يعمل مستخلص Herba Cistanche على تعزيز حالة الجلوتاثيون في الميتوكوندريا والتنفس في قلوب الفئران، مع إمكانية تحريض البروتينات غير المنفصلة

مقدمة

تؤدي إعادة ضخ عضلة القلب الإقفارية سابقًا إلى سلسلة من التغيرات في الميتوكوندريا، بما في ذلك زيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، Ca2+الحمل الزائد وانخفاض إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، وكل ذلك يمكن أن يؤدي إلى نخر و / أو موت الخلايا بوساطة موت الخلايا المبرمج (Redegeld et al.، 1992؛ Lemasters et al.، 1998). كما تلعب الميتوكوندريا دورا حاسما في التحديدفي مصير الخلايا العضلية القلبية بعد تحدي نقص التروية / ضخه (I / R)، يجب أن تستهدف الحماية ضد إصابة عضلة القلب I / R نحو الحفاظ على السلامة الهيكلية والوظيفية للميتوكوندريا. يعد الحفاظ على استقلاب طاقة الميتوكوندريا بعد تحدي I / R أمرًا مهمًا بشكل خاص لأن وظيفة انقباض القلب تعتمد بشكل كامل تقريبًا على ATP الناتج عن الميتوكوندريا. الخلايا العضلية القلبية التي تكون على قيد الحياة ولكنها لا تنكمش تكون ذات فائدة قليلة جدًا.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتعزيز المناعة PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche، النبات المجفف بالكاملسيستانش ديزيرتيكولاYC Ma (Orobanchaceae)، هو نبات طفيلي ينمو بشكل رئيسي في المناطق الصحراوية في شمال وشمال شرق الصين. Herba Cistanche، المصنفة على أنها عشبة "يانج" في الطب الصيني، توصف لعلاج قصور الكلى، والعقم عند النساء، والإمساك الناجم عن جفاف الأمعاء لدى مرضى الشيخوخة (تشن، 1998). وقد أظهرت الدراسات السابقة في مختبرنا أن الميثانولمستخلص هربا سيستانشيزيد من قدرة توليد ATP لعضلة القلب (Leung & Ko، 2008) ويحمي من إصابة I / R لعضلة القلب في الفئران (Leung، 2006). في حين أن تحفيز قدرة توليد ATP كان يوازيه تعزيز نقل إلكترون الميتوكوندريا (Leung & Ko، 2008)، فإن حماية القلب ضد إصابة I / R التي يوفرها علاج Herba Cistanche ارتبطت بانخفاض في استنزاف عضلة القلب ATP (Leung، 2006). في الدراسة الحالية، لتحديد دور الميتوكوندريا في العمل الوقائي للقلب لـ Herba Cistanche، قمنا بدراسة تأثير علاج Herba Cistanche على حالة الجلوتاثيون بالميتوكوندريا ومحتوى Ca2+ وإمكانات الغشاء ومعدل التنفس في قلوب الفئران. .

المواد والأساليب

مادة عشبية

تم شراء Herba Cistanche من تاجر أعشاب محلي (مقره هونج كونج) (Lee Hoong Kee). تمت المصادقة على العشبة من قبل المورد وتم إيداع عينة قسيمة (HKUST00301) في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا (HKUST). تم إجراء استخراج الميثانول من العشبة، بناءً على دراسات سابقة تشير إلى أن مثل هذا المستخلص يعزز توليد ATP للميتوكوندريا ويحمي من إصابة I / R في قلوب الفئران (Leung، 2006؛ Leung & Ko، 2008). باختصار، تم تقطيع Herba Cistanche (400 جم) إلى قطع صغيرة وتم استخلاصها بالتسخين تحت الارتجاع في 300 مل من الميثانول عند درجة حرارة 60 لمدة ساعتين، كما هو موصوف سابقًا (Leung & Ko، 2008). تم تكرار الإجراء مرتين. تم تجفيف المستخلص المجمع عن طريق تبخير المذيب تحت ضغط منخفض؛ وكان المحصول 42% (وزن/وزن) من كمية العشب الخام. يتم تخزين المستخلص في درجة حرارة 4 درجة حتى الاستخدام. على الرغم من أن الأعشاب الصينية يتم استخلاصها تقليديًا من الماء للاستهلاك الفموي، فقد تم استخدام الميثانول في دراستنا السابقة لتوفير الراحة في معالجة العينات وتخزينها (Yim & Ko, 2002)، ووجدنا أن استخلاص الميثانول مرضٍ من جميع النواحي.

