توظيف المركبات الفينولية من نباتات الزيتونالماء في الدجاج اللاحم: الآثار على ميكروبات الأمعاء وعلى العمر الافتراضي لشرائح الثدي الجزء 3

يرجى الاتصالoscar.xiao@wecistanche.comلمزيد من المعلومات

2.7.أكسدة الدهون

تمت دراسة أكسدة الدهون من خلال قياس الثانوية (TBARs) والابتدائية (D232 و D270)الاكسدهالمركبات (الجدول 7). ولم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات التجريبية الثلاث، وإن كان من الجدير بالذكر أن هناك زيادة طفيفة في قيم TBARs للدجاج في المجموعة L2 فيما يتعلق بتلك الموجودة في المجموعتين L1 و L0، في حين أظهر D232 الاتجاه المعاكس. كان هذان المؤشران التحليليان مرتبطين بشكل كبير (TBARs مقابل D232 r = -0.5,p<0.001 and="" tbars="" vs.="" d270r=""><0.05). the="" cooking="" treatment="" caused="" decreases="" in="" the="" primary="" oxidation="" products=""><0.01), which="" were="" followed="" by="" increases="" in="" the="" secondary="" ones="" (p=""><0.001). no="" interactions="" between="" diet="" and="" cooking="" were="" observed.="" on="" the="" contrary,="" [31]and="" [45]="" observed="" a="" significant="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" breasts="" from="" chickens="" whose="" diets="" were="" supplemented="" with="" either="" olive="" cake="" or="" omww.="" similarly,="" [46]="" observed="" a="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" quadriceps="" femoris="" of="" chickens="" whose="" diets="" were="" enriched="" with="" omww="" permeate="" and="" the="">

يرجى الضغط هنا لمعرفة المزيد

أضاف Oke et al. [16] كميات مختلفة من مستخلص أوراق الزيتون (5 و 10 و 15 مل / لتر) إلى مياه الشرب المقدمة إلى دجاج التسمين من سلالة Abor acre ، مع ملاحظة تأثير كبير على انخفاض مستويات الدم من malondialdehyde (MDA). لاحظ إبراهيم وآخرون [42] انخفاضا كبيرا في تركيز MDA في صدور الدجاج التي تم الحصول عليها عن طريق إضافة النظام الغذائي مع زيادة مستويات ثفل الزيتون المجفف المخمر أو المخمر إنزيميا. على عكس الدراسات الأخرى ، لم يلاحظ تأثير وقائي ضد أكسدة الدهون العضلية في الأنسجة العضلية في الدراسة الحالية. هناك العديد من العوامل التي تولد التباين والاختلافات بين الدراسات. بصرف النظر عن سلالة الحيوانات وطول فترة التسمين ، فإن عوامل أخرى مثل التركيب الغذائي للنظام الغذائي ، وتناول الأعلاف ، ودرجة الحرارة البيئية جنبا إلى جنب مع الظروف المجهدة الأخرى يمكن أن تؤدي إلى نتائج مختلفة جدا يصعب مقارنتها في كثير من الأحيان. ليس الأخير نوع المصفوفة التي يتم إثراء النظام الغذائي بها بالفينولات (كعكة الزيتون ، ثفل الزيتون ، مستخلص أوراق الزيتون ، مستخلص الماء الخضري ، على سبيل المثال لا الحصر) بسبب تركيز المركبات النشطة ووجود مواد إضافية مع عمل تآزري أو وقائي موجود في نفس المصفوفة ، يمكن أن يؤثر بشكل كبير على عمل مضادات الأكسدة سواء في الجسم الحي أو في أنسجة اللحوم بعد الذبح [47]. الفوائد الصحية المحتملة من دمج المضافات المضادة للأكسدة في اللحوم الطازجة ومنتجات اللحوم ليست مثبتة دائما [48]. على العكس من ذلك ، فإن العديد من مركبات أكسدة الدهون والبروتين الأولية والثانوية ، مثلهيدروبيروكسيدات، الإيبوكسيدات,,4-هيدروكسي نونينال ، مالونالدهيديتم التعرف عليها كمواد مسرطنة محتملة أو يمكن أن تؤثر على نقل الإشارة الخلوية كما هو الحال في مركبات الكربونيل [49]. في حالة اللحوم الطازجة ، فإن إمكانية زيادة إمكانات مضادات الأكسدة من خلال تقنين الحيوانات هي احتمال موحي للغاية ، خاصة في استخدام المواد الطبيعية بدلا من المواد الاصطناعية. في الواقع ، على عكس المنتجات القائمة على اللحوم حيث توفر التكنولوجيا إمكانيات مختلفة للتدخل لزيادة إمكانات مضادات الأكسدة ، فإن البديل الوحيد للتدخل في اللحوم الطازجة من خلال النظام الغذائي للحيوانات هو العلاج الذي يستهدف سطح المنتج الذي يجب أن يكون متسقا مع التشريعات المعمول بها. من غير المرجح أن تسبب الكمية المتبقية من الفينولات المقاسة في لحم الثدي في هذه الدراسة فوائد صحية مباشرة ولكن يمكن أن تفعل ذلك بشكل غير مباشر. على سبيل المثال ، يتسبب طهي اللحوم في فقدان صاف لدفاعات الأنسجة المضادة للأكسدة ، وبالتالي فإن إثراء أنسجة اللحوم بمركبات لا تزال نشطة حتى بعد المعالجة الحرارية ، كما هو الحال فيالفينولات، ذات أهمية كبيرة للتطبيق في ضوء زيادة العمر الافتراضي وسلامة المنتج نفسه. السبب في عدم ملاحظة تأثيرات الفيديو أو الفيديو السابقة نتيجة لتجربة التغذية باستخدام CPC ، يستحق المزيد من التحقيقات التجريبية ، خاصة فيما يتعلق بالتفاعل بينالبوليفينول الغذائيوالميكروبات المعوية للدجاج التي تستفيد من جزء كبير من الآثار الكيميائية الحيوية المحتملة للفينولات [9,10].

