إمباغليفلوزين يخفف من أعراض مرض السكري والخلل الأنبوبي الكلوي في نموذج الفئران لمرض السكري مع تضخم الكلى (DEK)

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

أياكا دومون¹، كنتارو كاتاياما¹، توكو ساتو²يوكي توتشيغي¹، هيرويوكي تازاكي²، سوزوكي هيروتسو^1*

الملخص

معلومات أساسية: تستخدم مثبطات ناقل cotransporter 2 (SGLT2) الصوديوم على نطاق واسع لتقليل ارتفاع السكر في الدم. بحثت الدراسة الحالية في تأثيرات مثبط SGLT2 ، إمباغليفلوزين ، على ارتفاع السكر في الدم في نموذج جرذ جديد لمرض السكري من النوع 2 غير السمنة مع تضخم.الكلى(DEK). Methods: Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations ≤300 mg/dl and >تم تصنيف 300 مجم / ديسيلتر على أنها غير السكري والسكري على التوالي. تم تغذية مجموعات من الجرذان غير المصابة بمرض السكر (مجموعة التحكم) والسكري (DM-cont) طعامًا قياسيًا لمدة 12 أسبوعًا ، في حين تم إطعام مجموعة أخرى من الفئران المصابة بداء السكري (DM-empa) طعامًا قياسيًا يحتوي على إمباغليفلوزين (300 مجم / كجم / يوم) لمدة 12 أسبوعًا . تم قياس نسبة السكر في الدم ، ووزن الجسم ، وتحمل الجلوكوز ، وتناول الطعام والماء ، وحجم البول ، والبلازما ، والمعايير الكيميائية الحيوية في المسالك البولية ، وكثافة المعادن في العظام ،الكلىوالبنكرياس تم تحليلها نسيجيا. النتائج: أدى العلاج بإمباغليفلوزين إلى خفض تركيز الجلوكوز في الدم وتناول الطعام في الفئران المصابة بداء السكري ، ولكنه منع فقدان اللجام وأدى إلى زيادة وزن الجسم. خفف إمباغليفلوزين من التبول والعطاش ولكنه زاد تركيزات البلازما من الكوليسترول الكلي والصوديوم والبروتين الكلي نحو المستوى الطبيعي. كما قلل إمباغليفلوزين بشكل كبير من إفراز البول للبروتينات والإلكتروليتات واستعاد كثافة المعادن في العظام وتركيزات البلازما من الفالين والأيسولوسين إلى المستويات الطبيعية. علاوة على ذلك ، تمدد الأنابيب الكلوية والكلىلم يتم تخفيف التوسيع في مجموعة DM-empa. الخلاصة: اختلفت استجابة جرذان DEK للإمباغليفلوزين عن استجابة النماذج الحيوانية الأخرى المصابة بداء السكري ، مما يشير إلى أن فئران DEK لها خصائص فريدة لدراسة وتقييم التأثيرات البيولوجية المتعددة لمثبطات SGLT2. أشارت هذه النتائج أيضًا إلى أن إمباغليفلوزين يمكن أن يحسن التمثيل الغذائي الجهازي ويحسنكلويوظيفة الأنابيب فيمريض بالسكرالظروف.

يمنع Cistanche tubulosaالكلىالمرض ، انقر هنا للحصول على العينة

مقدمة

يستمر انتشار مرض السكري (DM) في جميع أنحاء العالم في الازدياد ، حيث يُقدر أن يصل عدد المرضى إلى 700 مليون بحلول عام 2045 [1]. يعاني حوالي 90-95 بالمائة من هؤلاء المرضى من النوع 2 DM ، والذي يتميز بالانخفاض التدريجي لإفراز الأنسولين مع أو بدون مقاومة الأنسولين [2] وهو عامل خطر رئيسي لأمراض الكلى والقلب والأوعية الدموية [3]. النوع 2 DM هو السبب الرئيسي للفشل الكلوي في نهاية المرحلة (الداء الكلوي بمراحله الأخيرة) ، مع اعتلال الكلية السكري ، ويسمى أيضًا مرض السكريالكلىالأمراض ، كونها مسؤولة عن الداء الكلوي بمراحله الأخيرة في 20-40 في المئة من هؤلاء المرضى [4]. المرضى الذين يعانون من الداء الكلوي بمراحله الأخيرة تتطلب غسيل الكلى أو زرع الكلى للحفاظ على وضعها الطبيعيوظائف الكلى. تضع هذه الإجراءات أعباء اجتماعية واقتصادية على عاتق المجتمعات والأفراد ، كما تؤثر على نوعية حياة المريض [5]. لذلك هناك حاجة إلى بذل جهود لمنع أو تخفيف مرض السكري واعتلال الكلية السكري [6].

مثبطات ناقل الجلوكوز الصوديوم 2 (SGLT2) هي فئة جديدة من الأدوية المضادة للسكري التي تعمل بشكل مستقل عن الأنسولين الداخلي [7]. تقلل مثبطات SGLT2 من تركيزات الجلوكوز في الدم عن طريق تثبيط إعادة امتصاص الجلوكوز في الأنابيب الكلوية القريبة [7]. مثبطات SGLT2 لها أيضًا تأثيرات مفيدة على المضاعفات الكلوية والقلبية الوعائية لمرض السكري [8-10] ، بالإضافة إلى تحسين التمثيل الغذائي [11] ، وكلها مستقلة جزئيًا عن آثارها الخافضة للجلوكوز. علاوة على ذلك ، تعمل مثبطات SGLT2 على تحسين النتائج الكلوية لدى المرضى غير المصابين بمرض السكري المزمنالكلىالأمراض [12]. ومع ذلك ، فإن تأثيرات مثبطات SGLT2 ، بما في ذلك النتائج الكلوية ، تختلف بين المرضى [13]. من المحتمل أن تعكس هذه الاختلافات الاختلافات في عوامل متعددة ، بما في ذلك الاستعداد الوراثي ، والحالة الأيضية ، وديناميكا الدم ، ونمط الحياة.

