تعزيز البروتينات من أعلى إلى أسفل لأنسجة المخ باستخدام FAIMS الجزء 1

خلاصة

قدمت التحقيقات البروتينية لمرض الزهايمر ومرض باركنسون رؤى قيمة حول الاضطرابات التنكسية العصبية. وحتى الآن، اقتصرت هذه التحقيقات إلى حد كبير على النهج من القاعدة إلى القمة، مما يعيق الدرجة التي يمكن بها وصف الحالة "السليمة" للبروتين.

مرض الزهايمر هو مرض تنكس عصبي له آثار لا رجعة فيها على ذاكرة الشخص وقدراته المعرفية. على الرغم من أن الناس لا يستطيعون علاج المرض بشكل كامل، إلا أنه من خلال العلاج والوقاية الدقيقة، يمكن إبطاء تطور المرض قدر الإمكان ويمكن الحفاظ على الصحة الجسدية والعقلية للمريض.

تعتبر الذاكرة من أكثر الجوانب التي يتأثر بها مرضى الزهايمر بشكل واضح. وقد ينسون في كثير من الأحيان معلومات مهمة، مثل أسمائهم، وأسماء أحبائهم، والتواريخ المهمة، وما إلى ذلك. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم أيضًا نسيان بعض مفردات التعلم الذاتي المتقدمة، مثل المفاهيم المجردة والمرادفات. ومع ذلك، مع بعض التدريب والعلاج المعرفي، لا يزال بإمكان مرضى الزهايمر الحفاظ على ذاكرتهم في بعض الجوانب.

على الرغم من أن مرض الزهايمر يمكن أن يكون له آثار سلبية، إلا أنه يجب أن ننظر إليه بشكل إيجابي. أولا، من خلال زيادة الوعي والفهم لهذا المرض، يمكننا الوقاية منه وعلاجه بشكل أفضل. ثانيًا، يمكن أيضًا لمقدمي الرعاية وأفراد أسر مرضى الزهايمر تعلم كيفية التواصل والتفاعل معهم بشكل فعال لمساعدة المرضى على الحفاظ على كرامتهم الذاتية والعيش بسعادة قدر الإمكان.

بشكل عام، على الرغم من أن مرض الزهايمر يمكن أن يسبب آثارًا لا رجعة فيها على الذاكرة والقدرات المعرفية، إلا أنه يجب علينا الحفاظ على موقف متفائل ومحاولة إبطاء تطور المرض من خلال العلاج والإجراءات الوقائية. وفي الوقت نفسه، يجب علينا أيضًا تقديم المزيد من المساعدة والدعم لأولئك الذين يعتنون بمرضى الزهايمر، والعمل معًا على إنشاء مجتمع أكثر دفئًا وتفاعلًا. ويمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين الذاكرة. يمكن لـ Cistanche تحسين الذاكرة بشكل كبير لأنها مادة طبية صينية تقليدية لها العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. يأتي تأثير Cistanche من المكونات النشطة المختلفة التي يحتوي عليها، بما في ذلك حمض التانيك، والسكريات، وجليكوسيدات الفلافونويد، وما إلى ذلك. ويمكن لهذه المكونات تعزيز صحة الدماغ بعدة طرق.

انقر فوق تعرف على 10 طرق لتحسين الذاكرة

تتغلب البروتينات من أعلى إلى أسفل (TDP) على هذا القيد؛ ومع ذلك، فهو يقتصر عادةً على مراقبة الأشكال البروتينية الأكثر وفرة ذات الحجم الصغير نسبيًا.

ولذلك، تُستخدم تقنيات التجزئة بشكل شائع لتقليل تعقيد العينة. هنا، نقوم بالتحقيق في تجزئة مرحلة الغاز من خلال قياس طيف التنقل الأيوني غير المتماثل عالي المجال (FAIMS) داخل TDP.

الاستفادة من عينة عالية التعقيد المستمدة من أنسجة المخ مرض الزهايمر (AD)، ونحن نصف كيف يمكن إضافة FAIMS إلى TDP بقوة تحسين عمق التغطية البروتينية.

