نمط التعبير عن -Tubulin و Inversin وهدفه أشعث -1 ومورفولوجيا الأهداب الأولية في تطور الكلى البشري الطبيعي والأمراض

edmund.chen@wecistanche.com

الملخص:تم تحليل التعبير الزماني المكاني للبروتينات -1 (DVL -1) المشوشة المرتبطة بمسار إشارات Wnt ، ومورفولوجيا الأهداب الأولية في تطويرالكلى(من 14 إلى 38 أسبوعًا من الأسابيع التنموية) ، وبعد الولادة الصحية (1. 5- و 7- عامًا) ، والإنسان الذي تغير مرضيًاالكلىبما في ذلك خلل التنسج متعدد الكيساتالكلى(MCDK) ، وتصلب الكبيبات البؤري القطعي (FSGS) والمتلازمة الكلوية من النوع الفنلندي (CNF). تم إجراء التحليل عن طريق التألق المناعي المزدوج ، والفحص المجهري الإلكتروني ، والطرق شبه الكمية والإحصائية. لوحظ التعبير المشترك السيتوبلازمي لـ -tubulin ، و inversion ، و DVL -1 في الأنابيب الملتوية القريبة (pct) ، والنبيبات الملتفة البعيدة (dct) ، والكبيبات (g) للأنسجة التي تم تحليلها. أثناءالكلىفي التطور ، انخفض التعبير الكلي لـ -tubulin ، و inversion ، و DVL -1 ، بينما زاد بشكل طفيف في فترة ما بعد الولادة. تميزت التعابير الأعلى من -Tubulin وانعكاس DCT و G ، بينما تميز DVL المرتفع -1 pct. -أنماط التعبير -Tubulin و Inversion و DVL -1 في MCDK و FSGS و CNFالكلىتختلف اختلافًا كبيرًا عن التحكم الصحي. مقارنة بالصحةالكلى، تغيرت مرضياالكلىكان لديه أهداب أولية مشوهة. ديناميكيات التعبير المختلفة لـ -Tubulin و Inversion و DVL -1 أثناءالكلىيمكن أن يشير التطور إلى أن التبديل بين إشارات Wnt الكنسي وغير الكنسي ضروري للطبيعيالكلىالتشكل. على النقيض من ذلك ، فإن تعبيرهم المضطرب في الحالة المرضيةالكلىقد تترافق مع أهداب أولية غير طبيعية ، مما يؤدي إلى مرض مزمنأمراض الكلى.

الكلمات الدالة:تطور الكلى البشرية - التوبولين. إنفرسين. DVL -1 ؛ MCDK. FSGS. CNF. الكلى والكلى

سيحسن القسطرة من أمراض الكلى / الكلى

مقدمة 

تطوير نهائي أو ميتانيفريكالكلىيبدأ خلال الأسبوع الخامس من الحمل (GW) ، والذي يتمايز بعد ذلك باستمرار لتشكيل كليتين دائمتين [1،2]. تضمن تفاعلات الإشارات بين اللحمة المتوسطة الكلية وبرعم الحالب بشكل صحيحالكلىالتطور أثناء تكوّن الكلية. باختصار ، يحفز برعم الحالب الانتقال من اللحمة المتوسطة إلى الظهارية (MET) في اللحمة المتوسطة الكلوية ، والتي تتكثف وتتشكلكلويحويصلات ، متبوعة بأجسام على شكل فاصلة وعلى شكل حرف S ، وتؤدي في النهاية إلى تكوين الكبيبات [3]. في المقابل ، تحث اللحمة المتوسطة على مزيد من التفرع في برعم الحالب. تصبح الكلى الميتانية وحدات إفرازية وظيفية في الأسبوع الحادي عشر من التطور البشري. ومع ذلك ، تكتمل عملية تكوين الكلية خلال الأسبوع 34 إلى 36 من نمو الجنين ، عندما تنتهي أحداث التفرع المتعددة ، ولكن تستمر عملية تمايز الكلى في فترة ما بعد الولادة [4،5]. تؤدي اضطرابات هذه التفاعلات المعقدة إلى تشوهات خلقية مختلفة في الكلى والمسالك البولية (CAKUT) ، بما في ذلك خلل التنسج ، ومرض الكلى المتعدد الكيسات ، وخلل التنسج متعدد الكيسات.مرض كلوي(MCDK) ، مما يؤدي إلى مزمنمرض كلوي(كد) [6].

في هذه الدراسة ، ركزنا على مظهر الأهداب الأساسي ومسار إشارات Wnt ، والذي يلعب دورًا مهمًا أثناء تكوّن الكلية الطبيعي وفيالكلىعملية الإصلاح ، بعد الحادة أو المزمنةمرض كلوي[7]. وجود أهداب أولية أثناء تكوّن الكلية والعدد الكبير للنموالكلىتشير العيوب التي تحدث في المرضى الذين يعانون من مرض الهدبي إلى أن وظيفة الأهداب الأولية الحقيقية ضرورية للطبيعيالكلىتكوين الأعضاء [8،9]. يعتبر الهدب الأولي عضية قائمة على الأنابيب الدقيقة مهمة لاستتباب الأنسجة ، حيث يعتبر التوبولين هو المكون الأساسي [10]. يؤدي فقدان أسيتيل التوبولين في الخلايا الخالدة إلى الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة (EMT) ، مما يعني أن التوبولين الأسيتيل مهم في تثبيت الأنابيب الدقيقة [11]. أثناء التطور البشري ، يتيح مسار Wnt الأساسي بوساطة الأهداب تكاثر الخلايا والتمايز وتشكل الأنسجة [12]. يصاب عدد كبير من الأطفال الذين يعانون من ضعف وظيفة الأهداب الأولية ومسار إشارات Wnt المعطل بمرض الكلى المزمن ، حيثكلويالاضطرابات هي المسؤولة عن ما يقرب من نصف الحالات [13]. أكثر الأمراض الكيسية الخلقية شيوعًا عند الأطفال هو خلل التنسج متعدد الكيساتمرض كلوي(مكدك) [14]. تكيسات متعددة لا تتواصل [15] وتفتقر إلى الوضع الطبيعيكلويالحمة هي نتائج مجهرية مميزة لـ MCDK. يعد تصلب الكبيبات البؤري القطعي (FSGS) أحد أكثر أمراض الكبيبات شيوعًا التي تؤدي إلى المرحلة النهائيةمرض كلوي[16]. في البداية ، FSGS هي سمة من سمات كونها بؤرية ، تنطوي فقط على أقلية من الكبيبات والقطعية ، والتي تنطوي على تغييرات في جزء فقط من الدائرة الكبيبية [17]. المتلازمة الكلوية الخلقية من النوع الفنلندي (CNF) هي صفة جسمية غير شائعة وراثية متنحيةمرض كلوييتمثل في اندلاع ما قبل الولادة لفقدان واسع النطاق للبروتين [18] ، المرتبط بتكوين المثانة للأنابيب القريبة [19]. تتطور العديد من أمراض الكبيبات الأولية إلى بروتينية نتيجة لتلف حاجز الترشيح الكبيبي [20]. يشير قدر كبير من الدراسات إلى أن الإصابة والخلل الوظيفي للخلايا البودوسيتية لهما دور جوهري في التسبب في البيلة البروتينية لمرض الكلى المزمن [21]. الدراسة التي أجراها Vukojevic وآخرون. يُظهر عددًا متزايدًا من الخلايا الهدبية وسوء التمايز في CNF [22]. أشارت الدراسات السابقة إلى أن مسار إشارات Wnt / -catenin يلعب دورًا أساسيًا في التخفيف من اختلال وظائف الخلايا البودوسية مع البيلة البروتينية [23]. هناك مساران رئيسيان لإشارات Wnt ، أحدهما يُعرف باسم الكنسي المعتمد على الكاتينين والآخر غير الكنسي المستقل عن الكاتينين. أثناء الماوسالكلىالتنمية ، إشارة Wnt الكنسي نشطة على أطراف برعم الحالب وفي الأجسام على شكل حرف S [24]. علاوة على ذلك ، فإن Wnt عبر الإشارات المتعارف عليها له صلة بالحفاظ على MET أثناء تكوّن الكلية [25]. على وجه التحديد ، يعد ربط مركب البروتين الذي يحتوي على Dvl بمستقبل الغشاء أمرًا إلزاميًا لتنشيط مسار Wnt ، بينما يؤدي تعطيل المكونات الرئيسية لهذا المسار إلى وفيات الفترة المحيطة بالولادة المبكرة بسبب غياب المنطقة الكلوية فيالكلى[25]. 

