الحماض خارج الخلية يقيد عملية التمثيل الغذائي للكربون الواحد ويحافظ على جذع الخلايا التائية
Dec 22, 2023
يؤدي تراكم منتجات النفايات الأيضية الحمضية داخل البيئة الدقيقة للورم إلى تثبيط وظائف المستجيب للخلايا الليمفاوية التي تضخيم الورم (TILs). ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح كيف تؤثر البيئة الحمضية على استقلاب الخلايا التائية وتمايزها. نظهر هنا أن التعرض لفترات طويلة للحمض يعيد برمجة عملية التمثيل الغذائي داخل الخلايا التائية ولياقة الميتوكوندريا ويحافظ على جذعية الخلايا التائية. ميكانيكيًا، يؤدي ارتفاع الحماض خارج الخلية إلى إضعاف امتصاص الميثيونين والتمثيل الغذائي عن طريق تقليل تنظيم SLC7A5، وبالتالي تغيير ترسب H3K27me3 عند مروجي الجينات الجذعية للخلايا التائية الرئيسية. تعمل هذه التغييرات على تعزيز الحفاظ على حالة "الذاكرة الشبيهة بالجذع" وتحسين الثبات في الجسم الحي على المدى الطويل والفعالية المضادة للورم في الفئران. لا تكشف النتائج التي توصلنا إليها فقط عن قدرة غير متوقعة للحماض خارج الخلية للحفاظ على الخصائص الشبيهة بالجذع للخلايا التائية، ولكنها أيضًا تعزز فهمنا لكيفية تأثير استقلاب الميثيونين على جذعية الخلايا التائية.
نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة
انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity
【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
يمثل النقل بالتبني للخلايا التائية الخاصة بمستضد الورم تقدمًا كبيرًا في مجال علاج السرطان، حيث أدى إلى الانحدار الكامل لبعض الأورام الخبيثة. فعاليته العلاجية تعتمد بشكل كبير على حالة الثبات والتمايز للخلايا التائية المنقولة. تعد خلايا الذاكرة التائية الأقل تمايزًا هي المجموعة المفضلة لنقل الخلايا التائية بالتبني (ACT) نظرًا لخصائصها الشبيهة بالخلايا الجذعية المتمثلة في التجديد الذاتي وتعدد القدرات. في الواقع، ثبت أن استخدام خلايا الذاكرة التائية الشبيهة بالجذعية في ACT يحقق استجابات فائقة مضادة للورم 5 . بالمقارنة مع الخلايا التائية المؤثرة المتمايزة بشكل نهائي، تعرض الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية سمات مميزة 6 . تتميز كل من الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية البشرية والفأرية بتعبيرها عن الجزيئات ذات الخبرة بالمستضد والجزيئات المرتبطة بالتوجيه، بما في ذلك المستويات العالية من CD62L وCCR7 (المرجع 7). لقد تطور فهمنا للملفات النصية والتعديلات اللاجينية والمسارات الأيضية التي تنظم الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية بشكل كبير في السنوات الأخيرة 8-10. تم الإبلاغ عن أن العديد من عوامل النسخ، مثل TCF1، وKLF2، وLEF1، تلعب أدوارًا أساسية في تحفيز الخلايا التائية أو الحفاظ عليها. والجدير بالذكر أن TCF1 هو عامل النسخ الرئيسي الذي يعزز توليد خلايا الذاكرة التائية طويلة العمر 11 . أثناء حالات العدوى المزمنة، يحافظ جزء صغير من الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية TCF1+ على استجابات الخلايا التائية ضد العدوى الثانوية. توفر التغييرات اللاجينية وسيلة للخلايا التائية لبدء التغييرات النسخية التي تكمن وراء اكتساب خصائص خلايا الذاكرة، والحفاظ على أنماط التعبير النسخي هذه. أظهرت دراسات متعددة أن ثلاثي ميثيل هيستون H3 عند K4 (H3K4me3)، وهو تعديل مرتبط بالتنشيط، يتم اكتسابه في مواقع الجينات المرتبطة بالذاكرة، بما في ذلك TCF7 وKLF2 وLEF1 وCCR7 وSELL، أثناء تمايز القرص المضغوط الساذج {{47 }} الخلايا التائية في خلايا الذاكرة التائية، في حين يُفقد ثلاثي ميثيل H3 عند K27 (H3K27me3)، وهو تعديل قمعي، في هذه المواقع 13-15. على العكس من ذلك، تظهر الجينات المرتبطة بالمستجيب (GZMB، PRF1، IFNG، وTBX21) انخفاضًا في التعديلات الجينية القمعية وزيادة التنشيط في هذه المواقع في الخلايا التائية المستجيبة. أخيرًا، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الدوائر الأيضية تملي قرارات مصير الخلايا التائية وتشكل حالاتها اللاجينية والوظيفية. الخلايا التائية المؤثرة قصيرة العمر شديدة التحلل وتعتمد على استقلاب كربون واحد، في حين تعرض خلايا الذاكرة التائية الشبيهة بالجذع ملامح استقلابية متميزة تتميز بزيادة أكسدة الأحماض الدهنية (الفاو) والقدرة التنفسية الاحتياطية للميتوكوندريا (SRC)، الخصائص المشاركة في الثبات على المدى الطويل . ولذلك، فإن إعادة البرمجة الأيضية مهمة لاكتساب الخلايا التائية كفاءة وبقاءها على المدى الطويل.
فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة
تعد البيئة المكروية للورم المثبطة للمناعة (TME)، والتي تتميز بانخفاض الرقم الهيدروجيني ونقص الأكسجة والحرمان من الجلوكوز وإثراء حمض اللاكتيك، هي الحاجز الرئيسي الذي يعيق توسع الخلايا التائية المناسبة والتمايز والوظائف . في الواقع، فإن الإجهاد الأيضي الذي يفرضه TME يضعف قدرة الميتوكوندريا واللياقة البدنية، مما يؤدي إلى قصور التمثيل الغذائي للخلايا التائية داخل الفم وخلل وظيفي . ومن المثير للاهتمام أن معظم الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) تكون مختلة وظيفيًا، ولكن جزءًا صغيرًا منها يحتوي على ذاكرة تشبه الجذع أو خصائص السلائف. تحافظ مجموعة TIL الفرعية الشبيهة بالجذع على القدرة التكاثرية والمثابرة وترتبط باستجابة إيجابية لحصار نقطة التفتيش المناعية (ICB) وTIL-ACT لدى الأشخاص المصابين بالسرطان. أظهرت الدراسات السابقة أن ارتفاع الحماض خارج الخلية (↑[H+]) يثبط نشاط التحلل الخلوي للخلايا التائية سواء في المختبر أو في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك، فإن TME الحمضي له تأثير كبير على نشاط وتمايز الخلايا النخاعية المتسللة للورم، مثل الخلايا الجذعية (DC) والبلاعم المرتبطة بالورم (TAMs) . ومع ذلك، فإن تأثير ↑[H+] على جذع الخلايا التائية واللياقة الأيضية لا يزال غير معروف إلى حد كبير. هنا، نذكر أن التعرض طويل الأمد في المختبر ↑[H+] يسهل التمايز بين الخلايا التائية CD8+ الشبيهة بجذع الإنسان والفأر على حساب الخلايا التائية CD8+ ذات المستجيب الطرفي. لقد وجدنا أن العلاج طويل الأمد ↑[H+] يعيد تشكيل استقلاب الخلايا التائية ويحافظ على قدرة الميتوكوندريا التنفسية. علاوة على ذلك، فإن التعرض المستمر لـ ↑[H+] يضعف امتصاص الميثيونين والتمثيل الغذائي، مما يؤدي لاحقًا إلى انخفاض ترسب H3K27me3 للجينات المرتبطة بالذاكرة، مما يسهل الحفاظ على حالة "الذاكرة الشبيهة بالجذع". أخيرًا، يُظهر النقل بالتبني للخلايا التائية المستزرعة في ظروف ↑[H+] نشاطًا قويًا مضادًا للورم في الجسم الحي، وذلك تماشيًا مع النمط الظاهري الأقل استنفادًا. وهكذا، تكشف دراستنا الدور غير المتوقع للحماض خارج الخلية في الحفاظ على جذعية الخلايا التائية من خلال إعادة تشكيل التمثيل الغذائي الخلوي والأنماط اللاجينية.
نتائج
↑[H+ ] يؤدي التعرض إلى تعزيز نشوء الخلايا التائية CD8+
لتحديد ما إذا كان ↑[H+] خارج الخلية يؤثر على تمايز الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية، أجرينا تحليل التدفق الخلوي للأنماط الظاهرية الرئيسية الشبيهة بالجذع على الخلايا التائية البشرية المستزرعة لمدة 12 يومًا في أي من وسطي التحكم، ↑[H+ ] الذي يحتوي على 10 ملي مولار من حمض اللاكتيك. (تقليد تركيز اللاكتات في المواقف الفيزيولوجية المرضية ) أو الوسط الحمضي (حوالي 6.6 درجة حموضة، بواسطة حمض الهيدروكلوريك) (الشكل 1 أ). شوهدت نسبة أعلى من الخلايا التائية CD8+ الشبيهة بالجذع، بما في ذلك الذاكرة المبكرة (CD45RO− CD27+ ) والذاكرة المركزية (CD45RO+ CD27+ )، في الخلايا التائية المكيفة في ↑ [H+] مقابل وسيط التحكم (البيانات الموسعة الشكل 1 أ). بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن الخلايا التائية المستزرعة في وسط ↑[H+] تحتوي على نسبة أعلى من الخلايا الشبيهة بالجذعية (CCR7+ CD62L+) (الشكل 1 ب). تجدر الإشارة إلى أننا لاحظنا زيادة ملحوظة في تعبير TCF1، وهو العامل الرئيسي الذي يدفع تمايز الذاكرة المركزية والشبيهة بالجذع، على مستوى البروتين في كل من الخلايا التائية البشرية والفأرية CD8+ المعرضة لـ ↑[H+] (الشكل 1 ج و البيانات الموسعة الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك، كان هناك تأثير يعتمد على التركيز [H+] على تعبير CCR7 وTCF1 (البيانات الموسعة الشكل 1 ج). وفقًا للنمط الظاهري الشبيه بالجذع للخلايا التائية المكيفة ↑[H+]، تم تقليل إنتاج الإنترفيرون داخل الخلايا (IFN-) وعامل نخر الورم (TNF-) بشكل كبير في هذه الخلايا (الشكل 1 د).
لاستكشاف حالة تمايز الخلايا التائية بشكل أفضل، أجرينا تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) ووجدنا أن التعرض طويل المدى في المختبر ↑[H+] أدى إلى ملف تعريف نسخي متميز (البيانات الموسعة الشكل 1 د). أدى التعرض لـ ↑[H+] إلى انخفاض ملحوظ في التعبير عن الجينات التي تشفر جزيئات المستجيب، مثل PRF1 وGZMB وIFNG، والمستقبلات المثبطة المشتركة BTLA (الشكل 1e وf والبيانات الموسعة الشكل 1e). على النقيض من ذلك، أظهرت الخلايا التائية المستنبتة ↑[H+] تعبيرًا أعلى عن BACH2 وCCR7 وLEF1 وTCF7، والتي ترتبط بجذع الخلايا التائية (الشكل 1e وf والبيانات الموسعة الشكل 1e). أظهر تحليل تخصيب مجموعة الجينات (GSEA) أن النمط النسخي الناجم عن التعرض ↑[H+] كان مشابهًا لنمط خلايا الذاكرة التائية (الشكل 1 ز والبيانات الموسعة الشكل 1f). علاوة على ذلك، أكد تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) زيادة تعبير mRNA لـ BACH2 وKLF2 وLEF1 وTCF7 بعد العلاج ↑[H+] (الشكل 1ح). بشكل جماعي، تدعم هذه الملاحظات حقيقة أن العلاج ↑[H+] يشكل بشكل كبير الملامح النسخية للخلايا التائية لإثبات الجذع. تجدر الإشارة إلى أننا وجدنا أن العلاج ↑[H+] يمنع تكاثر الخلايا التائية ويحرف توزيع دورة الخلية نحو الطور G1 وبعيدًا عن الطور S (الشكل التكميلي 1 أ-ج). قمنا بعد ذلك بفحص تنشيط الخلايا التائية عند علاج ↑[H+] أثناء تحفيز TCR ووجدنا أن التعرض ↑[H+] ليس له تأثير كبير على التعبير عن علامات تنشيط الخلايا التائية أو حجم الخلية (الشكل التكميلي 2 أ، ب). بالإضافة إلى ذلك، أكدنا أيضًا أن التعرض لـ ↑[H+] بعد تنشيط الخلايا التائية يمكن أن يؤدي إلى حالة تشبه الجذع في الخلايا التائية (الشكل التكميلي 2ج-و). تستبعد هذه النتائج احتمال أن تكون الخلايا التائية المعرضة لـ ↑[H+] ببساطة مقاومة للتحفيز، بدلاً من تبني حالة تشبه الجذع.
cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي
أظهرت التقارير السابقة أن البيئة الحمضية تمنع بشكل حاد نشاط التحلل الخلوي للخلايا التائية سواء في المختبر أو في الجسم الحي . لقد وجدنا أيضًا أن التعرض قصير المدى ↑[H+] يضعف إنتاج السيتوكينات ولكن كان له تأثير ضئيل على النمط الظاهري الشبيه بالجذع في الخلايا التائية (البيانات الموسعة الشكل 1g-i والشكل التكميلي 3a-c). علاوة على ذلك، فإن التأثيرات المثبطة لإنتاج السيتوكين عن طريق التعرض ↑[H+] تكون عابرة وقابلة للعكس لأن إزالة ↑[H+] تستعيد إنتاج السيتوكين بواسطة الخلايا التائية بسرعة (البيانات الموسعة الشكل 1 س). وبالتالي، فإن تثبيط وظيفة مستجيب الخلايا التائية بواسطة الوسط الحمضي يكون سريعًا جدًا، في حين أن إعادة برمجة جذع الخلايا التائية تتطلب تعرضًا طويلًا ↑[H+ ]. نظرًا لوجود اللاكتات في المحلول إما في شكله غير المنفصل (حمض اللبنيك) أو كملح أيوني (لاكتات الصوديوم)، فقد سعينا بعد ذلك إلى تحديد ما إذا كان لاكتات الصوديوم يظهر تأثيرات مماثلة على جذع الخلايا التائية ووجدنا أن لاكتات الصوديوم يعزز أيضًا توقيعات الجذعية. على الرغم من أن فعاليته كانت أقل بكثير من فعالية معالجة حمض اللاكتيك (10 ملم) (البيانات الموسعة الشكل 1 ي، ك والشكل التكميلي 4 أ-و). تشير هذه النتائج إلى أهمية ↑[H+] واختلافه عن معالجة أيونات اللاكتات، في تحفيز النمط الظاهري الشبيه بالجذع لخلايا CD8+ T.
![Fig. 1 | ↑[H+ ] exposure facilitates the differentiation of stem-like CD8+ T cells. a Schematic of human T cell activation in the indicated conditions: pH 7.4 (–↑[H+ ], control), pH 6.6 (+↑[H+ ], hydrochloric acid), or 10 mM lactic acid (+↑[H+ ]). PBMCs, peripheral blood mononuclear cells. b, Representative CCR7 and CD62L expression profiles in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. c, Representative histograms and quantification of TCF1 expression in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. MFI, mean fluorescence intensity. d, Human T cells were expanded as in a for 12 days and stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) containing brefeldin A (BFA) for 4.5 h. The intracellular expression profile of IFN-γ and TNF-α is depicted for T cells in the pH 7.4 (left), 10 mM lactic acid (middle), or pH 6.6 (right) condition. n = 3 independent samples. e,f, RNA-seq analysis of human T cells that were expanded in control (pH 7.4) or lactic acid (10 mM). Heat map of selected genes (e) and volcano plot of all genes in which genes associated with memory, effector, and exhausted T cells were labeled (f). In the volcano plot, the x-axis represents the log2-transformed fold change (FC) values for cells treated with lactic acid relative to controls at day 12, and the y-axis represents the adjusted P values. n = 4 independent samples. g, GSEA plot comparing control with lactic-acid conditioned T cells for effector versus memory enrichment. NES, normalized enrichment score. h, Quantitative mRNA expression of transcription factors associated with T cell stemness (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) in T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by unpaired two-tailed Student's t-test (b–d,h). Nominal P values and false-discovery rates (FDRs) were calculated with the default method of the GSEA software (g).](/Content/uploads/2023842169/20231219104316e880161f05a346bca771aace88a72449.png "Fig. 1 | ↑[H+ ] exposure facilitates the differentiation of stem-like CD8+ T cells. a Schematic of human T cell activation in the indicated conditions: pH 7.4 (–↑[H+ ], control), pH 6.6 (+↑[H+ ], hydrochloric acid), or 10 mM lactic acid (+↑[H+ ]). PBMCs, peripheral blood mononuclear cells. b, Representative CCR7 and CD62L expression profiles in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. c, Representative histograms and quantification of TCF1 expression in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. MFI, mean fluorescence intensity. d, Human T cells were expanded as in a for 12 days and stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) containing brefeldin A (BFA) for 4.5 h. The intracellular expression profile of IFN-γ and TNF-α is depicted for T cells in the pH 7.4 (left), 10 mM lactic acid (middle), or pH 6.6 (right) condition. n = 3 independent samples. e,f, RNA-seq analysis of human T cells that were expanded in control (pH 7.4) or lactic acid (10 mM). Heat map of selected genes (e) and volcano plot of all genes in which genes associated with memory, effector, and exhausted T cells were labeled (f). In the volcano plot, the x-axis represents the log2-transformed fold change (FC) values for cells treated with lactic acid relative to controls at day 12, and the y-axis represents the adjusted P values. n = 4 independent samples. g, GSEA plot comparing control with lactic-acid conditioned T cells for effector versus memory enrichment. NES, normalized enrichment score. h, Quantitative mRNA expression of transcription factors associated with T cell stemness (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) in T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by unpaired two-tailed Student's t-test (b–d,h). Nominal P values and false-discovery rates (FDRs) were calculated with the default method of the GSEA software (g).")