على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي تنفيذ FAIMS مع جهد التعويض الخارجي (CV) عند −50 و−40 و−30 CV إلى أكثر من ضعف متوسط ​​عدد الأشكال البروتينية غير الزائدة والجينات وتغطية تسلسل البروتينات مقارنةً بدون FAIMS.

لقد وجدنا أيضًا أن FAIMS يمكن أن يؤثر على نقل الأشكال البروتينية وأغلفة الشحن الخاصة بها بناءً على حجمها. الأهم من ذلك، أن FAIMS مكّن من تحديد أشكال بروتينات أميلويد بيتا (A) السليمة، بما في ذلك المتغير A 1–42 المعرض للتجميع والذي يرتبط بقوة بـAD.

تم إيداع البيانات الأولية والملفات المرتبطة بها في ProteomeXchange Consortium عبر مستودع البيانات MassIVE بمعرف مجموعة البيانات PXD023607.

مقدمة

على مدى العقدين الماضيين، تضاعف معدل الإصابة بالأمراض التنكسية العصبية في جميع أنحاء العالم، وكان مرض الزهايمر (AD) هو الشكل الأكثر انتشارًا. هناك نوعان من البروتين، ببتيدات الأميلويد بيتا (A) والبروتين المرتبط بالأنيبيبات الدقيقة المفسفرة تاو (تاو)، 2-5 ترتبط بقوة مع م.

لذلك، كان التوصيف البروتيني التفصيلي لمرض الزهايمر ذا أهمية خاصة.6،7 وقد لعب قياس الطيف الكتلي دورًا مركزيًا في هذه التحقيقات،8 في الغالب من خلال الأساليب التصاعدية.9-16

ومع ذلك، فإن هضم الأنزيم البروتيني المطلوب للتحليلات من أسفل إلى أعلى يعيق التقاط الحالة الكاملة للبروتين، والتي يمكن أن تختلف بسبب الأليلات الجينية، والربط البديل، والمعالجة المحللة للبروتين، وتعديلات ما بعد الترجمة (يشار إليها باسم "الأشكال البروتينية"). 20

نظرًا لأن الأساليب البروتينية من أعلى إلى أسفل (TDP) تحلل البروتينات في حالة سليمة، فإن احتمالية التقاط الأشكال البروتينية المرتبطة ببعض الأمراض تكون أكبر وتسمح باتصال أقوى وأكثر مباشرة بين النمط الجيني والنمط الظاهري.20-22

على سبيل المثال، يعتبر TDP مناسبًا بشكل خاص لالتقاط الأجزاء المحللة للبروتين الذاتية المشتقة من البروتينات مثل تاو، والتي تم ربطها بأمراض الزهايمر. وقد أظهرت العديد من تطبيقات TDP السابقة وعدًا كبيرًا في الكشف عن عدم تجانس بروتينات الدماغ الإقليمية والتغيرات العصبية استجابةً للمحفزات المختلفة. .27-30

ومع ذلك، يتطلب TDP للعينات المعقدة عادةً تقنيات تجزئة غير متصلة بالإنترنت لتقليل تعقيد العينة نظرًا لأن البروتين البشري يمتد لعدة أوامر من حيث الحجم والوفرة، ولا يتم حل البروتينات بشكل جيد بشكل عام باستخدام تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء للمرحلة العكسية (LC).31

يمكن تحقيق هذا التجزئة دون الاتصال بالإنترنت باستخدام الفصل الكهربائي لاحتجاز جزء السائل المخلوط بالهلام، أو كروماتوجرافيا استبعاد الحجم، أو كروماتوجرافيا التبادل الأيوني، أو تنقية الألفة، على سبيل المثال لا الحصر.

ولسوء الحظ، فإن التجزئة غير المتصلة بالإنترنت تقلل عادةً من الإنتاجية والإنتاجية عن طريق طلب معالجة موسعة للعينات.36 يعتبر فصل تنقل الأيونات في الطور الغازي بديلاً جذابًا للتجزئة يمكن تقديمه بين أبعاد LC وMS دون الحاجة إلى خطوات إضافية لمعالجة العينات.