لقد أنشأنا مؤخرًا سلالة جرذ جديدة من النوع 2 DM غير السمنة مع تضخمالكلى(DEK) من LEA. سلالة متجانسة من الحيوانات الأليفة والحيوانات الأليفة. في سلالة DEK ، يُظهر حوالي 50 بالمائة من الذكور مرض السكري في عمر 30 أسبوعًا. أظهرت الفئران المصابة بداء السكري انخفاضًا تدريجيًا في تركيز الأنسولين في البلازما بسبب فقدان خلايا البنكرياس وزيادة النسيج الكلوي والتضخم الملحوظ في تركيز الأنسولين في البلازما.الكلىمع تمدد الأنابيب الكلوية [14]. أظهرت فئران DEK أيضًا انخفاضًا في تركيزات البلازما من الكوليسترول الكلي (TCHO) والبروتين الكلي والألبومين [14]. هذه السمات النسيجية والتمثيل الغذائي فريدة من نوعها لفئران DEK ، مما يميز هذا النموذج عن النماذج الحيوانية الأخرى لمرض السكري ويقترح أن فئران DEK يمكن أن تكون مفيدة لدراسة التأثيرات الدوائية للأدوية المضادة للسكري علىالكلىوالتمثيل الغذائي. لذلك ، قيمت الدراسة الحالية آثار مثبط SGLT2 ، إمباغليفلوزين على الكلى والتمثيل الغذائي الجهازي لجرذان DEK.

Materials and methods Animals Blood samples were obtained from the tail veins of non-fasting male DEK rats (total n = 33), and glucose concentrations were measured with GLUCOCARD PlushCare (Arkray Inc., Kyoto, Japan). Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations≤300 mg/dl and >تم تصنيف 300 مجم / ديسيلتر على أنها غير السكري والسكري على التوالي [14]. تم الحفاظ على جميع الفئران في ظل الظروف التقليدية ، بما في ذلك ضوء 14:10 ساعة: دورة مظلمة ، ودرجة حرارة الغرفة 20 ± 2 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية 50 ± 10 في المئة. تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان والاستخدام التابعة لجامعة نيبون للطب البيطري وعلوم الحياة وتم إجراؤها وفقًا لإرشادات لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في جامعة نيبون للطب البيطري وعلوم الحياة.

Male rats with blood glucose concentrations >تم تقسيم 300 مجم / ديسيلتر في عمر 15-20 أسبوعًا في سلالة DEK بشكل عشوائي إلى مجموعة نظام غذائي إمباجليفلوزين (DM-empa) (n=5) ومجموعة نظام غذائي قياسي (DM-cont) (n {{6} }) في غضون 2-3 أسابيع بعد تطوير DM. تم تعريف ذكور الجرذان التي لا تحتوي على DM (كان مستوى السكر في الدم لا يزال أقل من 300 مجم / ديسيلتر عند عمر 30 أسبوعًا) في سلالة DEK على أنها مجموعة تحكم (ن=12). كان لمجموعات التحكم و DM-cont الحصول على الماء والنظام الغذائي القياسي (CR-LPF، Oriental Yeast Co.، Ltd.، Tokyo. Japan) لمدة 12 أسبوعًا ، بينما كان لدى الفئران في مجموعة DM-empa حق الوصول إلى الماء والنظام الغذائي القياسي بالإضافة إلى إمباغليفلوزين (300 مجم / كجم ؛ إيلي ليلي اليابان ؛ كوبي ، اليابان). تم تصميم جرعة إمباغليفلوزين بالإشارة إلى التقارير السابقة [15 ، 16]. تم قياس تركيزات الجلوكوز في الدم غير الصائمين ووزن الجسم وتناول الطعام أسبوعياً. تم التضحية بجميع الفئران بعد 12 أسبوعًا ، والكلىوالبنكرياس وعينات الدم. وضعنا نقاط نهاية إنسانية لأي حيوان انخفض بنسبة 25 في المائة من وزن الجسم أو ظهرت عليه أعراض مرتبطة بمرض شديد. ومع ذلك ، لم تظهر الفئران مثل هذا الانخفاض الحاد في وزن الجسم والحالة المرضية في هذه الدراسة.

اختبار تحمل الجلوكوز الفموي (OGTT)

تم إجراء اختبارات تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) في اليوم التالي لفترة العلاج التي تبلغ 12 أسبوعًا ، كما هو موصوف [14]. لفترة وجيزة ، صُممت الفئران لمدة 16 ساعة وأعطيت 2 جم / كجم من وزن الجسم (BW) من الجلوكوز عن طريق الفم. تم الحصول على الدم من وريد الذيل ، وتم قياس تركيزات الجلوكوز 0 ، 3 0 ، 60 ، 120 ، 180 ، 240 دقيقة بعد تحميل الجلوكوز. تم أيضًا جمع عينات الدم من الوريد الوداجي تحت تخدير الأيزوفلورين الذي يتم التحكم فيه بواسطة مخدر للحيوانات الصغيرة (TK -7 ، Biomachinery ، Chiba ، اليابان) في 0 ، 30 ، و 60 دقيقة بعد تحميل الجلوكوز ، مختلطة مع الهيبارين والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على البلازما. تم قياس تركيزات الأنسولين في البلازما باستخدام LBIS Rat Insulin ELISA Kit (RTU) (Shibayagi ، Gunma ، اليابان).

قياس المعلمات الكلوية

خلال الأسبوع 12 ، تم إيواء الفئران بشكل فردي في أقفاص أيضية لمدة 24 ساعة ، وتم قياس حجم البول وحجم مياه الشرب [14]. تم قياس التركيزات البولية من الكرياتينين (Cre) ، نيتروجين اليوريا (UN) ، الكالسيوم (Ca) ، Na-K-Cl ، والجلوكوز (Glu) باستخدام Dri Chem 3500V (FUJIFILM ، طوكيو ، اليابان). تم قياس تركيزات البروتين في البول باستخدام Protein Assay Rapid Kit Wako II (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation ، طوكيو ، اليابان). تم جمع الدم من الوريد الأجوف الذيلي تحت تخدير الأيزوفلورين ، وتم قياس تركيزات البلازما من الأمم المتحدة ، والألبومين (ألب) ، والبروتين الكلي (TP) ، والكوليسترول الكلي (Tcho) ، و Ca ، و Na K-Cl باستخدام Dri-Chem 3500V. تم قياس تركيز البلازما لـ Cre باستخدام FUJIFILM VET Systems Co.، Ltd. (طوكيو ، اليابان). تم حساب تصفية الكرياتينين (Ccre) والجلوكوز (Cglu) والكالسيوم (Cca) والصوديوم (Can) والبوتاسيوم (Ck) والكلور (Ccl) باستخدام الصيغة:

التصفية (Cx) (ml / min / kg)=[تركيز البول (mg / dl أو mEq / l) × حجم البول (ml / min)] / تركيز البلازما (mg / dl أو mEq / l) / وزن الجسم (كجم).