الشكل 1|↑[H+] التعرض يسهل تمايز الخلايا التائية CD8+ الشبيهة بالجذع. رسم تخطيطي لتنشيط الخلايا التائية البشرية في الظروف المشار إليها: الرقم الهيدروجيني 7.4 (–↑[H+]، التحكم)، الرقم الهيدروجيني 6.6 (+↑[H+]، حمض الهيدروكلوريك)، أو 10 ملي مولار من حمض اللاكتيك (+↑[H+]). PBMCs، خلايا الدم وحيدة النواة المحيطية. ب ، ملفات تعريف التعبير التمثيلية CCR7 و CD62L في خلايا CD 8+ T البشرية في ظل ظروف مختلفة في اليوم 12. n=3 عينات مستقلة. ج ، الرسوم البيانية التمثيلية والتقدير الكمي للتعبير TCF1 في الخلايا التائية CD 8+ البشرية في ظل ظروف مختلفة في اليوم 12. n=3 عينات مستقلة. مؤسسات التمويل الأصغر، يعني كثافة مضان. د، تم توسيع الخلايا التائية البشرية كما في a لمدة 12 يومًا وتم تحفيزها باستخدام أسيتات phorbol 12- ميريستات 13- (PMA) التي تحتوي على البريفيلدين A (BFA) لمدة 4.5 ساعات. يتم تصوير ملف تعريف التعبير داخل الخلايا لـ IFN- وTNF- للخلايا التائية في حالة الرقم الهيدروجيني 7.4 (يسار)، أو 10 ملي مولار من حمض اللاكتيك (الأوسط)، أو 6.6 درجة الحموضة (يمين). ن=3 عينات مستقلة. e، f، تحليل RNA-seq للخلايا التائية البشرية التي تم توسيعها في التحكم (الرقم الهيدروجيني 7.4) أو حمض اللاكتيك (10 ملم). خريطة حرارية للجينات المحددة ( هـ ) ومؤامرة البركان لجميع الجينات التي تم فيها تصنيف الجينات المرتبطة بالذاكرة والمستجيب والخلايا التائية المنهكة ( و ). في مخطط البركان، يمثل المحور السيني سجل 2-قيم تغير الطية المحولة (FC) للخلايا المعالجة بحمض اللاكتيك بالنسبة لعناصر التحكم في اليوم 12، ويمثل المحور الصادي قيم P المعدلة. ن=4 عينات مستقلة. g ، مؤامرة GSEA تقارن التحكم مع الخلايا التائية المكيفة بحمض اللاكتيك من أجل إثراء المستجيب مقابل الذاكرة. NES، درجة التخصيب الطبيعية. h ، تعبير mRNA الكمي لعوامل النسخ المرتبطة بجذر الخلايا التائية (BACH2، KLF2، LEF1، TCF7) في الخلايا التائية في ظل الظروف المشار إليها. ن=3 عينة مستقلة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± تم تحديد التحليلات الإحصائية بواسطة اختبار الطالب غير المقيَّم ثنائي الذيل (b – d، h). تم حساب قيم P الاسمية ومعدلات الاكتشاف الخاطئ (FDRs) بالطريقة الافتراضية لبرنامج GSEA (g).
يؤدي ارتفاع [H+] إلى إعادة البرمجة الأيضية
إلى جانب برامج النسخ المتميزة، تكتسب الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية أيضًا سمات استقلابية فريدة بشكل تفضيلي، بما في ذلك ارتفاع مستوى منظمة الأغذية والزراعة والتمثيل الغذائي المقيد لتحلل السكر. لاستكشاف السمات الأيضية للخلايا التائية المكشوفة في المختبر على المدى الطويل ↑[H+]، أجرينا تحليل إثراء الجينات (GO) ووجدنا اختلافات كبيرة في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمسارات الأيضية، مثل استقلاب الجزيئات الصغيرة و تحلل السكر (الشكل 2 أ). في الواقع، أظهرت الخلايا التائية المكيفة طويلة المدى ↑[H+] انخفاضًا في تحلل السكر واستقلاب الأحماض الأمينية على النقيض من زيادة استقلاب الأحماض الدهنية طويلة السلسلة (البيانات الموسعة الشكل 2 أ، ب). على عكس التعرض طويل المدى ↑[H+]، فإن العلاج قصير المدى ↑[H+] يمنع تحلل السكر فقط، ولكن لم يكن له تأثيرات كبيرة على منظمة الأغذية والزراعة (الشكل التكميلي 5 أ). أكد تحليل PCR الكمي أيضًا أن جينات تحلل السكر SLC2A1 و SLC2A3 و LDHA انخفضت بشكل ملحوظ في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+] (البيانات الموسعة الشكل 2 ج). على العكس من ذلك، عزز تكييف ↑[H+] التعبير عن كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز 1 (المشفر بواسطة CPT1A)، وهو إنزيم محدد للمعدل يشارك في منظمة الأغذية والزراعة (البيانات الموسعة الشكل 2 ج). لتوضيح التغيرات الأيضية الناجمة عن ↑[H+]، أجرينا تحليلًا استقلابيًا غير متحيز ووجدنا 285 وسيطًا متميزًا في الخلايا التائية المستنبتة بـ ↑[H+] مقابل عناصر التحكم (البيانات الموسعة الشكل 2 د). على وجه الخصوص، أدى التعرض لـ ↑[H+] إلى انخفاض كبير في الوسطيات المحللة للسكر وبعض الأحماض الأمينية الأساسية بدلاً من زيادة أنواع الكارنيتين المتعددة، وهو الشكل المنشط للأحماض الدهنية الذي يتم نقله إلى الميتوكوندريا للأكسدة (البيانات الموسعة الشكل 2 هـ-ز). أظهر تحليل التدفق الأيضي باستخدام الجلوكوز [13C6] أو [13C16] بالميتات أن التعرض ↑[H+] أعاق بشكل كبير دمج الجلوكوز [13C6] في وسائط TCA وحمض اللاكتيك مع تعزيز دمج [13C16] بالميتات في أسيتيل مرافق الإنزيم أ والسيترات، مما يدعم الفكرة. أن الحماض خارج الخلية يثبط تحلل السكر ويعزز منظمة الأغذية والزراعة في الخلايا التائية (الشكل 2 ب – هـ). أظهرت هذه الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] قيودًا فيما يتعلق بامتصاص العناصر الغذائية، كما يتضح من انخفاض استهلاك الجلوكوز [13C6] وامتصاص نظائرها الدهنية (BODIPY FL C16)، وهي نتيجة قد تكون ناجمة عن زيادة التدرج الكهروكيميائي (البيانات الموسعة الشكل 2 ح، ط).
يمكن أن يؤدي الامتصاص المحدود للمغذيات وتحول الأيض الخلوي إلى تغييرات في شبكات الإشارات في الخلايا التائية. كشف تحليل التخصيب GO للخلايا التائية المعالجة بحمض اللاكتيك أن معظم الجينات المصابة متورطة بشكل أساسي في إشارات PI3K-AKT وmTOR وTCR (البيانات الموسعة الشكل 3 أ). تلعب إشارات mTOR دورًا مركزيًا في دمج الإشارات المناعية والإشارات الأيضية من أجل التنشيط الصحيح للخلايا التائية، كما يؤدي تثبيط إشارات mTOR إلى تحريف الخلايا نحو تكوين خلايا الذاكرة المضغوطة 8+ T بدلاً من تمايز المستجيب . أشار تحليل GSEA الخاص بنا إلى أن نشاط كل من إشارات AKT-mTOR وNF-кB في الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] قد انخفض مقارنةً بنشاط الخلايا التائية الخاضعة للتحكم (الشكل 2f والبيانات الموسعة الشكل 3 ب). تم تأكيد ذلك أيضًا من خلال انخفاض الفسفرة لـ S6 (في Ser235 وSer236)، و4EBP1 (في Thr37 وThr46)، وAKT (في Ser473) وNF-кB (في Ser536) في الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] (الشكل 1 أ). 2g،h والبيانات الموسعة الشكل 3 ج). ومن المعروف أن mTOR هو منظم حاسم للعمليات البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك حجم الخلية، وتوليد الطاقة، وتخليق البروتين. في الواقع، وجدنا أن حجم خلية الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] قد انخفض مقارنةً بحجم خلايا التحكم التائية (البيانات الموسعة الشكل ثلاثي الأبعاد). قمنا بعد ذلك بتقييم تخليق البروتين المعتمد على الطاقة الحيوية في الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] باستخدام SCENITH، وهي طريقة مطورة حديثًا تستخدم دمج البيوروميسين كقراءة لمستويات تخليق البروتين. كما هو متوقع، أدى التعرض لـ ↑[H+] إلى تثبيط تخليق البروتين كثيف الاستهلاك للطاقة (الشكل 2i)، مما يشير إلى أن استقلاب الطاقة في الخلايا التائية CD8+ قد تغير. تتوافق هذه النتائج مع النتائج السابقة التي تفيد بأن تثبيط نشاط mTOR بواسطة الراباميسين زاد من التعبير عن عوامل النسخ المرتبطة بالجذر (البيانات الموسعة الشكل 3 هـ ، و). من خلال جمع نتائجنا معًا، نستنتج أن التعرض طويل الأمد لـ ↑[H+] ينظم التبديل الأيضي ويمنع نشاط mTOR، مما يسهل اكتساب وصيانة الخلايا التائية الجذعية.
cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي
↑[H+] - تقييد استقلاب الميثيونين يحافظ على الجاذبية اللاجينية
تشير الأدلة المتراكمة إلى أن استقلاب الكربون الواحد يملي قرارات مصير الخلايا التائية ويشكل حالاتها الوظيفية . أظهر تحليل RNA-seq الخاص بنا ضعف التخصيب في عملية التمثيل الغذائي أحادية الكربون وتوقيع دورة الميثيونين في الخلايا التائية المعرضة للعلاج طويل المدى، وليس قصير المدى، ↑[H+] (الشكل 3 أ، البيانات الموسعة الشكل 4 أ، والشكل التكميلي 5 ب). وفقًا لذلك، أدى التعرض لـ ↑[H+] إلى منع التعبير عن الجينات التي تشفر الإنزيمات المرتبطة بدورة الميثيونين (MTR وAHCY وBHMT) بالإضافة إلى استقلاب حمض الفوليك (SHMT1 وSHMT2) (البيانات الموسعة الشكل 4 ب). كشف المزيد من تحليل التمثيل الغذائي أن الخلايا التائية المستزرعة في حامض اللبنيك أظهرت انخفاضًا ملحوظًا في المستقلبات داخل الخلايا المشاركة في دورة الميثيونين، بما في ذلك الميثيونين وS-adenosylmethionine (SAM) وS-adenosylhomocysteine (SAH)، ولكن زيادة في مستويات السيرين والهموسيستين (ممتد) بيانات الشكل 4 ج). [13C5] أكد تتبع الميثيونين أيضًا أن الامتصاص والوفرة داخل الخلايا للميثيونين، وSAM داخل الخلايا المسمى 13C (m+5)، وSAH (m+4) و5′-ميثيل-ثيوادينوسين (MTA، m +1) تم تخفيضها بشكل ملحوظ في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+] (الشكل 3 ب – د والبيانات الموسعة الشكل 4 د). تجدر الإشارة إلى أن مكملات الميثيونين الخارجية استعادت الامتصاص والوفرة داخل الخلايا للميثيونين [13C5] بالإضافة إلى الوسطيات ذات الصلة في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+] (الشكل 3 ج، د والبيانات الموسعة الشكل 4 د)، مما يشير إلى أن الميثيونين الخارجي المكملات يمكن أن تستعيد امتصاص الميثيونين والتمثيل الغذائي للخلايا التائية المكشوفة ↑[H+]. قمنا بعد ذلك بالتحقق مما إذا كان تقييد الميثيونين يمكن أن يؤدي إلى نشوء الخلايا التائية. لقد وجدنا أن الحرمان من الميثيونين عزز بالفعل تحريض مجموعة الخلايا التائية TCF 1+ CD 8+ ولكن لم يكن له أي تأثير على التعبير عن CD62L وCD44 (البيانات الموسعة الشكل 4e، f). لمزيد من دراسة دور استقلاب الميثيونين في نشأة الخلايا التائية المستحثة بـ ↑[H+]، قمنا بزراعة الخلايا التائية باستخدام وسط ↑[H+] مكمل بالميثيونين أو SAM أو SAH. تم بالفعل حظر النمط الظاهري لجذع الخلايا التائية الناجم عن الحماض خارج الخلية جزئيًا عن طريق المكملات مع الميثيونين أو SAM ، ولكن ليس SAH (الشكل 3e والبيانات الموسعة الشكل 4g-i). يتم تحويل الميثيونين داخل الخلايا إلى SAM، وهو مانح مهم لمجموعة الميثيل لتفاعلات مثيلة الحمض النووي والهيستون (البيانات الموسعة الشكل 5 أ). وهكذا، قمنا بتمييز أنماط مثيلة هيستون ووجدنا أن ارتفاع [H+] قلل بشكل كبير من إجمالي مستويات H3K27me3 في الخلايا التائية، ولكن لم يكن له تأثير كبير على التعبير عن علامات مثيلة هيستون الأخرى (الشكل 3f والبيانات الموسعة الشكل 5 ب). كما هو متوقع، أعادت مكملات الميثيونين إلى الخلايا التائية تحت التعرض ↑[H+] المستوى الإجمالي للتعبير H3K27me3 (الشكل 3f). إن الانخفاض المحدد في مستوى H3K27me3 الذي لوحظ في الخلايا التائية التي خضعت لعلاج طويل الأمد ↑[H+] دفعنا إلى افتراض أن التعرض ↑[H+] ينظم بشكل انتقائي نقل الميثيل المحدد لترسب H3K27me3. في الواقع ، لاحظنا انخفاضًا ملحوظًا في التعبير عن EZH2، وهو ميثيل ترانسفيراز رئيسي لـ H3K27me3، سواء على مستوى الرنا المرسال أو البروتين في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+] (البيانات الموسعة الشكل 5 ج، د). علاوة على ذلك، أدى تثبيط نشاط EZH2 بواسطة مثبط محدد للغاية، GSK126، إلى زيادة التعبير عن TCF1، وكذلك النسبة المئوية لخلايا CCR 7+ CD62L + CD 8+ T (البيانات الموسعة الشكل 5 هـ، و) ، والذي كان يتماشى مع تقرير سابق مفاده أن EZH2 يمكنه تنظيم إمكانات خلايا الذاكرة التائية من خلال التعديلات اللاجينية الانتقائية . لتحديد التغيرات على مستوى الجينوم في الأنماط اللاجينية لجذع الخلايا التائية المستحثة بـ ↑[H+]، أجرينا اختبار CUT&Tag-seq ووجدنا تغييرات طفيفة في تناسب ترسب H3K4me3 وH3K27me3 بين المجموعات المعالجة المختلفة على طول المروج والجسم الجيني و المناطق الجينية (البيانات الموسعة الشكل 5 ز). على وجه التحديد، كشف التنميط اللاجينومي عن انخفاض مستوى علامة هيستون القمعية H3K27me3 في مواضع الجينات المرتبطة بالذاكرة (على سبيل المثال، TCF7 وCCR7 وID3 وLEF1 وKLF2) في الخلايا التائية المعالجة بـ ↑[H+] على المدى الطويل (الشكل 3g). . الأهم من ذلك، أن إضافة الميثيونين تحت التعرض ↑[H+] أعاد جزئيًا مستوى H3K27me3 في الموقع أعلاه، بالإضافة إلى تعبيرهم الجيني، مما يشير إلى دور مهم للميثيونين في التعديل اللاجيني لهذه الجينات المرتبطة بالذاكرة (الشكل 3g و البيانات الموسعة الشكل 5 ح). تمشيا مع دراسة سابقة 14 ، اكتسبت الجينات المستجيبة مثل PRF1 و GZMB و IFNG و TBX21 و NR4A2 بشكل إيجابي نمط مثيلة هيستون المنشط (H3K4me3hi و H3K27me3lo) (الشكل 3g). تجدر الإشارة إلى أن إشغال H3K4me3 في مناطق المروج لهذه الجينات المستجيبة قد تم إضعافه في الخلايا التائية المستزرعة تحت التعرض ↑[H+] وتم استعادتها بواسطة مكملات الميثيونين (الشكل 3g). بشكل عام، تشير هذه النتائج إلى أن خلل دورة الميثيونين بوساطة ↑[H+] يعزز الحفاظ اللاجيني على جذعية الخلايا التائية.