يعد قياس طيف التنقل الأيوني غير المتماثل عالي المجال (FAIMS) مناسبًا بشكل خاص لهذه المهمة مع طرح جهاز FAIMS Pro مؤخرًا، والذي يسمح تصميمه المعياري بدمج قابلية الحركة الأيونية بسهولة في العديد من أدوات Orbitrap الحالية.37

FAIMS، والذي يشار إليه أيضًا باسم قياس طيف الحركة التفاضلي، يفصل الأيونات في الغاز الحامل بناءً على مجموعات من العوامل مثل الحجم أو الشحنة أو الشكل من خلال إدخال شكل موجة غير متماثل مع مجالات كهربائية عالية ومنخفضة.38 لمنع تصادم الأيونات مع القطب الكهربائي، يتم إدخال انحراف في مسار الأيون من خلال تطبيق جهد تعويض التيار المستمر (CV)،39 مما يسمح بالنقل الانتقائي لذلك الأيون.38

لقد اقتصر تطبيق FAIMS على تحليل البروتين السليم إلى حد كبير على فصل البروتينات المطابقة للبروتينات الفردية أو مجموعات صغيرة من البروتينات؛

ومع ذلك، تم تطبيق FAIMS مؤخرًا على تحليلات البروتينات السليمة والمحلية باستخدام تحليل سطح استخلاص السائل.

المسح عبر نطاق السيرة الذاتية من −50 إلى −20 CV مع خطوات خارجية سمح لنا بتحديد كيفية تأثير تعديل FAIMS CV على خصائص الأيونات المنقولة عبر وحدة FAIMS الأسطوانية، وكيف يمكن استغلال هذه العلاقة لاستهداف الأشكال البروتينية بناءً على الحجم.

ساهم FAIMS-TDP في زيادة تعريفات الشكل البروتيني بأكثر من الضعف في سيرة ذاتية واحدة مقارنةً بدون FAIMS، كما مكّن من إجراء استجواب أعمق للأشكال البروتينية ذات الصلة بالأمراض التنكسية العصبية، بما في ذلك - و - و - السينوكلينات، وPARK7، والأشكال الإسوية للصق تاو، والعديد من الأشكال البروتينية السليمة.

مجتمعة، يصف هذا العمل كيف يمكن تحقيق تعريف أكبر للأشكال البروتينية والتغطية البروتينية بشكل متكرر عبر تجزئة الطور الغازي باستخدام FAIMS في TDP.

طُرق

تحضير العينة

تم استلام عينة MFC من مركز مرض الزهايمر بجامعة راش. وكان المشاركون من كبار السن في العيادة الذين سجلوا مع شكاوى الذاكرة و/الخرف من عام 1992 إلى عام 2005.

تم تقييمهم في عيادة Rush Memory Clinic لاحتمال الإصابة بالخرف ووافقوا على التبرع بالدماغ كجزء من المركز السريري لمركز Rush Alzheimer’sDisease Core Center. تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمركز الطبي بجامعة راش.

بعد الوفاة، قدم أقرب الأقارب موافقته على تشريح الجثة. كانت فئة التشخيص المعرفي العام للمريض هي الخرف الناتج عن مرض الزهايمر مع عدم وجود أسباب أخرى للضعف الإدراكي، 51 بينما كانت فترة ما بعد الوفاة 230 دقيقة.

تم تنفيذ جميع خطوات معالجة العينات باستخدام احتياطات BSL {{0}}. تم نقل 33 ملغ من أنسجة MFC المخزنة عند درجة -80 درجة إلى أنابيب LoBind Eppendorf سعة 1.5 مل (Eppendorf، Cat # 022431081) مع إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت للتجانس الذي يتكون من 8 م من اليوريا و 10 م من بيكربونات المامونيوم (ABC) و 10 مم. تريس (2- كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) عند درجة الحموضة 7.5.