تم العثور على بروتين مهم كمفتاح جزيئي بين مسارات إشارات Wnt الكنسي وغير الكنسي ليكون انعكاسًا [26]. على الرغم من اكتشاف تفاعلات البروتينات المختلفة مع الانعكاس ، إلا أن وظيفتها الدقيقة لم يتم توضيحها بالكامل بعد. في الكلويالخلايا الظهارية ، يقع الانقلاب في الأهداب الأولية ، ويعمل كبروتين هدبي [27]. بالإضافة إلى ذلك ، يشكل الانعكاس مركبًا ثابتًا مع التوبولين في ثقافاتكلويالخلايا ، وتتجمع في الجسم الحي [27،28]. يبدو أن الانعكاس يلعب دورًا أساسيًا في التشكل المبكر للنظام الكلوي وتحديد التناظر بين اليسار واليمين أثناء التطور [29،30]. حدث مهم لكل من مسارات إشارات Wnt الكنسي وغير الكنسي في توظيف Dvl السيتوبلازمي في غشاء الخلية. منذ أن أظهرت النتائج السابقة أن الانعكاس و Dvl يتجمعان في الخلايا الظهارية الكلوية ، يمكن التكهن بأن الانعكاس قد يكون له أيضًا دور في الإشارات غير الكنسية. يؤدي عدم تنظيم إشارات Wnt بوساطة الانعكاس إلى حدوث تكاثر شاذ في الأنابيب [31]. كشفت الاختبارات الجينية عن طفرة DVL -1 في المرضى الذين يعانون من متلازمة روبينو السائدة في الجسم ، مما يؤدي إلى اضطرابات غير متجانسة في بعض المرضى المرتبطين بالجهاز البولي التناسلي والجهاز البولي التناسلي.كلويالشذوذ [32].

سيحسن الكستانش الكلى / الكلى

تم فحص نمط التعبير التطوري لـ -tubulin و inversion و DVL -1 في نماذج حيوانية مختلفة. وهكذا ، تم تأكيد تعبيرهم في الرينفروس من Xenopus laevis باستخدام الفحص المجهري داخل الحجاج [31] ، بينما تم العثور عليها في سلالات الخلايا المشتقة من الخلايا الأنبوبية القريبة من الفئران باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وقياس الطيف الكتلي [33]. بالإضافة إلى ذلك ، كشف الفحص المجهري الضوئي والتألق المناعي المزدوج عن وجودهما في أقسام من الفئرانالكلى[34]. أفادت الدراسات التي أجريت على الفئران القاضية الانعكاسية عن تكيسات منتشرة متضخمة فيكلويالنخاع والقشرة المرتبطة بانقلاب الموقع الحشوي [35]. في البشر ، تم تقديم طفرة الانقلاب مع التهاب الكلية الطفولي الذي أدى إلى إنهاء الحمل [36]. على الرغم من الدراسات العديدة حولكلوي-التوبولين والعكس ونمط التعبير ووظيفة DVL -1 ، على حد علمنا ، لم يتم بعد التحقق من نمط التعبير عن هذه البروتينات في الأنسجة البشرية الجنينية والأنسجة البشرية بعد الولادة وتوصل إلى علاقة متبادلة. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أدلة تدرس التعبير عن الانعكاس و DVL -1 في بداية التطور البشري. لذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تحليل نمط التعبير المكاني والزماني للتوبولين ، والانعكاس ، و DVL -1 أثناء مراحل الجنين وما بعد الولادة للإنسان السليم.الكلى، وكذلك فيالكلىأنسجة MCDK و FSGS و CNFالكلىمن أجل إنشاء حلقة مفقودة محتملة بين هذه الكيانات. وبالتحديد ، نقترح أن أنماط التعبير المضطربة لبروتينات التوبولين والانعكاس وبروتينات DVL -1 قد تكون هي عملية تكوين المثانة الكامنة ووظيفة غير طبيعية للأهداب الأولية التي تؤدي إلى الإصابة المزمنةأمراض الكلى. 

نتائج

تحليل النمو وما بعد الولادةالكلىتم إجراء الأنسجة على هياكل متباينة بوضوح منالكلى:الأنابيب الملتوية القريبة (pct) ، الأنابيب الملتوية البعيدة (DCT) والكبيبات (g). خلال مراحل النمو التي تم تحليلها وبعد الولادةالكلىأظهرت الأنسجة ، والتوبولين ، والانعكاس ، و DVL -1 أنماط تعبير إيجابية ولكن مع اختلافات في الكثافة والتوزيع والكمية. تحليل المرضيأنسجة الكلىتم إجراء MCDK و FSGS و CNF على عدد الصور الكامل للخلايا الإيجابية مقارنة بالتحكم الصحي في أنسجة الكلى.

2.1. الفحص المجهري الضوئي ، والفحص المجهري الإلكتروني ، والكيمياء المناعية (التوبولين) لأنسجة الكلى البشرية الصحية والمتغيرة باثولوجيًا بعد الولادة

2.1.1. ضوء الكلى الصحي بعد الولادة

الفحص المجهري للولادةالكلىيوضح النسيج أنه واضح المعالمالكلىالهياكل ، مع اختلاف واضح بين اللب والقشرة وتشكيل pct ، dct ، و g في المنطقة القشرية. يكشف التلوين الكيميائي الهيستوكيميائي المناعي لـ -tubulin عن وجود هدب أولي واحد في وسط سطح الخلية القمي لكل خلية أنبوبية وفي 0. 0 18 بالمائة ± 0.00014 بالمائة SD على سطح الخلايا الكبيبية. يُظهر الفحص المجهري الإلكتروني وجود هدب أولي واحد فقط ينشأ من الجسم القاعدي على سطح الخلية القمي للنبيب (الشكل 1 أ).

2.1.2. كنف

معظم g التي تم تحليلها أصغر حجمًا ومفصصًا (80 بالمائة) ، بينما الأقلية ذات حجم طبيعي أو تضخم (20 بالمائة ، n=100). تم العثور على التصلب القطاعي أو الشامل للجرام ، في حين أن pct و dct متوسعة جزئيًا ومغلفة بظهارة ضامرة. في البنية التحتية ، لوحظ فقدان ميكروفيلي وانخفاض في ارتفاع الخلية مع تجزئة متعددة من النوى. في الخلايا الجسدية ، يتم فقدان عمليات القدم بشكل منتشر. الأهداب الأولية الأنبوبية غير منظمة ، لا سيما في أكياس الأنابيب القريبة ، مما يُظهر تغيرات في الطول وموضع السيتوبلازم (الشكل 1 ب).

2.1.3. MCDK

في الأنسجة الكلوية ، يمكن العثور على g المتقطعة والناضجة.الكلىالأنسجة مليئة بالعديد من الأكياس البيضاوية. تغطي الخلايا الظهارية العمودية الأكياس وتحيط بها نسيج ضام رخو. يُظهر تلطيخ المناعي الكيميائي إلى التوبولين العديد من الأهداب الأولية الطويلة وغير المنظمة على سطح الخلايا الظهارية (الشكل 1 ج).

