تعزيز البروتينات من أعلى إلى أسفل لأنسجة المخ باستخدام FAIMS الجزء 3
Aug 27, 2024
إحدى الملاحظات المباشرة والواضحة هي أنه كلما ارتفعت نسبة الوفرة، زاد احتمال التعرف على TDP. بمعنى آخر، يحدد TDP في الغالب البروتينات الوفيرة للغاية.
مع تقدمنا في السن، يجد الكثير من الناس أن ذاكرتهم قد تراجعت. وهذه ظاهرة شائعة، خاصة بعد أن عانينا من ضغوط نفسية طويلة الأمد، وقلة النوم، والأنظمة الغذائية غير المتوازنة.
لكن هل تعلم أن إحدى الطرق التي تساعدنا على تحسين ذاكرتنا هي زيادة تناول البروتين عالي الجودة؟ البروتين عالي الوفرة غني بالأحماض الأمينية، التي يمكنها تصنيع جزيء يسمى الناقل العصبي في الدماغ ويعزز أيضًا نمو ونشاط الخلايا العصبية. الخلايا العصبية هي الوحدات الأساسية في الدماغ وهي المفتاح لقدراتنا على التعلم والذاكرة. لذلك، يمكن للبروتين عالي الوفرة أن يحسن ذاكرتنا من خلال تعزيز وظيفة الخلايا العصبية.
وقد أثبتت الأبحاث أيضًا العلاقة بين البروتين والذاكرة. على سبيل المثال، وجدت إحدى الدراسات أنه بالمقارنة مع النظام الغذائي عالي البروتين، فإن النظام الغذائي منخفض البروتين يؤدي إلى انخفاض وظائف المخ، بما في ذلك الانتباه والذاكرة.
لذا، إذا كنت ترغب في تحسين ذاكرتك، فيمكنك أيضًا إضافة بعض الأطعمة الغنية بالبروتين إلى نظامك الغذائي، مثل الدجاج، والأسماك، ولحم البقر، والبيض، والتوفو، وما إلى ذلك. وبالطبع، يجب عليك أيضًا الانتباه إلى التوازن. وتنوع نظامك الغذائي، ولا يمكنك تناول نوع واحد فقط من الطعام.
باختصار، يمكن للبروتين عالي الوفرة أن يساعد في تحسين ذاكرتنا. إذا كنت ترغب في الحصول على ذاكرة أفضل، فمن الأفضل أن تبدأ بنظامك الغذائي وتحاول تناول أكبر عدد ممكن من الأطعمة الغنية بالبروتين! وهذا يوضح أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا، ويمكن لـ Cistanche تحسين الذاكرة بشكل كبير لأنه يمكنه أيضًا تنظيم توازن الناقلات العصبية، مثل زيادة مستويات الأسيتيل كولين وعوامل النمو، وهي مهمة جدًا للذاكرة والتعلم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لـ Cistanche أيضًا تحسين تدفق الدم وتعزيز توصيل الأكسجين، مما يضمن حصول الدماغ على التغذية والطاقة الكافية، وبالتالي تحسين حيوية الدماغ والقدرة على التحمل.
انقر فوق معرفة المكملات الغذائية لتعزيز الذاكرة
تم احتواء حوالي نصف الجينات التي تم تحديدها من مجموعات البيانات من أعلى إلى أسفل (مع أو بدون FAIMS) ضمن أعلى 20٪ من صناديق الوفرة للتحليل من أسفل إلى أعلى (الشكل 6A). على العكس من ذلك، لا يمكن العثور على 71 جينًا إلا في مجموعات البيانات من الأعلى إلى الأسفل ("NA" bin) (الشكل 6A).
يبدو أن هذه الجينات تمثل بروتينات قصيرة نسبيًا (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis.
على سبيل المثال، تم تضمين بروتينات هيستون مثل H3C1 وH4C1 وH1–4 وH2BC12 داخل الصندوق من أعلى إلى أسفل فقط. وكما كان متوقعًا، وجدنا أن FAIMS يمكن أن يحسن التعريفات في النسب المئوية الأقل وفرة على "No FAIMS"، مما يزيد من العمق من البروتين الذي يمكن ملاحظته.