تم حساب الإفراز الجزئي للجلوكوز (FEglu) والكالسيوم (FEca) والصوديوم (FEna) والبوتاسيوم (FEk) والكلور (FEcl) باستخدام الصيغة:

إخراج الكسر (FEx) (النسبة المئوية)=Cx (مل / دقيقة / كجم) / Ccre (مل / دقيقة / كجم) × 100.

تم قياس التركيز البولي لارتباط الأحماض الدهنية للكبد (L-FABP) باستخدام مجموعة Mouse / Rat FABP1 / L-FABP (R&D Systems ، Inc. ، MN ، الولايات المتحدة الأمريكية)

علم الأنسجة ، التألق المناعي ، وحساب المنطقة الإيجابية للأنسولين

تم قتل الحيوانات بجرعة زائدة من بنتوباربيتال الصوديوم بعد 12 أسبوعًا من العلاج. الالكلىوالبنكرياس من كل فأر الموت الرحيم ووزنها. تم إصلاح عينات الأنسجة بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد في محلول ملحي بالفوسفات (PBS) ، مدمج في البارافين باتباع الإجراءات القياسية ، ومقطع بسمك 1 ميكرومتر أو 4 ميكرون من أجل حامض شيف الدوري (PAS) وتلطيخ المناعي. تم تسجيل تمدد الأنبوب الكلوي كما هو موضح سابقًا [17]. تم تسجيل عشرة حقول مكبرة عشوائية غير متداخلة مقاس 4 0 × من القشرة الكلوية والمنطقة المجاورة للجسد. تم تسجيل تمدد أنبوبي على مقياس من {{1 0} - 3 ، حيث يشير 0 و 1 و 2 و 3 إلى 0 ،<5, 5–10,="" and="">10 dilated tubules per field, respectively. Pancreas sections were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS and incubated overnight at 4˚C with guinea pig anti-insulin polyclonal antibody (1: 100, Abcam K. K., Tokyo, Japan) or mouse anti-glucagon polyclonal antibody (1: 200, Abcam K.K.). The sections were rinsed with PBS and incubated for one hour at room temperature with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-guinea pig IgG antibody (1: 1000, Life Technologies, Carlsbad, CA) or Alexa Fluor 568 conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (1: 1000, Life Technologies). After rinsing in PBS, the sections were mounted with ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Images were acquired with a Biozero BZ-X800 all-in-one fluorescence microscope, (KEYENCE, Tokyo, Japan). Islet areas and insulin-positive areas were measured in >10 أقسام جزيرة لكل فأر باستخدام برنامج Image J ، وتم حساب النسبة المئوية للمنطقة الإيجابية للأنسولين لكل منطقة جزيرة.

تحليل كثافة العظام لعظام الفخذ

تم استئصال الفخذ من أربعة فئران غير قابلة للقتل الرحيم ، وثلاثة DM-cont ، وثلاثة جرذان DM-empa بعد فترة علاج 12 أسبوعًا وتم مسحها ضوئيًا باستخدام نظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Latheta LCT -100 ، Aloka ، طوكيو ، اليابان) . تم حساب كثافة المعادن في العظام (كثافة المعادن بالعظام ، مجم / سم 3) والمحتوى المعدني للعظام (BMC ، مجم) باستخدام برنامج Latheta.

تحليل كروماتوغرافيا الغاز لقياس الطيف الكتلي (GC-MS) للأحماض الأمينية في البلازما

Plasma samples were obtained from 30-week-old control rats and from 27–32 week-old DMcont and DM-empa rats after the 12-week treatment period. The plasma samples were treated with Phenomenex EZ: fast AA analysis kit (Phenomenex, Torrance, CA), with norvalin used as the internal standards [18]. GCMS-QP2010Plus and GCMS solution software (Shimadzu, Kyoto, Japan) were used for GC-MS analysis [19].

تحليل احصائي

تمت مقارنة النتائج ، التي تم تقديمها على أنها خطأ معياري متوسط ​​(SE) ، في مجموعتين من خلال اختبارات t للطلاب ثنائيي الذيل وفي مجموعات متعددة بواسطة اختبارات Tukey-Kramer. تم اعتبار القيمة p <0. 05="" ذات="" دلالة="">

نتائج

الحالات العامة المرتبطة بمرض السكري

أظهرت القياسات الأسبوعية لتناول الطعام أن المتوسط ​​المقدر لتناول الطعام اليومي كان أعلى قليلاً في DM-cont منه في مجموعة DM-empa (36.9 ± 1.5 جم مقابل 34.3 ± 1. 0 جم). كانت الجرعة اليومية المقدرة من إمباغليفلوزين في مجموعة DM-empa 23.7 ± 0 .7 مجم / كجم من وزن الجسم (BW). خفض إمباجليفلوزين تركيز الجلوكوز في الدم بشكل كبير في اليوم التالي لبدء العلاج ، من 4 0 4.6 ± 36.3 مجم / ديسيلتر إلى 143.8 ± 14.6 مجم / ديسيلتر) ، مع انخفاض نسبة الجلوكوز في الدم في مجموعة DM-empa بشكل ملحوظ عنها في DM - مجموعة المحتويات خلال فترة العلاج 12- أسبوعًا (الشكل 1 أ). يشبه هذا المستوى في DM-empa التحكم الطبيعي مع نظام غذائي عادي (147. {{4 0}} ± 1.2 مجم / ديسيلتر) [14]. زاد وزن الجسم تدريجيًا مع تقدم العمر في مجموعة DM-empa ، ولكن ليس في مجموعة DM-cont (الشكل 1 ب) ، حيث بلغ وزن وزن الجسم النهائي بعد 12 أسبوعًا 444.6 ± 18.0 جم في DM empa و 372.3 ± 26.4 جم في DM- مجموعة متابعة. في نفس العمر ، كان وزن الجسم المسيطر حوالي 533.4 ± 9.8 جم [14]. تمشيا مع زيادة وزن الجسم ، بقيت مقاليد adeps (1.4 ± 0.2 جم) في DM-empa ولكن ليس في مجموعة DM-cont.

