كيف يؤثر Cistanche Deserticola Polysaccharide على امتصاص العظام؟

الاتصال: أودري هوaudrey.hu@wecistanche.com

Cistanche Deserticola Polysaccharide يخفف تكوّن الأرومة العظمية وامتصاص العظام عن طريق تثبيط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية RANKL والإشارات

Dezhi Song et al

هشاشة العظام هي مرض استقلابي يتميز بهشاشة العظام وتدهور البنية البنائية. ناقضات العظم هي الخلايا المستجيبة الأولية التي تؤدي إلى تدهور مصفوفة العظام وتؤدي وظيفتها غير الطبيعية إلى تطور هشاشة العظام. يعزز تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أثناء عملية التمثيل الغذائي الخلوي تكاثر ناقضات العظم وتمايزها ، وبالتالي تلعب دورًا مهمًا في هشاشة العظام.سيستانشالصحراءعديد السكاريد(CDP) يحتوي على ورم ،مضاد التهاب، والنشاط المضاد للأكسدة. ومع ذلك ، فإن تأثير ناقضات العظم CDPon غير واضح. في هذه الدراسة ، تم استخدام تلطيخ الفوسفاتاز الحمضي المقاوم للطرطرات ، والتألق المناعي ، والنسخ العكسي ، تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحليل اللطخة الغربية لإثبات أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)تثبيط تكوين الخلايا العظمية وامتصاص هيدروكسيباتيت. بالإضافة إلى ذلك ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)منع أيضًا التعبير عن جينات علامة الخلايا العظمية بما في ذلك Ctsk و Mmp9 و Acp5 ، ولم يكن له أي تأثير على منشط مستقبلات العامل النووي κB (RANK). كشفت التحليلات الميكانيكية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يزيد من التعبير عن إنزيمات مضادات الأكسدة لتخفيف إنتاج ROS بوساطة RANKL في ناقضات العظم ويثبط العامل النووي للخلايا التائية النشطة وتنشيط بروتين كيناز الميثوجين. تشير هذه النتائج إلى أن CDP قد يمثل دواءً مرشحًا لعلاج هشاشة العظام الناتجة عن النشاط المفرط لخلايا العظم.

الكلمات الدالةارتشاف العظامسيستانشالصحراءعديد السكاريد ، MAPK ، osteoclast ، أنواع الأكسجين التفاعلية

1|المقدمة

يلعب التوازن بين تكوين العظام ، بوساطة بانيات العظم ، وارتشاف العظم ، بوساطة ناقضات العظم ، دورًا حيويًا في الحفاظ على التوازن الأيضي للعظام (Manolagas، 2000؛ Zhuet al.، 2018). عندما يتجاوز ارتشاف العظام تكوين العظام ، يحدث هشاشة العظام ، والتي تتميز بانخفاض كتلة العظام وتلف العظام المجهرية (Ikeda ، 2008). هشاشة العظام مرض شائع لدى كبار السن والنساء بعد سن اليأس ولم يتم توضيح أسبابه بشكل كامل (Cooper & Melton ، 1992). يعد نقص هرمون الاستروجين سببًا رئيسيًا لهشاشة العظام (مانولاغاس ، أوبراين ، والميدا ، 2013). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحفيز أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عن طريق منشط مستقبلات العامل النووي يجند B (RANKL) وترتبط بتشكيل ناقضات العظم (Yip et al. ، 2005) ، وبالتالي قد تساهم في تطور هشاشة العظام (Manolagas ، 2010). وجدت بعض الدراسات أن نقص مضادات الأكسدة Nrf2 يزيد من مستويات ROS ويعزز تمايز ناقضات العظم المستحثة بـ RANKL (Hyeon، Lee، Yang، & Jeong، 2013). لذلك ، يجب تقييم تقليل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أثناء تمايز ناقضات العظم كإستراتيجية علاجية لعلاج هشاشة العظام.