يمكن للعديد من ناقلات الميثيونين (SLCs)، بما في ذلك SLC7A5 وSLC38A1 وSLC38A2 وSLC43A2، التوسط في نقل الميثيونين . لاستكشاف كيف يؤدي التعرض لـ ↑[H+ ] إلى تقليل امتصاص الميثيونين والتمثيل الغذائي في الخلايا التائية، قمنا بتحليل أنماط التعبير الخاصة بـ SLCs المتميزة ووجدنا أن ↑[H+ ] قلل بشكل كبير من تعبير SLC7A5 وSLC38A2، ولكن لم يكن له تأثير يذكر على تعبير SLC38A1 (موسع). بيانات الشكل 6 أ، ب). بالإضافة إلى ذلك، أدى التعرض ↑[H+] إلى تقليل تعبير ونشاط MYC (شكل البيانات الموسعة 6 ج، د)، والذي تم الإبلاغ عنه لتنظيم التعبير عن ناقلات الميثيونين مثل SLC7A5 (المرجع 47). لقد أظهرنا أيضًا نسبة إشغال عالية لـ MYC على مروج SLC7A5 وبدرجة أقل على مروج SLC38A2 (البيانات الموسعة الشكل 6 هـ). الأهم من ذلك أنه لوحظ انخفاض كبير في ارتباط MYC بهذه المواقع في الخلايا التائية المعالجة طويلة المدى ↑[H+] (البيانات الموسعة الشكل 6 هـ). تمشيا مع هذه الملاحظات ، أعاد التعبير الزائد عن MYC بشكل ملحوظ التعبير عن SLC7A5 و SLC38A2 في الخلايا التائية المكشوفة ↑ [H + ] (البيانات الموسعة الشكل 6f). تدعم هذه النتائج الدور الهام لـ MYC في تقليل التعبير عن ناقلات الميثيونين عند التعرض ↑[H+]. ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا أن مكملات الميثيونين يمكنها أيضًا استعادة تعبير MYC وSLC7A5 في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+] (البيانات الموسعة الشكل 6g)، مما يشير إلى أن مكملات الميثيونين قد تستعيد قدرة الخلايا التائية على امتصاص الميثيونين عن طريق تنظيم تعبير ناقل الميثيونين SLC7A5 بطريقة تعتمد على MYC. أظهرت دراسة سابقة أن SLC7A5 هو ناقل الميثيونين الأكثر وفرة في الخلايا التائية المنشَّطة . يشير هذا، إلى جانب النتائج السابقة التي توصلنا إليها، إلى أن SLC7A5 قد يلعب دورًا مهمًا في تقييد الميثيونين الناجم عن ↑[H+] والحفاظ على حالة تشبه الجذع. في الواقع، وجدنا أن الإفراط في التعبير عن SLC7A5 يضعف جزئيًا النمط الظاهري الشبيه بالجذع الناجم عن ↑[H+] (البيانات الموسعة الشكل 6h، i)، مما يدعم أيضًا مشاركة ناقل الميثيونين SLC7A5 في ذاكرة الخلايا التائية المستحثة ↑[H+] -مثل النمط الظاهري. من خلال تحليل مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية المضغوطة المتسللة للورم 8+، وجدنا تعبيرًا مخفضًا لكل من MYC وSLC7A5 في الأقراص المضغوطة الشبيهة بالذاكرة 8+ TILs (البيانات الموسعة الشكل 7 أ، ب)، والتي تتماشى مع مع النتائج التي توصلنا إليها في المختبر. وبالتالي، تشير هذه النتائج إلى أن محور MYC-SLC7A5-الميثيونين يمكن أن يساهم في الحفاظ على حالة TILs الشبيهة بالذاكرة.
![Fig. 2 | ↑[H+ ] exposure triggers metabolic reprogramming and suppresses mTOR signaling. a, GO analysis using RNA-seq data, showing representative differentially expressed metabolic genes in control and lactic-acid-conditioned human T cells (adjusted P value < 4.23 × 10–2). b, Schematic of [13C6]glucose or [ 13C16]palmitate labeling patterns. c, Percentage of the indicated m+3 lactate out of total lactate or of m+3 pyruvate out of total pyruvate in T cells. n = 3 independent samples. d, Percentage of isotopomer for the TCA intermediates, such as citrate (m+2), malate (m+2), and succinate (m+2), derived from [13C6]glucose. n = 3 independent samples. e, Percentage of the indicated m+2 acetyl-CoA out of total acetyl-CoA or of m+2 citrate isotope out of total citrate in T cells from [13C16] palmitate. n = 4 independent samples. f, GSEA with statistical analysis of the gene set associated with mTORC1 signaling in control versus lactic-acid-conditioned (left) or pH 6.6-conditioned (right) human T cells. g,h, Flow cytometric analysis and quantification for S6 phosphorylated at Ser235 and Ser236 (g) and 4EBP1 phosphorylated at Thr37 and Thr46 (h) in human CD8+ T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. I, Flow cytometric analysis and quantification of energy-intensive protein synthesis in controls or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by one-sided Fisher exact test with Benjamini–Hochberg multiple-comparisons test (a) or unpaired two-tailed Student's t-test (c–e,g–i). Nominal P values and FDRs were calculated with the default method in the GSEA software (f).](/Content/uploads/2023842169/202312191044395da385e9aa8c4673a892ee5262c6dba0.png "Fig. 2 | ↑[H+ ] exposure triggers metabolic reprogramming and suppresses mTOR signaling. a, GO analysis using RNA-seq data, showing representative differentially expressed metabolic genes in control and lactic-acid-conditioned human T cells (adjusted P value < 4.23 × 10–2). b, Schematic of [13C6]glucose or [ 13C16]palmitate labeling patterns. c, Percentage of the indicated m+3 lactate out of total lactate or of m+3 pyruvate out of total pyruvate in T cells. n = 3 independent samples. d, Percentage of isotopomer for the TCA intermediates, such as citrate (m+2), malate (m+2), and succinate (m+2), derived from [13C6]glucose. n = 3 independent samples. e, Percentage of the indicated m+2 acetyl-CoA out of total acetyl-CoA or of m+2 citrate isotope out of total citrate in T cells from [13C16] palmitate. n = 4 independent samples. f, GSEA with statistical analysis of the gene set associated with mTORC1 signaling in control versus lactic-acid-conditioned (left) or pH 6.6-conditioned (right) human T cells. g,h, Flow cytometric analysis and quantification for S6 phosphorylated at Ser235 and Ser236 (g) and 4EBP1 phosphorylated at Thr37 and Thr46 (h) in human CD8+ T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. I, Flow cytometric analysis and quantification of energy-intensive protein synthesis in controls or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by one-sided Fisher exact test with Benjamini–Hochberg multiple-comparisons test (a) or unpaired two-tailed Student's t-test (c–e,g–i). Nominal P values and FDRs were calculated with the default method in the GSEA software (f).")
الشكل 2|↑[H+] يؤدي التعرض إلى إعادة البرمجة الأيضية ويمنع إشارات mTOR. تحليل GO باستخدام بيانات RNA-seq، يُظهر الجينات الأيضية التمثيلية المعبر عنها تفاضليًا في الخلايا التائية البشرية الخاضعة للتحكم والخلايا التائية البشرية المكيفة بحمض اللاكتيك (قيمة P المعدلة <4.23 × 10–2). ب، رسم تخطيطي لأنماط وضع العلامات على الجلوكوز أو [13C16] بالميتات. ج، النسبة المئوية لللاكتات m+3 المشار إليها من إجمالي اللاكتات أو m+3 البيروفات من إجمالي البيروفات في الخلايا التائية. ن=3 عينات مستقلة. د، النسبة المئوية للنظائر المشعة للمركبات الوسيطة TCA، مثل السيترات (m+2)، والمالات (m+2)، والسكسينات (m+2)، المشتقة من الجلوكوز [13C6]. ن=3 عينات مستقلة. e، النسبة المئوية لـ m+2 acetyl-CoA المشار إليه من إجمالي acetyl-CoA أو نظير m+2 سيترات من إجمالي السيترات في الخلايا التائية من [13C16] بالميتات. ن=4 عينات مستقلة. f ، GSEA مع التحليل الإحصائي لمجموعة الجينات المرتبطة بإشارات mTORC1 المتحكمة مقابل الخلايا التائية البشرية المكيفة (يسار) أو الرقم الهيدروجيني 6. 6- مكيفة (يمين). g، h، تحليل قياس التدفق الخلوي والتقدير الكمي لـ S6 المفسفر في Ser235 وSer236 (g) و4EBP1 المفسفر في Thr37 وThr46 (h) في خلايا CD 8+ T البشرية تحت الظروف المشار إليها. ن=3 عينات مستقلة. I، تحليل قياس التدفق الخلوي والتقدير الكمي لتخليق البروتين كثيف الاستهلاك للطاقة في عناصر التحكم أو حمض اللاكتيك أو الرقم الهيدروجيني 6.6- الخلايا التائية البشرية المكيّفة. ن=3 عينات مستقلة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسطات ± sem تم تحديد التحليلات الإحصائية عن طريق اختبار فيشر الدقيق من جانب واحد مع اختبار المقارنات المتعددة Benjamini-Hochberg (a) أو اختبار الطالب غير المقترن ثنائي الذيل (c – e، g – i). تم حساب القيم P الاسمية وFDRs بالطريقة الافتراضية في برنامج GSEA (f).
![Fig. 3 | Increased [H+ ] alters T cell methionine metabolism to preserve epigenetic stemness. a GSEA plot of the gene set associated with one-carbon metabolism and cysteine and methionine metabolism in control versus lactic acid-conditioned human T cells. b, Schematic of [13C5]methionine labeling patterns. c, Percentage of intracellular SAM (m+5), SAH (m+4), and MTA (m+1) derived from [13C5]methionine, out of their respective total pools, in T cells cultured in control conditions or with 10 mM lactic acid or 10 mM lactic acid supplemented with methionine (10 mM + Met). n = 3 independent samples. d, Relative abundance of [12C5]methionine and [13C5]methionine in T cells. e, Representative histogram and quantification of TCF1 in human CD8+ T cells cultured in various conditions. n = 3 independent samples. f, Effects of methionine supplementation on histone methylation in human T cells. H3K4me3, histone H3 trimethylated at K4; H3K79me2, H3 dimethylated at K79; H3K27me3, H3 trimethylated at K27; H3K9me2, H3 dimethylated at K9. n = 3 independent samples. g, Genome track view of representative gene loci showing H3K27me3 (red, above the line) or H3K4me3 (blue, below the line) peaks. CUT&Tag-seq data are from two independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Nominal P values and FDRs were calculated with the default method of the GSEA software (a). Statistical analyses were done using two-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's multiple-comparisons test (c–f).](/Content/uploads/2023842169/20231219104503793116dde85a413baf8c838599f2d1aa.png "Fig. 3 | Increased [H+ ] alters T cell methionine metabolism to preserve epigenetic stemness. a GSEA plot of the gene set associated with one-carbon metabolism and cysteine and methionine metabolism in control versus lactic acid-conditioned human T cells. b, Schematic of [13C5]methionine labeling patterns. c, Percentage of intracellular SAM (m+5), SAH (m+4), and MTA (m+1) derived from [13C5]methionine, out of their respective total pools, in T cells cultured in control conditions or with 10 mM lactic acid or 10 mM lactic acid supplemented with methionine (10 mM + Met). n = 3 independent samples. d, Relative abundance of [12C5]methionine and [13C5]methionine in T cells. e, Representative histogram and quantification of TCF1 in human CD8+ T cells cultured in various conditions. n = 3 independent samples. f, Effects of methionine supplementation on histone methylation in human T cells. H3K4me3, histone H3 trimethylated at K4; H3K79me2, H3 dimethylated at K79; H3K27me3, H3 trimethylated at K27; H3K9me2, H3 dimethylated at K9. n = 3 independent samples. g, Genome track view of representative gene loci showing H3K27me3 (red, above the line) or H3K4me3 (blue, below the line) peaks. CUT&Tag-seq data are from two independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Nominal P values and FDRs were calculated with the default method of the GSEA software (a). Statistical analyses were done using two-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's multiple-comparisons test (c–f).")
شكل 3|تؤدي زيادة [H+] إلى تغيير استقلاب الميثيونين في الخلايا التائية للحفاظ على الجاذبية اللاجينية. مؤامرة GSEA لمجموعة الجينات المرتبطة باستقلاب الكربون الواحد واستقلاب السيستين والميثيونين في السيطرة مقابل الخلايا التائية البشرية المكيفة بحمض اللاكتيك. ب، رسم تخطيطي لأنماط وضع العلامات على الميثيونين [13C5]. ج، النسبة المئوية لـ SAM (m +5) داخل الخلايا، وSAH (m +4)، وMTA (m +1) المشتقة من [13C5] ميثيونين، من إجمالي مجموعاتها، في الخلايا التائية المستزرعة في ظروف التحكم أو مع 10 ملي مولار من حمض اللاكتيك أو 10 ملي مولار من حمض اللاكتيك المضاف إلى الميثيونين (10 ملم + ميت). ن=3 عينات مستقلة. د ، الوفرة النسبية للميثيونين [12C5] والميثيونين [13C5] في الخلايا التائية. e ، الرسم البياني التمثيلي والتقدير الكمي لـ TCF1 في الخلايا التائية CD 8+ البشرية المستزرعة في ظروف مختلفة. ن=3 عينات مستقلة. و، آثار مكملات الميثيونين على مثيلة هيستون في الخلايا التائية البشرية. H3K4me3، هيستون H3 ثلاثي الميثيل عند K4؛ H3K79me2، H3 ثنائي الميثيل عند K79؛ H3K27me3، H3 ثلاثي الميثيل عند K27؛ H3K9me2، H3 ثنائي الميثيل عند K9. ن=3 عينات مستقلة. g ، عرض مسار الجينوم لمواقع الجينات التمثيلية التي تظهر الذروة H3K27me3 (الأحمر، فوق الخط) أو H3K4me3 (الأزرق، أسفل الخط). بيانات CUT&Tag-seq مأخوذة من عينتين مستقلتين. يتم تقديم البيانات كقيم P الاسمية المتوسطة ± sem وتم حساب FDRs بالطريقة الافتراضية لبرنامج GSEA (أ). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار توكي للمقارنات المتعددة (c – f).
التعرض لـ ↑[H+ ] يحافظ على لياقة الميتوكوندريا
نظرًا لانخفاض تخليق البروتين كثيف الاستهلاك للطاقة في الخلايا التائية المكيفة ↑[H+]، افترضنا أن التعرض طويل المدى لـ ↑[H+] قد يؤدي إلى تغييرات كبيرة في التمثيل الغذائي النشط الخلوي. تم تحليل كل من الخلايا التائية المتحكمة و↑[H+] باستخدام SCENITH42 من أجل حساب الاعتماد على الجلوكوز، والاعتماد على الميتوكوندريا، وقدرة تحلل السكر، وقدرة أكسدة الأحماض الأمينية ومنظمة الأغذية والزراعة (الشكل 4 أ والبيانات الموسعة الشكل 8 أ). وفقًا لنتائج التمثيل الغذائي ونتائج تتبع النظائر لدينا، لاحظنا زيادة استقلاب الميتوكوندريا في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+]، في حين انخفضت معدلات تحلل السكر (الشكل 4 ب، ج والبيانات الموسعة الشكل 8 ب)، مما يشير إلى إعادة برمجة الخلايا التائية داخل الخلايا. التمثيل الغذائي النشط في الخلايا التائية ↑[H+] المكيفة. كشف تحليل فرس البحر كذلك أن الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] أظهرت معدل استهلاك أكسجين أعلى (OCR) بالإضافة إلى SRC، وهي سمة أساسية للخلايا التائية ذات الذاكرة طويلة العمر CD8+ ومعدل تحمض أقل خارج الخلية ( ECAR) (الشكل 4d – h والبيانات الموسعة الشكل 8c – f). نظرًا لأن زيادة كتلة / اندماج الميتوكوندريا وانخفاض إمكانات غشاء الميتوكوندريا (Δψm) مهمان للحفاظ على جذعية الخلايا التائية 48-50، فقد قمنا بفحص كمية ونوعية الميتوكوندريا في الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] ووجدنا أن ↑[H+ ] عزز العلاج كتلة الميتوكوندريا في كل من الخلايا التائية البشرية والماوس (الشكل 4i، j والبيانات الموسعة الشكل 8g، h)، والتي تحافظ أيضًا على انخفاض Δψm (الشكل 4k والبيانات الموسعة الشكل 8i). كشف تحليل البنية التحتية بواسطة المجهر الإلكتروني (EM) أن الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+] تحتوي على ميتوكوندريا كبيرة ومعبأة بكثافة منتشرة في السيتوبلازم ولديها العديد من الأعراف الضيقة والضيقة مقارنة بالخلايا التائية الضابطة، وهو ما يتماشى مع النتائج المنشورة ذات الصلة. إلى مورفولوجيا الميتوكوندريا في خلايا الذاكرة التائية (الشكل 4ل، م). تمشيا مع هذه النتيجة ، لاحظنا أيضًا زيادة التعبير الجيني للعديد من المنظمات الحاسمة لاندماج الميتوكوندريا في الخلايا التائية المكيفة ↑ [H + ] (البيانات الموسعة الشكل 8 ي) ، والتي تم اقتراحها لتلعب دورًا ضروريًا لتوليد خلايا الذاكرة التائية . بشكل عام، تشير هذه النتائج إلى أن التعرض لـ ↑[H+] يعزز كتلة/اندماج الميتوكوندريا وملاءمتها لتعزيز تكوين الخلايا التائية الشبيهة بالجذع.
نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة
↑[H+] التعرض يعزز نشاط الخلايا التائية CD8+ المضادة للورم
تفضل الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية التطعيم والتوسع والفعالية المضادة للورم في العلاج المناعي بالتبني . للتحقق مما إذا كانت الخلايا التائية طويلة المدى ↑[H+ ] -CD8+ تظهر توسعًا معززًا أو ثباتًا عند النقل، CD45.1+ خلايا OT-I T التي تم توسيعها في التحكم أو ↑[ تم نقل الوسيط المكيف H + ] بالتبني إلى CD45. 2+ الفئران C57BL / 6N بدون ورم مزروع (الشكل 5 أ). على الرغم من اكتشاف أعداد متزايدة قليلاً من الخلايا المبرمج عند تكييف ↑[H+] (البيانات الموسعة الشكل 9 أ)، كانت هناك نسبة أعلى بكثير من الخلايا التائية في الدم المحيطي للفئران المنقولة مع توسيع الخلايا التائية في حالة ↑[H+] بالمقارنة مع تلك الموسعة في وسط التحكم (الخلايا التائية الضابطة) (الشكل 5 ب). وبالمثل، تم الكشف عن ترددات أعلى بكثير من الخلايا التائية في الطحال والغدد الليمفاوية (LNs) (البيانات الموسعة الشكل 9 ب، ج). بالإضافة إلى ذلك، وجدنا زيادة ملحوظة في تراكم الخلايا التائية في الأورام والطحال والغدد الليمفاوية المستنزفة في الفئران الحاملة للورم B16- OVA والتي تم فيها نقل الخلايا الموسعة ↑[H+ ] بالتبني مقارنةً بتلك الموجودة في الفئران التي خلايا التحكم المستلمة ، مما يشير إلى أن خلايا CD 8+ T المحفوظة في ↑ [H + ] قد حسنت الثبات (الشكل 5 ج – هـ والبيانات الموسعة الشكل 9 د). تمشيا مع هذه النتائج، زادت بشكل ملحوظ النسبة المئوية لخلايا الذاكرة التائية في الطحال وLNs لدى الفئران التي تلقت خلايا T مكيفة ↑[H+] (الشكل 5f والبيانات الموسعة الشكل 9e). والجدير بالذكر أن خلايا OT-I T الموسعة ↑[H+] أظهرت تأخرًا كبيرًا في نمو الورم مقارنةً بالخلايا التائية الضابطة (الشكل 5 ز). قمنا بعد ذلك بدراسة الفعالية العلاجية للخلايا التائية ↑[H+] -الموسعة CD19 المعدلة بمستقبلات المستضد الخيميري (CAR) مع نموذج ورم في الجسم الحي حيث تم حقن الخلايا السرطانية CD19-K562 تحت الجلد في جوانب الورم. الفئران NCG (الشكل 5 ح). لقد وجدنا أن التعرض لـ ↑[H+] عزز أيضًا نشأة خلايا CAR-T ولكن لم يكن له أي تأثير على موت الخلايا المبرمج (البيانات الموسعة الشكل 9f)، كما يتضح من النسب المئوية المتزايدة بشكل ملحوظ لـ CCR7+ CD62L+ الشبيهة بالجذع CAR-T الخلايا وكذلك التعبير المنتظم لـ TCF1 (شكل البيانات الموسعة 9g، h). بالإضافة إلى ذلك، كان هناك معدل أعلى لتراكم خلايا CAR-T في مواقع الورم والطحال لدى الفئران NCG بعد التسريب بخلايا T المكيفة ↑[H+] (الشكل 5i). كما هو متوقع، أظهرت فئران NCG التي تم نقلها بالتبني مع خلايا CAR-T التي تم توسيعها في ↑[H+] إزالة أكبر للورم CD19+ المزروع مقارنة بتلك التي تلقت خلايا CAR-T التي تم توسيعها في وسط التحكم (الشكل 5 ي). أظهرت هذه البيانات مجتمعة أن العلاج ↑[H+] يعزز الثبات في الجسم الحي والنشاط المضاد للورم للخلايا التائية.
التعرض لـ ↑[H+] يقيد استنفاد الخلايا التائية
لمزيد من استكشاف تأثيرات التعرض المستمر لـ ↑[H+] على استنفاد الخلايا التائية في المختبر، قمنا بقياس تعبير LAG-3 وTIM-3 في الخلايا التائية البشرية المجهزة بـ ↑[H+] والتي خضعت لجولات متعددة من مزيد من التحفيز باستخدام الأجسام المضادة لـ CD3 وتم تكييفها في وسط التحكم (الشكل 6 أ). لقد وجدنا أن تعبير LAG-3 وTIM-3 قد انخفض في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+] (الشكل 6 ب والبيانات الموسعة الشكل 10 أ)، مما يشير إلى أن العلاج ↑[H+ ] يؤدي إلى انخفاض استنفاد الخلايا التائية. علاوة على ذلك، وجدنا أن التركيز العالي من الميثيونين يؤدي إلى زيادة في التعبير عن العلامات المثبطة، مثل PD-1، وLAG-3، وTIM-3، في حين أن العلاج بتركيز منخفض انخفض تركيز الميثيونين بشكل طفيف في التعبير عن هذه العلامات (الشكل التكميلي 6 أ-ج). على وجه الخصوص، عند التعرض طويل الأمد في المختبر ↑[H+]، كان تردد TIM-3+ LAG-3+ المتسلل إلى خلايا OT-I T وخلايا CD19-CAR T داخل الأورام إلى حد كبير تم تقليله بعد النقل بالتبني (الشكل 6 ج – هـ والبيانات الموسعة الشكل 10 ب) ، وهو ما يتوافق مع انخفاض استنفادهم في المختبر وتحسين قدرة التحكم في الورم في الجسم الحي . علاوة على ذلك، أثبتنا أن الخلايا التائية المكيفة ↑[H+] طويلة المدى أظهرت انخفاضًا ملحوظًا في تعبير TOX سواء في المختبر أو في الجسم الحي (الشكل 6f،g والبيانات الموسعة الشكل 10c،d). كما هو موضح سابقًا، يمكن تقسيم الخلايا التائية المنهكة عمومًا إلى مجموعة فرعية منهكة سلفًا أو منهكة نهائيًا، على النحو الذي يحدده تعبير TCF1 وTIM-3 . على هذا النحو، قمنا بقياس نمط التعبير عن TCF1 وTIM-3 في CD45.1+ TILs ولاحظنا أن تردد الخلايا التائية TCF1− TIM-3+ المنهكة بشكل نهائي انخفض إلى حد كبير، مع زيادة كبيرة في النسبة المئوية لـ TCF 1+ TIM -3 - الخلايا التائية السلفية تحت تكييف ↑ [H + ] (الشكل 6 ح). علاوة على ذلك، أظهرنا زيادة في عدد الخلايا التائية LY108+ TIM-3- (البيانات الموسعة الشكل 10e) بالإضافة إلى زيادة تكرار IFN- + TNF- + T الخلايا (البيانات الموسعة الشكل 10f)، مما يدعم أيضًا حقيقة أن الخلايا التائية المنقولة بالتبني طويلة المدى ↑[H+] الموسعة في المختبر تحد من الإرهاق وتحافظ على الجذع.
مناقشة
يعد ACT الخاص بالورم طريقة واعدة لعلاج الأفراد المصابين بأورام حرارية، ولكن التأثيرات العلاجية مقيدة إلى حد كبير بسبب خلل الخلايا التائية في TME. في الآونة الأخيرة، تم إيلاء اهتمام كبير للتكييف المسبق للخلايا التائية مع تجويع الجلوكوز العابر، أو تقييد الجلوتامين، أو ارتفاع البوتاسيوم خارج الخلية (↑[K+]) أثناء الاستنبات في المختبر للحفاظ على جذعية الخلايا التائية وتحسين النتائج العلاجية. في هذه الدراسة، أثبتنا أن زراعة الخلايا التائية CD8+ تحت مستويات عالية من [H+] أثناء التحضير عززت بشكل مدهش اكتساب الخلايا التائية الجذعية وزيادة المقاومة لاستنفاد الخلايا التائية، مما أدى إلى تحسين كبير في التأثيرات المضادة للورم الخلايا التائية المنقولة بالتبني.
لطالما اعتبر التراكم المفرط لحمض اللاكتيك داخل TME عاملاً رئيسياً في الهروب المناعي للورم. على سبيل المثال، ثبت أن حمض اللاكتيك وTME الحمضي يقمعان نشاط التحلل الخلوي للخلايا التائية CD{{0}} وإنتاج السيتوكينات 31–33,57. تماشيًا مع هذه النتائج، وجدنا أيضًا أن التعرض قصير المدى لـ ↑[H+] في المختبر كان كافيًا لمنع إنتاج السيتوكينات المستجيبة بشكل عميق ولكن لم يكن له أي تأثير على تعبير TCF1 أو السمات الأيضية المرتبطة بالجذع. ومع ذلك، فإن العلاج طويل الأمد ↑[H+] عزز بشكل غير متوقع تعبير TCF1 وحافظ على النمط الظاهري للخلايا التائية الشبيهة بالجذعية من خلال إعادة البرمجة الأيضية وإعادة التشكيل اللاجيني. إن تعرض الخلايا التائية لـ ↑[H+] بعد تنشيطها الكامل يمكن أن يؤدي أيضًا إلى تحفيز النمط الظاهري الشبيه بالجذع، وبالتالي يستبعد احتمال أن الخلايا التائية المعرضة لدرجة الحموضة المنخفضة أصبحت ببساطة مقاومة للتحفيز، بدلاً من اعتماد حالة تشبه الجذع. يبلغ تركيز حمض اللاكتيك الفسيولوجي في دم الأفراد الأصحاء حوالي 1.5-3.0 ملم، لكنه يمكن أن يرتفع إلى 10 ملم إلى 40 ملم في TME35،58. باستخدام نموذج التحفيز المستمر المضاد لـ CD3/CD28، فنغ وآخرون. أبلغت مؤخرًا أن التركيز العالي من لاكتات الصوديوم يزيد من مستويات H3K27ac في موضع المحسن الفائق TCF7 من خلال تثبيط نشاط هيستون دياسيتيلاز، مما يؤدي إلى زيادة تعبير TCF1 وتعزيز الخلايا التائية CD8+ الجذعية. في المقابل، وجدنا أن التعرض طويل الأمد لتركيز منخفض نسبيًا من حمض اللاكتيك (10 ملم)، ولكن ليس لاكتات الصوديوم، يمكن أن يؤدي بسهولة إلى ظهور توقيع جذعي للخلايا التائية من خلال تقييد استقلاب الميثيونين وتنظيم H3K27me3. الترسب في مواضع الجينات المرتبطة بالجذع، والذي يدعم بوضوح التنظيم اللاجيني المتميز بواسطة لاكتات الصوديوم وحمض اللاكتيك. ومع ذلك، فإن العلاج منخفض الحموضة (الرقم الهيدروجيني 6.9) ليس له تأثير كبير على تعبير TCF1 في ظل التحفيز المستمر المضاد لـ CD3/CD28، مما يشير إلى أن التوقيعات الشبيهة بالجذع لخلايا CD8+ T المستحثة بواسطة ↑[H+] قد يتم تجاوز التعرض عن طريق تحفيز TCR. يمكن أن يؤدي تنشيط TCR إلى تعزيز امتصاص الميثيونين وإعادة برمجة استقلاب الميثيونين للمساعدة في تنشيط الخلايا التائية . لقد توقعنا أن تحفيز TCR قد يعزز امتصاص الميثيونين في الخلايا التائية المعالجة بـ ↑[H+]، والتي قيدت استقلاب الميثيونين، وبالتالي إزعاج الجذع اللاجيني الناجم عن ↑[H+]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للخلايا التائية استخدام أيونات اللاكتات كمصدر للكربون خارج الخلية لتسهيل اكتساب الجاذبية في وجود أو عدم وجود تحفيز TCR المستمر. يرتبط النشاط الأيضي ارتباطًا وثيقًا بتمايز الخلايا التائية، وقد تؤدي بعض التدخلات الأيضية إلى تعزيز تكوين خلايا الذاكرة التائية طويلة الأمد بشكل كبير. وفقًا لذلك، تدعم تحليلاتنا الأيضية وتتبع النظائر فكرة أن التعرض طويل المدى لـ ↑[H+] يؤدي إلى إعادة برمجة أيضية مذهلة، مثل انخفاض امتصاص الجلوكوز وانخفاض تحلل السكر واستقلاب دورة TCA. أظهرت العديد من الدراسات أن خلايا الذاكرة CD8+ T تستخدم منظمة الأغذية والزراعة لتلبية احتياجاتها من الطاقة، على الرغم من أن هذا من المحتمل أن يكون تكيفًا لتمايز سلالات الذاكرة، كما أن الإفراط في التعبير عن Cpt1 يعزز طول عمر الخلايا التائية 21,22,63,64. ومع ذلك، في نموذجهم للحذف الجيني الخاص بالخلايا التائية لـ Cpt1a، Raud et al. أثبت مؤخرًا أن LC-FAO يمكن الاستغناء عنه إلى حد كبير لتنشيط الخلايا التائية وتكوين خلايا الذاكرة CD 8+ T65. ويظل تفسير هذا التناقض تحديًا. في سياق دراستنا، نتوقع أن إعادة برمجة استقلاب الأحماض الدهنية المدفوعة بالحماض خارج الخلية من المحتمل أن ترتبط بتوليد خلايا الذاكرة التائية، على الرغم من أن الآلية الدقيقة الكامنة وراء هذه الفرضية تتطلب مزيدًا من البحث. علاوة على ذلك، وجدنا أن التعرض لـ ↑[H+] يثبط نشاط mTOR، والذي قد يكون ناجمًا عن تثبيط تحلل السكر. والجدير بالذكر أن قمع إشارات mTOR قد يساهم أيضًا في التحول الأيضي من تحلل السكر إلى التنفس الميتوكوندريا. في الواقع، أظهرت هذه الخلايا التائية الموسعة ↑[H+] لياقة الميتوكوندريا محسنة، كما يتضح من زيادة ملحوظة في SRC وكتلة الميتوكوندريا وانخفاض ميكرومتر. يتم تعديل توقيعات الميتوكوندريا هذه، والتي يتم إثراؤها في الخلايا التائية الشبيهة بالجذعية والمرتبطة بطول العمر والنشاط الفائق المضاد للورم في الجسم الحي، عن كثب عن طريق اندماج الميتوكوندريا وديناميكيات الانشطار . يلعب بروتين دمج الغشاء الداخلي للميتوكوندريا OPA1 دورًا لا غنى عنه في توليد خلايا الذاكرة التائية . وفقًا لذلك، وجدنا أن الحماض خارج الخلية عزز أيضًا تعبير OPA1 في الخلايا التائية، مما أدى في النهاية إلى التوازن المورفولوجي نحو الاندماج في الخلايا التائية. لقد ثبت أن العديد من المستقلبات الخلوية تساهم بشكل مباشر في التعديلات اللاجينية. على سبيل المثال، يمكن لعملية التمثيل الغذائي للكربون الواحد أن تولد SAM المتبرع بالميثيل العالمي لميثيل هيستون.
![Fig. 4 | Mitochondrial fitness is sustained in T cells exposed to ↑[H+ ]. a SCENITH analysis of the human T cells in control or lactic-acid-conditioned T cells. A representative translation level (anti-Puro) is shown (n = 3 independent samples). The dashed line represents the background level obtained after 2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O) treatment. b,c, Quantitative analysis of glycolytic capacity (b) and mitochondrial dependence (c) within a. n = 3 independent samples. d–f, OCR (d) of control and lactic-acid-conditioned T cells was measured in real-time under basal conditions in response to the indicated inhibitors. FCCP, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT/ AA, rotenone and antimycin A. Representative statistical analysis of basal OCR (e), maximal respiration (e) and SRC (f). n = 9 tests; 3 independent samples were analyzed and each sample was measured 3 times. g,h, ECAR (g) of control or lactic-acid-conditioned T cells measured in response to the indicated inhibitors. Representative statistical analysis of basal ECAR and stressed ECAR (h). n = 9 tests; 3 independent samples were detected and each sample was measured 3 times. i, Immunoblot analysis of COXIV and TIM23 in human T cells under the indicated conditions. Actin was used as a loading control. j,k, Representative histograms or contour plots and statistical analysis of mitochondrial mass (MTG) (j) and mitochondrial membrane potential (TMRM) (k), respectively, in the control or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. l,m, Representative mitochondrial morphology of T cells cultured in the control condition, lactic acid or the pH 6.6 condition for 12 days, analyzed by EM (scale bar, 1 μM) (l). The area of individual mitochondria in T cells (m), n = 45 cells. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/2023121910470232da8d22ab0a4279b68730f453fa0325.png "Fig. 4 | Mitochondrial fitness is sustained in T cells exposed to ↑[H+ ]. a SCENITH analysis of the human T cells in control or lactic-acid-conditioned T cells. A representative translation level (anti-Puro) is shown (n = 3 independent samples). The dashed line represents the background level obtained after 2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O) treatment. b,c, Quantitative analysis of glycolytic capacity (b) and mitochondrial dependence (c) within a. n = 3 independent samples. d–f, OCR (d) of control and lactic-acid-conditioned T cells was measured in real-time under basal conditions in response to the indicated inhibitors. FCCP, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT/ AA, rotenone and antimycin A. Representative statistical analysis of basal OCR (e), maximal respiration (e) and SRC (f). n = 9 tests; 3 independent samples were analyzed and each sample was measured 3 times. g,h, ECAR (g) of control or lactic-acid-conditioned T cells measured in response to the indicated inhibitors. Representative statistical analysis of basal ECAR and stressed ECAR (h). n = 9 tests; 3 independent samples were detected and each sample was measured 3 times. i, Immunoblot analysis of COXIV and TIM23 in human T cells under the indicated conditions. Actin was used as a loading control. j,k, Representative histograms or contour plots and statistical analysis of mitochondrial mass (MTG) (j) and mitochondrial membrane potential (TMRM) (k), respectively, in the control or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. l,m, Representative mitochondrial morphology of T cells cultured in the control condition, lactic acid or the pH 6.6 condition for 12 days, analyzed by EM (scale bar, 1 μM) (l). The area of individual mitochondria in T cells (m), n = 45 cells. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
الشكل 4|يتم الحفاظ على لياقة الميتوكوندريا في الخلايا التائية المعرضة لـ ↑[H+ ]. تحليل SCENITH للخلايا التائية البشرية المسيطرة أو الخلايا التائية المكيفة بحمض اللاكتيك. يتم عرض مستوى ترجمة تمثيلي (مضاد لـ Puro) (عدد=3 عينات مستقلة). يمثل الخط المتقطع مستوى الخلفية الذي تم الحصول عليه بعد علاج 2- deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O). ب ، ج ، التحليل الكمي لقدرة تحلل السكر ( ب ) والاعتماد على الميتوكوندريا ( ج ) داخل أ . ن=3 عينات مستقلة. تم قياس d - f و OCR ( d ) للخلايا التائية المتحكمة وحمض اللاكتيك في الوقت الفعلي في ظل الظروف القاعدية استجابةً للمثبطات المشار إليها. فككب، كربونيل سيانيد- ف- ثلاثي فلورو ميثوكسي فينيل هيدرازون؛ ROT / AA، روتينون وأنتيميسين A. التحليل الإحصائي التمثيلي للتعرف الضوئي على الحروف الأساسي (e)، والتنفس الأقصى (e) وSRC (f). ن=9 الاختبارات؛ تم تحليل 3 عينات مستقلة وتم قياس كل عينة 3 مرات. g، h، ECAR (g) من الخلايا التائية المتحكمة أو المكيفة بحمض اللاكتيك والتي يتم قياسها استجابةً للمثبطات المشار إليها. التحليل الإحصائي التمثيلي لـ ECAR الأساسي وشدد على ECAR (ح). ن=9 اختبارات؛ تم الكشف عن 3 عينات مستقلة وتم قياس كل عينة 3 مرات. ط، تحليل Immunoblot لـ COXIV وTIM23 في الخلايا التائية البشرية في ظل الظروف المشار إليها. وقد استخدم الأكتين كعنصر تحكم التحميل. j، k، الرسوم البيانية التمثيلية أو المخططات الكنتورية والتحليل الإحصائي لكتلة الميتوكوندريا (MTG) (j) وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (TMRM) (k)، على التوالي، في التحكم أو حمض اللاكتيك أو الرقم الهيدروجيني 6. {{30} } الخلايا التائية البشرية المكيفة. ن=3 عينات مستقلة. l، m، مورفولوجيا الميتوكوندريا التمثيلية للخلايا التائية المستزرعة في حالة التحكم، أو حمض اللاكتيك أو حالة الرقم الهيدروجيني 6.6 لمدة 12 يومًا، ويتم تحليلها بواسطة EM (شريط المقياس، 1 ميكرومتر) (ل). مساحة الميتوكوندريا الفردية في الخلايا التائية (م)، ن=45 من الخلايا. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± sem. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الذيل.