3. المواد والأساليب 3.1. المرافق التجريبية

أجريت التجربة في بيت الدواجن في المزرعة التجريبية بجامعة بادوفا (ليغنارو ، بادوفا ، إيطاليا) بعد 6 أشهر من التوقف. تم تجهيز بيت الدواجن بنظام تبريد وتهوية قسرية وتسخين مشع وأنظمة إضاءة خاضعة للرقابة. تم استخدام ما مجموعه 12 قلم شبكي سلكي (2.5×2.4 م ؛ 6 م 2) ، كل منها مجهز بخمسة شاربين للحلمة (المسافة: 20 سم) ووحدة تغذية دائرية (قطرها: 30 سم) للتوزيع اليدوي للأعلاف. كان لكل قلم أرضية خرسانية مغطاة بفضلات حلاقة الخشب (عمق 5 سم ، 2.5 كجم / م).

تم توفير الضوء 24 ساعة / يوم لأول يومين بعد وصول الدجاج إلى بيت الدواجن. بعد ذلك ، تم تقليل عدد ساعات الضوء تدريجيا حتى تم تحقيق فترة ضوئية 18L: 6D ، والتي تم الحفاظ عليها بعد ذلك من عمر 12 يوما فصاعدا.

Cistanche يمكن أن يحسن المناعة

3.2. الحيوانات والمجموعات التجريبية وتسجيلات الجسم الحي

تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات (Organismo per la Protezione del Benessere Animale; OPBA)من جامعة بادوفا (المشروع 17/2016; لا يوجد 154392 من 10 مايو 2016). تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا لمبادئ التوجيه 2010/63/EU[50] بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى. كان الباحثون المشاركون في التعامل مع الحيوانات إما متخصصين في الحيوانات (درجة الدكتوراه أو الماجستير في علوم الحيوان) و / أو ممارسين بيطريين.

