يتم التعبير عن HLA-G على نطاق واسع بواسطة الخلايا البدينة في مناطق تليف الأعضاء في الكبد والرئة والكلى

edmund.chen@wecistanche.com

الملخص:لقد أثبتنا سابقًا أن الخلايا البدينة التي تعبر عن HLA-G ترتبط بمناطق التهاب الكبد الوبائي سيكبدالتليف. هنا ، نهدف إلى تحديد ما إذا كان تعبير HLA-G في الخلايا البدينة محددًا للمسببات الفيروسية ،كبد، أو لعملية التليف العام. عددنا خلايا HLA-G plus والخلايا البدينة بواسطة الكيمياء المناعية لـ (i)كبدكتل من 41 حالة من حالات تليف الكبد الكحولي ، (2) 10 حالات من التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، و (3) 10 من ريناlالتليف. تم تحديد طبيعة خلايا HLA-G plus عن طريق التألق المناعي المتعدد باستخدام البرنامج. كان أكثر من نصف جميع خلايا HLA-G plus عبارة عن خلايا سارية في مناطق متليفية من تليف الكبد الكحولي و IPF. في الالكلى,تعرضت خلايا HLA-G plus للتليف الكيسي ، وكانت في الواقع خلايا سارية ولكن لا يمكن عدها. علاوة على ذلك ، في حالات معينة منكبدوالرئة ، لاحظنا عددًا من العقد الخلوية ، والتي كانت عبارة عن بصيلات ثانوية أو من الدرجة الثالثة ، حيث تم التعبير عن HLA-G بشكل كبير بواسطة الخلايا الليمفاوية البائية. في الختام ، يمكن ملاحظة الخلايا البدينة HLA-G plus في المناطق الليفية لجميع الأعضاء المدروسة. تشير الدراسات السابقة إلى دور وقائي للخلايا البدينة HLA-G plus ضد الالتهاب والتليف. قد تعزز البصيلات التي تمت ملاحظتها مع الخلايا الليمفاوية B التي تعبر عن HLA-G دورها المضاد للتليف.

الكلمات الدالة:تليف؛ HLA-G ؛ الخلايا البدينة؛ بصيلات؛ الخلايا الليمفاوية ب مضاد التليف. الكلى؛ كبد

مقدمةترتبط الأمراض المزمنة التي تؤدي إلى الإصابة بالتليف العضوي بالوفيات والمراضة بشكل كبير ، حيث تمثل ما يصل إلى 45 في المائة من الوفيات في البلدان المتقدمة [1]. انتشار الأمراض التليفية يتزايد باطراد وهو مشكلة صحية عامة مهمة. يمكن أن تصيب الأمراض التليفية جميع الأعضاء ، مثلكبد, الكلىوالرئتين والقلب. يتميز التليف الباثولوجي المرضي بالترسيب المبالغ فيه لمكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، مثل الكولاجين. يؤدي تراكم ECM هذا إلى تدمير البنية الطبيعية للعضو ويؤدي إلى اختلال وظيفي بالأعضاء وفشل مع تغيير الوظائف المتخصصة لكل عضو ، أي بالنسبة لـكبد، وظيفة إزالة السموم ، للرئة ، وظيفة تبادل الغازات ، والكلى،وظيفة التصفية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يعزز التليف الكيسي تطور السرطان. غالبًا ما يمثل الزرع لاستبدال العضو الليفي أفضل خيار علاجي. تحدث عملية التليف الكيسي استجابة لإصابة أو تلف الأنسجة بعد استجابة التهابية مستمرة أو قوية للغاية. يمكن أن يتطور التليف ، الذي يكون قابلاً للعكس في البداية ، إلى حالة لا رجعة فيها [2]. الكبديمكن أن يصاب بالفيروسات (التهاب الكبد B ، C ، D ، E) ، والسموم الفطرية ، والطفيليات ، والأجسام المضادة الذاتية ، والنظام الغذائي الغني بالدهون ، والإفراط في استهلاك الكحول ، وهو من المسببات المتكررة لـكبدفيبروزيس [3] وحتى السبب السائد في بعض البلدان. عندما تتكرر الإهاناتكبديُصاب بالتهاب الكبد المزمن المصحوب بالتليف الكبدي متبوعًا بالتليف الكبدي المتقدم أو تليف الكبد ، وهي حالة مهيئة لسرطان الخلايا الكبدية (HCC).

في الرئة ، يمثل التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) أكثر الأمراض شيوعًا التي تشمل فرط الحساسية التليفية والرئة الروماتيزمية. هذا المرض الرئوي الخلالي المزمن المتفاقم المزمن مجهول المنشأ نادر الحدوث ، ويؤثر على ثلاثة ملايين شخص في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك ، يرتبط IPF بالموت المبكر. في الواقع ، يؤدي IPF إلى فشل تنفسي متقدم ويمثل أيضًا عامل خطر مستقل لسرطان الرئة [4]. يجب اعتبار زرع الرئة كخيار للمرضى الشباب المصابين بمرض متقدم.

كلويفيبروزيس هو المسار المشترك الخامس للعديد من التقدميأمراض الكلى.الاصابة المزمنةمرض كلوي، مما يؤدي إلى نهاية المرحلةامراض الكلى، بشكل ملحوظ ، مما أثر على 10 في المائة من سكان العالم ، مع ارتفاع معدل الوفيات [5]. بالإضافة إلى المرضى المزمنينمرض كلويلديهم خطر متزايد من التطورالكلىالسرطان (حتى 10 أضعاف مثيله لدى عامة السكان) ، مع حدوث أضرار ثنائية و / أو متعددة البؤر بشكل متكرر [6].