تم تحقيق التجانس من خلال الاضطراب الجسدي من خلال استخدام مدقة الحبيبات المحمولة باليد لمدة 3 0 ثانية (BioVortexer مع SpiralPestle؛ Biospec 1083 و1017)، قبل إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت للتجانس في درجة حرارة الغرفة.

تم بعد ذلك تحضين العينة عند 37 درجة لمدة 60 دقيقة عند 1200 دورة في الدقيقة باستخدام ThermoMixer للسماح باستخلاص البروتينات الخلوية وتمسخها. تم تكوير المادة غير القابلة للذوبان في اليوريا باستخدام الطرد المركزي عند 18,{5}} جم لمدة 20 دقيقة عند 22 درجة، ثم تمت إضافة المادة الطافية الناتجة إلى 3 مل من محلول الغسيل المنظم (WB؛ 8 مولار يوريا، 10 ملي مولار ABC، الرقم الهيدروجيني 7). .5) ضمن مرشح قطع الوزن الجزيئي (MWCO) 4 مل 100 كيلو دالتون لإزالة أنواع MW الكبيرة.

بعد ساعة واحدة من الطرد المركزي عند 22 درجة و5000 جم، كان حجم المحجز 200 ميكرولتر وكان حجم الراشح 3.8 مل. تم نقل 3.8 مل من المرشح إلى مرشح MWCO 3 كيلو دالتون لإزالة الملوثات الجزيئية الصغيرة والببتيدات المنخفضة ميجاوات.

تم الطرد المركزي لمرشح 3 كيلو دالتون MWCO عند 22 درجة و7300 جم لمدة ساعة واحدة، مما يعطي حجمًا مثبطًا قدره 200 ميكرولتر. تم غسل 200 ميكرولتر من المشبك من مرشح 100 كيلو دالتون MWCO مرة أخرى عن طريق تخفيفه إلى 4 مل باستخدام WB وترشيحه مرة أخرى من خلال نفس المرشح.

تمت إضافة هذا التدفق إلى نفس مرشح 3 كيلو دالتون MWCO كما هو مذكور أعلاه وتم تركيزه مرة أخرى.

تم نقل Final200 ميكرولتر من retentate من غسل مرشح 3 كيلو دالتون MWCO إلى أنبوب LoBindEppendorf سعة 1.5 مل. لتحميض العينة، تمت إضافة 10 ميكرولتر من 10% حمض الفورميك (FA)، مما أدى إلى تركيز 0.5% FA في العينة النهائية.

تم طرد العينة بالطرد المركزي عند 18,{1}} جم لمدة 15 دقيقة لإزالة المادة المترسبة قبل قياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيكينكونيك (BCA).

تم إعداد معايير ألبومين المصل البقري في 8 م من اليوريا، و1 0 ملي مولار ABC، و0.5% FA لحساب أي مساهمات عازلة محتملة في اختبار BCA. تم تحديد تركيز البروتين بواسطة اختبار BCA ليكون 1.1 مجم/مل، وهو ما يتوافق مع الناتج النهائي لـ 0.22 مجم من إجمالي البروتين المسترد في عينة ∼200 ميكرولتر. تم تخفيفه إلى 0.5 مجم / مل مع WB يحتوي على 0.5٪ FA وتخزينه عند -80 درجة حتى تحليل LC-MS.

يجب أن نلاحظ أن التجارب الأولية (البيانات غير منشورة) باستخدام كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني/الفوسفاتيز التقليدي داخل المخزن المؤقت للتجانس لدينا أدى إلى نتائج BCAassay وLC-MS مضللة بسبب الاحتفاظ بالعديد من مكونات الكوكتيل بواسطة مرشح 3KMWCO.

علاوة على ذلك، فإن العديد من مثبطات الفوسفاتيز والبروتياز شائعة الاستخدام غير متوافقة كيميائيًا مع عوامل الاختزال مثل TCEP. بالنظر إلى حالات عدم التوافق هذه، وأنه من المتوقع أن تؤدي ظروف تغيير طبيعة 8 م من اليوريا مع 10 مم من TCEP إلى تعطيل معظم البروتياز، فقد اعتقدنا أن التحلل البروتيني سيظل في حده الأدنى في ظل هذه الظروف.