من خلال تحديد نسبة FAIMS إلى "لا يوجد FAIMS" عبر جميع النسب المئوية، تظهر زيادة ملحوظة في التعريفات أقل من النسبة المئوية الأربعين داخل السير الذاتية في نطاق −40 إلى −50 (الشكل 6B).
ومع ذلك، عند النظر في العدد المطلق للجينات، فإن المساهمة الكبرى لميزة FAIMS تكون من خلال توسيع نطاق التعريف عبر جميع النسب المئوية للوفرة.
العلاقة بين السيرة الذاتية لـ FAIMS وانتقال النماذج البروتينية
مع FAIMS ، لاحظنا أيضًا وجود اتجاه بين FAIMS CV والوزن الجزيئي البروتيني (الشكل 7). عند −50 CV ، تكون الكتلة البروتينية المتوسطة ∼ 5 كيلو دالتون وتزداد إلى ∼ 15 كيلو دالتون عند −20CV.
بناءً على هذه التوزيعات الجماعية (الشكل 7)، تبدو السير الذاتية التي تقل عن −50 فولت مناسبة تمامًا للتجارب البروتينية من أعلى إلى أسفل أو من منتصف إلى أسفل، في حين أن السير الذاتية الأكبر من −50 فولت ربما تستفيد بشكل أفضل من التجارب الببتيدية أو من أسفل إلى أعلى.
من المفترض أن يمتد اتجاه الوزن الجزيئي الملحوظ إلى ما هو أبعد من −20 CV؛ ومع ذلك ، فقد قمنا بتقييد بحثنا على -20 السيرة الذاتية بناءً على الانخفاض في تعريفات البروتين والجينات مما أدى إلى تناقص العوائد في تغطية التسلسل البروتيني لكل تشغيل.
يجب أن نلاحظ أن العمل السابق باستخدام FAIMS وجد أن +40 CV هو الجهد المثالي لنقل سلسلة ثقيلة NIST mAb (∼ 51 كيلو دالتون) وكان −20 CV هو الأفضل للسلسلة الخفيفة المقابلة (∼ 23 كيلو دالتون)، مما يدعم الفكرة. أن الاتجاه الذي نلاحظه يمتد إلى FAIMS CVs.45 الإيجابية
ومن المثير للاهتمام، أنه على الرغم من أن العديد من الأطياف التي تحدد شكلًا بروتينيًا واحدًا كانت مقتصرة على العثور عليها ضمن نطاق 10 فولت (3599 من 5165)، إلا أنه كان هناك سبعة أشكال بروتينية تمت ملاحظتها عبر نطاق السيرة الذاتية بأكمله من −50 إلى −20. من المفترض أن يعزى ذلك إلى وفرتها العالية في العينة، خاصة في حالة اليوبيكويتين (UBB)، وبروتين المايلين الأساسي، والبروتين المرتبط بـ acylCoA.
ومع ذلك، فمن المحتمل أيضًا أن حالات الشحن المختلفة لهذه الأشكال البروتينية تتبنى عدة تطابقات في الطور الغازي اعتمادًا على أيزومرة البروتون الخاصة بها، مما يؤثر على حركتها.
سمحت لنا هذه الأشكال البروتينية السبعة باستكشاف كيفية انتقال غلاف حالة الشحن بشكل تفاضلي من خلال تعديل السيرة الذاتية. كبديل لتوزيع حالة الشحن في كل سيرة ذاتية، استخدمنا حالة الشحن المتوسطة بناءً على تطابقات الطيف البروتيني (PrSMs) المحددة في كل سيرة ذاتية وتتبعنا كيفية تغير هذه القيمة كدالة للسيرة الذاتية بدءًا من −50 السيرة الذاتية.
توضح عمليات مسح MS1 في الشكل S3 كيف تتتبع حالة شحن PrSM المتوسطة توزيع حالة الشحن لـ UBB. من بين هذه الأشكال البروتينية السبعة، اتبعت أربعة منها علاقة عكسية، مع زيادة حالة الشحنة المتوسطة مع انخفاض السيرة الذاتية (الشكل 8).