بغض النظر عن العضو الذي يصاب بالتليف الكيسي ، من المهم فهم الآليات التي ينطوي عليها ظهوره لتطوير علاجات للوقاية منه. على وجه الخصوص ، يؤدي الالتهاب المزمن إلىكبدأوكلويالتليف ، والسيطرة عليه قد يجعل من الممكن الحد من تقدمه وظهور فشل العضو أو السرطان. تلعب السيتوكينات والكيموكينات دورًا مركزيًا في توجيه الاستجابة المناعية والحفاظ على الالتهاب [7،8]. بالإضافة إلى هذه الجزيئات المناعية ، تم فحص البروتينات الأخرى ، مثل HLA-G ، وهو جزيء من فئة Ib HLA معروف جيدًا بخصائصه المناعية ، [9]. لقد أوضحنا سابقًا أن HLA-G يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا البدينة المرتبطة بمنطقة التهاب الكبد C الناجم عن فيروس التهاب الكبد الوبائي.كبدفيبروزيس [10،11]. في هذه الدراسة ، حققنا فيما إذا كان تعبير HLA-G في الخلايا البدينة محددًا للمسببات الفيروسية ،كبد، أو عملية التليف ، بغض النظر عن العضو. قمنا بتمييز تعبير HLA-G في الخلايا البدينة والخلايا المناعية على كتل البارافين لمجموعات من 41 مريضًا يعانون من تليف الكبد الناجم عن الكحول ، و 10 مع IPF ، و 10 مرضى معكلويالتليف. تم إجراء تحديد دقيق للخلايا التي تعبر عن HLA-G باستخدام تألق مناعي رباعي على أقسام البارافين والبرمجيات التي تحلل الفلورة بشكل منفصل وتدمجها في ثلاث حالات منكبدالتليف الناجم عن الكحول واثنان من IPF.

نتائج

التعبير الكمي وطبيعة خلايا HLA-G plus في التليف الناجم عن الكحولتم إجراء دراسة أولية للكيمياء المناعية على سلسلة من عينات فيبروسيس التي يسببها الكحول (ن=41) ، مما يسمح بتعداد خلايا HLA-G plus و CD117 plus عبر الشرائح بأكملها عن طريق التعداد شبه التلقائي باستخدام برنامج HALO. تم تلخيص النتائج في الجدول 1.

تم حساب خلايا HLA-G plus و CD117 plus على كامل سطح الشرائح التسلسلية لـ 41 حالة من تليف الكبد الكحولي باستخدام برنامج HALO مع الخوارزمية المناسبة بعد الكيمياء المناعية مع 4H84 ، والتي تتعرف على HLA-G ، و anti-CD117 / c-kit. يشار إلى المتوسط ​​والانحراف المعياري والنطاق لخلايا HLA-G plus و CD117 plus: 555 ± 699 HLA-G plus / (41-2686) و 200 ± 271 CD 117 plus الخلايا (12-1113).

تتوافق السمات المورفولوجية لخلايا HLA-G plus في طبوغرافيا تليف الكبد الناجم عن الكحول مع الخلايا البدينة (الشكل 1A). في بعض الحالات ، تم إجراء وضع العلامات المزدوجة لـ CD117 والخلايا البدينة البشرية وأظهر أن الخلايا الكبدية CD117 plus هي خلايا سارية في المنطقة التليفية (الشكل 1 أ). تمت دراسة ثلاث حالات تمثيلية لتليف الكبد الناجم عن الكحول بواسطة التألق المناعي الرباعي وتلطيخ سيريوس الأحمر باستخدام برنامج HALO لتحديد خلايا HLA-G plus بدقة. متوسط ​​مساحة الفيفيبروز يتوافق مع 19.4 في المئة منكبدالانسجة. أظهر تحديد خلايا HLA-G بالإضافة إلى 51 في المائة أنها خلايا سارية (الجدول 2 ؛ الشكل 1 أ ، 1 ب 1) التي تم تحديدها بواسطة تريبتاز الخلايا البدينة البشرية بالإضافة إلى النمط الظاهري CD1177 أو تريبتاز الخلايا البدينة البشرية بالإضافة إلى تلطيخ مشترك لـ CD117. كانت الخلايا البدينة التي تعبر عن HLA-G موجودة في المناطق الليفية (الشكل 1B1). على العكس من ذلك ، لم تكن 49 بالمائة من خلايا HLA-G plus خلايا سارية ولا خلايا CD117 plus (الجدول 3) ويبدو أنها مجمعة معًا كعقد (الشكل 1B2). وهكذا ، تم تنفيذ علامات أخرى على مناطق مختلفة لتحديد هذه الخلايا (الجدول 4). اختلفت إعادة تقسيم الأنواع المختلفة لخلايا HLA-G plus اعتمادًا على مساحةكبدفحص الأنسجة (الجدولان 3 و 4). بشكل عام ، يبدو أن 63 في المائة من خلايا HLA-G plus في منطقة التليف الكيسي هي خلايا سارية مقابل 3 في المائة فقط في العقد. بالإضافة إلى ذلك ، شارك 68 بالمائة من خلايا HLA-G plus في العقد CD20 في التعبير المشترك ، وعلامة الخلايا الليمفاوية B (الشكل 1C1) ، و 3 بالمائة CD3 (الشكل 1C2). HLA-G plus CD117 الخلية البدينة tryptase HLA-G plus CD117 HLA-G plus CD117 الخلية الصارية tryptase plus ، و HLA-G plus CD117 plus الخلايا البدينة tryptase plus تم حسابها في ثلاث حالات تمثيلية منكبدfifibrosis باستخدام برنامج HALO مع الخوارزمية المناسبة. تم عد الخلايا في منطقتين مختلفتين من عينة التشمع الكحولي ، أي المنطقة الليفية والعقدة الخلوية ، في حالة تمثيلية لـكبدfifibrosis باستخدام برنامج HALO مع الخوارزمية المناسبة. لا توجد خلايا HLA-G plus تشارك في التعبير عن CD31 ، وهي علامة على الخلايا البطانية أو CD1a ، وهي علامة للخلايا المتغصنة.