تم تسليم ما مجموعه 144 كتاكيت عمرها يوم واحد (روس 308) بواسطة شاحنة تجارية ، وفقا للائحة المجلس (EC) رقم 1/2005 [51] ، إلى المرافق التجريبية للجامعة. تم تطعيم جميع الكتاكيت ضد مرض ماريك والتهاب الشعب الهوائية المعدية ومرض نيوكاسل في المفرخ. تم وزن الكتاكيت بشكل فردي في يوم وصولها ، وتم تحديدها بواسطة علامة الساق ، وتم توزيعها عشوائيا بين الأقلام ال 12 (12 طائرا لكل قلم و 10 طيور / متر مربع)），ثم وزنها مرة واحدة في الأسبوع لقياس وزنها الحي حتى الذبح التجاري. تم قياس استهلاك تغذية القلم يوميا أثناء التجربة. تم إعطاء ثلاثة أنظمة غذائية تجارية في شكل منهار خلال التجربة (Martini SpA Longiano ، Forli-Cesena ، إيطاليا): النظام الغذائي P1 من 0 إلى 23 d ، النظام الغذائي P2 من 24 إلى 37 d ، والنظام الغذائي P3 من 38 d حتى الذبح في 48 يوما (انظر المواد التكميلية للحصول على البيانات التحليلية ، الجدول S1). تم الحصول على مركز الفينول الخام (CPC) كما هو موضح من قبل [12] ، لفترة وجيزة ، تمت معالجة OVWs باستخدام إنزيمات ذات أنشطة البكتيناز و hemicellulosic ثم تعرضت للترشيح الدقيق والترشيح الفائق والتناضح العكسي. تمت إضافة CPC إلى الوجبات الغذائية على النحو التالي: (i) L0 Control diet (P3) ، (ii) L1 Control diet بالإضافة إلى CPC (220 mg / kg feed as theoretical total phenols) ، (i) L2 Control diet plus CPC (440 mg / kg feed as theoretical total phenols). وأبلغ في الجدول دال-2 عن المحتوى الفعلي للمركبات الفينولية الفردية للكلوريد متعدد الكلور والوجبات الغذائية. تم تكرار كل نظام غذائي في أربعة أقلام (متجانسة للوزن الحي الأولي والتقلب). وتم توريد التصنيف المركزي للمنتجات من عمر 24 يوما (د) حتى الذبح التجاري في سن 48 (انظر المواد التكميلية للتكوين الفينولي للتصنيف التعاوني للمنتجات). تم إطعام جميع الحيوانات بشكل خاص طوال التجربة ، وتم إعداد الوجبات الغذائية المكملة أسبوعيا.

لتحديد تكوين المجتمع الميكروبي المعوي ، تم جمع مسحات عباءة (4 / قلم) في 23,34 ، و 44 د من العمر لما مجموعه 12 حيوانا (4 في كل نظام غذائي) الذين تم اختبارهم ثلاث مرات (36 عينة مسحة تم جمعها في المجموع).

3.3. الذبح التجاري ، وتسجيل جودة الذبيحة واللحوم

في عمر 48 يوما ، بعد سحب الأعلاف والمياه (لمدة 7 و 2 ساعة ، على التوالي) ، تم ذبح جميع الدجاج في مسلخ تجاري. تم وزن الدجاج بشكل فردي قبل القفص. تم تحميل جميع الدجاج من القلم في قفص نقل (الارتفاع ، 62.5 سم × 160 سم × 25.0 سم ؛ مساحة الأرضية，1 م²）. استغرق التحميل والنقل من المرافق التجريبية إلى المسلخ التجاري والمخابئ قبل الذبح حوالي 3 ساعات. تم ذبح الدجاج وفقا للممارسات القياسية للمسلخ التجاري. تم استرداد الجثث بعد 2 ساعة من التبريد عند درجتين مئويتين وتم وزنها بشكل فردي لقياس نسبة خلع الملابس المذبوحة [52].

بعد أربع وعشرين ساعة من الذبح ، تم تشريح الجثث للحصول على العضلات الرئيسية الصدرية المنفصلة عن الثديين [53].

خلال التجربة ، كانت هناك خسارة مسجلة بنسبة 17.4٪ (25 دجاجة) بسبب الوفيات. ومن بين 119 جثة(72)، خصصت للتحليلات الميكروبيولوجية خلال فترة الصلاحية (يشرح القسم 2-4 إنشاء تكوين ميكروبات الثدي بطرق تعتمد على الثقافة ومستقلة)، في حين تم تجميد ال 47 جثة المتبقية (-40 درجة مئوية) واستخدمت لاحقا لتقييم التراكيب القريبة ومعدلات أكسدة الدهون في اللحوم النيئة والمطبوخة (الفقرة 3-5).