تشتق ناقضات العظم من سلالة الخلايا الوحيدة أو المكونة للبلعم وهي الخلايا الوحيدة متعددة النوى التي تقوم بامتصاص العظم (Teitelbaum ، 2000). لذلك ، فإن البحث الذي ينطوي على تكوين ناقضات العظم له أهمية كبيرة في تطوير علاجات فعالة لأمراض استقلاب العظام (Lorenzo ، 2017). يعتبر عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M ‐ CSF) و RANKL ، الذي تنتجه بانيات العظم والخلايا التائية المنشطة ، من أهم الخلايا التي تنظم تكوين الخلايا العظمية (Kim & Kim، 2016؛ Teitelbaum & Ross، 2003). يستحث RANKL التعبير عن العامل النووي للخلايا التائية المنشطة (NFATc1) ، وهو عامل نسخ حاسم نشط أثناء تكوين ناقضات العظم (Ishidaet al. ، 2002). يعزز NFATc1 المنشط التعبير عن جينات علامة ناقضات العظم مثل الفوسفاتاز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAcP) والكاثيبسين K (CTSK) الذي ينظم تكوّن الخلايا العظمية ووظيفة ناقضات العظم (Balkan et al. ، 2009 ؛ Crottiet al. ، 2008).

سيستانشالصحراءعديد السكاريد(CDP) معزول عن السيقان اللحميةسيستانشويمتلك تنظيمًا للمناعة ، ومضادًا للورم ، ومضادًا للشيخوخة ، وتأثيرات دوائية أخرى (Guo et al. ، 2016 ؛ Jia ، Guan ، Guo ، & Du ، 2012). CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)كان له تأثير مثبط على إنتاج أكسيد النيتريك الناجم عن عديد السكاريد الشحمي (NO) في خلايا mousemicroglial (خلايا BV ‐ 2 ؛ Nan et al. ، 2013). بالإضافة إلى ذلك ، خلاصة غنية بالفينيلثانويد (ECD) منسيستانشعزز قدرة الفئران على السباحة عن طريق تقليل تلف العضلات ، وتأخير تراكم حامض اللاكتيك ، وتحسين تخزين الطاقة (Cai et al. ، 2010) ، ومع ذلك ، فإن تأثيرات CDP على وظيفة ونشاط ناقضة العظام لا تزال غير معروفة.

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يثبط تمايز الخلايا العظمية المستحثة بـ RANKL وامتصاص العظام. كانت الآلية الأساسية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يعزز التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة لتكثيف إنتاج ROS ، ثم يثبط شلالات إشارات RANKL ‐ المنشط NFAT والبروتين كيناز المنشط (MAPK). تشير هذه النتائج إلى أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمكن استخدامها لعلاج هشاشة العظام الناتجة عن فرط ارتشاف العظم الناجم عن ترقق العظام.

2|المواد والأساليب

2.1|المواد

CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)(نقاء> 98 في المائة) تم شراؤه من Solarbio (بكين ، الصين) وتم إعداده بتركيز مخزون قدره 1 ملي مولار في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS). الأجسام المضادة خاصة بـ c ‐ Fos و CTSK و GSR و TRX1 و NOS2 و TRAF6 و RANK و NFATc1 و ERK و JNK و p38 و phosphorylated (p) ‐ERK و p ‐ p38 و p JNK و actin تم الحصول عليها من سانتا Cruz Biotechnology (سان خوسيه ، كاليفورنيا). تم إنتاج الأجسام المضادة لـ V-ATPase d2 كما هو موصوف سابقًا (H. Feng et al. ، 2009). تم الحصول على 3‐ (4،5 ‐ dimethylthiazol ‐ 2 ‐ yl) ‐5‐ (3 carboxymethoxyphenyl) ‐2‐ (4 ‐ sulfophenyl) ‐2H ‐ tetrazolium (MTS) ونظام فحص اللوسيفيراز من Promega (سيدني ، أستراليا). تم شراء Recombinant M ‐ CSF من R&D Systems (مينيابوليس ، مينيسوتا). تم التعبير عن بروتين GST ‐ rRANKL المؤتلف وتنقيته كما هو موصوف سابقًا (Xu et al. ، 2000).