تجدر الإشارة إلى أن هذا الاتجاه قد لوحظ عمومًا مع الببتيدات والبروتينات الصغيرة. ومن المثير للدهشة أن ثلاثة أشكال بروتينية أظهرت العلاقة المعاكسة حيث أدى تناقص السيرة الذاتية إلى انخفاض حالات الشحن المتوسطة التي لوحظت (الشكل 8).
يشير الفحص السريع لمتوسط كتلة السلائف بين المجموعتين إلى أن السلائف الأكبر حجمًا من المرجح أن تفضل حالات الشحن الأعلى مع انخفاض السيرة الذاتية.
للتحقق من صحة هذه العلاقات بشكل أكبر، قمنا بتوسيع هذا التحليل ليشمل الأشكال البروتينية التي تم تحديدها ضمن نطاق أكثر تواضعًا، ولكنه لا يزال واسعًا، من 20 إلى 30 CV (n=256 من الأشكال البروتينية). هنا، الأشكال البروتينية التي تحول متوسط شحنتها بأكثر من شحنة واحدة عبر تم تجميع نطاق السيرة الذاتية بالكامل في مجموعتين مختلفتين اعتمادًا على اتجاه هذا التحول.
تلك التي حولت أقل من شحنة واحدة اعتبرت "محايدة" فيما يتعلق بتغيير السيرة الذاتية. على غرار النتائج السابقة، كان من المرجح بشكل كبير أن ترتبط السلائف الأكبر بعلاقة عكسية بين حالات الشحن المرصودة والسيرة الذاتية (الجدول S2).
مع تناقص السيرة الذاتية، يبدو أن غالبية الأشكال البروتينية تنتقل عند حالات شحن أقل (n=177) مقارنة بتلك التي فضلت حالات الشحن الأعلى (n=39). الباقي (ن=40) تم اعتباره "محايدًا" فيما يتعلق بالتغييرات في السيرة الذاتية.
أظهرت الأشكال البروتينية الموجودة ضمن المجموعة المحايدة متوسط كتلة سلائف بين المجموعتين العكسية والمباشرة، مما يشير مرة أخرى إلى أن كتلة الشكل البروتيني مرتبطة ارتباطًا جوهريًا بهذا السلوك.
ومع ذلك، لم تكن المعلمات الأخرى المستندة إلى التسلسل الأساسي مثل تكوين الأحماض الأمينية الأساسية / الحمضية ومؤشر الأليفاتية مرتبطة بشكل كبير (الجدول S2).
على الرغم من أنه من المفترض أن يتم تغيير طبيعة البروتينات التي يتم إدخالها في الطور الغازي، إلا أن العوامل المرتبطة عادةً بالبروتينات الأصلية مثل عزم ثنائي القطب أو المقطع العرضي التصادمي قد يكون لها قيمة تنبؤية أفضل تجاه هذه الظاهرة.64-66 توضح نتائجنا كيف يمكن استخدام السيرة الذاتية لتصفية البروتينات المختلفة الجماهير، وكيف يمكن أن تنتقل حالة شحنة البروتين بشكل مختلف من خلال FAIMS أيضًا.
فائدة شظايا البروتين في تجارب TDP
والمثير للدهشة أن عددًا كبيرًا من الأشكال البروتينية التي حددناها كانت عبارة عن أجزاء من بروتينات أكبر. لقد وجدنا أن 25% فقط من الأشكال البروتينية الفريدة التي تم تحديدها تغطي أكثر من نصف تسلسل البروتين الذي اشتقت منه.
كان متوسط كتلة 25% هذا 11.4 كيلو دالتون مقارنة بـ 75% المتبقية التي كان متوسط كتلتها 5.7 كيلو دالتون. قد تساهم عدة عوامل في هذه الملاحظة، بعضها مستقل عن FAIMS.
على سبيل المثال، قد تكون هذه الأجزاء نفسها عبارة عن منتجات انقسام بروتيني تم إنتاجها في ظل ظروف استتبابية طبيعية كجزء من "التحلل" الخلوي،67 أو على الرغم من الاحتياطات المختلفة المتخذة، والتي تم تقديمها خلال فترة ما بعد الوفاة ومعالجة العينات.