2.1.4. FSGS

في 90 بالمائة من الجرام ، تم العثور على تصلب قطاعي واسع النطاق (ن=100) ، مرتبط بالتليف الخلالي وعلامات التلف الأنبوبي. تم العثور على الانخفاض في ارتفاع الخلايا الظهارية مع فقدان ميكروفيلي في المجهر الإلكتروني ، في حين أن الخلايا البطانية ومناطق ميسانجيال لديها بنية دقيقة منتظمة. في المجهر الإلكتروني ، لوحظ وجود الهدب الطويل جدًا والمخلوع (اللامركزي) على سطح الخلية الأنبوبية البعيدة (الشكل 1 هـ). تظهر خلايا بودوسيت فقدانًا منتشرًا لعمليات القدم مع نسيج مكروي واسع النطاق. يظهر تلطيخ المناعي الكيميائي للتوبيولين عدة أهداب أولية طويلة وغير منظمة على سطح الخلايا الظهارية (الشكل 1 ج).

2.2. تلطيخ كيميائي مناعي إلى 心 Tubulin و Inversion و DVL {2}} والتحليل الإحصائي لتطور الكلى البشرية بعد الولادة وصحتها

في أسابيع الحمل الرابع عشر والخامس عشر والسادس عشر ، كانالكلىيتم تقديم الأنسجة بمراحل تطور مختلفة من تكوين النيفرون: من أكواب ميتانفريك ،كلويمراحل الحويصلات لتوجيه النيفرون على شكل حرف S ، وبالتالي تشكل المنطقة الكلوية في القشرة الخارجية (الشكل 2). يمكن ملاحظة تمييز pct و dct و g في مناطق قشرية أقرب إلى الالكلىالنخاع. خلال ال 22 GW ، أصبحت أجزاء من النخاع والقشرة مميزة بشكل واضح ، بينما في 38 GW ،الكلىتظهر الهياكل على أنها متباينة للغاية ، وتحتوي على أشكال ناضجة من pct و dct و g

2.2.1. أ- توبولين

أثناء التطوير ، يتم التعبير عن التوبولين بقوة في جميع النماءالكلىالهياكل ، في المقام الأول تصور شكل الأهداب الأولية على أسطح الخلايا الظهارية الجدارية لكبسولة بومان ، g ، pct و dct. داخلالكلىنسيج ، 82-97 بالمائة من خلايا pct تعبر عن توبولين ، بينما في تعبير dct يسقط من 99 بالمائة إلى 72 بالمائة في 38 GW (انظر الشكل 3 ، الجدول 1). من بين مراحل النمو المختلفة ، تم العثور على أقوى تعبير عن التوبيولين في G من 16 GWالكلىتحتوي على 93 في المائة من الخلايا الإيجابية. الجيغاواط 14 و 15 و 22 (انظر الشكل 3 أ ، ب ، الجدول 1) ، حوالي 7 0 بالمائة من الخلايا g تعبر عن التوبولين ، بينما لوحظ أقل تعبير في GW 38 (p <0.01) مع="" 34="" في="" المائة="" من="" الخلايا="" الإيجابية="" (الشكل="" 3="" ج).="" في="" فترة="" ما="" بعد="">الكلىالأنسجة (1. 5- عام و 7- عامالكلى) ، لوحظ أقوى نشاط مناعي لـ a-tubulin على سطح الخلية القمي من pct و dct (الشكل 3d-f). يوجد تعبير a-tubulin أيضًا في السيتوبلازم المحيط بالنواة في DCT والخلايا الظهارية الجدارية لكبسولة بومان. البقع a-tubulinكلويبنى بمتوسط ​​5 0 بالمائة من الخلايا الإيجابية في pct و 94 بالمائة في dct و 85 بالمائة في g (الشكل 3f). بقع DCT مختلفة بشكل ملحوظ عن pct (p <0.0001). تلطخ="" جميع="" الهياكل="" التي="" تم="" فحصها="" بإيجابية="" لـ="" a-tubulin="" ،="" مع="" 77="" بالمائة="" من="" الخلايا="" الإيجابية="" في="" pct="" ،="" و="" 72="" بالمائة="" في="" dct="" و="" 58="" بالمائة="" في="" g="">

الشكل 3. تلطيخ التألق المناعي من -Tubulin و DAPI في أنسجة الكلى البشرية النامية وبعد الولادة (a-e). كلاوي من 14 ، 15/16 ، 38 جيجاواط (أ - ج) ؛الكلىمن 1. 5- و 7- من الأطفال في عمر (ت ، هـ). يظهر التلوين الإيجابي لـ -Tubulin (الأسهم) في كل بنية في القشرة من خلال مراحل النمو وما بعد الولادة (a-e) ، الأنابيب الملتفة القريبة (pct) ، الأنابيب الملتفة البعيدة (dct) والكبيبات (g). تفاصيل الأهداب الأولية في pct (d) و dct (a-c ، e) تظهر كإدراج تكبير أعلى (صندوق أبيض). التكبير × 40 ، شريط المقياس 100 ميكرومتر. يوضح الرسم البياني (و) توزيع خلايا -Tubulin الإيجابية لكل بنية في مراحل مختلفة من التطور وفي فترة ما بعد الولادة. يوضح الرسم البياني (ز) (العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية للبروتين في الهياكل المرصودة) تعبير البروتين المرتبط بوقت النمو (الانحدار الخطي) والعلاقة المتبادلة بين -Tubulin و DVL -1 من خلال التطور والنضج (Two-Way ANOVA متبوعًا بـ اختبار SIDAK's posthoc). تظهر البيانات على أنها تعني ± SD.

يوضح الرسم البياني (و) توزيع الخلايا الإيجابية التيبولين لكل بنية في مراحل مختلفة من التطور وفي فترة ما بعد الولادة. يوضح الرسم البياني (ز) (العدد الإجمالي للخلايا الموجبة للبروتين في الهياكل المرصودة) تعبير البروتين المرتبط بوقت النمو (الانحدار الخطي) والعلاقة المتبادلة بين -Tubulin و DVL -1 من خلال التطور والنضج (ثنائي الاتجاه ANOVA متبوعًا بـ اختبار Sidak اللاحق). تظهر البيانات كوسيلة ± SD.

2.2.2. التلوين المناعي المزدوج للانعكاس و DVL -1 وصمة DAPI النووية في تطوير وصحة التعبير الانعكاسي للكلى بعد الولادة في أنسجة الكلى النامية وبعد الولادة

في GW 14 و 15 و 16 ، يظهر الانعكاس تعبيرًا حبيبيًا قويًا في g ، وتعبير حبيبي معتدل في السيتوبلازم لـ pct و dct (الشكل 4 أ ، ب) ، بينما في 22 و 38 غيغاواط (انظر الشكل 4 ج) ، بقوة لوحظ التعبير الإيجابي في g (الجدول 1). بين الرابع عشر والثاني والعشرين GW ، حوالي 5 0 بالمائة من الخلايا تعبر عن الإصدار. في GW السادس عشر ، تعبر خلايا pct عن الانعكاس في 73 بالمائة من الخلايا ، بينما تتناقص إلى 29 بالمائة من الخلايا (p <0.05) في="" gw="" 38="" (انظر="" الشكل="" 4f).="" تم="" العثور="" على="" التعبير="" الإيجابي="" للانعكاس="" في="" حوالي="" 80-90="" في="" المائة="" من="" الخلايا="" dct="" و="" g="" في="">الكلىأنسجة جيغاواط 14 و 16 ، مع أقل تعبير في dct 38 جيجاواط (p <0. 0="" 5="" ،="" p=""><0.0001 ،="" على="" التوالي)="" حيث="" كانت="" 66="" بالمائة="" من="" الخلايا="" موجبة.="" في="" فترة="" ما="" بعد="">الكلى، بقع pct بقوة على غشاء الخلية القمي ، بينما بقع dct في الغالب في غشاء الخلية القاعدية وفي السيتوبلازم المحيط بالنواة (الشكل 4 د ، هـ). في تلك المرحلة ، وجدنا تعبيرًا عن الانقلاب في كل ما تم فحصهكلويالهياكل ، بما في ذلك pct ، dct و g ، مع تعبير متوسط ​​من خلايا إيجابية من 92 في المئة لنسبة مئوية ، 88 في المئة ل DCT و 9 0 في المئة ل g (الشكل 4f). لم نلاحظ فرقًا كبيرًا في قوة إشارة تعبير الانعكاس بين الهياكل. تم العثور على أعلى تعبير عن الانعكاس في g ، بمتوسط ​​94 بالمائة من الخلايا الإيجابية (الشكل 4f). تم العثور على اختلاف كبير في مقارنة تلطيخ g (حيث 94 بالمائة من الخلايا تلطخ بشكل إيجابي) إلى pct ، حيث 58 بالمائة من الخلايا تلطخ بشكل إيجابي (p <0. 01)="" و="" dct="" ،="" حيث="" تكون="" 49="" بالمائة="" من="" الخلايا="" موجب="" (p=""><0.0001 ،="" الشكل="">