![Fig. 5 | ↑[H+ ]-expanded T cells display enhanced anti-tumor activity. a,b, Control or lactic-acid-expanded CD8+ T cells were analyzed for persistence after adoptive transfer (n = 6 mice). Freshly isolated mouse CD45.1+ OT-I T cells were activated with mouse IL-2 and plate-bound anti-mouse CD3 and anti-mouse CD28 antibodies for 2 days and then maintained in a culture medium with mouse IL-2 until adoptive transfer (CD3&CD28+IL-2). A schematic of the animal experiment (a) as well as representative FACS plots and statistical analysis of CD45.1+ and CD45.2+ T cells in the blood are shown in (b). c–g, CD45.1+ OT-I T cells were expanded in control or lactic acid medium for 7 days and transferred into B16-OVA-tumor-bearing mice, and the infiltration of ratio was evaluated (n = 5 mice). A schematic of the animal experiment using B16-OVA tumor-bearing mice (c), as well as representative FACS plots (left) and statistics for the number (right) of transferred CD45.1+ OT-I T cells in the tumor (d). s.c., subcutaneous injection. Statistics for the percentage of CD45.1+ T cells (e) and representative data (left) and statistics for the percentage (right) of CD62L+ CD44+ CD45.1+ T cells (f) in the spleen are shown. Tumor growth curve (g) (n = 5 mice, day 14). h–j, CD19-CAR T cells were expanded in control or lactic acid medium for 12 days and transferred into CD19-overexpressing K562 tumor-bearing NCG mice, and the infiltration ratio in tumor and spleen was evaluated (n = 6 mice). A schematic of the animal experiment (h), a representative percentage of transferred T cells in the tumor and spleen (i), and tumor growth curves (j) are shown (n = 6 mice, day 10). Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/20231219104719ae22f2dc6bc348bda4bf8bfe75b347db.png "Fig. 5 | ↑[H+ ]-expanded T cells display enhanced anti-tumor activity. a,b, Control or lactic-acid-expanded CD8+ T cells were analyzed for persistence after adoptive transfer (n = 6 mice). Freshly isolated mouse CD45.1+ OT-I T cells were activated with mouse IL-2 and plate-bound anti-mouse CD3 and anti-mouse CD28 antibodies for 2 days and then maintained in a culture medium with mouse IL-2 until adoptive transfer (CD3&CD28+IL-2). A schematic of the animal experiment (a) as well as representative FACS plots and statistical analysis of CD45.1+ and CD45.2+ T cells in the blood are shown in (b). c–g, CD45.1+ OT-I T cells were expanded in control or lactic acid medium for 7 days and transferred into B16-OVA-tumor-bearing mice, and the infiltration of ratio was evaluated (n = 5 mice). A schematic of the animal experiment using B16-OVA tumor-bearing mice (c), as well as representative FACS plots (left) and statistics for the number (right) of transferred CD45.1+ OT-I T cells in the tumor (d). s.c., subcutaneous injection. Statistics for the percentage of CD45.1+ T cells (e) and representative data (left) and statistics for the percentage (right) of CD62L+ CD44+ CD45.1+ T cells (f) in the spleen are shown. Tumor growth curve (g) (n = 5 mice, day 14). h–j, CD19-CAR T cells were expanded in control or lactic acid medium for 12 days and transferred into CD19-overexpressing K562 tumor-bearing NCG mice, and the infiltration ratio in tumor and spleen was evaluated (n = 6 mice). A schematic of the animal experiment (h), a representative percentage of transferred T cells in the tumor and spleen (i), and tumor growth curves (j) are shown (n = 6 mice, day 10). Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
شكل 5|↑[H+]-تعرض الخلايا التائية الموسعة نشاطًا معززًا مضادًا للورم. تم تحليل الخلايا التائية a، b، أو التحكم أو القرص المضغوط الموسع بحمض اللاكتيك 8+ من أجل الثبات بعد النقل بالتبني (n=6 الفئران). الفأر المعزول حديثًا CD45. 1+ تم تنشيط خلايا OT-I T باستخدام الماوس IL -2 والأجسام المضادة CD3 المضادة للفأر والأجسام المضادة CD28 المضادة للفأر لمدة يومين ثم تم الحفاظ عليها في وسط استزراع مع الماوس IL-2 حتى النقل بالتبني (CD3&CD28+IL-2). رسم تخطيطي للتجربة الحيوانية (أ) بالإضافة إلى مخططات FACS التمثيلية والتحليل الإحصائي لـ CD45. 1+ و CD45. 2+ تظهر الخلايا التائية في الدم في (ب). c – g، CD45.1+ تم توسيع خلايا OT-I T في وسط التحكم أو حمض اللاكتيك لمدة 7 أيام وتم نقلها إلى الفئران الحاملة للورم B16-، وتم تقييم تسلل النسبة (ن=5 الفئران). رسم تخطيطي للتجربة على الحيوانات باستخدام الفئران الحاملة للورم B16- OVA (ج)، بالإضافة إلى مخططات FACS التمثيلية (يسار) وإحصائيات لعدد (يمين) CD45 المنقول.1+ OT- خلايا T في الورم (د). الشوري، الحقن تحت الجلد. إحصائيات النسبة المئوية لـ CD45.1+ الخلايا التائية (هـ) والبيانات التمثيلية (يسار) وإحصائيات النسبة المئوية (يمين) لـ CD62L + CD44+ CD45.1+ الخلايا التائية (و ) في الطحال. منحنى نمو الورم (ز) (ن=5 الفئران، يوم 14). h – j، CD 19- تم توسيع خلايا CAR T في وسط التحكم أو حمض اللاكتيك لمدة 12 يومًا وتم نقلها إلى CD 19- الفئران NCG الحاملة للورم K562 المفرطة التعبير، وكانت نسبة التسلل في الورم والطحال تم تقييمها (ن=6 الفئران). يتم عرض رسم تخطيطي للتجربة الحيوانية (ح)، ونسبة تمثيلية للخلايا التائية المنقولة في الورم والطحال (ط)، ومنحنيات نمو الورم (ي) (ن=6 الفئران، اليوم 10). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± sem. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الذيل.
![imageFig. 6 | ↑[H+ ] exposure restricts T cell exhaustion. a Schematic of chronic stimulation of human T cells in vitro. b, Representative FACS plots for LAG-3 and TIM-3 in chronically stimulated human T cells cultured in control or lactic acid conditions. n = 3 independent samples. c, The expression of LAG-3 and TIM-3 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). d, Quantification of the expression of LAG-3, TIM-3 and PD-1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA-tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). e, The expression of LAG-3 and TIM-3 in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice, as determined by flow cytometry (n = 6 mice). f, The expression of TOX in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). g, The histograms and statistical analysis of TOX in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice (n = 6 mice). h, Left, representative flow cytometry plots for TIM-3 and TCF1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). Right, the percentage of TCF1+ TIM-3– or TCF1– TIM-3+ populations. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/20231219104739789f56482ec84fdf8c79bfbf223df3ca.png "imageFig. 6 | ↑[H+ ] exposure restricts T cell exhaustion. a Schematic of chronic stimulation of human T cells in vitro. b, Representative FACS plots for LAG-3 and TIM-3 in chronically stimulated human T cells cultured in control or lactic acid conditions. n = 3 independent samples. c, The expression of LAG-3 and TIM-3 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). d, Quantification of the expression of LAG-3, TIM-3 and PD-1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA-tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). e, The expression of LAG-3 and TIM-3 in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice, as determined by flow cytometry (n = 6 mice). f, The expression of TOX in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). g, The histograms and statistical analysis of TOX in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice (n = 6 mice). h, Left, representative flow cytometry plots for TIM-3 and TCF1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). Right, the percentage of TCF1+ TIM-3– or TCF1– TIM-3+ populations. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
شكل 6|↑[H+] التعرض يقيد استنفاد الخلايا التائية. رسم تخطيطي للتحفيز المزمن للخلايا التائية البشرية في المختبر . ب ، مؤامرات تمثيلية FACS لـ LAG -3 و TIM -3 في الخلايا التائية البشرية المحفزة بشكل مزمن والمزروعة في ظروف التحكم أو حمض اللاكتيك. ن=3 عينات مستقلة. ج، تعبير LAG -3 وTIM -3 في CD45. 1+ TILs من فئران B16- OVA الحاملة للورم C57BL/6N (ن=5 فئران ). د، القياس الكمي للتعبير عن LAG-3 وTIM-3 وPD-1 في CD45.1+ TILs من B16-OVA-tumor-bearing C57BL/ 6N الفئران (ن=5 الفئران). e، التعبير عن LAG-3 وTIM-3 في خلايا CD19- CAR T المتسللة للورم من فئران NCG الحاملة للورم CD19-K562، كما هو محدد بواسطة قياس التدفق الخلوي (ن=6 الفئران). f ، تعبير TOX في CD45. 1+ TILs من الفئران B 16- OVA الحاملة للورم C57BL / 6N (ن=5 الفئران). g ، الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي لـ TOX في خلايا CD 19- CAR T المتسللة للورم من فئران NCG الحاملة للورم CD 19- K562 (n=6 الفئران). h، يسار، مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لـ TIM -3 وTCF1 في CD45. 1+ TILs من B 16- فئران C57BL/6N الحاملة للورم OVA (ن=5 فئران) . حسنًا، النسبة المئوية لمجموعات TCF1+ TIM-3– أو TCF1– TIM-3+. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± sem. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الذيل.
تم الإبلاغ عن أن المستقلبات، مثل S-2-hydroxyglutarate و-hydroxybutyrate، تعمل كمنظمين جينيين لتمايز خلايا الذاكرة-T67،68. أظهرت نتائجنا أن العلاج المستمر ↑[H+] يحد من امتصاص الميثيونين واستقلاب الميثيونين مع انخفاض الميثيونين داخل الخلايا وSAM وSAH من خلال تثبيط التعبير عن ناقلات الميثيونين. قد تفسر هذه النتائج جزئيًا سبب عدم قدرة الخلايا التائية على التغلب على الخلايا السرطانية في امتصاص الميثيونين في TME69. ميكانيكيًا، أثبتنا أن التعرض لـ ↑[H+] قلل بشكل كبير من تعبير MYC وارتباطه بمروج SLC7A5، مما أدى بالتالي إلى انخفاض تعبير SLC7A5 وضعف استقلاب الميثيونين في الخلايا التائية. ومن المثير للاهتمام أن مكملات الميثيونين يمكن أن تستعيد التعبير عن MYC وSLC7A5، بالإضافة إلى تدفق دورة الميثيونين في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+]، مما يشير إلى أن استعادة القدرة على امتصاص الميثيونين كانت على الأرجح بسبب تنظيم ناقل الميثيونين. SLC7A5 بطريقة تعتمد على MYC. تم الإبلاغ عن نشاط mTOR لتنظيم ترجمة MYC . وفقًا لذلك، توقعنا أن التنظيم الناجم عن ↑[H+] لـ MYC من المحتمل أن يكون بسبب القمع الترجمي من خلال التثبيط التدريجي لـ mTOR وضعف امتصاص الميثيونين. قد يتم عكس هذا القمع عن طريق مكملات الميثيونين الخارجية، على الرغم من أن الآلية الدقيقة تحتاج إلى مزيد من الدراسة. تم اعتبار SAM المشتق من دورة الميثيونين للتوسط في مثيلة هيستون وإعادة التشكيل اللاجيني أثناء تمايز خلايا المستجيب-T 8،71. تمشيا مع انخفاض SAM داخل الخلايا في الخلايا التائية الموسعة ↑[H+]، وجدنا أن الوفرة الإجمالية لـ H3K27me3 وشغلها في مروج مواضع جذع الخلايا التائية قد انخفضا بشكل كبير. يتم تعديل H3K27me3 وH3K4me3 بشكل انتقائي بطريقة ترتبط بالتعبير عن الجينات المركزية لبرنامج المستجيب أو الجذعي للخلايا التائية. في الواقع، كان هناك إثراء أقل لـ H3K4me3 داخل محفزات الجينات المستجيبة في الخلايا التائية ↑[H+] الموسعة. وبالتالي، فإن المستويات المنخفضة من SAM المانحة للميثيل الناتجة عن ضعف امتصاص الميثيونين والتمثيل الغذائي تحت حالة ↑[H+] تؤدي إلى تغييرات جينية تفضل في النهاية تمايز الخلايا التائية في حالة الذاكرة. ومن المثير للاهتمام، أن إضافة الميثيونين تحت التعرض ↑[H+] لا ينقذ فقط تعبير MYC وSLC7A5 في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+]، ولكنه يستعيد أيضًا المستوى الإجمالي للتعبير H3K27me3، مما يدعم دورًا مهمًا لـ MYC – SLC7A5 -محور استقلاب الميثيونين في تنظيم ↑[H+] الجذوع اللاجيني الناجم. في الواقع، وجدنا أن الإفراط في التعبير عن SLC7A5 يضعف جزئيًا النمط الظاهري الشبيه بالجذع الناجم عن ↑[H+]، مما يدعم بشكل أكبر الدور الحاسم لناقل الميثيونين SLC7A5 في اكتساب النمط الظاهري الذي يشبه ذاكرة الخلية التائية تحت التعرض ↑[H+].
تاريخيًا، كان يُعتقد أن معظم TILs قد استنفدت بسبب التعرض المستمر لـ TCR داخل الأورام، ولكن من المفارقة أن مجموعة فرعية صغيرة من الأنماط المستنسخة للخلايا التائية في TILs التي تعبر عن عامل النسخ TCF1 تحتفظ بخصائص تشبه الخلايا الجذعية. كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن التعرض ↑[H+] يعوض وظيفة المستجيب للخلايا التائية ويحافظ على جذعية الخلايا التائية عبر محور استقلاب الميثيونين MYC-SLC7A5، والذي يوفر تفسيرًا محتملاً للمفارقة الحالية حول سبب استمرار جزء صغير من TILs في إيواء الخلايا الجذعية. مثل الذاكرة أو خصائص السلائف. في الواقع، تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة حيث تخدم أيونات البوتاسيوم في TME دورًا مزدوجًا يؤثر على كل من وظيفة مستجيب الخلايا التائية والجذعية 56،72، مما يدعم بشكل أكبر التأثيرات المعقدة للعوامل المثبطة للمناعة TME (على سبيل المثال، تحفيز TCR المزمن، ونقص الأكسجة، وانخفاض الجلوكوز) على وظيفة الخلايا التائية وتمايزها. بالإضافة إلى ذلك، فإن المناطق الحمضية داخل الأورام تكون ديناميكية للغاية ويتم تنظيمها مكانيًا وزمانيًا، ومن المحتمل أن تطغى على لياقة الخلايا التائية المتكيفة مع الحماض خارج الخلية عندما تواجه عوامل TME قاسية أخرى يمكن أن تؤثر على وظيفة المستجيب للخلايا التائية والتمايز. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا تعبيرًا أعلى عن MYC في الخلايا التائية المنهكة نهائيًا (LY108− TIM-3+ ) مقارنة بالخلايا التائية المنهكة السلف (LY108+ TIM-3–)، وهي تمشيا مع التقارير السابقة التي تفيد بأن خلايا MYClo T تكتسب بشكل تفضيلي مصير الذاكرة . تمشيا مع انخفاض تعبير SLC7A5 وامتصاص الميثيونين في الخلايا التائية المكشوفة ↑[H+]، تم أيضًا تقليل التعبير عن SLC7A5 بشكل ملحوظ في LY108+ TIM-3 - عدد الخلايا التائية المنهكة السلف داخل الأورام، مما يشير إلى أن المحور التنظيمي MYC – SLC7A5 – الميثيونين قد يعمل أيضًا في الجسم الحي . أصبح من الواضح الآن أن خلايا الذاكرة التائية الشبيهة بالجذعية الأقل تمايزًا لها تأثيرات علاجية متفوقة مضادة للورم نظرًا لاستمرارها على المدى الطويل ومقاومتها لتطور الخلل الوظيفي . لقد قدمنا هنا أدلة دامغة على أن الخلايا التائية المكيفة ↑[H+ ] طويلة المدى 8+ أظهرت ثباتًا معززًا وقدرة فائقة على مكافحة الورم في الجسم الحي، مع انخفاض عدد الخلايا التائية المنهكة نهائيًا (TCF1− TIM{ {39}} ) وزيادة المجموعة الفرعية السلفية الشبيهة بالجذع (TCF1+ TIM-3– ) داخل الأورام. في الختام، توفر دراستنا الحالية نظرة ثاقبة للتأثيرات متعددة الأبعاد للتعرض ↑[H+] على قمع وظيفة المستجيب للخلايا التائية وتأثيرها المتزامن على جذع الخلايا التائية.
