفلورية بطريقة تعتمد على التركيز ، وهو ما يتوافق مع نتائج الدراسة التي أجراها Yang et al. [33] على موت الخلايا المبرمج المستحث بالجينجيرول لخلايا HepG2. باستخدام طريقة التلوين المزدوج Annexin V-FITC / PI للكشف عن خلايا HepG2 المعالجة بـ TG لمدة 24 ساعة ، وجد أنزاد معدل موت الخلايا المبرمج للخلايا تدريجياً مع زيادة التركيز.

لتال جليكوسيدات من Cistanche deserticol

Dsh و - Catenin و GSK -3 هو Wnt / - Disheveled (Dvl / Dsh) نموذجي منظم مهم في مسار إشارات Catenin ، وهو بروتين رئيسي في مسار إشارات Wnt ويمكنه نقل إشارات Wnt إلى المصب المستجيبات [34]. في مسار إشارات Wnt الكلاسيكي ، يتم استدعاء Dsh إلى غشاء الخلية بواسطة المستقبل Frizzled ، الذي يعمل كجينات أورام أولية ويرتبط بعامل تثبيط المحور الجسدي (Axin) ، وجين داء البوليبات الغدي (APC) ، و GSK -3 الارتباط لتشكيل مركب تدهور يثبط GSK -3 نعم - أسباب تدهور الفسفرة في Catenin - يدخل Catenin في النواة والوظائف [34-36]. - يتم التعبير عن الكاتينين بشكل رئيسي في غشاء الخلية للخلايا الطبيعية ويرتبط بالالتصاق الخلوي. كما تشارك في نقل المعلومات لمسارات إشارات Wnt ، وتنظيم تكاثر الخلايا وتمايزها. عندما يتم تنشيط مسار إشارات Wnt بشكل غير طبيعي ، - قد تكون إعادة توزيع كاتينين أحد أسباب حدوث الورم [37]. يُذكر أنه يمكن ملاحظته في 20 بالمائة - 35 بالمائة من حالات سرطان الكبد [15] - تنشيط Catenin. في الوقت نفسه ، من الممكن أيضًا قمع Wnt by / - مسار إشارات Catenin الذي ينشط الالتهام الذاتي لمنع تكاثر خلايا HepG2 [38]. وجدت هذه الدراسة أنه بعد علاج TG ، فإن خلايا HepG2 ، Dsh - انخفض مستوى Catenin خطيًا مع زيادة تركيز الدواء ؛ GSK -3 زادت تدريجيًا ، ولكن ليس بطريقة تعتمد على الجرعة. لذلك ، يمكن الاستدلال على أن TG يمر بمسار إشارات Wnt / - Catenin للحث على موت الخلايا المبرمج في خلايا HepG2.

المؤشرات الحيوية الأكثر استخدامًا لسرطان الكبد الأولي في جميع أنحاء العالم هي - ألفا فيتوبروتين (أ ف ب) [39]. يلعب AFP دورًا مهمًا في المراقبة المبكرة ، والتصنيف المرضي ، واختيار العلاج ، والتشخيص للمرضى المصابين بسرطان الكبد الأساسي. بغض النظر عن طريقة العلاج ، عندما يكون مستوى البروتين الدهني أعلى من 400 نانوغرام / مل ، سيؤدي ذلك إلى ضعف البقاء على قيد الحياة [40]. من خلال الكشف عن مستوى التعبير عن بروتين AFP في الخلايا المعالجة بـ TG ،وجد أن TG يمكن أن يقلل بشكل فعال من التعبير عن AFP ، مما يشير إلى أن TG يمكن أن يلعب دورًا في تثبيط خلايا سرطان الكبد في المرحلة المبكرة من سرطان الكبد.