DVL -1 التعبير في تطوير وأنسجة الكلى بعد الولادة

لوحظ تعبير خفيف إلى قوي عن DVL {{0}} في السيتوبلازم من pct و dct و g في فترة الجنين (انظر الشكل 4 أ-ج ، الجدول 1). في pct ، 76 - 86 في المئة من الخلايا تعبر عن DVL -1 في 14–22 GW ، بينما في 38 GW ، هناك 57 بالمائة من الخلايا الإيجابية (الشكل 4g). في dct من 14 و 15 GW ، 68-7 0 بالمائة من الخلايا تعبر عن DVL -1 ، في 16 و 22 GW ، ينخفض ​​عدد الخلايا الإيجابية إلى 42-5 {{41} } بالمائة ، بينما في تعبير GW 38 (p <0.001) ،="" لوحظ="" في="" 19="" بالمائة="" من="" خلايا="" dct.="" يزداد="" التعبير="" عن="" dvl="" -1="" في="" g="" خلال="" مراحل="" الجنين:="" في="" الـ="" 14="" جيجاوات="" ،="" يكون="" 6٪="" ،="" بينما="" في="" 15="" و="" 16="" و="" 22="" gw="" ،="" يزداد="" إلى="" 10٪="" (p=""><0.01). في="" 38="" جيجاوات="" ،="" تعبر="" 14="" بالمائة="" من="" الخلايا="" g="" عن="" dvl="" -1="" (الشكل="" 4="" جم).="" في="" فترة="" ما="" بعد="" الولادة="" ،="" يتم="" تفريق="" نشاط="" المناعة="" dvl="" -1="" في="" السيتوبلازم="" (الجدول="" 1)="" لكل="" من="" pct="" و="" dct="" (الشكل="" 4="" د="" ،="" هـ).="" تم="" العثور="" على="" الإشارة="" في="" جميع="" الهياكل="" التي="" تم="" فحصها="" ولكن="" في="" الغالب="" في="" السيتوبلازم="" المحيط="" بالنواة.="" كثافة="" تعبير="" dvl="" -1="" أعلى="" بشكل="" ملحوظ="" في="" pct="" مقارنة="" بـ="" dct="" و="" g="" (p=""><0.01). 39-45="" بالمائة="" من="" الخلايا="" في="" pct="" و="" dct="" تعبر="" عن="" dvl="" -1="" ،="" بينما="" في="" g="" ،="" 21="" بالمائة="" من="" الخلايا="" إيجابية="" (الشكل="" 4="" جم).="" لم="" نجد="" فرقا="" كبيرا="" بين="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" المناعية="" في="">كلويالهياكل. النسبة المئوية للخلايا المناعية DVL -1 هي 34 بالمائة في pct و 36 بالمائة في dct و 27 بالمائة في g على التوالي (الشكل 4g).

الشكل 4. التلوين المناعي المزدوج للانعكاس (أخضر) ، DVL -1 (أحمر) و DAPI (أزرق) في أنسجة الكلى النامية وبعد الولادة (14 - 38 جيجاوات ، 1. 5- و {{6 }} من أنسجة الكلى البالغة من العمر عامًا). يظهر التلوين الإيجابي (الأسهم) في كل هيكل في جميع مراحل التطور (أ - ج) وفترة ما بعد الولادة (د ، هـ). الميكروفونات المدمجة جنبًا إلى جنب مع الهياكل ذات الأهمية في القشرة: الأنابيب الملتوية القريبة (pct) ، والأنابيب الملتوية البعيدة (DCT) والكبيبات (g). يظهر تحديد موقع الانعكاس / DVL -1 (رأس السهم) في الصور المجهرية المدمجة. تظهر بقع التحكم السلبي كإدخالات على الانعكاس و DVL -1 (أ). يمكن رؤية كريات الدم الحمراء كخلايا ملطخة بقوة بالقرب من dct. يتم عرض التفاصيل على شكل إدخالات تكبير أعلى. التكبير × 40 ، شريط المقياس 100 ميكرومتر. يظهر التوزيع الخلوي الإيجابي الديناميكي للانعكاس و DVL -1 في هياكل الكلى (pct ، dct ، g) خلال مراحل التطور وما بعد الولادة في الرسوم البيانية (f ، g). يوضح الرسم البياني (ح) تعبير البروتين (العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية في الهياكل) المرتبط بالوقت التطوري (الانحدار الخطي) والعلاقة المتبادلة للانعكاس إلى DVL -1 من خلال التطوير والنضج (ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار Sidak اللاحق ). تظهر البيانات كوسيلة ± SD.

لوحظ التعبير المشترك عن الانعكاس و DVL -1 في السيتوبلازم للكلى g و dct و pct أثناء التطور (انظر الشكل 4 أ-ج ، الدمج). في فترة ما بعد الولادة ، يميز التعبير المشترك عن الانعكاس و DVL -1 الأجزاء الخلوية المختلفة للخلايا الأنبوبية في pct و dct ، بينما يتميز التعبير المشترك في g بالانتشار القوي لتعبير الانعكاس (انظر الشكل 4 د ، دمج ). في العام 7- من الكلى بعد الولادة ، يظهر التعبير المشترك عن الانعكاس و DVL -1 في الخلايا الأنبوبية من dct و pct ، وفي g حيث يسود التعبير المعكوس قليلاً مقارنة بـ DVL -1 (الشكل 4 هـ ، دمج).

2.2.3. الاختلافات في التعبير عن -Tubulin و Inversion و DVL -1 بين مراحل نمو الكلى المختلفة والكلى بعد الولادة

كان عدد الخلايا الإيجابية التيبولين في جزء كبير من نسيج الكلى الجنيني أعلى بشكل ملحوظ من الناحية الإحصائية مقارنةً بنسيج الكلى للأطفال البالغ من العمر 7- عامًا (الثالث عشر (p <0. 0="" {="" {11}}="" 1)="" ،="" الخامس="" عشر="" (p=""><0. 0="" 0="" 0="" 1)="" والسادس="" عشر="" (p=""><0. 00001)="" غيغاواط).="" كان="" لدى="" dct="" لمراحل="" الجنين="" المبكرة="" (13="" و="" 15="" و="" 16="" و="" 22="" غيغاواط)="" خلايا="" أكثر="" إيجابية="" بالمقارنة="" مع="" أنسجة="" الكلى="" للأطفال="" بعمر="" 38="" جيجاوات="" و="" 1.="" 5-="" عامًا="" (p=""><0.0001 ،="" على="" التوالي="" ،="" الشكل="" 3f).="" عندما="" تمت="" مقارنة="" المراحل="" التنموية="" المختلفة="" ،="" وجدنا="" مستويات="" أقل="" من="" التعبير="" الانعكاسي="" في="" pct="" من="" 13="" (p=""><0.0001) ،="" 15="" (p=""><0.00001) ،="" 22="" (p=""><0.001) و="" 38="" (p=""><0.0001) gw="" بالمقارنة="" مع="">كلوينسيج من 1. 5- عام من الطفل. في dct ، تم العثور على تعبير أقل ذي دلالة إحصائية عن الانعكاس بمقارنة 16 GW إلى 38 GW أنسجة الكلى (p <0. 0="" 0="" 0="" 1).="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" لوحظ="" انخفاض="" التعبير="" عن="" الانقلاب="" في="" dct="" في="" أنسجة="" الكلى="" للأطفال="" بعمر="" 7-="" عام.="" مقارنة="" 13="" ،="" 15="" (p=""><0.001 ،="" كلاهما)="" ،="" 16="" و="" 1.="" 5-="" سنة="" أنسجة="" الكلى="" بعمر="" 7-="" سنة="" من="" أنسجة="" الكلى="" (p=""><0.00001 ،="" على="" التوالي="" ،="" الشكل="" 4f).="" كشفت="" الإشارة="" المرصودة="" لتعبير="" dvl="" -1="" خلال="" المراحل="" المختلفة="" أن="" النسبة="" المئوية="" للثالث="" عشر="" (p=""><0.01) ،="" الخامس="" عشر="" ،="" السادس="" عشر="" (p=""><>< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. العلاقة بين تعبيرات -Tubulin وانعكاس DVL -1 في أنسجة الكلى النامية وبعد الولادة