تعد أنسجة الجهاز العصبي المركزي مصدرًا غنيًا لببتيدات الإشارة المعروفة باسم "الببتيدات العصبية" والتي تشتق عادةً من بروتينات سلائف أكبر بكثير أيضًا.
من خلال الإسناد الترافقي لتعريفات الشكل البروتيني لدينا مع قاعدة بيانات الببتيد العصبي القائمة (NeuroPedia)،69 تمكنا من تحديد العديد من هذه الببتيدات العصبية بما في ذلك فاسوستاتين-1، سيكريتونيورين، كوليسيستوكينين-58 ديسونوببتيد، وببتيد عصبي y والعديد من متغيرات التسلسل غير المتعارف عليها. مشتقة من الجينات المعروفة المنتجة للببتيد العصبي.
بالإضافة إلى العوامل البيولوجية، يمكن لبعض معلمات الأداة أن تؤثر على مراقبة شظايا البروتين أيضًا. على سبيل المثال، يمكن عادةً استخدام الفولتية المنخفضة "للتجزئة" في المصدر (بين 10 و20 فولت) لإزالة التقريبات وأيونات البروتين المذابة، في حين يمكن استخدام الفولتية الأعلى التفكك الناجم عن المصدر.
ومع ذلك، فإن قابلية روابط الأميد للتفكك يمكن أن تختلف على نطاق واسع، ومع زيادة حجم البروتين، تزداد احتمالية احتوائه على روابط أميد قابلة للتغير مثل Xaa-Pro.70–73 حيث قد يتم إنتاج أيونات b وy عن غير قصد من خلال هذا. الآلية، حتى عند جهد المصدر المنخفض، قررنا تجنب تطبيق جهد المصدر لتقليل فرصة إدخال أيونات شظية في الجهاز.
ومن الممكن أيضًا أن تكون البروتينات عرضة لأحداث التجزئة أثناء مرورها عبر الحقول الكهربائية التي تم إنشاؤها في FAIMS. ومع ذلك، من غير المتوقع أن تتمتع هذه الأجزاء بنفس قدرة الأيون الأم على الحركة، مع التنبيه إلى أن هذا من المحتمل أن يعتمد على حجم القطعة بالنسبة للأيون السابق أيضًا.
أخيرًا، تجدر الإشارة إلى بعض العوامل التي يمكن أن تنحاز نحو مراقبة الأشكال البروتينية الأصغر (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74
يمكن أن يعزى انتشار الإشارة هذا إلى حد كبير إلى غلاف حالة الشحن والتوزيعات النظائرية لكل حالة شحن. كان الإعداد التجريبي الخاص بنا هو استخدام مرشح MWCO بحجم 3K كخطوة ترشيح نهائية في إعداد العينة الخاص بنا، والذي تم اختياره في هذه الحالة لضمان إمكانية التقاط بروتينات بيتا الأميلويد الأصغر بكفاءة إذا كانت موجودة.
يمكن للعوامل الأساسية العامة أن تخلق انحيازًا تجاه الأشكال البروتينية الصغيرة أيضًا، بما في ذلك ضبط الرباعي، والتقاط الديناميكا الكهربائية، والاصطدامات مع جزيئات الغاز المتبقية في خلية Orbitrap التي تؤدي إلى تحلل أسرع للجزيئات الأكبر حجمًا.75 بغض النظر عن هذه التحيزات أو الأصل الدقيق من الشظايا، لا يزال بإمكانهم تقديم نظرة ثاقبة للبروتين.
هذه الأجزاء مفيدة بشكل خاص في سياق الأمراض التنكسية العصبية حيث ترتبط الاضطرابات في الثبات البروتيني عادة بعلم الأمراض.76،77
في الواقع، غالبًا ما تكون شظايا تاو سامة للأعصاب وتلعب دورًا في تطور اعتلالات التاووبا مثل AD.23–26 بشكل عام، الشظايا التي نلاحظها أكبر بكثير من الببتيدات التربتية، وفي العديد من الحالات حيث يوجد العديد من الشظايا لبروتين معين. ، نلاحظ تغطية تسلسلية كبيرة.