4.3تقييم مدة الصلاحية

3.4.1.تحضير صدور الدجاج المعبأة

تم تعبئة العضلات الرئيسية P بشكل فردي في صواني البولي إيثيلين منخفضة الكثافة ملفوفة في فيلم PVC بسماكة 12 ميكرومتر（فايغل，كويكس412，جروبو فابري，فينيولا，مودينا，إيطاليا)وتخزينها في 4±1°C.in خزانة مبردة (Majolo" بالإضافة إلى 100 Spiceing Con-troller، Majolo، Cadoneghe، بادوفا، إيطاليا). تم إصلاح التعرض للضوء من الساعة 8:00 إلى الساعة 20:00 باستخدام مصباح فلورسنت بقوة 36 واط [54]. تم تصميم إعدادات التخزين بقصد محاكاة ظروف التبريد أثناء البيع. تم أخذ عينات عشوائية من الطرود في 24،72،120 و 180 و 216 و 264 ساعة من تاريخ الذبح

3.4.2. التحليل الحسي

تم إجراء تقييم حسي للثديين الطازجين وفقا ل [37] باستخدام نظام تسجيل 3 نقاط غير مقبول (1 = غير مقبول ، 2 =مقبول ، 3 = نوعية جيدة). تم حساب المؤشر الحسي الاصطناعي (SI) على أنه [(2×درجة الرائحة + 2× درجة اللون + 1× درجة الملمس)/5] ، مع درجة 1.8 بمثابة عتبة لتحديد العينات المدللة. تم إجراء التحليل الحسي من قبل ثمانية أعضاء مدربين.

3.4.3.التحليل الميكروبيولوجي للحوم الثدي خلال فترة الصلاحية

تم إجراء التحليلات الميكروبيولوجية وفقا للإجراءات الموصوفة من قبل [38]. تم استئصال العضلات الرئيسية الصدرية (حوالي 2 سم ×1 سم عمقا × 2 سم) بشكل معقم على طول كل ثدي للحصول على عينة تمثيلية من 25 لكل ثدي. تم خلط العينات في كيس معدة مع 225 مل من ماء الببتون المخزن مؤقتا وتحليلها بعد التخفيفات المناسبة. لاستخراج الحمض النووي، تم جمع 1 مل من كل متجانس في أنابيب إبندورف 2 مل وتم طرده مركزيا عند 13500× غرام لمدة دقيقة واحدة (جهاز الطرد المركزي إبندورف 5425، هامبورغ، ألمانيا). ثم ، تم التخلص من supernatant وتم تجميد الكريات عند -80 درجة مئوية. تم التحقيق في العديد من الأهداف الميكروبية لوصف ديناميكيات السكان الميكروبيين خلال فترة الصلاحية على النحو التالي: تم تقييم إجمالي العدد القابل للحياة (TVC) وإجمالي عدد التغذية النفسية (TPC) على Plate Count Agar (Biokar Diagnostics ، Beauvais ، فرنسا) ، وتم احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 72 ساعة أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام. تم تعداد البكتيريا المعوية مع أجار الجلوكوز الصفراوي الأحمر البنفسجي (Biokar Diagnostics، Beauvais، فرنسا) عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم تحليل بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) على دي مان وروغوسا وشارب أجار (Biokar Diagnostics، Beauvais، فرنسا) تحت ظروف لاهوائية عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تم تقييم العد على قاعدة Pseudomonas Agar مع مكملات السيتريميد والفوسيدين والسيفالوريدين عند 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (Oxoid Ltd. ، Basingstoke ، هامبشاير ، المملكة المتحدة). تم إجراء تعداد البكتيريا المنتجة ل H2S (المفترض Shewanella spp.) على أجار الحديد (Lyngby ، Laboratorios Conda ، Torrejon de Ardoz ، إسبانيا) عند 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. يتم الإبلاغ عن النتائج على أنها log10 CFU / g اللحوم.