تمت مقارنة تعبيرات التوبولين والانعكاس مع تعبير DVL -1 خلال مراحل النمو وفي أنسجة الكلى بعد الولادة. -التيوبولين كان له تعبير أعلى إحصائيًا في جميع المراحل الملاحظة ، مقارنة بتعبير DVL -1 (p <0. 0="" 01="" ،="" الشكل="" 3g).="" خلال="" جميع="" المراحل="" التي="" تمت="" ملاحظتها="" ،="" كان="" للانعكاس="" تعبير="" أعلى="" عند="" مقارنته="" بـ="" dvl="" -1="" (p=""><0.0001 ،="" الشكل="" 4="">

2.2.5. مقارنة بين تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع -Tubulin ، الإصدار و DVL -1- والتحليل الإحصائي لأنسجة الكلى المتغيرة باثولوجيًا (MCDK ، CNF ، FSGS) - التوبولين كان الاختلاف في تلطيخ التوبولين في MCDK و FSGS و CNF ذا دلالة إحصائية بالمقارنة إلى أنسجة الكلى السليمة بعد الولادة كمجموعة تحكم (p <{{7}. 0001="" ،="" على="" التوالي).="" كان="" لأنسجة="" الكلى="" خلل="" التنسج="" تعبير="" أعلى="" بشكل="" ملحوظ="" مقارنة="" بالمجموعة="" الضابطة="" ،="" بينما="" أظهر="" fsgs="" و="" cnf="" تعبيرًا="" أقل="" بشكل="" ملحوظ="" عن="" -tubulin="" عند="" مقارنته="" بالتحكم="" الصحي="" (الشكل="">

انعكاس

يتم التعبير عن الانقلاب في السيتوبلازم للخلايا الظهارية غير المنظمة والأنابيب من MCDK (الشكل 5 أ). في CNF ، يميز تعبير الانعكاس g و dct ، بينما يظهر بشكل أقل كثافة في أكياس pct (الشكل 5 ب). في FSGS ، يتم التعبير عن الانعكاس بقوة في g و dct ولكن بشكل أقل كثافة في الخراجات pct (الشكل 5 ج). أظهر التعبير المكاني للانعكاس معدل تلطيخ أعلى ذي دلالة إحصائية في أنسجة الكلى السليمة (الشكل 5 جم) بالمقارنة مع MCDK و FSGS و CNF (p <0. 0001="" ،="" على="">

الشكل 5. التلوين المناعي المزدوج للانعكاس (أخضر) ، DVL -1 (أحمر) و DAPI (أزرق) في أنسجة الكلى المرضية في MCDK (أ) ، CNF (ب) و FSGS (ج): الأنابيب (t) ، الكبيبات (g) ، كيس pct (c) ، ارتفاع الخلايا الظهارية في pct (*). يتم عرض البنية والتعريب المشترك للخلية للانعكاس و DVL -1 (رؤوس الأسهم) في الأقسام المدمجة مع التفاصيل في إدخالات التكبير العالي. تظهر بقع التحكم السلبي كإدخالات على الانعكاس و DVL -1 (أ). التكبير × 4 0 ، شريط المقياس 1 0 {{2 0}} ميكرومتر. علاقة -tubulin (d) والانعكاس (e) بتعبير DVL -1 في MCDK و FSGS و CNF (اتجاهين ANOVA متبوعًا باختبار SIDAK اللاحق). الفرق في ارتفاع الخلية الظهارية (f) لـ FSGS و CNF و MCDK pct مقارنة بالتحكم الصحي (ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق ، n=50). الفرق في النسبة المئوية الإجمالية للخلايا الإيجابية من -Tubulin و inversion و DVL -1 في MCDK و CNF و FSGS عند مقارنتها بالتحكم الصحي (g – i) ، ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق). تظهر البيانات كوسيلة ± SD. تمت الإشارة إلى فروق ذات دلالة إحصائية بواسطة قيمة p (* p <0.05 ،="" **="" p=""><0.01 ،="" ****="" p=""><0.0001). يتم="" التعبير="" عن="" dvl="" -1="" dvl="" -1="" بشكل="" معتدل="" جدًا="" فقط="" في="" الأنابيب="" غير="" المنظمة="" من="" mcdk="" ،="" بينما="" في="" cnf="" ،="" يميز="" تعبيرها="" dct="" و="" g="" (الشكل="" 5="" أ="" ،="" ب).="" في="" fsgs="" ،="" لوحظ="" dvl="" -1="" كتفاعل="" معتدل="" في="" g="" و="" dct="" و="" pct="" (الشكل="" 5="" ج).="" أظهرت="" أنسجة="" الكلى="" الصحية="" الملطخة="" بـ="" dvl="" -1="" معدل="" تلطيخ="" أعلى="" بكثير="" (الشكل="" 5="" ح)="" على="" عكس="" mcdk="" و="" fsgs="" (p=""><0.0001 ،="" كلاهما)="" ،="" بينما="" لم="" يتم="" العثور="" على="" فرق="" كبير="" في="">

2.2.6. العلاقة بين تعبيرات -Tubulin و Inversion to DVL -1 في أنسجة الكلى المتغيرة باثولوجيًا (MCDK ، CNF ، FSGS)في MCDK و FSGS و CNF ، يكون التوبولين ملطخًا بدرجة أعلى بكثير من DVL -1 (p <0. 0="" 0="" 01="" ،="" على="" التوالي="" ،="" الشكل="" 5="" د).="" انعكاس="" ملطخ="" أعلى="" بكثير="" بالمقارنة="" مع="" dvl="" -1="" في="" mdck="" (ع=""><0.0001) وفي="" fsgs="" (ف=""><0.01 ،="" الشكل="" 5="">

2.2.7. الاختلافات في ارتفاع الخلايا الظهارية للأنابيب الملتوية القريبة بين التحكم الصحي وأنسجة الكلى المتغيرة مرضيًا (MCDK ، CNF ، FSGS)تمت مقارنة ارتفاع الخلايا الظهارية pct (n {0} لكل مجموعة) بين الخلايا الأنبوبية في أنسجة الكلى السليمة وأنسجة الكلى المتغيرة مرضيًا (الشكل 5 ب ، ج ، و). كان متوسط ​​ارتفاع الخلية الظهارية في HC 12.91 ميكرومتر ± 1.847 ميكرومتر وكان أعلى بكثير بالمقارنة مع CNF و FSGS (p <0. 0001="" ،="" على="" التوالي).="" كان="" متوسط="" ​​ارتفاع="" الخلية="" في="" cnf="" pct="" 9.011="" ميكرومتر="" ±="" 1.453="" ميكرومتر="" ،="" بينما="" كان="" في="" fsgs="" 8.114="" ميكرومتر="" ±="" 0.9248="" ميكرومتر.="" لم="" تظهر="" الخلايا="" الظهارية="" pct="" لـ="" mcdk="" تغيرات="" كبيرة="" في="" الارتفاع="" (12.17="" ميكرومتر="" ±="" 1.476="" ميكرومتر)="" عند="" مقارنتها="" بـ="">