طُرق
الفئران وخطوط الخلايا
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) التابعة لمعهد سوتشو لطب الأنظمة (ISM-IACUC-0151-R)، وتم إيواء الحيوانات في مرافق فأر محددة خالية من مسببات الأمراض. تم إيواء الفئران في ظروف قياسية، مع دورات الضوء/الظلام 12- ساعة/12- ساعة ودرجة حرارة يمكن التحكم فيها تتراوح بين 22-24 درجة ورطوبة تبلغ 60%، مع طعام وماء غير مقيد توافرها، ويتم فحصها يوميا. لم تتجاوز جميع أعباء الورم الإذن الذي تمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لمعهد سوتشو لطب الأنظمة. CD45.1+ تم إيواء الفئران المعدلة وراثيا OT-I TCR على خلفية C57BL/6N معًا. CD45.2+ تم شراء فئران C57BL/6N أنثى تتراوح أعمارها بين 6 و8 أسابيع من Vital River كمستلمات. تم شراء الفئران الإناث NCG (NOD / ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 / Gpt) التي تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع من GemPharmatech. في تجربة مستقلة واحدة على الجسم الحي، كانت الفئران CD45.1+ وCD45.2+ (من 6 إلى 12 أسبوعًا) متطابقة مع الجنس. تم الحفاظ على خلايا HEK -293 T من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC) في وسط DMEM مع إضافة 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) و1٪ بنسلين - ستربتومايسين. تم نقل خط خلايا سرطان الجلد الفأري B16، من ATCC، للتعبير عن OVA وتم الحفاظ عليه في وسط DMEM مع 10٪ FBS و1٪ بنسلين - ستربتومايسين. تم نقل خلايا K562 من ATCC للتعبير عن CD19 البشري وتم تربيتها في وسط RPMI 1640 مكمل بـ 10٪ FBS، 1٪ بنسلين - ستربتومايسين، 1٪ GlutaMAX، 0.1 M HEPES، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية، 1 مم بيروفات الصوديوم و 50 ميكرومتر - مركابتويثانول. تم شراء جميع الكواشف المذكورة أعلاه من جيبكو.
عزل الخلايا التائية الأولية وتنشيطها وانتقال الفيروس العكسي
تم عزل الخلايا اللمفاوية التائية CD {{0}} من الطحال لمدة 6-12 أسبوعًا من ذكور أو إناث فئران OT-I باستخدام مجموعة عزل الخلايا التائية الساذجة CD8 (BioLegend) وتم زراعتها في RPMI {{5} } وسط مكمل بـ 10% FBS، 1% بنسلين - ستربتومايسين، 1% أحماض أمينية غير أساسية، 1% غلوتاماكس، 1 ملم بيروفات صوديوم، 0.1 م هيبيس و 50 ميكرومتر - مركابتوإيثانول في وجود الفأر IL -2 (20 وحدة/مل، بيبروتك). وفي تجربة مستقلة واحدة في المختبر، كانت الفئران الذكور والإناث المستخدمة (من 6 إلى 12 أسبوعًا) متطابقة مع الجنس. تم تنشيط الخلايا النقية بواسطة الأجسام المضادة CD3 المضادة للفأر (2 ميكروغرام / مل، BioLegend) والأجسام المضادة CD28 المضادة للفأر (1 ميكروغرام / مل، BioLegend) لمدة 48 ساعة. تم شراء خلايا أحادية النواة للدم المحيطي (PBMCs) من متبرعين أصحاء من Sailybio وتم زراعتها في وسط RMPI -1640 مكمل بـ 5٪ Human Serum AB (Gemini)، 1٪ بنسلين - ستربتومايسين، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية، 1% جلوتاماكس، 1 ملي مولار من بيروفات الصوديوم، 0.1 مولار هيبيس و50 ميكرومتر-ميركابتوإيثانول في وجود IL{39}} البشري (100 وحدة/مل، بيبروتيك). تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للإنسان (1 ميكروغرام / مل، BioLegend) وCD28 المضادة للإنسان (1 ميكروغرام / مل، BioLegend) لتنشيط PBMCs لمدة 3 أيام. تم تنشيط وتوسيع خلايا الفأر المنقى والخلايا التائية البشرية في ظروف الثقافة المشار إليها: درجة الحموضة 7.4، درجة الحموضة 6.6، حمض اللاكتيك (سانجون)، أو لاكتات الصوديوم (سانجون). تم استخدام المستقلبات التالية لتكملة درجة الحموضة 6.6 أو وسط حمض اللاكتيك (10 ملم): ميثيونين 800 ميكرومتر (MCE)، أو SAM 100 ميكرومتر (MCE)، أو SAH 100 ميكرومتر (سيجما). بالنسبة للانتقال الفيروسي، تم تنشيط 1 × 106 PBMCs لكل بئر في 24-ألواح البئر. بعد 48 ساعة من التنشيط، تم استبدال غالبية الوسط بمادة طافية غير مركزة من الفيروسات القهقرية تحتوي على 10 ميكروغرام/مل من مادة البوليبرين (سانتا كروز). بعد الطرد المركزي عند 600 جم لمدة 90 دقيقة عند 30 درجة، تم استزراع الخلايا في الحاضنة لمدة 24 ساعة بوسط جديد. تم تكرار عملية النقل بعد 24 ساعة ثم إعادتها إلى وسط جديد للثقافة. تم استخدام مستقبلات عامل نمو العصب منخفض الألفة (LNGFR) لقياس كفاءة العدوى.
التدفق الخلوي
كانت الخلايا ملطخة بالأجسام المضادة الفلورية ثم تم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. بالنسبة لتلوين العلامة السطحية، تم تلطيخ الخلايا بأجسام مضادة مترافقة بالفلورسنت ومجموعة صبغة الخلايا الميتة الحية / الميتة القابلة للإصلاح (Invitrogen) في المخزن المؤقت FACS (محلول ملحي بالفوسفات (PBS) مع 2٪ FBS)، ثم تم تثبيته باستخدام بارافورمالدهيد 2٪ (Casmart) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة للتلوين داخل الخلايا لبروتينات الفوسفو، تم إصلاح الخلايا الملطخة مسبقًا باستخدام مخزن مؤقت للتثبيت (BioLegend) ثم تم تلوينها بأجسام مضادة خاصة بالفوسفو في مخزن مؤقت للنفاذية (Invitrogen). للكشف عن السيتوكينات داخل الخلايا، تم تحفيز الخلايا باستخدام خلات phorbol ميريستات (PMA) في وجود Brefeldin A (BFA) (BioLegend) لمدة 4.5 ساعة. بعد ذلك، تم إصلاح الخلايا الملطخة مسبقًا وملطخة بالأجسام المضادة للسيتوكينات في منطقة عازلة للنفاذية. بالنسبة لتلطيخ العامل النسخي داخل الخلايا، كانت الخلايا ملطخة مسبقًا باستخدام مجموعة صبغة الخلايا الميتة الحية/الميتة والأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية للكشف عن العلامات السطحية. تم بعد ذلك تثبيت الخلايا لمدة 30 دقيقة على الجليد باستخدام FOXP3 / Transcription Factor Fixation Buffer (Invitrogen) وملطخة بالأجسام المضادة لعامل النسخ في Permeabilization Buffer. بعد تلطيخ، تم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS لقياس التدفق الخلوي. تم جمع بيانات التدفق الخلوي بواسطة BD LSR Fortessa وBD FACSDiva (الإصدار 8.0.2)، وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo (الإصدار 10.4). يتم توفير استراتيجيات النابضة التمثيلية في البيانات الموسعة الشكل 10ب.
تسلسل الحمض النووي الريبي
تم إجراء تحليل RNA-seq باستخدام 12- الخلايا التائية الموسعة يومًا والمزروعة في الظروف المشار إليها كما هو موضح في الشكل 1 أ. باختصار، بعد 12 يومًا من توسع الخلايا التائية، تم استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي عن طريق التجانس في TRIzol (تاكارا) والتجميد في أنابيب خالية من RNase مع النيتروجين السائل. تم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام المحلل الحيوي Agilent 2100 (Agilent). تم إنشاء المكتبات باستخدام مجموعة إعداد عينة TruSeq RNA (FC -122-1001، Illumina). تم بعد ذلك تسلسل المكتبات باستخدام منصة Illumina NovaSeq 6000 (PE150)، وتم إنشاء ما يقرب من 40 مليون قراءة مزدوجة (Novogene). تم استخراج أعداد القراءة الأولية ثم تم تطبيعها من خلال عوامل حجم المكتبة الخاصة بها باستخدام DESeq2 (الإصدار 1.28.1). تم استخدام تحويل اللوغاريتم المنتظم (r-log) لتثبيت التباين عبر العينات. تم إجراء تحليل إثراء مسار GO وKEGG للجينات المعبر عنها تفاضليًا باستخدام الملف التعريفي العنقودي (الإصدار 3.16.0). تم إنشاء خرائط التعبير الحراري باستخدام حزمة R "phheatmap" (الإصدار 1.0.12). تم استخدام GSEA v.4.0 لتحليل GSEA.
قطع وعلامة تسلسلها
تم إجراء CUT&Tag-seq كما هو موضح سابقًا، باستخدام Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit لـ Illumina (TD903، Vazyme). باختصار، تم توسيع الخلايا التائية البشرية لمدة 12 يومًا تحت ظروف التحكم، أو حمض اللاكتيك، أو حمض اللاكتيك مع 800 ميكرومتر من الميثيونين. بعد ذلك، تم إخماد 1 × 10 خلايا T لاستخراج المواد النووية وتم تحضينها بخرز ConA في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تم إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من الجسم المضاد المختلط مسبقًا مع الجسم المضاد الأولي (المضاد لـ H3K27me3 أو المضاد لـ H3K4me3) واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات. تم تحضين العينات مع الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم تم تحضينها بشكل مشترك مع البروتين A/G-Tn5 transposase في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لإزعاج تجزئة الحمض النووي. تم استخدام الحمض النووي المنقى لإعداد المكتبة وتسلسله باستخدام PE150 بواسطة جهاز التسلسل Illumina Nova6000.
تحليل القطع والعلامات
تم استخدام FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) للتحقق من جودة القراءة التسلسلية. تم تقليص جودة القراءات إلى درجة Phred لا تقل عن 20 باستخدام Trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . تمت محاذاة جميع القراءات التي تم إنتاجها بواسطة CUT&Tag-seq لـ H3K27me3 وH3K4me3 مع الجينوم البشري hg38 باستخدام Bowtie2 (الإصدار 2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) مع الخيارات: –local– حساس للغاية-محلي-لا-أونال-لا-مختلط-لا-متنافر-phred33 -I 10 -X 700. تم تطبيع العينات التي لا تحتوي على ارتفاع في الحمض النووي باستخدام طريقة ChIPseqSpikeInFree، وهي طريقة طريقة تطبيع جديدة لتحديد عوامل القياس للعينات بشكل فعال عبر مختلف الظروف والعلاجات . بالنسبة إلى H3K27me3، تم استدعاء القمم باستخدام MACS2 (الإصدار 2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ الذروة_استدعاء_أجهزة Mac .html) مع الخيارات "-g hs -f BAMPE–keep-dup all-broad-broad-cutoff 0.1". بالنسبة إلى H3K4me3، استخدم اتصال الذروة MACS2 مع المعلمات '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. تمت إضافة تعليقات توضيحية إلى الذروة باستخدام ChIPseeker (الإصدار 1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/)، وتم إنشاء تصورات باستخدام DeepTools (الإصدار 3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) وpyGenomeTracks (الإصدار 3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).
كيو آر تي-بي سي آر
تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام TRIzol (Takara) وعكسه إلى cDNA باستخدام HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة لـ PCR في الوقت الحقيقي الكمي، تم استخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي لمنشور ABI 7500 (Thermo Fisher) و2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام ACTB كمعيار داخلي. تم حساب التعبير النسبي لـ mRNA باستخدام طريقة 2−ΔΔCT. يمكن العثور على تسلسلات التمهيدي المستخدمة في qPCR في الجدول التكميلي 1.
النشاف الغربي
لتحليل التعبير البروتين، تم جمع الخلايا وغسلها مع برنامج تلفزيوني بارد، وتم استخراج البروتين الكلي باستخدام 1٪ SDS (سانغون) على الجليد. تم قياس تركيز البروتين بواسطة مجموعة فحص البروتين BCA (ميرك). تم فصل عينات البروتين بواسطة المواد الهلامية SDS-PAGE ثم نقلها إلى أغشية PVDF (ميليبور). تم حظر الأغشية بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في برنامج تلفزيوني يحتوي على Tween2 0. بعد الحجب، تم تحضين الأغشية بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات والأجسام المضادة الثانوية المقترنة بـ HRP لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم تطوير إشارة HRP بواسطة التألق الكهربي (ChemeMINI610) وتم جمعها بواسطة Sage Capture (الإصدار 2.19.12). تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج ImageJ (v1.8.0).
تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا
في كل بئر من {{0}} صفائح البئر، تم تنشيط PBMCs بواسطة الأجسام المضادة البشرية المضادة لـ CD3 والأجسام المضادة لـ CD28 لمدة 3 أيام وتم تربيتها في وسط RPMI -1640 في ظل ظروف مختلفة لمدة 12 يومًا. بعد ذلك ، تم جمع 1 × 106 PBMCs وتثبيتها في مخزن مؤقت للتثبيت مبرد مسبقًا (2.5٪ جلوتارالدهيد ، 0.1 م فوسفات عازل (PB) ، درجة الحموضة 7.4) طوال الليل عند 4 درجات. بعد غسلها باستخدام PBS ثلاث مرات، تم تثبيت الخلايا بعد ذلك في 1% من رابع أكسيد الأوزميوم في PBS لمدة ساعتين، وتم تجفيفها ودمجها في راتنج Spurr، وفقًا للإجراء القياسي. كانت المقاطع الرقيقة ملطخة بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص. تم تصوير مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال Hitachi HT -7800 (TEM) (الإصدار 01.20) وكاميرا AMT-XR81DIR.