تم عرض الفئران المصابة بـ DEK سابقًا على عدم تحمل الجلوكوز الشديد ، وعدم إفراز الأنسولين استجابةً لتحميل الجلوكوز ، وفقدان الخلايا [14]. قمنا بفحص ما إذا كان إمباغليفلوزين يحسن تحمل الجلوكوز وإفراز الأنسولين ويمنع فقدان الخلايا. كان مستوى الجلوكوز في الدم بعد 16 ساعة من الصيام أقل بكثير في DM-empa عنه في مجموعة DMcont ، كما كان مستوى الجلوكوز في الدم 60-240 دقيقة بعد تحميل الجلوكوز (الشكل 1C). يشبه التغيير المرتبط بالوقت في نسبة الجلوكوز في الدم في OGTT لـ DM-empa تقريبًا ذلك في فئران التحكم غير السكرية لسلالة DEK [14]. ومع ذلك ، لم يحدث إفراز الأنسولين الناجم عن الجلوكوز في أي من المجموعتين (الشكل 1 د). أظهر تلطيخ الأنسولين المناعي في جزر البنكرياس عدم وجود إشارات الأنسولين أو ضعفها في مجموعة DM-cont وحوالي 100 في المائة من الإشارات الإيجابية في الجرذان الضابطة ، في حين لوحظت إشارة الأنسولين الضعيفة ، والتي تشتمل على 24.2 ± 3.5 في المائة لكل منطقة جزيرة في ثلاثة فئران في مجموعة DM-empa (الشكل 2).

المعلمات الأيضية والكلى وقياس كثافة العظام

أظهرت قياسات المعلمات الأيضية بعد فترة علاج 12 أسبوعًا أن تناول الطعام كان أقل بشكل ملحوظ في DM-empa مقارنة بمجموعة DM-cont في كل من القيم النسبية (الشكل 3 أ) والمطلقة (S1 الشكل). بالإضافة إلى ذلك ، كان تناول الماء (الشكل 3B ، S1 الشكل) وحجم البول (الشكل 3C ، S1 الشكل) أقل بحوالي 50 بالمائة في DM-empa عنه في مجموعة DM-cont.

في نهاية فترة العلاج التي تبلغ 12- أسبوعًا ، كانت تركيزات البلازما Tcho و Cre و Alb و TP و Na أقل بشكل ملحوظ في DM-cont عنها في المجموعة الضابطة ، مع معظم هذه التخفيضات في DM-cont مجموعة تظهر الانتعاش الجزئي في مجموعة DM-empa. على وجه الخصوص ، كانت تركيزات البلازما Tcho و TP و Na أعلى بشكل ملحوظ في DM-empa عنها في مجموعة DM-cont ، على الرغم من أن كل هذه التركيزات كانت أقل في DM-empa عنها في المجموعة الضابطة. كانت مستويات البلازما Alb و Cre أعلى أيضًا في DM-empa عنها في مجموعة DM-cont ، لكن هذه الاختلافات لم تكن ذات دلالة إحصائية (الجدول 1). كانت الإفرازات البولية للجلوكوز ، والأمم المتحدة ، و Ca ، و Na ، و K ، و Cl ، والبروتين أعلى بكثير في DM-cont مقارنة بالمجموعة الضابطة ، مع تخفيف معظم هذه الزيادات في مجموعة DM-empa. على وجه الخصوص ، كانت إفرازات المسالك البولية لـ Glu و UN و Na و K و Cl أقل بكثير في DM-empa عنها في مجموعة DM-cont ، على الرغم من أن جميع هذه الإفرازات كانت أعلى بشكل ملحوظ في DM-empa عنها في المجموعة الضابطة . تم أيضًا التخفيف من الإفرازات البولية المتزايدة للكالسيوم والبروتين في مجموعة DM-empa ، مع عدم وجود فرق كبير بين مجموعات DM-empa ومجموعة التحكم (الجدول 2). باستثناء Ccre ، التي لم تختلف اختلافًا كبيرًا بين المجموعات الثلاث ، كانت جميع عمليات التطهير وإفرازات الكسر التي تم فحصها أعلى بشكل ملحوظ في DM-cont عنها في مجموعة التحكم (الجدول 3). علاوة على ذلك ، باستثناء Cglu و FEglu ، والتي ظلت أعلى في مجموعة DM-empa ، تم تخفيف معظم تلك الزيادات في مجموعة DM-cont في مجموعة DM-empa. على وجه الخصوص ، كانت Cca و Cna و Ccl أقل بشكل ملحوظ في DM-empa عنها في مجموعة DM-cont لكنها ظلت أعلى في DM-empa عنها في المجموعة الضابطة (الجدول 3).