2.2.8. الاختلافات في طول الأهداب الأولية بين التحكم الصحي وأنسجة الكلى المتغيرة باثولوجيًا (MCDK ، CNF ، FSGS)

تمت مقارنة طول الهدب الأساسي (ن=50 لكل مجموعة) بين HC وأنسجة الكلى المتغيرة بشكل مرضي (الشكل 6 ج). كانت أنسجة الكلى الصحية و MCDK ملطخة بـ -التوبولين لطمأنة خصوصية تلطيخ التوبولين cilium (الشكل 6 أ ، ب). في أنسجة الكلى السليمة ، كان السليوم الأولي بطول 5.065 ميكرومتر ± 1.229 ميكرومتر ، بينما كان في MCDK و CNF و FSGS أطول بشكل ملحوظ (p.<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

مناقشة

كان الهدف من دراستنا هو التحقيق في التعبير الكيميائي النسجي المناعي للأبيولين ، والانعكاس و DVL -1 في الجنينكلويالأنسجة وأنسجة الكلى بعد الولادة. علاوة على ذلك ، أردنا استكشاف ما إذا كان تعبير ونمط تلطيخ الأنبوبولين ، والانعكاس و DVL -1 مضطربًا في أمراض الكلى المختلفة عند مقارنتها بالتحكم الصحي. وبالتحديد ، على الرغم من الاهتمام الكبير للباحثين الآخرين بدور a-tubulin و inversion و DVL -1 أثناء تطور الكلى ، فقد استخدمت معظم الدراسات السابقة حيوانات أو نماذج تجريبية في المختبر. على حد علمنا ، هذه هي الدراسة الأولى التي أظهرت تعبير وتوطين التوبيولين جنبًا إلى جنب مع الانعكاس و DVL -1 في الكلى البشرية للجنين وبعد الولادة ، والتي استكشفت التعبير عن البروتينات المذكورة في الكلى الأمراض ، مثل MCDK و FSGS و CNF. قمنا أيضًا بتحليل التغيرات في طول الأهداب ومظهرها بواسطة الفحص المجهري الضوئي والإلكتروني ، حيث أشارت دراستنا السابقة بالفعل إلى أن الاضطرابات الهدبية قد تترافق مع تكوين المثانة في FSGF و CNF [19].

في مسار إشارات Wnt المتعارف عليه ، يؤدي ارتباط روابط Wnt بالمستقبلات إلى تجنيد Dvl [37]. يتم التحكم في عمليات MET ومسار قطبية الخلية المستوية خلال المراحل المبكرة من تشكل الكلى عن طريق إشارات Wnt. من خلال التوسط في مسار Wnt ، تتحكم الأهداب الأولية في تكاثر الخلايا والتمايز وتشكل الأنسجة [12] من خلال تنظيم الهيكل الخلوي واتجاه الخلية وكذلك استطالة الهيكل الأنبوبي [2،38]. في دراستنا ، كان كل من -tubulin و inversion و DVL -1 موجودًا في تراكيب الكلى ، وكلها تتجمع ليس فقط أثناء نمو كلية الجنين ولكن أيضًا في أنسجة الكلى من 1. 5- و {{9 }} عام. تتوافق هذه النتائج مع تنشيط مسار إشارات Wnt الذي ثبت أنه حدث بالفعل أثناء تكون الأنبوب [39]. بالإضافة إلى ذلك ، أوضحت نتائجنا أن التعبير عن -tubulin والانعكاس مرتبطان بشكل تبادلي بـ DVL -1 وأنهما يظهران فرقًا مهمًا إحصائيًا بين أنماط تعبيرهما. هذا مرتبط بالنماذج التجريبية ، حيث ينتج عن طفرة عائلة بروتين Dvl الكاملة في الفئران نقص في عملية المعدة ، بينما تظهر الطفرات التي لا تشمل عائلة البروتين بأكملها عيوبًا في وضع الأهداب العقدية إلى جانب عيوب في الأعضاء [40] . أشارت النتائج السابقة إلى أن الانعكاس له دور في هجرة الخلايا في Xenopus pronephros. نظرًا لأن هذا الجزء يرتبط بحلقة الثدييات من Henle والنبيبات البعيدة ، يمكن أن يشير هذا إلى أهمية الانقلاب أثناء نمو الكلى لدى البشر أيضًا [41]. بالاتفاق مع هذه الفرضية ، كشفت الدراسات السابقة أن طفرة في جين الانعكاس يمكن أن تؤدي إلى الإصابة بسرطان الكلية من النوع 2 ، والذي يتم التوسط فيه عن طريق تعبير DVL غير طبيعي -1 [42]. على الرغم من أن دور cilium الأولي مثير للجدل في تنظيم مسار إشارات Wnt ، وجدنا أن -Tubulin يتركز مع الانقلاب و DVL -1 في عينات الكلى التي تم تحليلها. علاوة على ذلك ، أشارت الدراسات السابقة إلى أن الهدب الأولي جنبًا إلى جنب مع الانعكاس ينظمان تدهور Dvl من خلال التأثير على مسار إشارات Wnt [43]. في أمراض الكلى البشرية المرتبطة بتطور الخراجات ، لوحظ توطين ووظيفة غير طبيعية للأهداب الأولية [19]. وبالمثل ، أكدت الدراسة الحالية أيضًا التغيرات المورفولوجية في تكوين الأهداب الأولية في الحالات المرضية مثل CNF و FSGS و MCDK. اعترفت النتائج السابقة بأن التنشيط المفرط لمسار Wnt الكنسي بعد تلف الكلى يؤدي إلى تغييرات هيكلية لا رجعة فيها في أنسجة الكلى [44]. على العكس من ذلك ، تم إعطاء cilium الأساسي دور التحول من مسار Wnt الكنسي إلى مسار Wnt غير الكنسي في المساعدةكلوييصلح. علاوة على ذلك ، وجد أن التنشيط المفرط لمسار Wnt الكنسي في أنسجة الكلى المزروعة له قيمة تنبؤية إيجابية تجاه التليف الكلوي [45]. إذا ساد مسار Wnt الكنسي على حساب غير الكنسي ، فإنه يدعم نظرية تليف الكلى كنتيجة. تشير النتائج التي توصلنا إليها لتعبير التوبولين المنخفض والتعبير الانعكاسي في CNF و FSGS إلى عدم نشاط مسار Wnt غير الكنسي ، خاصة وأن كلا الحالتين تميل إلى الوصول إلى المرحلة النهائية.امراض الكلى.على وجه التحديد ، يُعتقد أن التوطين الطبيعي ووظيفة cilium الأولي يمكن أن يكون عاملاً في الحفاظ على مسار Wnt منتظم ، وبالتالي ، شرط أساسي للتطور الطبيعي. في المقابل ، إذا تم تحسين مسار Wnt ، يمكن أن يؤدي إلى تكاثر وتمايز غير منظم للخلايا مما يؤدي إلى التسرطن [46]. كما هو موضح سابقًا ، يعد مسار Wnt الكنسي إلزاميًا لبدء MET وتشكيل النيفرون ، في حين أن اضطرابها قد يؤدي إلىكلوينقص تنسج [47]. تدعم نتائجنا هذه الفكرة من خلال الكشف عن أدنى تعبير لـ DVL -1 مع أعلى تعبير عن -Tubulin في MCDK مقارنةً بالتحكم الصحي. قد تشير هذه النتائج إلى أدنى تنشيط لمسار Wnt الكنسي ، والذي قد يكون سببًا أساسيًا لغياب تكوين النيفرون. على النقيض من ذلك ، فإن أعلى تعبير عن التوبولين مع أدنى تعبير لـ DVL -1 قد يفسر نتائج الخراجات المتعددة حيث لا يوجد استطالة منظمة واستقطاب خلوي يسترشد بمسار Wnt غير الكنسي. أظهرت الدراسات السابقة أيضًا أن الانعكاس يثبط مسار إشارة Wnt القانوني عن طريق استهداف Dvl للتدهور [26]. تم العثور على هذه الخطوة في تفاعلهم لتكون ضرورية لمنع إشارة Wnt الكنسي في الحفاظ على الاستطالة الأنبوبية العادية وتحديد المواقع. تؤدي طفرة الانعكاس إلى زيادة تنظيم إشارات Wnt الكنسية ، مما أدى لاحقًا إلى انتشار غير طبيعي في الخلايا الأنبوبية. وقد ثبت أن هذه الخطوة حاسمة في تكوين المثانة [42] ، في حين أن الضربة القاضية للانعكاس في الفئران تؤدي إلى مرض الكلى المتعدد الكيسات [48]. حسب نظريةكلويتكوين المثانة ، يعتبر الانقلاب "بروتين فطري" ، بسبب توطينه في الأهداب الأولية فيكلويالخلايا الأنبوبية. في دراستنا ، كانت الأهداب الأولية موجودة على سطح الخلية القمية للخلايا الأنبوبية في جميع المراحل التي تم تحليلها ، بينما خلال مراحل الجنين ، كان التعبير عن -Tubulin أقوى مما كان عليه في فترة ما بعد الولادة.