رعاية الحيوانات والعلاج من المخدرات

تم إيواء إناث فئران سبراغ داولي البالغة (8-10 أسابيع من العمر، 200-230 جم) في غرفة يتم التحكم في الرطوبة فيها، مع دورة مظلمة / فاتحة مدتها 12 ساعة، عند درجة حرارة 22 درجة تقريبًا، ويسمح لها بالطعام والماء حسب الرغبة. تم توزيع الحيوانات بشكل عشوائي على مجموعات مختلفة، مع خمسة حيوانات في كل مجموعة. تلقت الفئرانمستخلص هربا سيستانشداخل المعدة ({{0}}.2 جم/مل في الماء) بمعدل 0.5 جم/كجم أو 1.0 جم/كجم لمدة 3 أيام متتالية. تلقت الحيوانات المراقبة (غير المعالجة) الماء فقط. بعد أربع وعشرين ساعة من آخر جرعة، تم الحصول على أنسجة بطين القلب من الحيوانات المخدرة للتحليل الكيميائي الحيوي. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة ممارسات البحث، جامعة هونج كونج للعلوم والتكنولوجيا.

تحضير كسور الميتوكوندريا

تم تجانس أنسجة بطين القلب المفرومة (~{{0}}.6 جم) في 10- أضعاف (وزن / حجم) فائض من محلول السكروز البارد [0.32 مولار سكروز، 1 ملم مولار إيثيلين ثنائي أمين حمض رباعي الأسيتيك (EDTA)، 50 مم تريس / حمض الهيدروكلوريك؛ درجة الحموضة 7.4] باستخدام الخالط الزجاجي التيفلون، عند 4000 دورة في الدقيقة، مع 25-30 ضربة. تم تحضير كريات الميتوكوندريا من متجانسات الأنسجة عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم عند 4 درجات لمدة 30 دقيقة، وتم تحديد النقاء عن طريق قياس الأنشطة المحددة النسبية لإنزيم هيدروجيناز السكسينات ونازعة هيدروجين اللاكتات في طاف وحبيبات، على التوالي، كما هو موضح سابقًا (إيفانز، 1992). تم تعليق كريات الميتوكوندريا في 1 مل من المخزن المؤقت المتجانس.

قياس الميتوكوندريا خفض مستويات الجلوتاثيون والجلوتاثيون المؤكسد

تم تحديد مستويات الجلوتاثيون المختزل في الميتوكوندريا (GSH) إنزيميًا باستخدام 5،59-dithiobis(2- حمض النيتروبنزويك) (DTNB) واختزال الجلوتاثيون (GR)، في بروتوكول تم تعديله من Griffith (198{{17}) }). تم خلط قسامة (21 0 ميكرولتر) من جزء الميتوكوندريا مع 9 0 ميكرولتر من 1 0٪ (v / v) 5- حمض السلفوساليسيليك (SSA) و تم الطرد المركزي للخليط عند 600 × جم لمدة 10 دقائق. لقياس مستويات الجلوتاثيون المؤكسد (GSSG)، تم خلط كميات 100 ميكرولتر من المواد الطافية SSA مع 10 ميكرولتر من 20٪ (وزن / حجم) 2- فينيل بيريدين و10 ميكرولتر 60٪ (حجم / حجم) ثلاثي إيثانولامين في أنابيب microfuge. تم السماح لكل أنبوب بالوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. تم تحضين خليط التفاعل المحتوي على 0.63 ملي مولار DTNB و0.053 ملي مولار NADPH (فوسفات النيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد المخفض) في محلول الفوسفات (0.1 مولار، مع 5 ملي مولار Na2 EDTA؛ pH7.5) عند 30 درجة لمدة دقيقتين. تمت إضافة قسامة (30 ميكرولتر) من طاف عينة SSA (الجلوتاثيون الكلي) أو عينة GSSG إلى بئر 96- لوحة ميكروتيتر جيدة، و180 ميكرولتر من خليط التفاعل المُسخن مسبقًا، والذي يحتوي على 0.525U/ تمت إضافة مل GR بعد ذلك. تمت مراقبة تغيرات الامتصاصية عند 412 نانومتر طيفيًا لمدة 5 دقائق. تم تقدير تركيزات GSH وGSSG من منحنيات المعايرة باستخدام GSH وGSSG [المذاب في 3% (وزن/حجم) SSA] كمعايير وتم التعبير عنها كبروتين nmol/mg. تم تقدير مستويات GSH عن طريق طرح ضعف كمية GSSG من إجمالي GSH.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

قياس محتوى الميتوكوندريا Ca2+.