3.4.4.pH وفقدان بالتنقيط

تم استخدام مقياس الأس الهيدروجيني (Portamess 910 ، Knick ، برلين ، ألمانيا) ، المجهز بقطب كهربائي محدد (Mettler Toledo ، ميلانو ، إيطاليا) ، لقياس قيم الأس الهيدروجيني عن طريق الإدخال في العضلات الرئيسية الصدرية في ثلاثة أضعاف على جانبها البطني. تم تقييم فقدان التنقيط وفقا للطريقة التي قدمها [55] باستخدام طريقة الحقيبة. تم إدخال ما يقرب من 2.5 سم من شرائح مقطوعة من سطح الثديين الظهريين في أكياس البولي إيثيلين وعلقت بين عشية وضحاها عند 2±1 درجة مئوية. تم حساب فقدان التنقيط (٪) بواسطة المعادلة التالية: [(الوزن الأولي - الوزن النهائي)/الوزن الأولي].

3.4.5. تركيز الفينول في النظام الغذائي وفي عضلة الثدي

تم استخراج الفينولات على 5 غرام من عينة النظام الغذائي المفروم الممزوج ب 50 مل من الميثانول / الماء (محلول 80/20 (o / o) يحتوي على 20 ملغ / لتر من هيدروكسي تولوين بوتيل (BHT) ، تم تجانس الخليط باستخدام مشتت قضيب (IKA ، T50 Ultra-Turrax ، Werke ، Staufen ، ألمانيا) لمدة دقيقة واحدة عند 7000 دورة في الدقيقة ، تم طرد مركزي عند 9327×g لمدة 10 دقائق وتعافى السوبرناثان. تم تكرار الإجراء مرتين ، ثم تم تركيز المستخلص الذي تم جمعه بواسطة مبخر دوار (Buchi Rotavapor ، R-210 ، سويسرا) حتى وصل إلى الحجم النهائي البالغ 20 مل.تم تحميل خراطيش SPE Bond Elut Jr-C18,1 g (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، التي تم تنشيطها سابقا ب 10 مل من الميثانول و 10 مل من الماء ، مع 1 مل من المستخلص المائي تم إجراء الاستخلاص مع 50 مل من الميثانول. بعد إزالة المذيبات تحت الفراغ ، تم إذابة مستخلص الفينول في 1 مل من محلول يتكون من الميثانول / الماء (50: 50 v / v) وتمت تصفيته من خلال مرشح حقنة فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (0.2 مم). تم إجراء التحليل النوعي والكمي للمركبات الفينولية للمستخلص وفقا ل [31] بواسطة

HPLC (Mod. 1100 Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مجهز بعمود C18 (Spherisorb ODS-1 (250 مم × 4.6 مم) 5 حجم جسيمات أم ، مقدم من Waters S.p.A. (ميلانو ، إيطاليا). تم الكشف عن المركبات الفينولية باستخدام مجموعة DAD عند 280 نانومتر. تم تحديد القياس الكمي للبوليفينول باستخدام منحنيات معايرة واحدة لكل مركب ويتم التعبير عن النتائج على أنها mg kg-1. تم الحصول على هيدروكسي تيروسول (3,4-DHPEA) من Cabru S.p.A. (ميلانو ، إيطاليا) ، وتم شراء tyrosol p-HPEA من Merck Life Science S.r.l. (ميلانو ، إيطاليا) ، وتم أخذ verbascoside من Extrasynthese(Genay ، فرنسا). تم استخراج شكل ديالدهيد من de-carboxymethyl oleuropein aglycone (3,4-DHPEA-EDA) من زيت الزيتون البكر وفقا للإجراء المبلغ عنه من [56].

تم خلط ما مجموعه 10 غرامات من اللحوم مع 50 مل من الميثانول والماء（80/20，س/س）يحتوي على حمض الفورميك 0.2٪ و 20 ملغ / لتر من BHT. تم تجانس المحلول باستخدام مشتت قضيب (IKA ، T50 Ultra-Turrax ، Werke ، Staufen ، ألمانيا) لمدة دقيقة واحدة عند 7000 دورة في الدقيقة ، وطرد مركزي عند 4146×g لمدة 10 دقائق وتعافى supernatant. تكررت العملية مرتين ، وتم جمع اثنين من الأليكوت من المستخلص وتمت إزالة الميثانول بواسطة المبخر الدوار (Buchi Rotavapor ، R-210 ، سويسرا). تم تحميل عشرين مل من المستخلص المائي إلى خراطيش SPE Bond Elut HF Mega BE-C18,5g (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، التي تم تنشيطها سابقا ب 20 مل من الميثانول و 20 مل من الماء ؛ تم إجراء الاستخلاص باستخدام 50 مل من الميثانول. بعد إزالة المذيبات تحت الفراغ ، تم استرداد مستخلص الفينول مع 0.5 مل من محلول يتكون من الميثانول / الماء（50∶50 س/ø）وتصفيتها من خلال فلوريد البولي فينيلدين（بي في دي إف）مرشح حقنة (0.2 مم). تم إجراء تحليلات HPLC للمستخلصات الفينولية وفقا ل [56] بنفس المعدات كما ورد أعلاه. تم الكشف عن هيدروكسي تيروسول باستخدام كاشف التألق (FLD) الذي يعمل بطول موجي مثير يبلغ 280 نانومتر وانبعاث 313 نانومتر. تم إجراء القياس الكمي لهيدروكسي تيروسول باستخدام منحنى المعايرة ويتم التعبير عن النتائج على أنها ميكروغرام / كجم.