الشكل 1. طبيعة خلايا HLA-G في حالة تمثيليةكبدالتليف. (أ) في الفقرة الأولى ، تُظهر الصورتان الموجودتان على اليسار تعبير HLA-G و CD117 في حالة تمثيلية لـكبدمن أصل 41 حالة باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية ، يتعرف 4H84 على الجسم المضاد HLA-G و CD117 الذي يتعرف على خلايا المجموعة c. تم مقاومة الشرائح بواسطة ماير الهيماتوكسيلين. يمتد التليف محاطة بخط أحمر. تتطابق المناطق الموجودة في الدوائر طبوغرافيًا مع شرائح HLA-G و CD117 الملطخة. يُظهر المستطيل تكبيرًا قويًا لهذه المناطق مما يشير إلى أن خليتي HLA-G تتطابقان مع خليتي CD117. علاوة على ذلك ، لديهم مورفولوجيا متوافقة مع الخلية البدينة. تُظهر الصورة في flfluorescence مزدوج (CD117 / Mast cell tryptase) مع الصور الثلاث الموجودة على اليمين المقابلة للتألق البسيط (DAPI تلوين النواة باللون الأزرق ، CD117 باللون الأخضر ، تريبتاز الخلية البدينة باللون الأحمر) تظهر غالبية الخلايا ذات التسمية المشتركة باللون الأصفر. خلايا CD117 عبارة عن خلايا سارية إلى حد كبير. (ب) المناعي الرباعي في حالة تمثيليةكبدfifibrosis (من أصل ثلاثة) باستخدام DAPI مع نوى أزرق ، HLA-G (مع جسم مضاد 4H84) بلون أخضر زائف ، CD117 باللون السماوي الزائف ، تريبتاز الخلية البدينة باللون الأحمر الزائف ، والصورة المركبة أو الدمج. على اليمين ، يتم تمثيل تلطيخ سيريوس الأحمر. 1 و 2 يقابلان منطقتين مختلفتين منكبد،يمتد التليف الفسوي وعقدة الخلية على التوالي. تشترك غالبية خلايا HLA-G في CD117 وتريبتاز الخلية البدينة في التليف (1). في المقابل ، فإن غالبية خلايا HLA-G لا تشارك في التعبير عن الخلايا البدينة ، باستثناء بعض خلايا HLA-G في محيط عقدة الخلية (2) ، بالقرب من أو في التليف. (ج) المناعي الرباعي على خلايا العقدةكبدتظهر لعبة fifibrosis في B2 ، مع DAPI ، و HLA-G باللون الأخضر الزائف ، أو CD20 باللون الوردي الفوشيا ، أو CD3 باللون السماوي الزائف ، على التوالي ، في 1 و 2. مطابقة تلوين Sirius Red على اليمين. يُظهر المربع منطقة طبوغرافية محدودة تحتوي على خلايا إيجابية HLA-G والخلايا المقابلة في تلك المنطقة. تُظهر الصورة المركبة العلامة الوردية المشتركة لـ HLA-G و CD20. لم يلاحظ أي تلطيخ مشترك بين HLA-G باللون الأخضر الزائف و CD3 مع اللون السماوي الزائف.

تم تحديد العدد المطلق لخلايا HLA-G plus و CD3 plus (T lymphocytes) و CD20 plus (B lymphocytes) وخلايا tryptase plus (الخلايا البدينة) للخلايا البدينة باستخدام برنامج HALO مع الخوارزمية المناسبة في حالة تمثيلية واحدة ويتم التعبير عنها لكل مم 2.

تحليل خلايا HLA-G plus في IPFفي الدراسة الخامسة التي تم إجراؤها على سلسلة IPF (n=10) بواسطة الكيمياء المناعية ، كما هو موضح سابقًا ، قدرنا عدد خلايا HLA-G plus لتكون 135 ± 62 / مم 2 وعدد خلايا CD117 plus لتكون 227 ± 134 / مم 2 (الجدول 5). لم تتطابق خلايا HLA-G plus مع خلايا CD117 plus في التليف الرئوي (الشكل 2A). أظهر تحليل HALO للتألق المناعي الرباعي وتلطيخ سيريوس الأحمر أن طبيعة خلايا HLA-G تختلف اعتمادًا على المنطقة النسيجية للرئة (الجدول 6). في الواقع ، كانت 63 بالمائة من خلايا HLA-G plus في المناطق الليفية الفُسرية عبارة عن خلايا سارية (B1 ، C1) ، بينما كانت تتألف فقط من 7 بالمائة من خلايا HLA-G plus في العقد (B2 ، C2). معظم خلايا HLA-G plus في العقد التي تم التعبير عنها بشكل مشترك CD20 (الشكل 2B).