كان كثافة المعادن بالعظام الفخذية أقل بشكل ملحوظ في DM-cont مقارنة بالمجموعة الضابطة ، حيث وجد إمباغليفلوزين استعادة كثافة المعادن بالعظام الفخذية في مجموعة DM-empa (الجدول 4). تميل BMC إلى أن تكون أعلى في DM-empa عنها في مجموعة DM-cont ، لكن الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية (الجدول 4)

أمراض الكلى

أظهرت جرذان DEK المصابة تضخمًا تدريجيًا في الكلى مع نبيبات متوسعة [14]. على الرغم من أن علاج إمباغليفلوزين أدى إلى خفض مستويات الجلوكوز في الدم بشكل كبير ، إلا أنه لم ينقص

وزن الكلى ، والذي كان مشابهًا في مجموعات DM-empa و DM-cont (2.35 ± 0. 0 8 جم مقابل 2.24 ± 0.08 جم). أظهر الفحص النسيجي أن التمدد الشديد كان بارزًا في الأنابيب الكلوية للمناطق المجاورة للنسيج في كل من جرذان DM-cont و DM-empa (الشكل 4 أ). لم يخفف إمباغليفلوزين من تمدد الأنابيب الكلوية (الشكل 4 ب و 4 ج). تماشياً مع هذا ، كان الإفراز البولي لـ L-FABP ، وهو مؤشر حيوي للإصابة الأنبوبية الكلوية [20] ، أعلى في DM-cont و DM-empa مقارنةً بالتحكم ، ولم يكن هناك فرق بين DM-cont و DM-empa ( الشكل 4 د و 4 هـ). كما ورد سابقًا [14] ، لم يكن هناك آفة كبيبية نموذجية مثل تضخم في التحكم و DM-cont و DM-empa (الشكل 4F).

تحليل GC-MS للأحماض الأمينية في البلازما

Metabolic profiling using PLS-DA multivariate analysis showed differences in amino acid status among the control, DM-cont, and DM-empa groups (S2 Fig). The loading plot corresponded to a score plot consisting of 24 amino acids (S2 Fig). The variable influences on projection (VIP) parameters are shown in S2 Fig. Amino acids colored red had VIP >1 and were considered to have a relatively high impact for separating these groups. Moreover, statistical analysis of amino acids showed a VIP >1.

يميل ساركوزين البلازما إلى أن يكون أعلى في DM-cont منه في المجموعة الضابطة ، حيث زاد إمباغليفلوزين من ساركوزين البلازما. في المقابل ، تميل البلازما التربتوفان إلى أن تكون أقل في DM-cont مما كانت عليه في مجموعة التحكم ، مع وجود إمباغليفلوزين يقلل من التربتوفان في البلازما (الجدول 5). كانت مستويات الجلايسين في البلازما متشابهة في مجموعات DM-cont و Control لكنها كانت أعلى بشكل ملحوظ في DM-empa مقارنة بالمجموعتين الأخريين. كانت تركيزات الجلوتامين والأورنيثين أقل بشكل ملحوظ في DM-cont مقارنة بالمجموعة الضابطة ولم تتم استعادتها بواسطة علاج إمباغليفلوزين. مقارنة بالمجموعة الضابطة ، كان حمض أمينوبوتيريك في البلازما أقل بشكل ملحوظ في مجموعة DM-cont ، حيث قلل إمباغليفلوزين تركيزه بشكل أكبر. كانت تركيزات البلازما فالين والإيزولوسين أعلى بشكل ملحوظ في DM-cont مقارنة بالمجموعة الضابطة ، مع استعادة هذه التركيزات إلى مستوى التحكم عن طريق علاج إمباغليفلوزين.

مناقشة

تقلل مثبطات SGLT2 من مستويات الجلوكوز في الدم بطريقة مستقلة عن الأنسولين وتظهر تأثيرات كلى في المرضى الذين يعانون من النوع 2 DM ، وكذلك في العديد من النماذج الحيوانية [8 ، 12 ، 21-23]. أجريت معظم الدراسات على الحيوانات باستخدام مثبطات SGLT2 على حيوانات بدينة مصابة بالنوع 2 DM [22 ، 24-28]. ومع ذلك ، فإن العديد من مرضى DM من النوع 2 ، خاصة في آسيا ، غير مصابين بالسمنة [29]. لا تزال آثار مثبطات SGLT2 على المرضى الذين يعانون من آفات الكلى أو مرضى السكري غير البدينين غير واضحة [29 ، 30]. بحثت الدراسة الحالية في آثار إمباغليفلوزين على التمثيل الغذائي ، ووظيفة الكلى ، وعلم أمراض الأنسجة في فئران DEK ، وهو نموذج جديد لفئران غير مصابة بداء السكري مع استعداد لتضخم الكلى [14]. مقارنة بالنماذج الحيوانية المصابة بداء السكري مع السمنة ، اتسم النمط الظاهري لفئران DEK المصابة بداء السكري بالتخفيض التدريجي لتركيز الأنسولين في البلازما بسبب فقدان خلايا البنكرياس ، بدلاً من مقاومة الأنسولين ، لذلك أظهرت فئران DEK المصابة بداء السكري انخفاضًا في وزن الجسم والدهون مع زيادة الوزن. تطور DM. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت فئران DEK المصابة بداء السكري زيادة في النسيج الكلوي وتضخم ملحوظ في الكلى مع تمدد الأنابيب الكلوية [14].

تعمل مثبطات SGLT2 على تعزيز استخدام الدهون والعضلات والأحماض الأمينية كمصادر للطاقة [31-33] ، مما يقلل من كتلة الدهون و BW في البشر والحيوانات الذين يعانون من السمنة المفرطة [28 ، 34 ، 35]. كما لوحظ فقدان كتلة الدهون وانخفاض في زيادة الوزن في القوارض غير البدينة المصابة بداء السكري والتي عولجت بمثبطات SGLT2 [31]. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر كل من البشر والقوارض الذين عولجوا بمثبطات SGLT2 فرط بلع تعويضي للحفاظ على طاقتهم وتوازنهم الغذائي [27 ، 32 ، 36]. في هذه الدراسة ، أدى علاج إمباغليفلوزين إلى خفض مستويات الجلوكوز في الدم لدى جرذان DEK في غضون 24 ساعة ، مع الحفاظ على هذه التركيزات المنخفضة طوال فترة العلاج 12- أسبوعًا ، على غرار الدراسات الأخرى لمثبطات SGLT2 [15 ، 24]. على عكس النتائج السابقة [27 ، 28 ، 36] ، وجدنا أن علاج إمباجليفلوزين يقلل من تناول الطعام ويقلل من فقدان اللجام وتثبيط اكتساب وزن الجسم. ربما كانت هذه النتيجة غير المتوقعة مرتبطة بالتحسينات في توازن الطاقة. في البداية ، كان إفراز الجلوكوز البولي أقل بشكل ملحوظ في DM-empa مقارنة بالفئران DM-cont ، على الرغم من أن Cglu الأعلى بشكل ملحوظ في مجموعة DM empa نتج عن التثبيط الكامل لإعادة امتصاص الجلوكوز ، مع FEglu بنسبة 100 في المائة تقريبًا. تم دعم هذه النتيجة بشكل أكبر من خلال الانخفاض الكبير في إفراز البول لدى الأمم المتحدة ، وهو عامل تقويض البروتين ، على الرغم من مستوى BUN الطبيعي ، في مجموعة DM-empa [37]. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت الزيادة في TP في البلازما وانخفاض البروتين البولي في مجموعة DM-empa إلى أن إمباغليفلوزين يحسن الاحتفاظ بالبروتين. قد يكون الاحتفاظ بالجلوكوز واستخدامه والارتداد من حالة تقويضية إلى حالة استيعابية في الفئران التي عولجت بالإمباغليفلوزين بسبب تحكمه الناجح في مستويات الجلوكوز في الدم.