3.5. التركيب القريب ، وفقدان الطهي ، وتحليل الأحماض الدهنية

تم تقييم التركيب القريب ، وملف تعريف الأحماض الدهنية ، والاستقرار التأكسدي على كل من العينات الخام (الجانب الأيمن P. major) والمطبوخة (الجانب الأيسر P. maijor). بعد ذوبان الجليد ، تم تقييم فقدان الطهي وفقا ل [53] مع التعديلات التالية: تم وزن النصف الأيسر من كل ثدي ، وتعبئته بالتفريغ ، وطهيه في حمام مائي عند 80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، تم تبريد الثديين حتى 4 درجات مئوية والاحتفاظ بهما في الثلاجة (4 درجات مئوية) لمدة 72 ساعة قبل تفريغهما ووزنهما مرة أخرى لحساب فقدان الطهي على أنه [(وزن اللحم النيئ المطبوخ بوزن اللحم) / وزن اللحم النيء]×100). كانت العضلات، النيئة والمطبوخة على حد سواء، مطحونة ناعما (مرتين 2500 دورة في الدقيقة×10 ثانية، ريتش، دوسلدورف، ألمانيا) وخضعت لتحليل الرطوبة والبروتين الخام والرماد [57]، في حين تم تحديد محتوى الدهون الخام باستخدام الطريقة التي قدمها [58]. باختصار ، تمت إضافة 200 مل من خليط ثنائي كلورو الميثان / الميثانول 1: 1 إلى 5 جم من العينة ، متجانسة عند 11000 / دقيقة لمدة دقيقة واحدة (Ultraturrax T25 Basic ، Ika Werke. Staufen، ألمانيا)، ويتم احتضانها عند درجة حرارة 60 درجة مئوية في فرن (نظام PID، M120-VF، أدوات MPN، بيرناجيو، MB، إيطاليا) لمدة 20 دقيقة. في وقت لاحق ، تمت إضافة 100 مل أخرى من ثنائي كلورو الميثان ، وبعد التجانس (11000 / دقيقة لمدة دقيقة واحدة) تمت تصفية العينة (ورق الترشيح السريع) وأضيفت 100 مل من KCl 1 M إلى النفاذية. بعد الطرد المركزي (AvantiJ-E ، Beckman Coulter ، Brea ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 1000×g لمدة 30 مترا عند 4 درجات مئوية ، تم تفريغ supernatant وتم ترشيح المستخلص العضوي من خلال كبريتات الصوديوم اللامائية. تم استخدام أليكوت (حوالي 10 جم) لتحديد الجاذبية لنسبة الدهون ، وتم تقطير الباقي (Rotavapor"R-210 ، Büchi ، Essen ، ألمانيا) ، وتم استخدام الدهون اللامائية لمزيد من التحليل. تم تحضير استرات ميثيل الأحماض الدهنية (FAMEs) عن طريق وزن 0.015 غرام من الدهون اللامائية في أنبوب زجاجي مع غطاء لولبي [39] ، والذي تم إذابته مع 1 مل من 3 M ميثانوليك HCl (سيغما ألدريتش ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتحضينها لمدة 2 ساعة عند 60 درجة مئوية. ثم ، تمت إضافة 1 مل من الماء منزوع الأيونات و，بعد الخلط，تم استرداد FAMEs في 1 مل من n-hexane. الشهرات（1 ميكرولتر）تم تحليلها بواسطة كروماتوغراف الغاز (Shimadzu Italia Srl ، طراز 2014 ، ميلانو ، إيطاليا) مجهز بكاشف تأين اللهب (مضبوط على 250 درجة مئوية) وحاقن بدون انقسام (محدد عند 280 درجة مئوية). تم الاحتفاظ بالغرفة الحرارية ، التي احتفظت بالعمود الشعري (Supelco SP-2560 ؛ 100 m ×0.25 mm ×0.2 um) ، عند 60 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. ثم تم زيادة درجة الحرارة إلى 120 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة بمعدل 10 درجات مئوية / دقيقة ، ثم من 120 إلى 240 درجة مئوية بمعدل 2.5 درجة مئوية / دقيقة. تم الاحتفاظ بالإيزوثرم النهائي عند 240 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم تحديد الأحماض الدهنية باستخدام خليط قياسي خارجي (37 Component FAME Mix ، Supelco ، ألمانيا). وأجريت التحليلات في نسختين.