الشكل 2. طبيعة خلايا HLA-G في حالة تمثيلية لـ IPF. (أ) في الفقرة الأولى ، تُظهر الصورة على اليسار تلوين أحمر سيريوس لحالة تمثيلية واحدة من أصل عشرة IPF ، تُظهر الصورة الوسطى الصبغة المضادة بواسطة ماير الهيماتوكسيلين باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية. تتطابق المناطق الموجودة في الدوائر طوبوغرافيًا على شرائح HLA-G و CD117 الملطخة مع 4H84 يتعرف على الجسم المضاد HLA-G و CD117 الذي يتعرف على خلايا المجموعة c. تُظهر المستطيلات تكبيرًا قويًا لهذه المناطق ، مما يشير إلى أن خلايا HLA-G لا تتطابق مع خلايا CD117. (ب) المناعي الرباعي في حالة تمثيليةكبدفيبروسيس من اثنين باستخدام DAPI مع نوى أزرق ، HLA-G (مع جسم مضاد 4H84) بلون أخضر زائف ، CD117 باللون السماوي الزائف ، تريبتاز الخلية البدينة باللون الأحمر الزائف ، والصورة المركبة أو الدمج. على اليمين ، يظهر Sirius Red ؛ 1 و 2 متطابقتان مع منطقتين مختلفتين من الرئة ، على التوالي امتداد التليف وعقدة الخلية. (C) تألق مناعي خماسي مع DAPI ، HLA-G بلون أخضر زائف ، tryptase بلون أحمر زائف ، CD3 بلون زائف سماوي ، CD20 مع لون زائف وردي ضارب إلى الحمرة ، على نفس حالة IPF الموضحة في (B) . (C1) يقابل منطقة (B1). في (C1) ، تتوافق غالبية خلايا HLA-G مع الخلايا البدينة في منطقة التليف ، بينما الخلايا البدينة النادرة جدًا هي HLA-G في العقدة الموضحة في (C2). غالبية خلايا العقدة هي CD20. أظهر تحليل HALO أن معظم خلايا HLA-G plus هي خلايا ليمفاوية ب.

تم حساب خلايا HLA-G plus و CD117 plus للحالات العشر باستخدام برنامج HALO مع الخوارزمية المناسبة ، بعد الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يشار إلى المتوسط ​​والانحراف المعياري والمدى.

تحليل خلايا HLA-G plus في التليف الكلويفي دراسة سلسلة من 10 حالاتكلويفيبروسيس بواسطة الكيمياء المناعية ، وجدنا 133 ± 102 خلايا HLA-G plus / مم 2 و 426 ± 207 CD117 بالإضافة إلى خلايا / مم 2 (الجدول 7). لم يكن هناك تطابق بين خلايا HLA-G plus و CD117 plus (الشكل 3A).

الشكل 3. طبيعة خلايا HLA-G في حالة تمثيليةكلويتليف. (أ) في الفقرة الأولى ، تُظهر الصورة الموجودة على اليسار تلوين سيريوس الأحمر ، وتُظهر الصورة الوسطى الصبغة المضادة بواسطة ماير الهيماتوكسيلين باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية. تتوافق المناطق الموجودة في الدوائر طبوغرافيًا مع شرائح HLA-G و CD117 الملطخة ، مع التعرف على 4H84 على خلايا HLA-G و CD117 للتعرف على خلايا مجموعة c. الأسهم الحمراء خلايا إيجابية. تُظهر المستطيلات تكبيرًا قويًا لهذه المناطق مما يشير إلى أن خلايا HLA-G لا تتطابق مع خلايا CD117. (ب) التألق المناعي الرباعي في حالة تمثيلية لـكبدالتليف باستخدام DAPI مع نوى الأزرق ، HLA-G (مع الجسم المضاد 4H84) مع اللون الأخضر الزائف ، CD117 باللون السماوي الزائف ، تريبتاز الخلية البدينة باللون الأحمر الزائف ، والصورة المركبة أو الدمج. على اليمين ، يتم تمثيل Sirius Red. تتوافق الخلايا المصبوغة باللون الأصفر عند الدمج مع الخلايا البدينة HLA-G plus. (C) تتوافق المناطق الملطخة باللون السماوي مع العديد من الأنابيب التي تعبر فقط عن CD117. تتوافق الخلايا المصبوغة باللون الأصفر عند الدمج مع الخلايا البدينة HLA-G plus.

تم حساب خلايا HLA-G plus و CD117 plus لـ 10 حالاتكلويفيبروسيس باستخدام برنامج HALO مع الخوارزمية المناسبة ، بعد الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يشار إلى المتوسط ​​والانحراف المعياري والنطاق لخلايا HLA-G plus و CD117 plus. أظهر وضع العلامات الرباعي باستخدام برنامج HALO المقترن بتحليل Sirius Red وتحليل التشكل عدم تجانس كبير في وضع العلامات على قسم منالكلىوفقًا ليس فقط للمنطقة التشريحية ولكن أيضًا داخل نفس الحجرة التشريحية (الشكل 3 ب ، ج). وبالتالي ، فإن تعداد وحساب النسبة المئوية لخلايا HLA-G plus لم تكن ذات صلة في هذا العضو. في الواقع ، أظهر الفحص المجهري وصمة عار قوية لمحيط الأنابيب مع CD117 التي لم تشارك مع تلك الخلايا البدينة (الشكل 3C). خلايا HLA-G plus هي خلايا سارية وتقع في الخلالي الالتهابي (الشكل 3 ب ، ج).

مناقشةتم إظهار التعبير عن بروتينات HLA-G لأول مرة في الأرومة الغاذية الخلوية في واجهة الأم والجنين [12]. في ظل الظروف القاعدية ، يقتصر تعبيره إلى حد كبير على أنسجة معينة ، مثل القرنية [13] ، والغدة الصعترية [14] ، وجزر البنكرياس [15]. ومع ذلك ، فإن أنواعًا معينة من الخلايا قادرة أيضًا على التعبير عنها ، مثل الخلايا الظهارية القصبية [16] ، وخلايا اللحمة المتوسطة [17] ، وخلايا النسب الأحادية [18-20] ، والسلائف الكريات الحمر والبطانية [21] ، في ظروف خاصة . لقد أثبتنا سابقًا أن الخلايا البدينة يمكنها التعبير عن HLA-G في الحالة القاعدية ، مع زيادة التعبير في بيئات معينة غنية بالسيتوكين ، على وجه الخصوص ،أنسجة الكبد.لقد درسنا ما إذا كان يمكن التعبير عن HLA-G بواسطة الخلايا البدينة المرتبطة بـكبدالتليف من مسببات أخرى أو التليف الكيسي في عضو آخر من خلال دراسة 41 حالة من حالات الكحول المحرضكبدتليف الكبد ، 10 من IPF ، و 10 منكلويالتليف.