يتجلى ذلك من خلال فحص الأجزاء التي توفر التغطية لسلسلة B ∼ 50 كيلو دالتون tubulinalpha -1 (TUBA1B) و ∼ 70 كيلو دالتون Synapsin -1 (SYN1)، كما هو موضح في الشكل 9A، B، وكلاهما كبير البروتينات التي قد يكون من الصعب ملاحظتها في شكلها الكامل في TDP لعينة معقدة.
تحديد الأشكال البروتينية ذات الصلة بأمراض التنكس العصبي
أتاح استخدام FAIMS من خلال تحليلنا من أعلى إلى أسفل تحديد العديد من متغيرات لصق Swiss-Prot الفريدة وإدخالات TrEMBL، مع 267 متغيرًا فريدًا من لصق و96 إدخالات TrEMBL (الجدول S3).
والجدير بالذكر أننا نلاحظ وجود العديد من PrSMs تحدد بشكل لا لبس فيه شكلًا إسويًا بديلاً لـ ORF (A {{0}} A0D9SF30) لجزيء التصاق الخلايا العصبية 1 (NCAM1). لاحظنا أيضًا أشكالًا بروتينية مشتقة من الجينات التي لها أدوار معروفة في العديد من أمراض التنكس العصبي، وخاصة السينوكلين وPARK7.
في كلتا الحالتين، تحتوي الأشكال البروتينية السائدة على تسلسل كامل الطول. ومن المثير للاهتمام أنه تم العثور على غالبية -synuclein وsynuclein و(بدرجة أقل) -synuclein PrSMs تحتوي على تحول جماعي غير معروف ∼ 177 Da بالقرب من الطرف C (طيف سينوكليني كامل الطول مع تعديل غير معروف، كما هو موضح في الشكل S4A) .
تمت ملاحظة هذا التحول الكتلي سابقًا في عمليات البحث في قاعدة البيانات المفتوحة ويوجد بشكل عام في Asp أو Gluresidues.78 التفسير المحتمل الذي يتطابق بشكل وثيق مع متوسط الكتلة أحادية النظائر للتعديل يتكون من أكسجين واحد مع ثلاث ذرات حديد بالإضافة إلى فقدان سبع ذرات هيدروجين ( بناءً على انضمام Unimod رقم 1971).
توضح مقارنة القمم النظائرية لأيون شظية ay242+ من -synuclein (الشكل S4B) مع طيف محاكاة يحتوي على العناصر المذكورة أعلاه والتي يعتقد أنها تنتمي إلى التعديل غير المعروف (الشكل S4C) التشابه بين التوزيعتين النظائريين، مع محاذاة العديد من القمم النظائرية ضمن 2 جزء في المليون من بعضها البعض.
تجدر الإشارة أيضًا إلى أن القمم النظائرية في أقصى اليسار هي فريدة من نوعها بالنسبة لنظائر الحديد التي تحدث بشكل طبيعي، ويكون غياب هذه القمم واضحًا بسهولة عندما تتم محاكاة الطيف دون احتواء ذرات الحديد الثلاثة (الشكل S4D)، مما يشير بقوة إلى أن هذا التعديل غير المعروف من المحتمل جدًا أن يتكون من العناصر المقترحة
وقد وصفت الدراسات السابقة أيضًا التقارب العالي لـ -synuclein لأيونات المعادن المختلفة، والمنطقة التي نلاحظ أنها تحتوي على هذا التعديل تتداخل مع المخلفات المعروفة بأنها متورطة في الارتباط ― على وجه التحديد 119DPDNEA124motif (الشكل S5).79-81
تشير بياناتنا أيضًا إلى أن مناطق الطرف C لـ -synuclein و-synuclein لها أدوار مماثلة في الارتباط المعدني حيث تمت مطابقة الأطياف المتعددة ذات التحول الكتلي نفسه غير المعروف مع تسلسلات مماثلة داخل هذه البروتينات.
حول بروتين الميتوكوندريا PARK7، لاحظنا ∼ 116.0 Da تحول جماعي على بقايا Cys النشطة الفردية، C106 (الشكل S6). أحد التفسيرات المحتملة مع succinylation مماثل لدلتا ماسيس، وهو تعديل يعزى إلى إجهاد الميتوكوندريا وأشكاله بسبب إضافة مايكل للفومارات على مجموعة Cys thiol.82
For more information:1950477648nn@gmail.com