تم قياس محتوى الميتوكوندريا Ca{{0}} باستخدام مسبار مضان حساس Ca2+-، Fluo-5N AM ester (مجسات جزيئية، يوجين، OR) باستخدام عداد Victor2 متعدد الملصقات (النموذج 1420؛ بيركين إلمر، توركو، فنلندا)، كما هو موضح في Menze et al. (2005). تم تحديد ثوابت تفكك Ca2+ (قيم Kd) باستخدام مجموعة معايرة Ca2+ الصالحة في نطاق التركيز 1–1000 ميكرومتر؛ كانت قيم Kd المقدرة 90-100 ميكرومتر، مع موثوقية عالية، وفقًا لبيانات الشركة المصنعة للمجموعة. تم خلط قسامة (25 ميكرولتر) من جزء الميتوكوندريا (0.5 ملغ من البروتين / مل التركيز النهائي) مع 25 ميكرولتر من محلول الحضانة {100 ملم كلوريد الكربون و 30 ملم MOPS [3- (N-morpholino) حمض البروبانيسولفونيك]؛ الرقم الهيدروجيني 7.2} في 96-لوحة ميكروتيتر سوداء جيدًا. تم تحضين الخليط عند 25 درجة لمدة 15 دقيقة؛ تمت بعد ذلك إضافة 25 ميكرولتر من الديجيتونين (50 ميكروغرام/مل) و25 ميكرولتر من Fluo-5N AM ester (1 ميكرومتر في 0.005% (وزن/حجم) Pluronic F-127). من خلال تسهيل تخلل الغشاء، توسط الديجيتونين في دخول الميتوكوندريا لصبغة الفلورسنت. لقد وجدنا أن مستويات Fluo-5N في مستحضرات الميتوكوندريا في قلب الفئران زادت بمقدار 20- أضعاف في وجود الديجيتونين. تم تحضين مخاليط التفاعل عند 25 درجة لمدة 30 دقيقة، وتم قياس قراءات التألق عند طول موجة إثارة قدره 488 نانومتر وطول موجة انبعاث قدره 532 نانومتر. تم تقدير محتويات الميتوكوندريا Ca 2+ باستخدام منحنى المعايرة وتم التعبير عنها كبروتين ميكرومول / ملغ.

قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا

تم تقييم إمكانات الغشاء (ΔΨm) بطريقة معدلة من طريقة Bonavita et al. (2003)، باستخدام صبغة الفلورسنت، المسبار الكاتيوني المُحب للدهون 5,596،69- رباعي كلورو-1,193،39-يوديد رباعي إيثيل بنزيميدازوليل كاربوكيانين، يُطلق عليه عادةً JC-1. تم تحضين قسامات (50 ميكرولتر) من كسور الميتوكوندريا (المعدلة إلى 1 ملغ بروتين / مل) عند 37 درجة مع 50 ميكرولتر من محلول الركيزة (يحتوي على 6 مم بيروفات و 6 مم مالات)، 25 ميكرولتر من محلول ثنائي فوسفات الأدينوزين (ADP) (30 مم) المعالج مسبقًا، و 25 ميكرولتر من 3 ميكرومتر JC -1، في الظلام. تم الحصول على قيم ميكرومتر عن طريق قياس التألق عند 535 نانومتر (FL1) مقابل 580 نانومتر (FL2)، باستخدام عداد Victor2 MultiLabel. يشكل JC -1 مجاميع في الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى ارتفاع قيم مضان FL2 ويشير إلى إمكانات الميتوكوندريا الطبيعية. يؤدي فقدان ΔΨm إلى انخفاض في مضان FL2 (مجاميع JC -1 إلى حد أقل) وزيادة مصاحبة في مضان FL1 (من مونومرات JC -1). تم التعبير عن البيانات كنسب لقيم مضان FL1 / FL2. تم استخدام كاربونيل سيانيد م-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP)، وهو عامل انهيار ميكرومتر، للتحقق من صحة الاختبار.