ثبت أن مثبطات SGLT2 تزيد من حجم البول ، مع زيادة في إعادة الامتصاص الأنبوبي لتعويض الخسائر في سوائل الجسم والكهارل [21 ، 25 ، 38]. لذلك ، يزداد حجم البول مباشرة بعد بدء العلاج بمثبط SGLT2 ، ولكن العلاج طويل الأمد قد يقلل من حجم البول وكمية الماء المتناولة [38 ، 39]. على الرغم من أن مستوى كري في البلازما كان أقل بشكل ملحوظ في DM-cont و DM-empa عنه في المجموعة الضابطة ، لم يختلف Ccre بشكل كبير بين مجموعات التحكم و DM-cont و DM-empa. لذلك ، نظرًا لعدم وجود دليل واضح على تضخم الكبيبات في فئران DEK-DM [14] ، فقد يحدث بالكاد حدوث ترشيح كبيبي مفرط أو يكون خفيفًا في DM-cont. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤدي الكلية المتضخمة مع زيادة الحمة إلى زيادة عدد النيفرون ، مما يشير إلى أن الكلى المتضخمة في كل من DM-cont و DM-empa قد تكون مرتبطة بمستويات كريات البلازما المنخفضة. لذلك ، قد يكون انخفاض حجم البول في مجموعة DM-empa ناتجًا عن تحسينات في إعادة امتصاص الماء في الأنابيب الكلوية ، وليس من معدل الترشيح الكبيبي المنخفض. بشكل عام ، تم تخفيف الإفراز البولي المتزايد للإلكتروليتات في مجموعة DM-cont في مجموعة DM empa ، مما يشير إلى أن تركيزات البلازما المنخفضة للشوارد في مجموعة DM-cont قد تم تخفيفها عن طريق علاج إمباغليفلوزين عن طريق تحسين الوظيفة الأنبوبية الكلوية. تم دعم هذه الفرضية من خلال التخفيضات المتسقة في تخليصها مع إفرازات جزئية منخفضة في مجموعة DM-empa.

تم الإبلاغ عن أن مثبطات SGLT2 لها تأثيرات ضارة على العظام [31 ، 40]. لأن هشاشة العظام من المضاعفات الشائعة لمرض السكري ، قمنا بمقارنة كثافة المعادن بالعظام و BMC في المجموعات الثلاث من الفئران. كان BMD و BMC أقل بشكل ملحوظ في DM-cont مقارنة بالمجموعة الضابطة ، ولكن تم تخفيف هذه التخفيضات في مجموعة DM-empa. علاوة على ذلك ، كانت هذه الزيادات في كثافة المعادن بالعظام و BMC في مجموعة DM-empa مصحوبة بانخفاض في إفراز الكالسيوم في البول. نظرًا لأن مستويات الكالسيوم في البلازما منظمة بشكل صارم ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات الكالسيوم في البلازما بين مجموعة التحكم و DM-cont و DM-empa. تشير هذه النتائج إلى أن توازن الكالسيوم السلبي في مجموعة DM-cont قد يتم تعويضه عن طريق تعبئة a من العظم في الدورة الدموية ، مع تخفيف هذه الحالة جزئيًا بواسطة الوظيفة الأنبوبية الكلوية المحسنة لـ Ca في مجموعة DM-empa.

قد يكون توهين نقص بروتين الدم في مجموعة DM-empa ناتجًا عن تحسن في البيلة البروتينية. على الرغم من عدم ظهور فرط الترشيح الكبيبي والتضخم بوضوح في مجموعة DM-cont ، فإن انخفاض مستوى الجلوكوز في الدم قد يقلل من الترشيح الكبيبي لـ Alb. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون التحسينات في إعادة الامتصاص الأنبوبي للبروتينات والأحماض الأمينية قد ساهمت في تخليق بروتينات البلازما في الكبد. تتميز الفئران المصابة بـ DEK بتركيزات Tcho منخفضة في البلازما [14]. نظرًا لأن زيادة إنتاج Alb مصحوبة بزيادة إنتاج Tcho في الكبد [41] ، فقد تترافق المستويات الأعلى من البلازما Tcho في مجموعة DM-empa مع زيادة الإنتاج الكبدي لـ Alb. قد يكون هذا الأخير ناتجًا عن زيادة الأحماض الأمينية وإمدادات الطاقة المتعلقة بالتحسينات في احتباس البروتين وتوازن الطاقة.