شاي Cistanche

في ملخص،تمنع الجليكوسيدات الكلية لـ Cistanche deserticola تكاثر ونمو خلايا HepG2 من خلال التأثير على تقدم دورة الخلية ، وتدمير بنية الخلية ، وتعزيز موت الخلايا المبرمج ، والحد من هجرة الخلايا.قد تكون آلية العمل من خلال مسار إشارة Wnt / - Catenin ، مما يؤدي إلى تنشيط GSK -3 التحلل - يمكن أن يثبط Catenin سرطان الكبد ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من البحث. في المستقبل ، يمكن للخبراء والباحثين استكشاف بعمق تطبيق Cistanche deserticola في Wnt / - تُستخدم جزيئات البروتين المنبع والمصب لمسار إشارات Catenin للتحقق من الجينات المستهدفة واستكشاف آلية عمل إجمالي جليكوسيدات Cistanche deserticola ضد خلايا HepG2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تناول cistanche deserticola في النظام الغذائي اليومي ، باعتباره مادة طبية وغذائية متجانسة ، لتوفير الوقاية والعلاج على حد سواء ، وكذلك توفير أساس نظري معين لممارسة التوقعات الغذائية العظيمة ، وتعزيز بناء "الصين الصحية" ، وتحسين المستوى الصحي للناس.

[1] FENG D ، HE Y ، JIANG YJ ، وآخرون. تقدم البحث في وظيفة مكافحة الشيخوخة من Cistanches [J]. مجلة سلامة وجودة الغذاء ، 2021 ، 12 (11): 4429-4437.

[2] Ma G و Chen J و Wei T وآخرون. تثبيط أدوار FOXA2 في هجرة خلايا سرطان الكبد وغزوها عن طريق قمع نسخ microRNA103a -3 p وتفعيل محور GREM2 / LATS2 / YAP [J]. تكنولوجيا الخلايا. 2021 ، 73: 523-537.

[3] LI MQ ، WANG K ، ZHOU X. تثبيط مونج فول الببتيدات على الانتشار في خلية HepG2 [J]. مجلة المعهد الصيني لعلوم وتكنولوجيا الأغذية ، 2018 ، 18 (10): 52-57.

[4] HU Y و WANG S و WU X وآخرون. المركبات المشتقة من الأدوية العشبية الصينية لعلاج السرطان: التركيز على سرطان الخلايا الكبدية [J]. ي إثنوفارماكول. 2013 ، 149 (3): 601-612. دوى: 10.1016 / j.jep.2013.07.030.

[5] YE Y و SONG Y و ZHUANG J وآخرون. التأثيرات المضادة للسرطان لإشنكوسايد في نموذج فأر سرطان الخلايا الكبدية وخلايا HepG2 [J]. J خلية فيزيول. 2019 ، 234 (2): 1880-1888. دوى: 10.1002 / jcp.27063

[6] QI XX ، YOU SP ، HE ZX ، وآخرون. تأثير Cistanche deserticola phenylethanol glycoside على تكاثر واستماتة خلايا HepG2 في المختبر [J]. مجلة جامعة شينجيانغ الطبية ، 2021 ، 44 (09): 1041-1047.

[7] XIE YT. تأثيرات Echniacoside على 786- موت الخلايا المبرمج والآليات الاستقرائية في المختبر [D]. كلية المعلمين باوتو ، 2020.

[8] HAN YM و JIN WM و ZENG H وآخرون ، تأثيرات Echniacoside على انتشار وغزو ورم خبيث لسرطان القولون SW480 الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي [J]. مجلة جامعة قوانغتشو للطب الصيني التقليدي ، 2020،37 (08): 1542-1549.

[9] HU Q و YOU SP و LIU T وآخرون. تحقيق في التأثير المضاد لسرطان الكبد من cistanche [J]. التسرطن والتسخين والطفرات ، 2018،30 (03): 194-199.

[10] XU Q ، QIN W ، WU FZ ، وآخرون. تأثير مغلي Roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) على المادة السوداء من خلال مسار إشارات Wnt / -catenin في الفئران المصابة بمرض باركنسون الناجم عن 6- هيدروكسيدوبامين هيدروكلوريد [ J]. مجلة الطب الصيني التقليدي ، 2021 ، 41 (05): 762-770.

[11] YIN SL، WANG HB، YANG S. التأثيرات الوقائية العصبية لسيستانش ديزرتكولا عديد السكاريد على فئران باركنسون المستحث بواسطة 6- HODA الناجم عن تنشيط مسار Wntt / -catenin Signaling [J]. مجلة الصينية 10 للطب التكاملي حول أمراض القلب والأوعية الدموية ، 2020،18 (08): 1227-1230.