3.6.أكسدة الدهون

تم تحديد مركبات الأكسدة الأولية على أنها داينات مترافقة عن طريق التحليل الطيفي الضوئي في مجال الأشعة فوق البنفسجية باستخدام نسخة معدلة من الطريقة المشار إليها في ملحق Reg.EU/2015/1833 المجلس [59]. باختصار ، 0.01±0.001g من الدهون اللامائية وزنت في قارورة متدرجة 10 مل وذابت بواسطة سيكلوهكسان الصف الطيفي حتى العلامة. تم استخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية / Vis (Mod. 7800 Jasco UV / VIS ، أوكلاهوما سيتي ، أوكلاهوما سيتي ، أوكلاهوما سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحديد قيم الانقراض المحددة عند 232 (dienes مقترنة) و 270 نانومتر (trienes مترافقة) باستخدام نفس المذيب مثل المرجع. تم تحديد المنتجات الثانوية لأكسدة الدهون وفقا للطريقة التي قدمها [60] مع التعديلات ، على النحو التالي: في أنبوب جهاز طرد مركزي ، تمت إضافة 8 مل من محلول مائي من 5٪ (م / v) حمض ثلاثي كلورو أسيتيك و 5 مل من n-hexane إلى ما يقرب من 2 غرام من العينة المتجانسة. بعد التجانس مع Ultraturrax ل 30s بسرعة عالية. تم طرد العينة مركزيا لمدة 3 دقائق عند 3000× جم عند 4C (Eppendorf 5810R ؛ Eppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا) ، وتمت إزالة supernatant. تمت تصفية العينة من خلال مرشح ورقي سريع ، وتمت إضافة 2.5 مل من الترشيح إلى 2.5 مل من محلول مائي من 0.02 M من حمض الثيوباربيتوريك وتم تحضينه لمدة 35 دقيقة عند 95 درجة مئوية في حمام حراري (العمل ED-13; زيلباخ، بادن فورتمبيرغ، ألمانيا). بعد التبريد ، تم أخذ الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي المحدد على طول موجي يبلغ 532 نانومتر. يتم التعبير عن البيانات على أنها ملليغرام من مالونديالدهيد لكل كيلوغرام من اللحوم. تم إجراء القياسات في نسختين على كل من صدور الدجاج المطبوخة والنيئة.