تحليلات LC-MS/MS وإعدادات FAIMS

تم تحليل العينات باستخدام نظام Waters NanoACQUITY UPLC مع مراحل متنقلة تتكون من {{0}}.2% FA في H2O (المرحلة المتنقلة A) و0.2% FA في ACN (المرحلة المتنقلة B).

كان كل من العمود المسبق للملاءمة (معرف 100 ميكرومتر، طول 5 سم) والعمود التحليلي (معرف 75 ميكرومتر، طول 50 سم) ملاطًا مملوءًا بمادة التعبئة C2 (5 و3 ميكرومتر للمصيدة/التحليلية، على التوالي، 300 Å، تقنية طرق الفصل) . تم تحميل العينات في حلقة 5 ميكروليتر، تقابل 2.5 ميكروجرام من كمية المادة المحملة، وتم حقنها في عمود الملاءمة بتدفق متساوي قدره 5% ب عند 3 ميكروليتر/دقيقة على مدار 20 دقيقة.

تم إجراء الفصل بتدرج 5-50% ب على مدى 180 دقيقة عند 300 نلتر/دقيقة. لتحليل MS/MS للبروتينات، تم ربط نظام NanoACQUITY بمطياف الكتلة Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid المجهز بواجهة FAIMS Pro.

تتضمن معلمات المصدر جهد رش كهربائي يبلغ 2.2 كيلو فولت، ودرجة حرارة شعرية نقل تبلغ 275 درجة، وسعة تردد راديوي لقمع أيوني تبلغ 60%. تم ضبط FAIMS على الدقة القياسية دون تدفق غاز حامل إضافي يتحكم فيه المستخدم وجهد تشتت يبلغ −5 كيلو فولت (أي ما يعادل مجال تشتت يبلغ .333.3 كيلو فولت / سم )، بينما تختلف السيرة الذاتية اعتمادًا على التجربة (يشار إليها باسم "الخطوة الخارجية" ").

تم ضبط Fusion Lumos على وضع التطبيق "البروتين السليم"، مما يخفض ضغط خلية N2 لتفكك C-trap (HCD) عالي الطاقة إلى 2 mTorr، وتم جمع البيانات كملف تعريف كامل. تم الحصول على بيانات MS1 وMS2 بدقة 120k و60k، وعمليات مسح دقيقة لـ 3 و2، عبر نطاق 500–2،000 m/z و400–2،000 m/z، ومع أهداف AGC 5 × 106 و5 × 105 على التوالي.

تم الحصول على MS1 وMS2 بحد أقصى لوقت الحقن يبلغ 400 مللي ثانية أيضًا. تتضمن الإعدادات المعتمدة على البيانات مجموعة مختارة من الأيونات الستة الأكثر كثافة، واستبعاد الأيونات الأقل من حالة الشحن 5+، وإدراج حالات الشحن غير المحددة، والاستبعاد الديناميكي بعد ملاحظة واحدة لمدة 30 ثانية.

تم عزل الأيونات المختارة لـ MS2 على نافذة ± 1.5 م/ض وتم تجزئتها من خلال التفكك الناتج عن الاصطدام (CID) مع طاقة تصادم تبلغ 35%. استخدمنا CID بدلاً من HCD بسبب انخفاض الاعتماد على طاقة الاصطدام الطبيعية لتحقيق أطياف تجزئة البروتين القابلة للتفسير، وبالتالي إعطاء الأولوية لاتساع نطاق ملاحظاتنا البروتينية على تغطية التسلسل.

تم جمع مجموعات البيانات لكل سيرة ذاتية لـ FAIMS في ثلاث نسخ. تم إيداع جميع الملفات الأولية في مستودع بيانات MassIVE ويمكن الوصول إليها عبر الانضمام MSV000086696، أو باستخدام PXD023607 على ProteomeXchange.

For more information:1950477648nn@gmail.com