[12] يثبط TANG C H. Echinacoside خلايا سرطان الثدي عن طريق قمع مسار إشارات Wnt / الكاتينين [D]. جامعة تشونغتشينغ الطبية ، 2020.

[13] FENG L ، MA QL ، SHI L ، وآخرون. يمنع Echinacein تكاثر خلايا سرطان الدم النخاعي الحاد عن طريق قمع إشارة SOX4 / Wnt / beta-Catenin [J]. المجلة المناعية ، 2020،36 (02): 138-142.

[14] كليفرز إتش وآخرون. Wnt / -catenin الإشارات والمرض [J]. خلية. 2012 ، 149 (6): 1192-205.

[15] راسل جو ، مونغا إس بي. Wnt / -Catenin الإشارات في تطور الكبد ، والتوازن ، والبيولوجيا المرضية [J]. Annu Rev Pathol. 2018 ، 13: 351-378. دوى: 10.1146 / annurev-pathol -020117-044010

[16] LIU CY، CHEN KF، CHEN PJ. علاج سرطان الكبد [J]. كولد سبرينغ هارب بيرسبكت ميد. 2015 ، 5 (9): a021535.

[17] WANG F ، LI R ، TU P ، وآخرون. يعمل إجمالي جليكوسيدات Cistanche deserticola على تعزيز استعادة الوظيفة العصبية عن طريق تحفيز تجديد الأوعية الدموية عبر مسار Nrf -2 / Keap -1 في MCAO / Rats. الحدود في علم الصيدلة 2020 ، 11 ، 236.

[18] سونغ QJ. التأثير التثبيطي لمستخلصات فاكهة Akebia على الالتصاق والهجرة وغزو خلايا الورم الكبدي HepG2 البشرية والآليات ذات الصلة [D]. جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي ، 2019.

[19] صن كيو ، وانج جيه ​​، لي واي ، وآخرون. توليف وتقييم الأنشطة السامة للخلايا لمشتقات مادة الأرتيميسينين [J]. تشيم بيول دروغ ديس. 2017 ، 90 (5): 1019-1028.

[20] ZHAO YM و SUN LN و ZHOU HY وآخرون. تشترك قنوات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد في موت الخلايا المبرمج الناجم عن الغلوتامات في الخلايا العصبية الحُصَينية للفئران [J]. نيوروسسي ليت. 2006 ، 398 (1-2): 22-27.

[21] GALLE PR ، FOERSTER F ، KUDO M ، وآخرون. علم الأحياء وأهمية البروتين الجنيني ألفا في سرطان الخلايا الكبدية [J]. Liver Int، 2019 ، 39 (12): 2214-2229.

[22] MA G، CHEN J، WEI T، et al. تثبيط أدوار FOXA2 في هجرة خلايا سرطان الكبد وغزوها عن طريق قمع نسخ microRNA -103 a -3 p وتفعيل محور GREM2 / LATS2 / YAP [J]. تكنولوجيا الخلايا. 2021 ، 73 (4): 523-537.

[23] KAMARAJAH SK ، FRANKEL TL ، SONNENDAY C ، وآخرون. التقييم النقدي للجنة الأمريكية المشتركة للسرطان (AJCC) الإصدار الثامن لنظام التدريج للمرضى المصابين بسرطان الخلايا الكبدية (HCC): تحليل المراقبة وعلم الأوبئة والنتائج النهائية (SEER) [J]. J سورج أونكول. 2018 ، 117 (4): 644-650.

[24] EDGE SB، COMPTON CC. اللجنة الأمريكية المشتركة للسرطان: الطبعة السابعة من دليل تحديد مراحل السرطان AJCC ومستقبل TNM [J]. آن سورج أونكول. 2010 ، 17 (6): 1471-1474.

[25] VAUTHEY JN و LAUWERS GY و ESNAOLA NF وآخرون. التدريج المبسط لسرطان الخلايا الكبدية [J]. مجلة علم الأورام السريري: الجريدة الرسمية للجمعية الأمريكية لعلم الأورام السريري. 2002 ، 20 (6): 1527-36.

[26] ZHENG R و ZHANG S و ZENG H وآخرون. معدل الإصابة بالسرطان والوفيات في الصين ، 2016. مجلة المركز الوطني للسرطان ، 2022 ، 2 (1) ، 1–9.