يتم تحديد توازن الأحماض الأمينية ذات السلسلة المتفرعة (BCAA) إلى حد كبير عن طريق نشاط تقويضي BCAA في الأنسجة [42] ، مع وجود عيوب في توازن الأحماض الأمينية المتشعبة يعتبر مؤشرًا لمقاومة الأنسولين أو حالة مرض السكري [43-45]. أظهر تحليل GC-MS للأحماض الأمينية أن تركيزات البلازما من فالين وإيزولوسين في فئران DM-empa كانت مساوية لتلك الموجودة في فئران التحكم غير السكري ، مما يشير إلى أن علاج إمباغليفلوزين يحسن هدم البروتين وظروف مرض السكري. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أن زيادة محددة من إمباغليفلوزين في مستوى جلايسين البلازما كانت مرتبطة بتحسين مرض السكري. ومن المثير للاهتمام ، لوحظ انخفاض مستوى الجلايسين في البلازما في مرض السكري البشري [46] ، ووجد أن إعطاء الجلايسين يؤدي إلى إحداث تأثيرات مضادة للأكسدة وواقعية في الفئران المصابة بداء السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين [47]. لذلك قد تترافق مستويات الجلايسين المرتفعة في البلازما مع تخفيف الإجهاد التأكسدي واعتلال الكلية السكري لدى مرضى السكري وحيوانات التجارب المعالجة بالإمباغليفلوزين. تتأثر مستويات الأحماض الأمينية في البلازما باستخدام الأنسجة والأعضاء في جميع أنحاء الجسم ، وتعتمد على الظروف الابتنائية والتقويضية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد كيفية ارتباط التغييرات في مستويات هذه الأحماض الأمينية وغيرها بحالة التمثيل الغذائي.

تمارس مثبطات SGLT2 تأثيرات وقائية كلوية عن طريق قمع العديد من العمليات المرتبطة بأمراض الكلى ، مثل الزلال وزيادة وزن الكلى [15 ، 24 ، 48 ، 49]. يعد توسع النبيبات الكلوية والبيلة البروتينية من علامات تلف الكلى المرتبط بداء السكري [50]. ومع ذلك ، لم يكن إمباغليفلوزين قادرًا على قمع تمدد النبيبات الكلوية وزيادة إفراز البول لـ L-FABP في نموذج الفئران لدينا ، ولكن تحسن بشكل ملحوظ الوظيفة الأنبوبية. يشير هذا التناقض إلى أن التحسن المرتبط بالإمباغليفلوزين في الوظيفة الأنبوبية ناتج عن تأثيرات ثانوية أو ثانوية غير مصحوبة بتغييرات عضوية في الأنابيب الكلوية. بدلاً من ذلك ، نظرًا لأنه تم الحفاظ على التوسيع الأنبوبي مع الإصابة وزيادة وزن الكلى في ظروف السكر في الدم في فئران DEK المصابة ، فقد تكون هذه التغييرات عبارة عن سمات وراثية مرتبطة بمرض السكري في فئران DEK بدلاً من كونها ثانوية لارتفاع السكر في الدم.

على الرغم من أن مثبطات SGLT2 تستهدف الأنابيب الكلوية ، إلا أنه لا يُعرف الكثير عن تأثيرات هذه العوامل على التغيرات الكلية في وظيفة الأنابيب الكلوية ، باستثناء أن التضخم الكبيبي يتضمن النقل المشترك الأنبوبي للصوديوم مع الجلوكوز [13 ، 22 ، 24]. أظهرت الدراسات التي أجريت على تأثيرات مثبطات SGLT2 على الوظيفة الأنبوبية أن إعادة امتصاص الماء لم يتم تثبيطه فقط عن طريق إدرار البول التناضحي ولكن تم تعزيزه من خلال تنظيم ناقل الأكوابورين واليوريا بآلية غير محددة حتى الآن [21 ، 25]. تتأثر الخلايا الطلائية الأنبوبية الكلوية لمرضى السكري ليس فقط بالضغط التناضحي للجلوكوز الموجود في السائل الأنبوبي ولكن أيضًا بالجلوكوز الزائد والصوديوم الذي يتم امتصاصه في الخلايا عبر SGLT2. في الآونة الأخيرة ، تم اعتبار الإجهاد التأكسدي في الأنابيب الكلوية مهمًا لتطور اعتلال الكلية السكري (DN) ، وأظهر ipragliflozin تأثيرات وقائية كلوية عن طريق منع فرط إنتاج ROS في الأنابيب الكلوية [51]. على الرغم من عدم وجود تطور خطير في DN في فئران DEK المصابة ، إلا أن الإجهاد التأكسدي قد يضعف الوظيفة الأنبوبية. حاليًا ، لا يوجد إجماع موحد حول تأثيرات مثبطات SGLT2 على الوظيفة الأنبوبية ، مما يشير إلى الحاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح الآلية التي يعمل بها إمباغليفلوزين على تحسين الوظيفة الأنبوبية في جرذان DEK.

تم العثور على مثبطات SGLT2 للحفاظ على كتلة الخلية في النوع 1 DM ونماذج السمنة من النوع 2 DM [52 ، 53]. اكتشفنا خلايا ذات إشارات أنسولين ضعيفة في مجموعة DM-empa ، ولكن لا توجد خلايا في مجموعة DM-cont. ومع ذلك ، أظهر OGTT تحسنًا معتدلًا في تحمل الجلوكوز دون إفراز الأنسولين في مجموعة DM-empa. نظرًا لأن للإمباغليفلوزين نصف عمر قصير يبلغ حوالي 8 ساعات ، فإن انخفاض مستويات الجلوكوز في الدم التي لوحظت بعد صيام 16 ساعة والتحسن في تحمل الجلوكوز لم يكن بسبب تأثيرات إمباغليفلوزين المتبقية. لذلك ، تشير هذه النتائج إلى أن تناول إمباغليفلوزين على المدى الطويل قد يحسن استقلاب الجلوكوز ويقلل بشكل معتدل من مستوى الجلوكوز في الدم بعد تحميل الجلوكوز دفعة واحدة بطريقة مستقلة عن الأنسولين.

في الختام ، تشير نتائج الدراسة الحالية إلى أن إمباغليفلوزين يحسن التمثيل الغذائي الجهازي والوظيفة الأنبوبية الكلوية في فئران DEK ، على الرغم من أن الآليات التفصيلية الكامنة وراء الاستجابة الفريدة لهذه الحيوانات للإمباغليفلوزين لا تزال غير واضحة. تشير هذه النتائج أيضًا إلى أن فئران DEK هي نموذج مفيد لدراسة وتقييم الآثار البيولوجية المتعددة لمثبطات SGLT2 في مرض السكري.

مراجع

1. الاتحاد الدولي للسكري. IDF Diabetes Atlas 9th ed. بروكسل ، بلجيكا 2019.