7.3.استخراج الحمض النووي وإعداد مكتبة NGS

تم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي DNeasy PowerSoil (Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا). تمت إزالة الجليد من الكريات المتجانسة من لحم الثدي باستخدام 600 لتر من المخزن المؤقت Lysis الذي توفره المجموعة. تم قطع مسحات Cloacal بمقص معقم ، وضعت في أنبوب دقيق يحتوي على 600uL من المخزن المؤقت Lysis و 6 uL من 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم خلط الأنابيب جيدا باستخدام الدوامة لمدة 5 دقائق وتمت إزالة المسحات. بالنسبة لكل من عينات العباءة وحبيبات لحم الثدي ، تمت إضافة ما مجموعه 100 ملغ من الخرز المعقم 0.1 مم (BioSpec ، Bartlesville ، OK ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم استخدام مطحنة خرز (TissueLyser، Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) لتنفيذ الاضطراب في خطوات الاهتزاز عالية السرعة (2×30 ثانية عند 30 هرتز). تمت إضافة ما مجموعه 40 لتر من بروتين K (Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا) واحتضانها عند 56 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد هذه الخطوة، تم اتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة أدوات عزل DNeasy PowerSoil9DNA. تم تحليل تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (NanoDrop ND-1000 ، Thermo Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم استخدام نهج تضخيم من خطوتين لبناء مكتبة الحمض النووي 16S. تم تضخيم العينات في تفاعلات 20-μL，يتكون كل منها من 5 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف，0.4 uM من كل التمهيدي (الجدول 1) ، 0.25 mM deoxynucleotide (dNTP) ، 1× Phusion HF المخزن المؤقت ، و 1 U Phusion عالية الدقة بوليميراز الحمض النووي (New England BioLabs، Inc. ، Ipswich ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء PCR في 2720 دورة حرارية (النظم الحيوية التطبيقية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 25 دورة من 95 درجة مئوية ل 30 ثانية ، 60 ° كور 49 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، وتمديد نهائي لمدة 7 دقائق عند 72 درجة مئوية. تم إجراء ثلاث نسخ متماثلة من PCR لكل عينة.

تم تنقية المنتجات باستخدام مجموعة تنقية SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences ، إنديانابوليس ، IN، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وبعد تنقية الخرز ، تم تأكيد النطاق المستهدف باستخدام 1.8٪ من هلام الأغاروز. تم إدخال الباركود من خلال تحليل PCR ثان مع الاشعال الحاملة للباركود الخاصة بالمنصة. يحتوي كل تفاعل PCR 50-uL على منتج PCR ، 0.2 ميكرومتر من كل تمهيدي（الجدول 1），0.3 mMdNTP，1×Phusion HFbuffer，و 1UPhusion بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة. تم إجراء عشر دورات من ملف تعريف PCR الموصوف أعلاه.

تم تنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences ، إنديانابوليس ، IN، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد التنقية النهائية ، تم تحديد كمية كل عينة باستخدام مقياس الفلورومتر Qubit 2.0 (Invitrogen ، Life Technologies ، مونزا ، إيطاليا). تم اختبار جودة مكتبة الأمبليكون باستخدام محلل حيوي Agilent 2100 (Agilent Technologies ، بالو ألتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تسلسل المكتبات باستخدام منصة Illumina MiSeq مع تشغيل 300 دورة مقترن (Macrogen Inc. ، سيول ، كوريا).

4. الاستنتاجات

لم يكن إثراء الوجبات الغذائية للدجاج بالفينولات التي تم الحصول عليها عن طريق ترشيح وتركيز مياه النباتات في مطحنة الزيت لمدة 24 يوما مرتبطا بالاختلافات في نمو الحيوانات أو معدل تحويل الأعلاف أو محصول الذبيحة. أظهرت دراسة الميكروبات المعوية تأثيرا كبيرا لوقت التغذية ولكن ليس للنظام الغذائي في حد ذاته على تناوب المجموعات الميكروبية. من ناحية أخرى ، أظهر تكوين الميكروبات في اللحوم خلال فترة الصلاحية نموا أكبر للزائفة في عينات الدجاج التي استهلكت الأعلاف المخصبة بالفينولات. وأخيرا، لم تلاحظ أي اختلافات بين النظم الغذائية فيما يتعلق بالعلامات التحليلية (TBARs و dienes المترافقة) لعملية أكسدة الدهون. بدلا من ذلك ، تم تحديد هيدروكسي تيروسول في الأنسجة العضلية للعينات من الدجاج التي استهلكت الأعلاف مع الفينولات المضافة ، مما يدل على امتصاص الأمعاء المعتمد على الجرعة. نظرا لأن عملية الأكسدة تحدث بشكل رئيسي في بنية الغشاء لخلايا العضلات ، فمن الضروري إجراء مزيد من الدراسات لفهم توزيع HT بشكل أفضل في المقصورات الخلوية وخارج الخلية.

تم استخراج هذه المقالة من جزيئات 2021 ، 26 ، 4307. https://doi.org/10.3390/molecules26144307 https://www.mdpi.com/journal/molecules