[27] ANWANWAN D، SINGH SK، SINGH S et al. التحديات في سرطان الكبد وأساليب العلاج الممكنة [J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2020 ، 1873 (1): 188314.

[28] CHAFFER CL، WEINBERG RA. منظور على ورم خبيث الخلايا السرطانية [J]. Science، 2011، 331 (6024): 1559-1564.

[29] ZHONG Z ، YU J ، VIRSHUP DM ، وآخرون. Wnts وعلامات السرطان [J]. سرطان ورم خبيث القس 2020 ، 39: 625-645.

[30] SYAM S و ABDUL AB و SUKARI MA وآخرون. تتضمن تأثيرات تثبيط نمو girinimbine على HepG2 تحريض موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية [J]. جزيئات. 2011 ، 16 (8): 7155-7170.

[31] ZHANG X و LUO W و ZHAO W وآخرون. موت الخلايا المبرمج المستحث بالإيزوكريبتوتانشينون وإشارات MAPK المنشط في خلايا سرطان الثدي البشري MCF -7 [J]. ياء سرطان الثدي. 2015 ، 18 (2): 112-118.

[32] Ponselvi Induja M ، Ezhilarasan D ، Ashok Vardhan N. Evolvulus alsinoides المستخلص الميثاني يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج في خلايا HepG2 [J]. ابن سينا ​​ج فيتوميد. 2018 ، 8 (6): 504-512 .11

[33] YANG G و WANG SP و ZHONG LF وآخرون. 6- يحفز Gingerol موت الخلايا المبرمج من خلال المحور الجسيمي والميتوكوندريا في خلايا الورم الكبدي البشري G2 [J]. Phytother Res. 2012 ، 26 (11): 1667-1673. دوى: 10.1002 / ptr.4632

[34]  LI J و GUO G و FAN YM وآخرون. أشعث يعزز تكاثر الورم الدبقي: دراسة تجريبية [J]. العلاجات والعيادات الصينية ، 2021 ، 21 (18): 3077-3080.

[35] فيدلر إم ، ميندوزا توباز سي ، رذرفورد تي جيه ، ميسزكزانيك جي ، بيينز إم ديشفلد يتفاعل مع واجهة بلمرة مجال DIX الخاصة بـ Axin للتدخل في وظيفتها في تنظيم الكاتينين الخافض للرقابة [J]. بروك Natl Acad Sci US A. 2011 ؛ 108 (5): 1937-1942. دوى: 10.1073 / pnas.1017063108.

[36]  شي QQ ، ZUO GW ، FENG ZQ ، وآخرون. دراسة عن التأثير المضاد للورم الكبدي لجينسنوسيد Rh2 وآلية تحلل الكاتينين من خلال تنشيط GSK -3 [J]. الأدوية العشبية والتقليدية الصينية ، 2016،47 (18): 3231-3238.

[37] إشارات HE S ، TANG S. WNT / -catenin في تطور سرطانات الكبد [J]. فارماكوثر بيوميد. 2020 ، 132: 110851.

[38] HU P، CHENG B، HE Y، et al. يمنع الالتهام الذاتي تكاثر خلايا HepG2 عن طريق تثبيط إشارة glypican -3 / wnt / -catenin [J]. أهداف أونكو هناك. 2018 ؛ 11: 193-200.

[39] GAO YX و YANG TW و YIN JM وآخرون. تقدم وآفاق المؤشرات الحيوية في سرطان الكبد الأولي (مراجعة) [J]. إنت J أونكول. 2020 ، 57 (1): 54-66.

[40] Tangkijvanich P، Anukulkarnkusol N، Suwangool P، et al. الخصائص السريرية والتشخيص لسرطان الخلايا الكبدية: التحليل على أساس مستويات بروتين ألفا فيتوبروتين في الدم [J]. ياء نوتر جاسترونتيرول. 2000 ، 31 (4): 302-308.

[41] FENG D ، DUAN H ، LYU YN ، وآخرون. تطبيق Cistanche Deserticola Ma في الغذاء الوظيفي في الصين [J]. علوم وتكنولوجيا الأغذية ، 2021 ، 46 (12): 76-81.