سيحسن الكستانش من آلام الكلى / الكلى

أظهرت الدراسات السابقة أن وظيفة الأهداب الأولية قد تتأثر بخلل في تنظيم التوبولين أثناء النمو ، مما قد يؤدي إلى تكون المثانة وتطور الكلى غير الطبيعي وإمكانية الإصابة بأمراض الكلى المزمنة في مرحلة الطفولة [31،49]. هذا يتوافق مع النتائج التي توصلنا إليها حول الأهداب الأولية المختصرة والمشوهة التي لوحظت في MCDK أو مع أهداب متعددة وممدودة للغاية أو مخلوعة موجودة في الأنابيب المتوسعة من CNF و FSGS عند مقارنتها بالتحكم الصحي. لدعم حقيقة أن مسارات إشارات Wnt القانونية وغير الكنسية ، التي تنظمها الأهداب الأولية ، تعتبر إلزامية لتطور الكلى الطبيعي ، وجدنا تلطيخًا أقل بكثير للانعكاس و DVL -1 في MCDK مقارنة بالتحكم الصحي [31 ، 49]. قد تشير ديناميكيات أنماط التعبير المختلفة للتوبولين والانعكاس و DVL -1 خلال مراحل تطور الكلى المختلفة إلى التبديل بين مسار إشارات Wnt الكنسي وغير الكنسي أثناء التشكل الطبيعي للكلية. نقترح أن تبادلهم يحدد النسخ في المسار القانوني أو ترتيب هجرة الخلايا والاستقطاب أثناء تطور الكلى في مسار إشارات غير قانوني. يشير توازنها وتعبيرها في جميع هياكل الكلى التي تم فحصها إلى دورها المهم في التطور الطبيعي للكلى. أثناء النمو الطبيعي للكلية (من 13 جيجاوات إلى 38 جيجاواط) ، يتناقص التعبير العام عن -التوبولين ، والانعكاس ، و DVL -1 حيث تكتسب أنسجة الكلى مورفولوجيا ناضجة. في 1. 5- و 7- عامًا من أنسجة الكلى ، أظهر التوبولين والانعكاس زيادة طفيفة في التعبير مما يدعم حقيقة أن مسار Wnt غير الكنسي يظل نشطًا بعد الولادة. على العكس من ذلك ، يستمر DVL -1 مع انخفاض نمط التعبير مما قد يضيف إلى استنتاج مفاده أن مسار Wnt الأساسي يتم إسكاته في أنسجة الكلى السليمة. نتيجة لظروف الكلى المرضية ، قد تتفاعل الخلايا الظهارية في الكلى مع ظهور EMT والتليف [50] المرتبط بإعادة تنشيط مسار Wnt الكنسي [44]. لذلك ، قد تكون اضطرابات -Tubulin و inversion و DVL -1 الموجودة في الكلى المريضة هي الآلية المرضية الكامنة ونتيجة التحول من مسار Wnt غير الكنسي إلى مسار Wnt الكنسي في الكلى النامية مما يشير إلى التبديل بين الكلية القابلة للعكس إلى الكلية غير القابلة للعكس تلف. علاوة على ذلك ، التغييرات في ما قبل الولادة وبعدهاكلويقد يترافق نمط التعبير مع ضعف وظائف الكلى في مرحلة البلوغ ، مما يؤدي إلى أمراض خلقية وفشل كلوي مزمن.

4. المواد والطرق

4.1 عينات بشرية

تم جمع عينات من أنسجة الكلى الجنينية بعد فقدان الحمل في 14 و 15 و 16 و 22 و 38 GW في قسم أمراض النساء والتوليد في مستشفى الجامعة بمركز سبليت. تم فحص جميع المواد الجنينية المكتسبة من قبل أخصائي علم الأمراض ، وتم استخدام الأنسجة التي لم تظهر عليها علامات الشذوذ أو النقع أو الموت داخل الرحم مع karyogram الطبيعي للدراسة. تم فحص السجلات الطبية للأمهات قبل جمع العينات وفي حالة وجود مشاكل صحية قد تؤثر على نتيجة الحمل ، تم استبعاد أنسجة الكلى من الدراسة. تم تحديد النضج من خلال محيط الرأس ومحيط البطن وطول عظمة الفخذ [51] في ارتباط مع تقويمات الدورة الشهرية للمرضى. تم جمع عينات من نسيج كلوي يبلغ من العمر 1. 5- و 7- عام بعد الوفاة العرضية. تم الحصول على العينات في قسم علم الأمراض في مستشفى جامعة مركز سبليت. تم الحصول على عينات من أنسجة الكلى متعددة الكيسات خلل التنسج (MCDK) بعد فقدان الحمل ، وتم الحصول على تصلب الكبيبات البؤري القطعي (FSGS) والمتلازمة الكلوية من النوع الفنلندي (CNF) بسبب استئصال الكلية. تم فحص وتقييم جميع المواد التي تم الحصول عليها من قبل أخصائي علم الأمراض ، الذي قام بتصنيف التشخيصات. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بكلية الطب بجامعة سبليت (20 مايو 2016) وفقًا لإعلان هلسنكي وتحديثاته (رقم التصنيف: 003-08 / 16-03 / 0001 ، رقم التسجيل: 2181-198-03-04-16-0024 ، 20 مايو 2016) [52].

4.2 المناعية

تمت معالجة تثبيت عينة الأنسجة التي تم جمعها باستخدام 4 في المائة من بارافورمالدهيد في محلول ملحي بالفوسفات (PBS) لمدة 24 ساعة عند 22 درجة مئوية. بعد الجفاف في الإيثانول بنسبة 100 في المائة ، تم دمج العينات في البارافين ، كما هو موضح سابقًا [53]. تم تقطيع العينات إلى شرائح بسمك 5 ميكرون باستخدام مشراح ومن ثم تم تركيبها على شرائح المجهر. للتحقق من الحفاظ على الأنسجة ، كان كل قسم 10 ملطخًا بالهيماتوكسيلين ويوزين [54]. تم إجراء قسم التأنيث والكيمياء المناعية كما هو موضح سابقًا [2،55،56]. بعد الشطف في برنامج تلفزيوني ، تم تحضين شرائح المجهر طوال الليل بأجسام مضادة أولية في غرفة رطبة عند 22 درجة مئوية (نظام تلطيخ شريحة StainTray ؛ Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لألفا توبولين للأرنب (التخفيف 1: 1000 ؛ ab179484 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) ، الأجسام المضادة المضادة للانعكاس من Rabbit Polyclonal (التخفيف 1: 100 ؛ ab65187 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) ، الفأر أحادي النسيلة DVL -1 الجسم المضاد (التخفيف 1: 150 ؛ sc -8025 ، سانتا كروز Biotechnology ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) والأجسام المضادة لتوبولين الأرانب متعددة النسيلة المضادة لجاما (للتحقق من التلوين الأولي الخاص بالأهداب باستخدام alpha- tubulin ، 1: 500 التخفيف ؛ ab11321 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة). بعد الشطف في برنامج تلفزيوني ، تم إعطاء الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة كما هو مدرج: الحمار المضاد للأرنب IgG H&L ، Alexa Fluor 488 (التخفيف 1: 400 ؛ ab150073 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) والماعز المضاد للفأر IgG H&L ، TRITC (التخفيف) 1: 400 ؛ ab6786 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) 4 '، تم استخدام 6- ديميدينو -2- فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد (DAPI) لتلوين النوى وبعد 2- دقيقة حضانة ، وشرائح تم غسلها في برنامج تلفزيوني ومغطاة بوسط متصاعد وأغطية. تم منع تلطيخ غير محدد باستخدام كتلة البروتين (ab64226 ؛ Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) قبل تطبيق الجسم المضاد الأساسي. كعنصر تحكم سلبي ، تم إجراء اختبار ما قبل الامتزاز ، في حين تم التحقق من خصوصية الأجسام المضادة الثانوية عن طريق حذف الأجسام المضادة الأولية من إجراءات التلوين.