الأجسام المضادة والكواشف
وكانت الأجسام المضادة المستخدمة لتحليل التدفق الخلوي على النحو التالي. APC المضادة للإنسان NGFR (القط. رقم 345108، 1:1، 000 لـ FACS)، FITC المضاد للإنسان CD4 (القط. رقم 357406، 1: 200 لـ FACS)، المحيط الهادئ الأزرق المضاد للإنسان CD8 (القط. رقم 300928، 1:200 لـ FACS)، APC-Cy7 المضاد للإنسان/الماوس CD44 (القط. رقم 103028، 1:200 لـ FACS)، PE مضاد للإنسان CCR7 (القط. رقم 353204، 1) :200 لـ FACS)، PE مضاد للإنسان TNF- (قطة رقم 502909، 1:200 لـ FACS)، PE-Cy7 CD45RO مضاد للإنسان (قطة رقم 304230، 1:200 لـ FACS)، APC مضاد- IFN البشري- (القطط رقم 502512، 1:200 لـ FACS)، PE-Cy7 المضاد للإنسان LAG -3 (القطط رقم 369310، 1:200 لـ FACS)، PE المضاد للإنسان TIM {{ 52}} (قطة رقم 345006، 1:200 لـ FACS)، BV711 مضاد للإنسان PD -1 (قطة رقم 329928، 1:200 لـ FACS)، Percp-Cy5.5 CD62L مضاد للإنسان (القطة رقم 304824، 1:200 لـ FACS)، APC المضادة للإنسان CD27 (القطّة رقم 302810، 1: 200 لـ FACS)، BV711 المضادة للفأر CD8 (القطّة رقم 100748، 1: 200 لـ FACS) ) ، PE-Cy7 المضاد للفأرة CD62L (القط رقم 104418، 1:200 لـ FACS)، APC-Cy7 المضاد للفأرة CD45.2 (القط رقم 830789، 1:200 لـ FACS)، المحيط الهادئ الأزرق المضاد للفأرة الماوس CD45.1 (القط. رقم 110722، 1:200 لنظام FACS)، APC المضاد للفأر Ly108 (القط. لا. 134610، 1:200 لـ FACS)، PE anti-mouse LAG-3 (قطة رقم 125207، 1:200 لـ FACS)، جسم مضاد Alexa Fluor 488 anti-c-MYC (قطة رقم 626811، 1) :200 لـ FACS)، وPE المضاد للفأر TNF- (القطط رقم 506306، 1:200 لـ FACS)، وAPC المضاد للفأر IFN- (القطط رقم 505810، 1:200 لـ FACS) تم شراؤها من BioLegend . مجموعة بقع الخلايا الميتة الحية/الميتة القابلة للإصلاح، PerCP-eFluor710 المضاد للفأر PD -1 (قطة رقم 46-9981-82، 1:200 لـ FACS)، PE فوسفور-S6 (Ser235/236) (قطة . رقم 12-9007-42، 1:200 لـ FACS)، PE مضاد للإنسان/الفأر TOX (قطة. رقم 12-6502-82، 1:200 لـ FACS)، وPE-Cy7 مضاد للفأر TIM{ {149}} (cat. no. 25-5870-82، 1:200 لـ FACS) تم شراؤها من Thermo Fisher. تم شراء Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (القطط رقم 6709، 1:200 لـ FACS) والفوسفور -4E-BP1 (Thr37/46) (القطط رقم 2846، 1:200 لـ FACS) من تكنولوجيا إشارات الخلية. تم شراء Alexa Fluor 647 anti-puromycin (رقم القطة MABE 343- AF647، 1: 800 لـ FACS) من شركة Merck. وكانت الأجسام المضادة المستخدمة في البقع الغربية على النحو التالي. أرنب مضاد للفوسفو-أكت (Ser473) (قطة رقم 4060، 1:1، 000 لـ IB)، مضاد للفوسفو-NF-κB p65 (Ser536) (قطة رقم 3033، 1:1 ، 000 لـ IB)، مضاد c-MYC (قطة رقم 18583، 1:1، 000 لـ IB)، مضاد EZH2 (قطة رقم 5246، 1:1،{ {200}} لـ IB)، مضاد ثلاثي ميثيل هيستون H3 (Lys27) (قطة رقم 9733، 1:1، 000 لـ IB)، مضاد ثلاثي ميثيل هيستون H3 (Lys4) (قطة رقم 9751، 1:1، 000 لـ IB)، مضاد ثنائي ميثيل هيستون H3 (Lys9) (قطة رقم 4658، 1:1، 000 لـ IB) ، مضاد ثنائي ميثيل هيستون H3 (Lys79) (قطة رقم 5427، 1:1، 000 لـ IB)، مضاد هيستون H3 (قطة رقم 9715، 1:1، {{242) }} لـ IB)، مضاد لـ COXIV (قطة رقم 850، 1:1، 000 لـ IB)، IgG مضاد للأرنب (مرتبط بـ HRP) (قطة رقم 7074، 1:2،{ {253}} لـ IB)، وIgG المضاد للفأر (مرتبط بـ HRP) (القط رقم 7076، 1:2، 000 لـ IB) تم شراؤها من Cell Signaling Technology. كان الماوس المضاد لـ Tim23 (القط رقم 611223، 1:1، 000 لـ IB) من BD Biosciences. مضاد الفأرة- -actin (رقم القطة. 66009-1-Ig, 1:5,000 لـ IB)، مضاد SLC7A5 (قطة رقم 67951-1-Ig, 1: 1، 000 لـ IB)، والأرنب المضاد لـ SLC38A1 (القط. رقم 12039-1- AP، 1: 1، 000 لـ IB) من بروتينتك. تم شراء Rabbit anti-SLC38A2 (رقم القطة BMP081، 1:1، 000 لـ IB) من المختبرات الطبية والبيولوجية.
فحص التمثيل الغذائي للخلايا التائية
للتحقق من امتصاص BODIPY FL C16 في التحكم أو الخلايا التائية المعالجة ↑[H+]، تم استنبات الخلايا التائية بـ 1 ميكرومتر BODIPY FL C16 (Invitrogen) المذاب حديثًا لمدة ساعة واحدة، ثم تم غسلها مرتين باستخدام PBS قبل تلطيخ السطح. لمزيد من استكشاف الاعتماد الأيضي في مجموعات العلاج المختلفة، تم إجراء تجارب باستخدام طريقة SCENITH (التمثيل الغذائي النشط لخلية واحدة عن طريق تثبيط الترجمة) . باختصار، تم زرع الخلايا التائية في 96-ألواح جيدة بمعدل 1 × 106 خلية/مل. بعد ذلك تمت معالجة الخلايا بالتحكم (Ctrl)، 2- ديوكسي-د-جلوكوز (التركيز النهائي 100 مم)، أو أوليجوميسين (التركيز النهائي 5 ميكرومتر)، أو مزيج من المثبطات عند التركيزات النهائية لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة . تمت إضافة بوروميسين (التركيز النهائي 10 ميكروغرام/مل) خلال آخر 30 دقيقة. بعد علاج البيوروميسين، تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وتلطيخها مسبقًا باستخدام مجموعة صبغة الخلايا الميتة الحية/الميتة القابلة للتثبيت والأجسام المضادة ضد العلامات السطحية. وأعقب تلطيخ بوروميسين داخل الخلايا عملية تلطيخ لعوامل النسخ داخل الخلايا.
التحليل الأيضي باستخدام LC-MS/MS
تم إجراء التحليل الأيضي وجمع العينات كما في التقارير السابقة . باختصار، تم تنشيط PBMCs بشكل فردي في 24- صفائح جيدة بواسطة مضادات CD3/CD28 البشرية لمدة 3 أيام وتم تربيتها في وسط RPMI 1640 مع التحكم أو حمض اللاكتيك حتى اليوم 12. ثم، 8 × تم جمع 106 خلايا لكل عينة (عدد=4 عينات مستقلة لكل مجموعة) ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5- مل للطرد المركزي عند 300 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات ثم تغسل مع برنامج تلفزيوني بارد. بعد الطرد المركزي عند 300 جم لمدة 5 دقائق مرة أخرى، تمت إضافة 80٪ من الميثانول البارد وتدويمه بقوة لتعطيل بيليه الخلية تمامًا، ثم تم نقل الخلايا إلى الفريزر عند درجة -80 درجة. تم طرد العينات عند 12,000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات. تم جمع طاف. أخيرًا، تم تجفيف المستخلصات وتحليلها بواسطة UHPLC-MS/MS في نوفوجين. تمت معالجة ملفات البيانات الأولية التي تم إنشاؤها بواسطة UHPLC – MS / MS باستخدام Compound Discoverer (الإصدار 3.1، Thermo Fisher) لإجراء محاذاة الذروة، واختيار الذروة، والتقدير الكمي لكل مستقلب. تم استخدام برنامج Metaboanalyst (v5.0) لمزيد من تحليل البيانات، ثم تم اختيار مسارات غنية بشكل كبير باستخدام P <0.05.
تجارب وضع العلامات على النظائر المستقرة
تم إجراء التدفق الأيضي 13C على الخلايا التائية باستخدام الطرق الموصوفة مسبقًا60،78،79. باختصار، تم تنشيط PBMCs لكل بئر في 24-ألواح بئر تحتوي على مضادات CD3/CD28 البشرية لمدة 3 أيام، كما هو موضح أعلاه. بالنسبة لتتبع الجلوكوز [13C6]، تم تحويل الوسيط بعد 11 يومًا إلى RPMI (Gibco) الخالي من الجلوكوز مع 10٪ من FBS (Thermo Fisher Scientific)، 1٪ بنسلين - ستربتومايسين، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 50 ميكرومتر - مركابتوإيثانول و 0.1 M HEPES، يحتوي على 11 ملي مولار [13C6] جلوكوز (مختبرات كامبريدج للنظائر) مع التحكم أو 10 ملي مولار من حمض اللاكتيك، لمدة 24 ساعة. بالنسبة لتتبع بالميتات [13C16]، تم تنشيط 2 × 107 خلايا T ووضعها في وسط مكتمل مع التحكم أو ظروف حمض اللاكتيك 10 ملم كما هو موضح أعلاه في اليوم 12، والتي تحتوي على 200 ميكرومتر [13C16] بالميتات (مختبرات كامبريدج للنظائر)، لمدة 8 ح. بالنسبة لتتبع الميثيونين [13C5]، تم توسيع الخلايا التائية تحت السيطرة، أو حمض اللاكتيك أو حمض اللاكتيك مع ظروف ميثيونين 800 ميكرومتر لمدة 12 يومًا. بعد ذلك ، تم تحويل 4 × 10 خلايا T إلى وسط RPMI كامل خالٍ من الميثيونين (Gibco) وتم تربيتها تحت ظروف التحكم أو حمض اللاكتيك أو حمض اللاكتيك المكمل بالميثيونين (يحتوي على 100 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر أو 800 ميكرومتر [13C5] ميثيونين) (مختبرات كامبريدج للنظائر)، لمدة 8 ساعات. تم جمع المواد الطافية المعنية ثم تخزينها عند درجة حرارة -80 درجة. تم تكوير الخلايا بالطرد المركزي (300 جم، 4 درجة، 5 دقائق)، وغسلها مرتين بمحلول ملحي، وتجميدها على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة. تم استخلاص المستقلبات باستخدام ميثانول بدرجة HPLC بارد بنسبة 80% وتدويره لفترة وجيزة، متبوعًا بإضافة 200 مل من الماء بدرجة HPLC، ثم 500 مل من كلوروفورم بدرجة HPLC (الميثانول: الماء: نسبة الكلوروفورم، 5:2:5). ). تم دوامة الخليط وطرده بالطرد المركزي لتحقيق فصل الطور. تم تجفيف المواد الطافية بواسطة الدوران الفراغي من أجل الاشتقاق اللاحق، ثم تم تحضينها بنسبة 2٪ (وزن / حجم) ميثوكسي أمين هيدروكلوريد (226904، سيجما-ألدريش) في بيريدين لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة، وتم سيليلا بواسطة N-ميثيل-N-( ثالثي بوتيل ثنائي ميثيل سيليل) ثلاثي فلورو أسيتاميد مع 1٪ ثالثي بوتيل ثنائي ميثيل كلورو سيلان (TBDMS، 18162-48-6، Regis Technologies) لمدة 30 دقيقة عند 45 درجة. تم تحليل مشتقات الجلوكوز [13C6] بواسطة GC-HRMS، وكروماتوجرافيا الغاز Trace 1310 (Thermo Fisher) مع عمود DB – 35MS (Agilent Technologies)، ونظام Q Exactive GC Orbitrap GC – MS / MS (Thermo Fisher). تم إجراء فحوصات التمثيل الغذائي GC – MS / MS بواسطة Metabo-Profile. تم تحديد المستقلبات وقياس كميتها بواسطة Xcalibur (الإصدار 4.1) وTraceFinder (الإصدار 5.1) (Thermo Fisher)، بما في ذلك وقت الاحتفاظ، ونسبة الشحنة إلى الكتلة لشظايا الأيونات، وكثافة الذروة. تم تحليل مشتقات [13C16] بالميتات و [13C5] الميثيونين بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الضغط - مطياف الكتلة الرباعي الرباعي (UPLC – TQMS). تم تحليل البيانات الأولية من UPLC-TQMS باستخدام برنامج Waters 'MassLynx (الإصدار 4.1، Waters) لاستخراج ذروة المستقلبات وتكاملها وتحديدها وتقديرها كميًا. تم استخدام لغة R (الإصدار 4.1.1) للتحليل الإحصائي اللاحق.
نموذج الورم B16 والعلاج المناعي لنقل الخلايا بالتبني
للتحقيق في النشاط المضاد للورم للخلايا التائية في الجسم الحي، 0.2 × 106 B16- تم حقن خلايا سرطان الجلد OVA تحت الجلد في إناث الفئران C57BL/6N. بعد تسعة أيام من زرع الورم، تم حقن الفئران عن طريق الوريد بخلايا T 5 × 106 من فئران OT-I الأنثوية الموسعة لمدة 7 أيام في ظروف مختلفة. تلقت الفئران الحاملة للورم 5 غراي من التشعيع تحت المميت قبل ACT. تم قياس منطقة الورم كل يومين وتم حسابها بالطول (مم) × العرض (مم). تم الموت الرحيم للفئران التي تبلغ مساحة الورم فيها 300 مم2. لاستكشاف استمرارية الخلايا التائية الموسعة في ظروف مختلفة، تم نقل 4 × 106 CD45. 1+ خلايا T من فئران OT-I الأنثوية بالتبني إلى فئران C57BL/6N أنثى. وبعد أسبوع واحد، تم الموت الرحيم للفئران وتم حساب الخلايا من الدم المعزول والطحال والغدد الليمفاوية. تم تحديد نسبة الخلايا التائية المنقولة عن طريق البوابات على الخلايا التائية التي تعبر عن CD45.1+ وCD45.2+ من خلال قياس التدفق الخلوي.
نموذج الفئران NCG والعلاج بالقرص المضغوط19-CAR-T
تم زرع فئران NCG الأنثوية تحت الجلد بخلايا 1 × 106 CD 19- K562. عندما وصلت أحجام الورم إلى 75 مم 3، تلقت الفئران 5 × 106 خلايا T غير منتقلة وخلايا CD 19- CAR T المزروعة في السيطرة أو وسط يحتوي على حمض اللاكتيك 10 مم. تم قياس نمو الورم كل يومين باستخدام الفرجار الإلكتروني وحسابه بالطول (مم) × العرض (مم). تم الموت الرحيم للفئران التي تزيد مساحة الورم فيها عن 300 مم. تم جمع الأورام وهضمها ومعالجتها باستخدام Percoll (Sigma)، ثم تم تحديد وظيفة الخلية التائية والنمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي.
معدل استهلاك الأكسجين القاعدي وتحليل معدل التحمض خارج الخلية
لتحليل الخصائص الأيضية، تم تقييم التعرف الضوئي على الحروف وECAR بواسطة محلل فرس البحر XF24 (Agilent). باختصار، تمت معالجة الخلايا التائية البشرية المستزرعة في ظروف مختلفة لمدة 12 يومًا باستخدام وسط XF غير مخزن (RPMI 164 غير مخزن 0 يحتوي على 10 ملي مولار من الجلوكوز و1 ملي مولار من بيروفات الصوديوم و2 ملي مولار من الجلوتامين) . بعد ذلك، تم زرع الخلايا التائية البشرية عند 0.5 × 106 خلية لكل بئر في صفيحة زراعة الخلايا XF24 وحضنت في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. لتعزيز التصاق الخلايا، تم لف الصفائح عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 100 جم بدون فرامل. تم تحليل استهلاك الأكسجين والتحمض خارج الخلية في ظل الظروف القاعدية واستجابة لـ 1.25 ميكرومتر أوليغوميسين، و50 ملي مولار 2- ديوكسي-د-جلوكوز، و1.5 ميكرومتر FCCP، و0.5 ميكرومتر روتينون، و0.5 ميكرومتر أنتيميسين A. تم حساب SRC عن طريق الطرح التعرف الضوئي على الحروف الأساسي من الحد الأقصى للتعرف الضوئي على الحروف.
رقاقة – qPCR
تم إجراء الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) باتباع إرشادات الشركة المصنعة المقدمة مع مجموعة القص الأنزيمية السريعة ChIP-IT (Active Motif). باختصار، تم إصلاح 15 مليون خلية T بشرية مزروعة تحت السيطرة أو 10 ملي مولار من حمض اللاكتيك باستخدام الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتم إيقاف تفاعل التثبيت بإضافة 1 × جليكاين. تم تكوير الخلايا الثابتة باستخدام PMSF وكوكتيل تثبيط البروتين وتخزينها عند درجة -80 درجة قبل تحلل الخلية. بعد ذلك، تمت إعادة تعليق الحبيبة المذابة في محلول تحلل مثلج سعة 1 مل مع PMSF وكوكتيل تثبيط البروتين على الجليد لمدة 30 دقيقة للحصول على مادة نووية. تم بعد ذلك إعادة تعليق الحبيبة النووية وهضمها بكوكتيل إنزيمي لقص الكروماتين لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة. تم تحضين الكروماتين المنفصم باستخدام خرزات مغناطيسية من البروتين G مع مضاد c-MYC (CST، رقم القطة 18583، 1:100 لـ ChIP) ومضاد IgG (CST، رقم القطة 2729، 1:100 لـ ChIP) عند 4 درجات بين عشية وضحاها. بعد ذلك، تم غسل الخرز المغناطيسي بمحلول ChIP المؤقت أربع مرات وتم شطفه باستخدام محلول شطف سعة 50 ميكرولتر. تم ربط الحمض النووي المُزال بشكل عكسي لمدة 2.5 ساعة عند 65 درجة ثم تمت تنقيته عن طريق استخلاص الفينول كلوروفورم. تم استخدام الحمض النووي المنقى لإجراء ChIP-qPCR للكشف عن إثراء MYC لدى مروجي الجينات المستهدفة. يمكن العثور على الاشعال المستخدمة في ChIP-qPCR في الجدول التكميلي 2.
تحليل كتلة الميتوكوندريا والغشاء المحتمل
تم تحليل كتلة الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء باستخدام MitoTracker Green وtetramethyrhodamine methyl ester (TMRM). تم تلوين الخلايا بـ 250 نانومتر MitoTracker Green (Thermo Fisher) أو 50 نانومتر TMRM (Thermo Fisher) في حاضنة عند 37 درجة (5٪ ثاني أكسيد الكربون) لمدة ساعة واحدة قبل تلطيخ سطح الخلية. تم غسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت FACS ثلاث مرات، تليها علامات السطح تلطيخ لمزيد من تحليل FACS.
تحليل احصائي
تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism الإصدار 8.0. يتم عرض النتائج على أنه تم استخدام اختبار t للطالب ثنائي الذيل لمقارنة العلاجات مع مجموعات التحكم. تم تطبيق ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة لـ Tukey's Sidak's أو Dunnett لإجراء مقارنات متعددة. تم اعتبار P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
مراجع
1. جاتينوني، إل.، سبيزر، دي، ليشترفيلد، إم. وبونيني، سي. تي الخلايا الجذعية للذاكرة في الصحة والمرض. نات. ميد. 23، 18-27 (2017).