قياس التنفس الميتوكوندريا

تم قياس معدل تنفس الميتوكوندريا عند 37 درجة باستخدام أداة Hansatech Oxygraph-Plus المجهزة بقطب أكسجين من نوع كلارك (ساراسوتا، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعليق كسور الميتوكوندريا (0.6 ملغ من البروتين / مل) في المخزن المؤقت للتنفس الذي يحتوي على 125 ملي مول كلوريد الكربون، 2 0 ملي مولار MOPS، 10 ملي مولار تريس، 0.5 ملي مولار من حمض الإيثيلين جلايكول رباعي أسيتيك (EGTA)، و2 ملي مولار KH2 PO4؛ الرقم الهيدروجيني 7.2. بعد الحضانة عند 37 درجة لمدة دقيقتين، تلقت كل عينة 50 ميكرولتر من محلول الركيزة (5 مم بيروفات و5 مم مالات). تم قياس معدلات التنفس في وجود (الحالة 3) من 1 مم ADP وبعد الفسفرة لجميع ADP إلى ATP (الحالة 4). نسبة الحالة 3: معدلات التنفس الحالة 4 هي مؤشر التحكم في الجهاز التنفسي، الذي يشير إلى ضيق الاقتران بين التنفس والتفسفر (Javadov et al.، 2005؛ Kuwabara et al.، 1997). قبل إضافة محلول الركيزة، تم قياس معدل التنفس للحالة 1 حتى بدء التنفس للحالة 2، وتم تقدير معدل التنفس للحالة 2 قبل إضافة ADP.

تحليل احصائي

تم تحليل البيانات عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لإجراء مقارنات جماعية متعددة. تم استخدام قيم الفرق الأقل أهمية (LSD) لتحديد الاختلافات المهمة بين المجموعتين عندما كانت قيم p <0.05.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

نتائج

كما هو مبين في الشكلين 1 و2، المعالجة بالميثانولمستخلص هربا سيستانش({{0}}.5 أو 1.0 جم/كجم/يوم × 3) عزز بشكل كبير حالة الجلوتاثيون بالميتوكوندريا في قلوب الفئران، كما يتضح من الزيادات المعتمدة على الجرعة في مستويات هرمون GSH (11-30٪) وانخفاض في مستويات GSSG (31٪).

أدى علاج Herba Cistanche إلى انخفاض مستويات الميتوكوندريا Ca 2+ في قلوب الفئران مقارنةً بالضوابط؛ كان القمع 41٪ بجرعة 1.0 جم / كجم (الشكل 3).

أدى علاج Herba Cistanche إلى زيادة ميكرومتر الميتوكوندريا، كما يتضح من انخفاض (14-16٪) في نسبة FL1 / FL2. تسبب CCCP (100 ميكرومتر) في انهيار ميكرومتر، كما يتبين من زيادة نسبة FL1/FL2 (الشكل 4).

علاج هربا سيستانشتعزيز التنفس الميتوكوندريا، كما يتضح من معدل أعلى بكثير من التنفس الدولة 3 (84٪) في حيوانات الاختبار مقارنة مع الضوابط (الجدول 1). تمت زيادة مستويات التنفس للحالة 2 والحالة 4 بنسبة 47 و80%، على التوالي، ولكن تم قمع تحفيز التنفس للحالة 4 تمامًا بواسطة 1 ملم جوانوسين -5' - ثنائي الفوسفات، وهو مثبط لبروتين فك الارتباط 2/3. لم يؤثر علاج Herba Cistanche على مؤشر التحكم في الجهاز التنفسي، كما تم تقديره بنسبة معدلات التنفس في الحالة 3/الحالة 4.

مناقشة

أظهرت الميتوكوندريا المعزولة من قلوب الفئران المعالجة بـ Herba Cistanche حالة الجلوتاثيون المحسنة، كما يتضح من زيادة مستويات GSH وانخفاض مستويات GSSG. يعد الحفاظ على حالة الأكسدة والاختزال الجلوتاثيون في الميتوكوندريا أمرًا بالغ الأهمية لحماية القلب من إصابة I / R (Chiu & Ko، 20}03). يزداد محتوى Cytosolic Ca2+ أثناء نقص تروية عضلة القلب، عن طريق امتصاص الغشاء الداخلي Ca2+ uniporter (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990)، مما يؤدي إلى الميتوكوندريا Ca{{6} } تراكم. تشير نتائجنا إلى أن العلاج بمستخلص Herba Cistanche يعزز حالة الأكسدة والاختزال الجلوتاثيون في الميتوكوندريا ويقلل مستوى الميتوكوندريا Ca 2+، مما قد يوفر الحماية ضد إصابة عضلة القلب I / R (Leung، 2006). قد يكون عدم قدرة العلاج بـ Herba Cistanche، بجرعة أعلى تبلغ 1.0 جم/كجم، على تقليل مستويات GSSG وCa2+ بشكل أكبر، مرتبطًا بوجود آلية تنظيمية ذاتية التحديد تؤثر على إمكانية الأكسدة والاختزال في الجلوتاثيون وحالة الكالسيوم. في الميتوكوندريا.