يمكن للعدوى ، والإصابات السامة والاستقلابية ، والأمراض الالتهابية مجهولة السبب أن تؤدي إلى تطور التليف الكيسي لأن الإصابة المزمنة تحفز موت الخلايا المبرمج للخلايا المتنيّة التي تطلق السيتوكينات التليفية والتهابات مثل TGF-. تتمايز الخلايا المنتجة للكولاجين عن خلايا اللحمة المتوسطة استجابة للإصابة. الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة هو ظاهرة الانغماس في نقل الخلايا التي يتم ملاحظتها في الخلايا الصفراوية فيكبد، والخلايا الرئوية في الرئة ، والخلايا الظهارية الأنبوبية فيالكلى[22]. تؤدي الخلايا المبرمجية إلى زيادة تركيز TGF- في جميع الأعضاء. ومع ذلك ، يمكن تمييز السمات المحددة للتليف الليفي في الأعضاء المختلفة. في الكبد،يتعلق موت الخلايا المبرمج بالخلايا الكبدية ، بينما يؤثر على الخلايا الظهارية في الرئة والكلى[22]. وهكذا ، فإن الخلايا الليفية المقيمة فيالكلىوتنشيط الرئة إلى الأرومة الليفية العضلية التي تعبر عن a-SMA ، الكولاجين 1 ، بينماكبدالأرومة الليفية العضلية تحتفظ بالعلامات العصبية الخاصة بها [23].

في الكبد،تساهم الخلايا النجمية الكبدية بأكثر من 80 في المائة من جميع الخلايا المنتجة للكولاجين. في الرئتين ، يرتبط تلف الخلايا الرئوية باستماتة الخلايا البطانية. دور الالتهاب في IPF مثير للجدل. لا يُظهر IPF النموذجي تدفقًا للخلايا الالتهابية ، لكن بعض المؤلفين يقترحون دورًا للالتهاب في تمايز الأرومات الليفية الرئوية إلى الأرومات الليفية العضلية المنتجة لـ ECM [24]. الآفات الظهارية السنخية المتكررة لمسببات غير معروفة وموت الخلايا المبرمج الظهاري السنخي متورطة في IPF [25]. في الالكلىوكبد،يتم تجنيد الخلايا النخاعية من نخاع العظام وتمثل على التوالي 14 إلى 15 في المائة و 8 إلى 12 في المائة من الخلايا الليفية العضلية. لم يلاحظ أي انعكاس للتليف في الرئة على عكسكبدوالكلىفي حالة عدم وجود إصابة وإذا لم يتم الوصول إلى نقطة اللاعودة. في الواقع ، عمليات الالتهاب محدودة في IPF ، لا سيما في المرحلة المبكرة من المرض ، في حين أن الآفات الظهارية السنخية المتكررة من مسببات غير معروفة وموت الخلايا المبرمج السنخي الظهارية يمكن أن تعزز تكاثر وتفعيل الخلايا الليفية الرئوية أو الخلايا الليفية العضلية [25].

أما بالنسبة للكبدfifibrosis ، عملية التئام الجروح الفاشلة لـالكلىالأنسجة بعد الإصابة المزمنة والمستمرة تؤدي إلى إنتاج وإفراز السيتوكينات proinfllammatory ، وكذلك TGF- ، الذي يلعب دورًا رئيسيًا في عملية التليف. على سبيل المثال ، فيكبدفيبروزيس ، TGF- ، والذي يتم التعبير عنه كمقدار دقيق في HSC الهادئ ، يتم إنتاجه بسرعة بواسطة هذا النوع من الخلايا بعداصابة الكبد.بالإضافة إلى HSC ، تم وصف مصادر أخرى لـ TGF- بالصفائح الدموية ، والضامة ، وخلايا الكبد ، وكذلك الخلايا البدينة [26]. يتم تخزين TGF - 1 في المصفوفة بصورتها الكامنة ، وبمجرد تنشيطها ، فإنها تعزز الانتقال من الأرومة الليفية العضلية إلى الأرومة الليفية العضلية ، وهو أمر أساسي لعملية التليف العضلي. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يمنع تدهور ECM عن طريق قمع metalloproteases وتعزيز مثبط طبيعي TIMP. وبالتالي ، فإنه يحث على إنتاج ECM من خلال آليات SMAD 3- التابعة أو غير المرتبطة بـ SMAD [27]. في الواقع ، يوجد تفاعل متبادل بين الخلايا البدينة و TGF-. TGF- هو جاذب قوي للخلايا البدينة. في الواقع ، غالبًا ما ترتبط العمليات المرضية التي تتم بوساطة TGF- بتراكم الخلايا البدينة [28]. بالإضافة إلى ذلك ، تعد الخلايا البدينة أحد المصادر الأساسية لـ IL -17 التي تدفع TGF - - Fibrosis المعتمد [29]. تم الإبلاغ عن TGF- لتعزيز أو قمع وظائف الخلايا البدينة. في الواقع ، TGF- يثبط التعبير عن تقارب عالي لمستقبل IgE Fc1RI ، الذي ينشط الخلايا البدينة [30]. من ناحية أخرى ، فإنه يمنع تكاثر الخلايا البدينة ، وإزالة الحبيبات ، وإنتاج العديد من جزيئات المستجيب مثل الهيستامين و TNF- [31]. بالنظر إلى الزيادة في MC في التليف ، يمكن أن يكون تأثير TGF- على وظائف MC مهمًا في تنظيم الاستجابات الالتهابية التي تحافظ على عملية التليف.