4.3 المجهر الإلكتروني

تثبيتالكلىتم إجراء الأنسجة في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة لمدة 24 ساعة ، متبوعًا بالتثبيت اللاحق في 1 في المائة من رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة. تم إجراء عملية التجفيف باستخدام سلسلة الإيثانول والانتهاء من التضمين في راتينج LX 112 [22]. تم تلوين المقاطع الرقيقة ذات ميكرومتر واحد باستخدام أزرق التولويدين ودُرست لاختيار المقاطع الرقيقة للغاية. تم فحص المقاطع الرقيقة بسمك 0. 05 ميكرومتر بعد تلطيخها بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص. تم استخدام مجهر JEOL 1200 EX للحصول على الصور المجهرية.

4.4 التحليل الجيني

كما تم وصفه سابقًا [19] ، باستخدام الكريات البيض من الدم المحيطي ، تم استخراج الحمض النووي الجيني. تم العثور على طفرة خطأ متماثلة اللواقح في جين NPHS1 (c.1096A> C؛ p.Ser366Arg) ما أكد تشخيص المتلازمة الكلوية الخلقية من النوع الفنلندي (CNF) [57].

سيحسن القسطرة من التهاب الكلى / التهاب الجلد

4.5 تحليل البيانات

تم إجراء تحليل القسم على مجهر FL باستخدام 3 قنوات مضان FL (أوليمبوس BX51 ، طوكيو ، اليابان). تم التقاط الصور بواسطة الكاميرا الرقمية DP71 (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) بتكبير عالي الطاقة (× 40). فقطكلويكانت القشرة التي تحتوي على الأنابيب الملتفة القريبة (pct) والنبيبات الملتوية البعيدة (DCT) والكبيبات (g) موضع اهتمام. تمت معالجة الصور بعد ذلك بواسطة برنامج ImageJ (Rasband، WS، ImageJ، US National Institutes of Health، Bethesda، MD، USA، https://imagej.nih.gov/ij/ (تم الوصول إليه في 15 أكتوبر 2018) ، 1997-2021. ) و Adobe Photoshop (Adobe Inc. ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمزيد من التقييم. قبل عد الخلايا ، تم استخدام أداة ImageJ للقنوات المنقسمة. بعد ذلك ، تم طرح الصورة المجهرية الأصلية من التألق المناعي بواسطة القناة الحمراء أو الخضراء (اعتمادًا على القناة الأصلية) باستخدام أداة ImageJ الحاسبة للصور لمنع تسرب الإشارة. تم اعتبار القيم الواقعة تحت مستوى العتبة 50 سالبة. أحصينا الإشارات المناعية في الخلايا المكونة من 20 بنية على الأقل (pct أو dct أو g) لكل مرحلة أو العدد الإجمالي الإيجابي للخلايا لكل صورة ميكروية لخلل التنسج متعدد الكيساتالكلىالأنسجة ، FSGS و CNF. قمنا بتصنيف الخلايا على أنها إيجابية إذا تراكمت إشارة التألق المناعي على أي مستوى من الغشاء أو السيتوبلازم أو النواة أعلى من القيمة 50 المقاسة على برنامج ImageJ باستخدام أمر العتبة. تم تصنيف الخلايا السالبة على أنها خلايا مع عدم وجود أي نشاط مناعي. قام اثنان من المحققين المستقلين بتحليل البيانات.

4.6 التحليل شبه الكمي

تم تقييم شدة إشارة -Tubulin ، الانعكاس وتلطيخ DVL -1 بواسطة باحثين مستقلين باستخدام برنامج ImageJ. تم قياس شدة الإشارة الإجمالية بعد تعيين الصورة في نوع بت 8- ؛ بعد ذلك ، تم تقييم شدة تلطيخ العلامة في 2 0 نسبة مئوية ، DCT و G بقياس المنطقة المحددة للبنية. إذا كانت النتائج بين المقيّمين مختلفة ، أوضح باحث مستقل ثالث الشك. كانت شدة الإشارة القصوى لـ -Tubulin 84.125 ± 3.214 SD ، وكان الانعكاس 71.50 ± 2.715 SD و DVL {{13} }.916 ± 1.875 SD. تم وضع علامة على أعلى تشبع للون الإشارة في الصور المجهرية على أنها 3 (66.66-99.99 بالمائة من كثافة صورة الإشارة الإجمالية) ، تليها 2 (33.33 - 66.66 بالمائة) للشدة المتوسطة للإشارة و 1 (0.33 بالمائة - 33.33 بالمائة) لشدة الإشارة المنخفضة (الجدول 1.).

4.7 تحليل احصائي

لتحديد الاختلافات بين المراحل والهياكل ، تم إجراء اختبار Kruskal – Wallis ، تلاه اختبار Dunn اللاحق باستخدام برنامج GraphPad Prism (Graphpad Software Inc. ، سان دييغو كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، www.graphpad.com (تم الوصول إليه في 15 أكتوبر) 2 0 18.)). تم التعبير عن عدد الخلايا الإيجابية بالنسبة المئوية على أنها متوسط ​​القيمة ± الانحراف المعياري (SD) ، بينما تم الاعتراف بالأهمية الإحصائية عند p <0.05. كان="" عدد="" الهياكل="" التي="" تم="" تحليلها="" 4200="" في="" 35="" عينة="" ،="" مع="" عدد="" إجمالي="" يبلغ="" 135256="" خلية.="" استخدمنا="" 2-="" way="" anova="" مع="" اختبار="" sidak="" اللاحق="" لاختبار="" الاختلافات="" في="" التعبير="" عن="" -tubulin="" و="" inversion="" و="" dvl="" -1="" في="" مراحل="" تطور="" مختلفة.="" لدراسة="" تعبير="" البروتين="" فيما="" يتعلق="" بوقت="" النمو="" ،="" استخدمنا="" الانحدار="" الخطي.="" تم="" استخدام="" anova="" أحادي="" الاتجاه="" متبوعًا="" باختبار="" tukey="" اللاحق="" لاستكشاف="" الاختلافات="" في="" التعبير="" عن="" -tubulin="" و="" inversion="" و="" dvl="" -1="" في="">الكلىالأنسجة مقارنة بأنسجة MCDK و FSGS و CNF. تم التحقيق في الاختلافات في التعبير عن البروتينات بين MCDK و FSGS و CNF باستخدام طريقة ANOVA 2- متبوعة باختبار Sidak اللاحق. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق لتقييم الاختلافات في طول الأهداب وارتفاع الخلية الظهارية في pct بين التحكم الصحي والمرضي.الكلىمناديل. تم عرض البيانات على أنها قيمة متوسطة ± الانحراف المعياري (SD) مع وجود فرق إحصائي معترف به عند p <0.>