تقوم الميتوكوندريا بتوليد تدرج بروتوني كهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي، عن طريق نقل الإلكترون. يتم استخدام هذا التدرج بواسطة سينسيز ATP لفوسفوريلات ADP إلى ATP. يؤدي انخفاض إمكانات غشاء الميتوكوندريا، كما هو الحال في نقص الأكسجة / إعادة الأكسدة بعد إصابة الخلايا العضلية القلبية المستنبتة (تشيو وآخرون، 2008)، إلى انخفاض في توليد ATP. علاج Herba Cistanche، والذي قد يزيد من إمكانات غشاء الميتوكوندريا في عضلة القلب، ربما يعزز توليد ATP، خاصة أثناء ضخه بعد نقص التروية. مرة أخرى، قد يفسر وجود آلية تنظيمية ذاتية التحديد سبب عدم اعتماد تأثيرات علاج Herba Cistanche على إمكانات غشاء الميتوكوندريا على الجرعة.

أدى علاج Herba Cistanche إلى زيادة كبيرة في معدل التنفس 3 في ميتوكوندريا قلب الفئران، وفقًا لتقييم استهلاك الأكسجين. تتوافق هذه النتيجة مع النتائج التي تم الحصول عليها من القياسات المختبرية والموقعية لقدرة توليد ATP بالميتوكوندريا (Leung & Ko، 2008). ومن المثير للاهتمام أنه على الرغم من أن علاج Herba Cistanche قلل من مستوى الحالة المستقرة لـ ATP في عضلة القلب (البيانات غير معروضة)، إلا أن العلاج عزز توليد ATP في الميتوكوندريا. قد يفسر تورط التنفس غير المنفصل هذه الملاحظات المتضاربة. يحدث الفسفرة التأكسدية غير المنفصلة عندما يتم نقل البروتونات عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا، وبالتالي تبديد إمكانات الغشاء التي تشكلها سلسلة نقل الإلكترون. وينتج عن هذا انخفاض في القوة الدافعة للبروتون التي تحرك تكوين ATP (Garvey، 2003). ونتيجة لذلك، فإن تركيز Ca2+ وإنتاج ROS في الميتوكوندريا يضعف بشكل كبير (Teشيما وآخرون، 2003). يتوافق هذا الاقتراح مع نتائج الدراسة الحالية، والتي أظهرت انخفاضًا في مستويات الميتوكوندريا Ca2+ في القلوب المعالجة بـ Herba Cistanche. فيما يتعلق بالتنفس غير المنفصل، قد يتم تحفيز تخليق البروتينات المنفصلة (UCPs) عن طريق العلاج بـ Herba Cistanche. من المعروف أن UCPs تفصل الفسفرة التأكسدية والتعبير عن UCP1 في قلوب الفئران المعدلة وراثيا المحمية ضد تلف عضلة القلب الناجم عن I / R (Hoerter et al.، 2004). تم تثبيط تأثير فك الارتباط من UCPs بواسطة ثنائي فوسفات النوكليوتيدات البيورين وثلاثي الفوسفات (مثل ADP و ATP وثنائي فوسفات الجوانوزين (GDP) و GTP) (Echtay et al.، 2002). في هذه الدراسة، تم قياس معلمات الميتوكوندريا مثل إمكانات الغشاء ومعدل التنفس في وجود ADP (كركيزة)؛ وبالتالي تم منع تأثير فك الارتباط من UCPs. ومع ذلك، عندما تم قياس معدل التنفس لحالة الميتوكوندريا 4 في غياب ADP، كان هذا المعدل أعلى في الميتوكوندريا المحضرة من القلوب المعالجة بـ Herba Cistanche مقارنة بقلوب الضوابط غير المعالجة. يعكس معدل التنفس للحالة 4 استهلاك الميتوكوندريا للأكسجين عندما تتسرب البروتونات مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا عبر آلية لا تتضمن F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003). يتم دعم التورط المحتمل لـ UCPs في الزيادة التي يسببها Herba Cistanche في تنفس الحالة 4 من خلال اكتشاف أن هذا التعزيز تم قمعه بواسطة الناتج المحلي الإجمالي (Bento et al.، 2007).

في الختام، العلاج باستخدام Herba Cistanche قد يعزز حالة الجلوتاثيون في الميتوكوندريا، ويقلل من مستوى الكالسيوم في الميتوكوندريا 2+، ويزيد من إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومعدل التنفس في قلوب الفئران. قد يكون تعزيز حالة الجلوتاثيون في الميتوكوندريا والقدرة الوظيفية، والتحريض المفترض لـ UCPs، مرتبطًا بالحماية القلبية التي يوفرهاعلاج هربا سيستانشبعد إصابة I/R.

مستخلص نبات السيستانش توبولوسا الطبيعي PHGS75% ECH 30% ACT 12%