كما هو الحال في فيروس التهاب الكبد الوبائي سيكبدفيبروسيس ، وجدنا أن نصف خلايا HLA-G plus في تليف الكبد الناجم عن الكحول هي خلايا سارية (الجدول 2) و 34 بالمائة فقط من الخلايا البدينة تعبر عن HLA-G ، مع تباين فردي مرتفع يظهره الانحراف المعياري (الجدول 1) . بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا تقسيمًا متميزًا وفقًا لمنطقةكبد،حيث كانت نسبة 63-92 بالمائة من خلايا HLA-G plus في المناطق الليفية الفُسرية من الخلايا البدينة ، بينما كانت نسبة 3 إلى 23 بالمائة فقط من الخلايا البدينة في العقد الخلوية (الجدول 3). وبالمثل ، لوحظ نمط مختلف للخلايا البدينة ، حيث أن 92 في المائة من الخلايا البدينة في المناطق الليفية الفُسرية تعبر عن HLA-G ، في حين أن 23 في المائة فقط عبرت عن HLA-G في العقد الخلوية (البيانات غير معروضة). وبالتالي ، فإن التعبير عن HLA-G لا يقتصر على المسببات الفيروسية لـكبدالتليف الكبدي. في الواقع ، حصلنا على نتيجة مماثلة للرئة. في IPF ، كانت 63 بالمائة من خلايا HLA-G plus في المناطق الليفية الفُسرية من الخلايا البدينة ، بينما كانت 7 بالمائة فقط من الخلايا الموجودة في العقد عبارة عن خلايا سارية (الجدول 6). حالاتكلويكانت الفيفيبروز خاصة. نتيجة للعدد الكبير من الأنابيب ، لم يكن من الممكن عد الخلايا بشكل صحيح في المناطق التليفية الفيمية لأن الخلايا البدينة قد اخترقت الأنابيب. يمكن إجراء المراقبة المجهرية النوعية فقط ، والتي تُظهر عددًا من خلايا HLA-G plus لتكون خلايا سارية ، دون التمكن من تمييز الأنابيب من المناطق المتليفة (الشكل 3). وبالتالي ، يبدو أن HLA-G يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا البدينة في مرض التليف الفيفي من خلال سطح الخلية والجزيئات داخل السيتوبلازم ، بغض النظر عن العضو. لقد أوضحنا سابقًا أن الخلايا البدينة البشرية في المزرعة كانت قادرة على إنتاج أشكال HLA-G قابلة للذوبان في الوسط المكيف في الحالة القاعدية وأن هذا الإفراز زاد بعد التحفيز باستخدام السيتوكينات ، بما في ذلك IL -10 [10].

النسبة الأعلى من الخلايا البدينة (أكثر من النصف) التي تعبر عن HLA-G فيكبدوالرئة يمكن تفسيرها بالمكونات الالتهابية للتليف. في الواقع ، كخلايا مناعية فطرية ، يزداد عدد الخلايا البدينة في حالات الالتهاب ، ويمكنها أيضًا إطلاق وسطاء proinfllammatory [32]. يرتفع عدد الخلايا البدينة في الأمراض التليفية. في الواقع ، تكون كثافة الخلايا البدينة أعلى في رئتي مرضى التليف الرئوي المزمن مقارنة بأولئك الذين يعانون من أمراض الرئة الأخرى [33] والرئة السليمة. وبالمثل ، الإنسانأمراض الكلىمصحوبة بزيادة في عدد الخلايا البدينة فيكلويالقشرة ، خاصة في منطقة التليف [34] ، حيث نادرًا ما تُلاحظ الخلايا البدينة في حالة صحيةالكلى.

ذكرت المنشورات السابقة أن الخلايا البدينة غائبة أو توجد بشكل ضئيل فقط في الكبد والرئتين البشرية الطبيعيةالكلى[35]. أظهر تقدم المعرفة بالخلايا البدينة أن الخلايا البدينة كخلايا مناعية فطرية يمكن ملاحظتها في جميع الأنسجة ، ولكنها أكثر وفرة في المواقع المعرضة للبيئة. علاوة على ذلك ، فإنها تعرض ذخيرة كبيرة من المستقبلات تسمح لها بالاستجابة للمنبهات والتفاعل مع الخلايا الأخرى [36].كلويتشبه الخلايا البدينة وظيفيًا تلك الموجودة في الرئة. تم الإبلاغ عن بيانات متناقضة لدور الخلايا البدينة في التليف. اقترح عدد من المؤلفين أن الخلايا البدينة متورطة في التليف الكيسي لأنها تلعب دورًا في الالتهاب الحاد والمزمن الذي يبدأ في حدوثه. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلايا البدينة قادرة على إفراز الهيستامين والهيبارين و IL -4 ، مما يعزز تكاثر الخلايا الليفية. ومع ذلك ، أظهر آخرون [37 ، 38] ، بمن فيهم نحن [39] ، أن الخلايا البدينة تلعب دورًا مضادًا للتليف: على سبيل المثال ، في النماذج الحيوانية ، مثل الفئران والجرذان Ws / Ws التي تعاني من ضعف الخلايا البدينة. أوكازاكي وآخرون أظهر أن التليف المحرض كان أكثر حدة في الفئران التي تعاني من ضعف الخلايا البدينة مقارنة بالفئران البرية [38].

علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا البدينة مستقطبة في السرطان ، على غرار البلاعم [40]. تعبر الخلايا البدينة المضادة للالتهاب عن السيتوكينات ، مثل IL -10 ، ويرتبط عددها عكسيًا مع شدة الالتهاب ، في حين أن الخلايا البدينة proinflflammatory تحلق إلى وضع proinflflammatory. من المحتمل أن الخلايا البدينة المضادة للالتهاب تعبر عن HLA-G ، على وجه الخصوص ، لأنه (1) ظهر ارتباط في عدة نماذج بين مستويات IL -10 وتعبير HLA-G و (2) HLA-G له تأثير مضاد للالتهابات. قد تتواجد الخلايا البدينة المعبرة عن HLA-G في مرحلة مبكرة من المرض ، خلال المرحلة الالتهابية ، لمواجهة الالتهاب ، وهو رد الفعل الأول للآفة. في الأدبيات ، تم الإبلاغ عن أن Il -10 ، عن طريق تقليل الاستجابة الالتهابية ، قد يثبط تكاثر الخلايا الليفية العضلية وتخليق الكولاجين [41]. في الواقع ، قد يلعب IL -10 دورًا وقائيًا في إدمان الكحولمرض الكبد[42]. في المقابل ، تم العثور على مستويات مصل أعلى من IL -10 في المرضى الذين يعانون من IPF من الأشخاص العاديين ، وأعلى مستوى من IL -10 في غسل القصبات الهوائية في المرضى الذين يعانون من IPF مقارنة مع الساركويد أو التهاب الرئة بفرط الحساسية [43]. يمكننا أن نفسر ذلك من خلال المكون الأقل أهمية للتضخم. فيكلويfifibrosis ، تم توضيحه في نموذج فأر أن نقص IL -10 تفاقمالكلىالتهاب وتليف [44]. في البشر ، يؤدي العلاج باستخدام العلاج المناعي الموضعي IL -10 المرتبط بمضاد TGF- إلى تحسين الحالة المزمنةمرض كلوي [45].

والنتيجة الأخرى ذات الصلة هي ملاحظة خلايا HLA-G plus في العقد الخلوية ، بالقرب من المناطق الليفية في حالات نادرة من تليف الكبد الكحولي. يتم تمثيل هذه الخلايا شكليًا بواسطة مجموعة من الخلايا التي يمكن التعرف عليها بسهولة من صغيرة إلى متوسطة الحجم ، مما يشير إلى تجمع ليمفاوي. توحي خصائصها المورفولوجية بوجود بصيلات ، وهي هياكل تتشكل أساسًا من الخلايا الليمفاوية البائية. أكد التألق المناعي الرباعي في العقد هذه الفرضية ، حيث أن 68 بالمائة من خلايا HLA-G plus تم التعبير عنها بشكل مشترك CD20 ، وهي علامة محددة للخلايا الليمفاوية B (الجدول 3). ولوحظت أيضًا هياكل مماثلة في IPF ، مع نتيجة مماثلة ، حيث أظهرت أن 76 بالمائة من خلايا HLA-G plus في العقد تكون من الخلايا الليمفاوية B (الجدول 6). تم الإبلاغ عن تكون الخلايا الليمفاوية في التليف. وهكذا ، في ظل ظروف مرضية معينة ، مثل الالتهاب المستمر ، قد تتطور التجمعات الخلوية إلى بنية عالية التنظيم تشبه الأنسجة الليمفاوية الثانوية ، أي الأعضاء الليمفاوية الثالثة أو الجريبات اللمفاوية المنتبذة [46]. تحتوي هذه الجريبات اللمفاوية على مناطق غنية بالخلايا التائية وجريبات خلية بائية مميزة مع مراكز جرثومية [47]. يتم التحكم في الآلية التي تنظم بها الخلايا البائية المتسللة الجريب المنتبذ والمركز الجرثومي بواسطة السموم اللمفاوية - 1 2 والكيماويات الليمفاوية ، مثل CC-chemokine ligand 19 (CCL19) ، CCL21 ، CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) ، و CXCL13 ، الذي ينظم توجيه الخلايا الليمفاوية. بالإضافة إلى السموم الضوئية الليمفاوية والكيموكينات ، فإن تحفيز المستضد مطلوب أيضًا للحث على تكوين البصيلات والحفاظ عليه. لم يتم ملاحظة مثل هذه البصيلات في مجموعتنا من فيروس التهاب الكبد الوبائيكبدفيفيبروزيس وتم العثور عليها فقط في واحدة من ثلاث حالات يسببها الكحولكبدفيبروزيس ، مما يشير إلى مرحلة مميزة من المرض. وبالفعل ، فإن وظيفة الأعضاء اللمفاوية المنتبذة وعلاقتها بالالتهاب والتليف الفكي ليست واضحة بعد. أظهر عدد من الدراسات دورًا جديدًا ومدهشًا للخلايا البائية في تنظيم الخلايا الليفية في فيبروزيس ، حيث يكون تأثيرها التليفي مشابهًا لتأثير TGF- وأيضًا معزز بعامل تنشيط الخلية البائية (BAFF) [48].

أهمية المصدر الخلوي لـ HLA-G في التليف الفسي ليس فقط وصفيًا ولكنه وظيفي أيضًا. HLA-G له تأثير مثبط على وظيفة جميع أنواع الخلايا الليمفاوية [49] والخلايا المتغصنة [20،50] من خلال مستقبلاته المحددة ، مثل ILT2 و ILT4. إن وجود HLA-G على هذه الخلايا المناعية ، بالإضافة إلى كونه علامة على الالتهاب ، هو أيضًا علامة على وجود رد فعل مناعي مناسب من خلال تقليل الالتهاب أيضًا. في الواقع ، من المعروف أن HLA-G يلعب دورًا وقائيًا ضد التفاعلات الالتهابية المبالغ فيها ، كما هو موضح سابقًا في الصدمة الإنتانية [51]. بالإضافة إلى ذلك ، درسنا سابقًا التفاعل المتبادل بين الخلايا البدينة والخلايا النجمية الكبدية وأظهرنا أنه يؤدي إلى جذب الخلايا البدينة وانخفاض ملحوظ في إنتاج الكولاجين بواسطة خلايا HSC من خلال إنتاج HLA-G [39]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعبير عن HLA-G بواسطة الخلايا البائية في الجريبات المنتبذة قد يساهم أيضًا في مواجهة التأثير التليفي للخلايا الليمفاوية B على الخلايا الليفية العضلية عن طريق تثبيط الخلايا البائية عبر آلية أوتوكرين.