2. جمعية السكري الأمريكية. تصنيف وتشخيص مرض السكري. القسم 2. معايير الرعاية الطبية لمرضى السكري -2019. رعاية مرضى السكري. 2019 ؛ 42 (ملحق 1): S13 – S28.

3. Zheng Y، Ley SH، Hu FB. المسببات والوبائيات العالمية لمرض السكري من النوع 2 ومضاعفاته. نات ريف إندوكرينول. 2018 ؛ 14 (2): 88-98.

4. Lin CC ، و Li CI ، و Liu CS ، و Lin WY ، و Lin CH ، و Yang SY ، وآخرون. تطوير والتحقق من صحة نموذج التنبؤ بالمخاطر لمرض الكلى في نهاية المرحلة في مرضى السكري من النوع 2. مندوب علوم .2017 ؛ 7 (1): 10177.

5. فالديرايبانو ف ، جوفر آر ، لوبيز-غويميز جم. جودة الحياة في مرضى الكلى في المرحلة النهائية. أنا J الكلى ديس. 2001 ؛ 38 (3): 443–64.

6. قاعة PM. الوقاية من تطور اعتلال الكلية السكري. طيف السكري. 2006 ؛ 19 (1): 18-24.

7. Hsia DS، Grove O، Cefalu WT. تحديث لمثبطات -2 الناقل المشترك للصوديوم والجلوكوز لعلاج داء السكري. السمنة السكري Opin Endocrinol السكري. 2017 ؛ 24 (1): 73-79.

8. Perkovic V ، Jardine MJ ، Neal B ، Bompoint S ، Heerspink HJL ، Charytan DM ، et al. Canagliflozin والنتائج الكلوية في مرض السكري من النوع 2 واعتلال الكلية. إن إنجل جي ميد. 2019 ؛ 380 (24): 2295-2306.

9. Sarafidis PA ، Tapas A. Empagliflozin ، نتائج القلب والأوعية الدموية ، والوفيات في مرض السكري من النوع 2. إن إنجل جي ميد. 2016 ؛ 374 (11): 1092.

10. Wiviott SD و Raz I و Bonaca MP و Mosenzon O و Kato ET و Cahn A وآخرون. Dapagliflozin ونتائج القلب والأوعية الدموية في مرض السكري من النوع 2. إن إنجل جي ميد. 2019 ؛ 380 (4): 347–357.

11. براون إي ، راجيف إس بي ، كاثبرتسون دي جي ، ويلدينج جيه ​​بي إتش. مراجعة آلية العمل ، وملف التمثيل الغذائي ، والتأثيرات الديناميكية الدموية لمثبطات -2 الناقل المشترك للصوديوم الجلوكوز. السكري السمنة ميتاب. 2019 ؛ 21 ملحق 2: 9-18.

12. Heerspink HJL ، Stefansson BV ، Chertow GM ، Correa-Rotter R ، Greene T ، Hou FF ، et al. الأساس المنطقي والبروتوكول الخاص بـ Dapagliflozin والوقاية من النتائج الضائرة في تجربة عشوائية محكومة بأمراض الكلى المزمنة (DAPA-CKD). زراعة الكلى. 2020 ؛ 35 (2): 274-282.

13. باي جي إتش ، بارك إي جي ، كيم إس ، كيم إس جي ، هان إس ، كيم إن إتش. آثار مثبطات ناقل cotransporter 2 الصوديوم الجلوكوز على النتائج الكلوية في مرضى السكري من النوع 2: مراجعة منهجية وتحليل تلوي للتجارب المعشاة ذات الشواهد. ممثل العلوم .2019 ؛ 9 (1): 13009.

14. Domon A ، Katayama K ، Tochigi Y ، Suzuki H. توصيف نموذج الجرذ الجديد غير المصاب بداء السكري من النوع 2 مع تضخم الكلى. J داء السكري الدقة. 2019 ؛ 2019: 8153140. بميد: 31467929

15. Vallon V و Gerasimova M و Rose MA و Masuda T و Satriano J و Mayoux E وآخرون. يقلل مثبط SGLT2 إمباغليفلوزين من النمو الكلوي والبيلة الزلالية بما يتناسب مع ارتفاع السكر في الدم ويمنع فرط الترشيح الكبيبي في فئران أكيتا المصابة بداء السكري. أنا J Physiol الكلوي Physiol. 2014 ؛ 306 (2): F194–204.

16. Vickers SP ، Cheetham SC ، Headland KR ، Dickinson K ، Grempler R ، Mayoux E ، et al. إن الجمع بين مثبط ناقل الصوديوم والجلوكوز -2 إمباغليفلوزين مع أورليستات أو سيبوترامين يحسن أيضًا من إنقاص وزن الجسم وتوازن الجلوكوز لدى الفئران البدينة التي تغذت على نظام كافيتريا الغذائي. متلازمة ميتاب السكري. 2014 ؛ 7: 265-75.

17. Glastras SJ ، Chen H ، The R ، McGrath RT ، Chen J ، Pollock CA ، وآخرون. نماذج الفئران لمرض السكري والسمنة وأمراض الكلى ذات الصلة. بلوس واحد. 2016 ؛ 11 (8): e0162131.

18. بدوي أ ، مورجان سي جيه ، تيرنر جا. تطبيق مجموعة Phenomenex EZ: faast ™ لتحليل الأحماض الأمينية من أجل التحديد السريع للكروماتوغرافيا الغازية لتركيزات التربتوفان في البلازما ومنافسيه امتصاص الدماغ. أحماض أمينية. 2008 ؛ 34 (4): 587-96.

19. ميتشيشيتا إم ، سايتو إن ، نوزاوا إس ، فوروموتو آر ، ناكاجاوا تي ، ساتو تي ، وآخرون. التنميط المستقلب في الخلايا المكونة للكرة من خطوط خلايا سرطان الغدة الثديية للكلاب باستخدام مقياس الطيف الكتلي للكتلة الغازية. J Vet Med Sci. 2019 ؛ 81 (9): 1238-1248.

20. Kamijo-Ikemori A ، Sugaya T ، Kimura K. البروتين المرتبط بالأحماض الدهنية البولية في أمراض الكلى. كلين شيم اكتا. 2006 ؛ 374 (1-2): 1-7.