2. جاو، س. وآخرون. خلايا الذاكرة التائية الشبيهة بالخلايا الجذعية: منظور من الجانب المظلم. الخلية المناعية. 361، 104273 (2021).
3. Rosenberg، SA & Restifo، NP نقل الخلايا بالتبني كعلاج مناعي شخصي لسرطان الإنسان. العلوم 348، 62-68 (2015).
4. Ribas، A. & Wolchok، JD العلاج المناعي للسرطان باستخدام حصار نقطة التفتيش. العلوم 359، 1350-1355 (2018).
5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA الجذعية والمستجيب والحالات الهجينة لخلايا الذاكرة المضغوطة 8+ T. اتجاهات إيمونول. 41، 17-28 (2020).
6. جاليتي، ج. وآخرون. مجموعتان فرعيتان من أسلاف خلايا الذاكرة التائية CD8+ الشبيهة بالجذع مع التزامات مصيرية مميزة عند البشر. نات. إيمونول. 21، 1552–1562 (2020).
7. جاتينوني، L. وآخرون. مجموعة فرعية من خلايا الذاكرة التائية البشرية ذات خصائص تشبه الخلايا الجذعية. نات. ميد. 17، 1290-1297 (2011).
8. Franco، F.، Jaccard، A.، Romero، P.، Yu، YR & Ho، PC التمثيل الغذائي والتنظيم اللاجيني لاستنفاد الخلايا التائية. نات. متعب. 2، 1001-1012 (2020).
9. Kaech، SM & Cui، W. التحكم النسخي في تمايز الخلايا التائية للمستجيب والذاكرة CD 8+. نات. القس إيمونول. 12، 749-761 (2012).
10. هوانغ، س. وآخرون. التمايز البدائي لخلايا الذاكرة CD8+ T الخاصة بالورم كمستجيبين حسني النية لحصار PD-1/PD-L1 في تصريف الغدد الليمفاوية. الخلية 185، 4049-4066 (2022).
11. صديقي، I. وآخرون. تعمل الخلايا التائية Tcf 1+ PD -1+ CD 8+ داخل الفم ذات الخصائص الشبيهة بالجذع على تعزيز السيطرة على الورم استجابةً للتطعيم والعلاج المناعي لحصار نقطة التفتيش. الحصانة 50، 195-211 (2019).
12. جانيت، ج. وآخرون. الدور الأساسي لمؤثر مسار Wnt Tcf-1 في إنشاء ذاكرة خلايا CD8 T الوظيفية. بروك. ناتل أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 107، 9777-9782 (2010).
13. Henning، AN، Roychoudhuri، R. & Restifo، NP التحكم اللاجيني في CD 8+ تمايز الخلايا التائية. نات. القس إيمونول. 18، 340-356 (2018).
14. كرومبتون، JG وآخرون. تم الكشف عن علاقة النسب للمجموعات الفرعية للخلايا التائية CD8+ من خلال التغييرات التقدمية في المشهد اللاجيني. خلية مول. إيمونول. 13، 502-513 (2016).
15. يو، ب وآخرون. تكشف المناظر الطبيعية اللاجينية عن عوامل النسخ التي تنظم تمايز الخلايا التائية CD8+. نات. إيمونول. 18، 573-582 (2017).
16. أراكي، Y. وآخرون. يكشف التحليل على نطاق الجينوم لميثيل هيستون عن التنظيم القائم على حالة الكروماتين لنسخ الجينات ووظيفة خلايا الذاكرة CD 8+ T. الحصانة 30، 912-925 (2009).
17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Metabolic برامج صممت مناعة الخلايا التائية في العدوى الفيروسية والسرطان والشيخوخة. خلية ميتاب. 34، 378-395 (2022).
18. فان، في وآخرون. يدعم التمثيل الغذائي لتحلل السكر التأسيسي تمايز ذاكرة مستجيب الخلايا التائية CD8+ أثناء العدوى الفيروسية. الحصانة 45، 1024-1037 (2016).
19. سنكلير، إل في وآخرون. التحكم في مستقبلات المستضد في استقلاب الميثيونين في الخلايا التائية. إي لايف 8، e44210 (2019).
20. أوسوليفان، D. وآخرون. تستخدم الخلايا التائية ذات الذاكرة المضغوطة 8+ تحلل الدهون داخل الخلية لدعم البرمجة الأيضية اللازمة للتنمية. الحصانة 41، 75-88 (2014).
21. بيرس، إل وآخرون. تعزيز ذاكرة الخلايا التائية CD8 عن طريق تعديل استقلاب الأحماض الدهنية. طبيعة 460، 103-107 (2009).
22. فان دير ويندت، جي جي وآخرون. تعد القدرة التنفسية للميتوكوندريا منظمًا مهمًا لتطور ذاكرة الخلايا التائية CD8+. الحصانة 36، 68-78 (2012). 23. Boedtkjer، E. & Pedersen، SF البيئة الدقيقة للورم الحمضي كمحرك للسرطان. آنو. القس فيزيول. 82، 103-126 (2020). 24. ثومين، دي إس وشوماخر، TN خلل الخلايا التائية في السرطان. الخلية السرطانية 33، 547-562 (2018).
25. شاربينج، NE وآخرون. تعمل البيئة المكروية للورم على قمع التكاثر الحيوي للميتوكوندريا للخلايا التائية لدفع القصور الأيضي للخلايا التائية داخل الفم والخلل الوظيفي. الحصانة 45، 374-388 (2016).
26. يو، ريال وآخرون. تعمل ديناميكيات الميتوكوندريا المضطربة في الأقراص المضغوطة 8+ TILs على تعزيز استنفاد الخلايا التائية. نات. إيمونول. 21، 1540–1551 (2020).
27. تشانغ، CH وآخرون. المنافسة الأيضية في البيئة المكروية للورم هي المحرك لتطور السرطان. الخلية 162، 1229-1241 (2015).
28. شاربينج، NE وآخرون. يؤدي إجهاد الميتوكوندريا الناجم عن التحفيز المستمر تحت نقص الأكسجة إلى استنفاد الخلايا التائية بسرعة. نات. إيمونول. 22، 205-215 (2021).
29. يانسن، CS وآخرون. يحافظ مكان داخل الورم على خلايا CD8 T الشبيهة بالجذع ويميزها. طبيعة 576، 465-470 (2019).
30. ايم، SJ وآخرون. تحديد الخلايا التائية CD8+ التي توفر الاندفاع التكاثري بعد علاج PD-1. طبيعة 537، 417-421 (2016).
31. هاس، ر. وآخرون. ينظم اللاكتات الدوائر الأيضية والمؤيدة للالتهابات في التحكم في هجرة الخلايا التائية ووظائف المستجيب. بلوس بيول. 13، e1002202 (2015).
32. وو، H. وآخرون. تنتج الخلايا التائية منافذ حمضية في العقد الليمفاوية لقمع وظائف المستجيب الخاصة بها. نات. مشترك. 11، 4113 (2020).
33. كالسينوتو، أ. وآخرون. تعديل حموضة البيئة الدقيقة يعكس الطاقة في الخلايا الليمفاوية التائية التي تتسلل إلى الورم البشري والفأري. الدقة السرطان. 72، 2746-2756 (2012). 34. جوتفريد، E. وآخرون. ينظم حمض اللاكتيك المشتق من الورم تنشيط الخلايا الجذعية وتعبير المستضد. الدم 107، 2013-2021 (2006).
35. كوليجيو، أو وآخرون. الاستقطاب الوظيفي للبلاعم المرتبطة بالورم بواسطة حمض اللاكتيك المشتق من الورم. طبيعة 513، 559-563 (2014).
36. إيرا دياز، ف. وآخرون. الحماض خارج الخلية وتثبيط mTOR يدفعان إلى تمايز الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الكريات الأحادية. مندوب الخلية 31، 107613 (2020).
37. سوكومار، م. وآخرون. يؤدي تثبيط استقلاب السكر في الدم إلى تعزيز ذاكرة الخلايا التائية CD8+ والوظيفة المضادة للورم. جيه كلين. يستثمر. 123، 4479–4488 (2013).
38. شولز، ج. وآخرون. يؤدي تعديل إشارات mTOR إلى تكوين خلايا T ذات ذاكرة تشبه الخلايا الجذعية. إي بيوميديسين 4، 50-61 (2016).
39. بوليزي، KN وآخرون. ينظم mTORC1 وmTORC2 بشكل انتقائي تمايز خلايا CD 8+ T. جيه كلين. يستثمر. 125، 2090-2108 (2015).
40. تشانغ، L. وآخرون. يتحكم هدف الثدييات من مجمع الرابامايسين 2 في تمايز ذاكرة خلايا CD8 T بطريقة تعتمد على Foxo1-. مندوب الخلية 14، 1206-1217 (2016).
41. Zhou، H. & Huang، S. دور إشارات mTOR في حركية الخلايا السرطانية والغزو والانتشار. العملة. بروتين بيبت. الخيال العلمي. 12، 30-42 (2011).
42. أرجويلو، RJ وآخرون. SCENITH: طريقة تعتمد على قياس التدفق الخلوي لتحديد استقلاب الطاقة وظيفيًا بدقة خلية واحدة. خلية ميتاب. 32، 1063-1075 (2020).
43. رون هاريل، ن. وآخرون. يعمل التولد الحيوي للميتوكوندريا وإعادة تشكيل البروتين على تعزيز عملية التمثيل الغذائي للكربون الواحد لتنشيط الخلايا التائية. خلية ميتاب. 24، 104-117 (2016).
44. Han، C.، Ge، M.، Ho، PC & Zhang، L. تأجيج مناعة الخلايا التائية المضادة للأورام: إعادة النظر في استقلاب الأحماض الأمينية. مناعي للسرطان. الدقة. 9، 1373–1382 (2021).
45. كاكارادوف، ب. وآخرون. التنظيم النسخي واللاجيني المبكر للتمايز الخلوي CD 8+ الذي كشف عنه تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) للخلية الواحدة. نات. إيمونول. 18، 422-432 (2017).
46. Wang، W. & Zou، W. الأحماض الأمينية وناقلاتها في مناعة الخلايا التائية وعلاج السرطان. مول. الخلية 80، 384-395 (2020).
47. Marchingo، JM، Sinclair، LV، Howden، AJ & Cantrell، DA التحليل الكمي لكيفية تحكم Myc في بروتينات الخلايا التائية والمسارات الأيضية أثناء تنشيط الخلايا التائية. اي لايف 9, e53725 (2020).
48. سوكومار، م. وآخرون. تحدد إمكانات غشاء الميتوكوندريا الخلايا ذات الجذع المعزز للعلاج الخلوي. خلية ميتاب. 23، 63-76 (2016).
49. علي زاده، د. وآخرون. يعزز IL15 نشاط مضاد الأورام لخلايا CAR-T عن طريق تقليل نشاط mTORC1 والحفاظ على النمط الظاهري لذاكرة الخلايا الجذعية. مناعي للسرطان. الدقة. 7، 759-772 (2019).
50. باك، دكتوراه في الطب وآخرون. تتحكم ديناميات الميتوكوندريا في مصير الخلايا التائية من خلال البرمجة الأيضية. الخلية 166، 63-76 (2016).
51. كريشنا، س. وآخرون. تتوسط خلايا CD8 T الشبيهة بالجذعية في استجابة العلاج المناعي للخلايا بالتبني ضد سرطان الإنسان. العلوم 370، 1328-1334 (2020).
52. برجر، مل وآخرون. تشكل التسلسلات الهرمية لهيمنة المستضد TCF 1+ الأنماط الظاهرية للخلايا CD8 T في الأورام. الخلية 184، 4996-5014 (2021).
53. قوه، Y. وآخرون. إعادة البرمجة الأيضية للخلايا التائية المضغوطة 8+ المنهكة نهائيًا بواسطة IL-10 تعزز المناعة المضادة للورم. نات. إيمونول. 22، 746-756 (2021).
54. كلاين جيلتينك، آر آي وآخرون. التكييف الأيضي للخلايا التائية المثبطة CD 8+ للعلاج بالخلايا بالتبني. نات. متعب. 2، 703-716 (2020).
55. سوزوكي، J.، Nabe، S.، Yasukawa، M. & Yamashita، M. Glutamine ينظم النشاط المضاد للورم لخلايا CD8 T. جان تو كاجاكو ريوهو 47، 11-15 (2020).
56. فودنالا، SK وآخرون. يتم تحفيز الخلايا التائية والخلل الوظيفي في الأورام من خلال آلية مشتركة. العلوم 363، eaau0135 (2019).
57. بوستيكاردو، م. وآخرون. التنشيط المتحيز للخلايا اللمفاوية التائية البشرية بسبب انخفاض درجة الحموضة خارج الخلية يتعارض مع تقدير تكلفة B7/CD28. يورو. جي إمونول. 31، 2829-2838 (2001).
58. بوسينو، V. وآخرون. يؤدي تراكم اللاكتات في موقع الالتهاب المزمن إلى تعزيز المرض عن طريق حث إعادة توصيل الخلايا التائية CD4+ الأيضية. خلية ميتاب. 30، 1055–1074 (2019).
59. فنغ، س. وآخرون. يزيد اللاكتات من جذعية الخلايا التائية CD8+ لزيادة المناعة المضادة للورم. نات. مشترك. 13، 4981 (2022).
60. روي، دي جي وآخرون. يشكل استقلاب الميثيونين استجابات الخلايا التائية المساعدة من خلال تنظيم إعادة البرمجة اللاجينية. خلية ميتاب. 31، 250-266 (2020).
61. Zhang، L. & Romero، P. التحكم الأيضي في قرارات مصير الخلايا التائية CD 8+ والمناعة المضادة للأورام. اتجاهات مول. ميد. 24، 30-48 (2018).
62. Cham، CM، Driessens، G.، O'Keefe، JP & Gajewski، TF يمنع الحرمان من الجلوكوز العديد من أحداث التعبير الجيني الرئيسية ووظائف المستجيب في خلايا CD 8+ التائية. يورو. J. Immunol.38، 2438-2450 (2008).
63. أوسوليفان، D. وآخرون. تستخدم الخلايا التائية ذات الذاكرة المضغوطة 8+ تحلل الدهون داخل الخلية لدعم البرمجة الأيضية اللازمة للتنمية. الحصانة 49، 375-376 (2018).
64. لين، ر. وآخرون. تتحكم أكسدة الأحماض الدهنية في بقاء خلايا الذاكرة التائية المقيمة في الأنسجة CD8+ في سرطان غدي معدي. مناعي للسرطان. القرار 8، 479-492 (2020).
65. راود، ب. وآخرون. تعتبر إجراءات Etomoxir على الخلايا التائية التنظيمية والذاكرة مستقلة عن أكسدة الأحماض الدهنية بوساطة Cpt1a. خلية ميتاب. 28، 504-515 (2018).
66. شارما، U. & راندو، OJ المدخلات الأيضية في الإبيجينوم. خلية ميتاب. 25، 544-558 (2017).
67. تيراكيس، PA وآخرون. ينظم S-2- hydroxyglutarate مصير CD8+ الخلايا اللمفاوية التائية. طبيعة 540، 236-241 (2016).
68. تشانغ، H. وآخرون. بيتا هيدروكسي بوتيرات الناتج عن التولد الكيتوني هو منظم جيني لتطور ذاكرة الخلايا التائية CD8+. نات. خلية بيول. 22، 18-25 (2020).
69. بيان، Y. وآخرون. يغير السرطان SLC43A2 استقلاب ميثيونين الخلايا التائية وميثيل هيستون. طبيعة 585، 277-282 (2020).
70. وول، م. وآخرون. التحكم الترجمي لـ c-MYC بواسطة الرابامايسين يعزز التمايز النخاعي الطرفي. الدم 112، 2305-2317 (2008).
71. Yerinde، C.، Siegmund، B.، Glauben، R. & Weidinger، C. التحكم الأيضي في علم الوراثة اللاجينية ودوره في تمايز الخلايا التائية CD 8+ ووظيفتها. أمام. إيمونول. 10، 2718 (2019).
72. إيل، ر. وآخرون. يحد كبت المناعة الأيونية داخل البيئة المكروية للورم من وظيفة المستجيب للخلايا التائية. طبيعة 537، 539-543 (2016).
73. قوه، A. وآخرون. تتعاون مكونات cBAF المعقدة وMYC مبكرًا في مصير الخلية التائية CD8+. طبيعة 607، 135-141 (2022).
74. Raynor، JL، Chapman، NM & Chi، H. التحكم الأيضي في توليد خلايا الذاكرة التائية والجذعية. حرب الربيع البارد. المنظور. بيول. 13، أ037770 (2021).
75. كايا أوكور، HS وآخرون. CUT&Tag للتنميط اللاجيني الفعال للعينات الصغيرة والخلايا المفردة. نات. مشترك. 10 ديسمبر 1930 (2019).
76. جين، H. وآخرون. ChIPseqSpikeInFree: نهج تطبيع ChIP-seq للكشف عن التغيرات العالمية في تعديلات هيستون دون حدوث ارتفاع. المعلوماتية الحيوية 36، 1270-1272 (2020).
77. Sellick، CA، Hansen، R.، Stephens، GM، Goodacre، R. & Dickson، AJ Metabolite استخراج من خلايا الثدييات المزروعة بالتعليق لتحديد ملامح المستقلب العالمي. نات. بروتوك. 6، 1241-1249 (2011).
78. لي، C. وآخرون. ينظم تقويض الأحماض الأمينية ثبات الخلايا الجذعية المكونة للدم عبر محور GCN2 – eIF2. الخلية الجذعية 29، 1119-1134 (2022).
79. وينيس، م. وآخرون. ينظم حامل البيروفات الميتوكوندريا تمايز خلايا الذاكرة التائية ووظيفة مضادة للأورام. خلية ميتاب. 34، 731-746 (2022).