مرضى وطرق

مرضىمجموعة من 41كبدتمت دراسة مرضى زرع مع تليف الكبد الناجم عن الكحول. تم إبلاغ المرضى بالبروتوكول ، وتم الحصول على عدم وجود معارضة (لجنة أخلاقيات المستشفى ، إخطار رقم 16.47). عشر عينات من كتلة البارافين منكلويتمت دراسة fifibrosis و 10 من IPF (لجنة أخلاقيات المستشفى ، الإشعار رقم 16.123) ، مجهول الهوية تمامًا وبشكل لا رجعة فيه ، وفقًا لمبادئ إعلان هلسنكي. تم تلخيص الخصائص السريرية والبيولوجية للمجموعات الثلاثة على التوالي في الجداول 8-10.

المنهجية

الكيمياء الهيستولوجية المناعية والتألق المناعيتم اشتقاق الأنسجة من explantedكبدوكلويأو خزعة الرئة. تم تحضير المقاطع التسلسلية المضمنة بالبارافين (بسمك 4 ميكرومتر) ، وتم إجراء تلطيخ نسيجي قياسي ، أي تلوين HES وعلامة Sirius Red للكولاجين. في موازاة ذلك ، تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية والتألق المناعي على المقاطع التسلسلية للأقسام المضمنة في البارافين من نفس الكتلة بعد إزالة المادة الفعالة وبروتوكول استرجاع المستضد. كانت الأجسام المضادة الأولية (mAbs) على النحو التالي: الفئران أحادية النسيلة المضادة للإنسان HLA-G (Exbio ، 4H 84 2 ميكروغرام / مل أو 1: 100 ، فيستيك ، جمهورية التشيك) ​​، مجموعة CD117 / c-kit للأرنب متعددة النسيلة ، التعرف على الخلايا النخاعية والخلايا البدينة (داكو ، 1: 200 ، كوبينهاجن ، الدنمارك) ، تريبتاز الخلية البدينة أحادية النسيلة المضادة للإنسان (همهمة) (استنساخ AA1 ، داكو ، 1: 1000) ، محدد للخلايا البدينة ، CD3 أحادي النسيلة مضاد للإنسان (Thermo Scientififics ، SP7 ، 1: 500 ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، محدد للخلايا اللمفاوية التائية ، و CD20 المضاد للإنسان وحيدة النسيلة (داكو ، M0755 ، 1: 600) ، محدد للخلايا الليمفاوية ب.

Brieflfly ، تم تحضين شرائح الكيمياء المناعية مع الأجسام المضادة الأولية في نظام آلي Discovery Ultra (Roche ، Meylan ، France). تم الكشف عن الجسم المضاد الأساسي المربوط باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز أو جسم مضاد IgG مضاد للأرنب (Vector ، ABCYS ، les Ulis ، فرنسا ، 1: 7 0 0) وثنائي بنزيدين (مجموعة DAB MAP ، Roche ، Meylan ، فرنسا) ، تليها تلوين ماير الهيماتوكسيلين. لتحديد طبيعة خلايا HLA-G plus بدقة ، ثلاثية (DAPI ، CD117 ، تريبتاز الخلية البدينة) ، رباعي (DAPI ، HLA-G ، CD117 ، تريبتاز الخلية البدينة) ، وخماسي (DAPI ، HLA-G ، CD3 ، تم إجراء CD20 ، تريبتاز الخلايا البدينة) تلطيخ التألق المناعي على ثلاث حالات تمثيلية لتليف الكبد الناجم عن الكحول وحالتين تمثيليتين لـ IPF. تم إجراء الوحي باستخدام مجموعات Discovery FAM و rhodamine و DCC و Cy5 (أنظمة Ventana الطبية ، Illkirch ، فرنسا). بعد التلوين ، تم رقمنة صورة لكامل سطح القسم عند تكبير 20 × أو 40 × باستخدام ماسح ضوئي متحد البؤر (الماسح الضوئي البانورامي ، 3DHistech ، بودابست ، المجر). تم تحليل الكيمياء المناعية وتلطيخ التألق المناعي المتعدد باستخدام برنامج التحليل الرقمي HALO (V3.0.311). تم تدريب البرنامج على التعرف على فيبروزيس (أحمر سيريوس) باستخدام وحدة قياس المساحة (V2.1.3) ، بينما تم تدريب وحدة Fish-IF (الإصدار 1.2.2) على العينات المصنفة بالأصباغ. تم اختيار أقسام كاملة من كل عينة للتحليل باستخدام الخوارزمية المقابلة. تم استخراج البيانات إلى برنامج جداول بيانات لتحليلها.

استنتاجهذا العمل المرتبط بتجاربنا السابقة على البيانات حول الدور المضاد للوقاية للخلايا البدينة عبر تعبير HLA-G [39] يشير إلى أن الخلايا البدينة تلعب دورًا مضادًا للتليف والوقاية من خلال التعبير عن HLA-G في المواقف التليفية. يتم تعزيز هذا الدور بواسطة الخلايا الليمفاوية B التي تعبر عن HLA-G في بصيلات الرحم. بشكل عام ، تشير هذه العناصر إلى دور وقائي لـ HLA-G المعبر عنها بواسطة الخلايا البدينة في الأعضاء التليفية.