2.2|زراعة الخلايا

تم الحصول على خلايا RAW264.7 (خلايا بلاعم الفأر) من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC ، Manassas ، VA) وتم تربيتها في وسط أساسي بسيط معدّل (Thermo FisherScientific ، Scoresby ، أستراليا) مكمل بـ 10 بالمائة من المصل البقري الجنيني ، 2 ملي مولار من L ‐ الجلوتامين ، 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (وسط كامل). تم عزل الخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظم (BMMs) من فئران C57BL / 6J عمرها 6 أسابيع ونصف ، والتي تم تغييرها الرحيم وفقًا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة أستراليا الغربية (RA / 3/100/1244). تشريح خالية من الأنسجة الرخوة ونخاع العظم يتم مسحه من عظم الفخذ والساق ، والذي تم تربيته بعد ذلك في وسط كامل في وجود M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل).

2.3|مقايسة تكون الخلايا العظمية

تم طلاء BMMs في لوحات استنبات 96 ‐ بكثافة 6 × 103 خلايا لكل بئر وتم معالجتها بوسط كامل يحتوي على M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل) و GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) ، في وجود أو عدم وجود تركيزات متفاوتة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>ثلاثة نوى) على أنها ناقضات العظم.

2.4|فحوصات السمية الخلوية

تم زرع BMMs في 96 طبق جيدًا عند 6 × 103 خلية لكل بئر وتركها طوال الليل للالتصاق. في اليوم التالي ، تم تحضين الخلايا بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). بعد 48 ساعة أخرى ، تمت إضافة محلول MTS (20 ميكرولتر / بئر) واحتضانه بالخلايا لمدة ساعتين. تم تحديد سعة الامتصاص 490 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية (MultiscanSpectrum؛ Thermo Labsystems، Chantilly، VA.

2.5|تلطيخ مناعي

تم زرع BMMs بكثافة 6 × 103 خلية لكل بئر في وجود M - CSF (50 نانوغرام / مل) طوال الليل. ثم تم تحفيز الخلايا باستخدام M ‐ CSF و GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) حتى تتشكل الخلايا الآكلة للعظم الناضجة. ثم عولجت ثيوستيوكلاستس بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لمدة 48 ساعة قبل التثبيت بـ 4٪ بارافورمالدهيد ، نفاذية بـ 0. 1٪ Triton X 100 – PBS ، وحجب بنسبة 3٪ من ألبومين مصل البقر في PBS. تم تحضين الخلايا المحضرة مع phalloidin مترافق رودامين لمدة 45 دقيقة في داكن إلى وصمة عار ل F ‐ أكتين. تم بعد ذلك غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ، تمت مواجهة النوى بـ 4 ، 6 Diamidino 2 phenylindole (DAPI) ، وتثبيتها بأغطية ساترة للفحص المجهري متحد البؤر.

2.6|مقايسة امتصاص هيدروكسيباتيت

لقياس نشاط ناقضة العظم تم تحفيز BMMs (1 × 105 خلية لكل بئر) المزروعة على ستة ألواح مغلفة بالكولاجين جيدًا (BD Biocoat ؛ ThermoFisher Scientific) باستخدام GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) و M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل ) حتى يتم إنشاء ناقضات العظم الناضجة (Zhou et al. ، 2016). تم بعد ذلك فصل الخلايا برفق عن محلول تفكك الخلية باستخدام الصفيحة (Sigma - Aldrich) وتم زرع أعداد متساوية من الخلايا الآكلة للعظم الناضجة على آبار فردية مغطاة بألواح هيدروكسيباتيت 96 بئر (Corning Osteoassay ، Corning ، NY). تم تحضين ناقضات العظم الناضجة في وسط يحتوي على GST ‐ rRANKL و M ‐ CSF مع أو بدون CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)في التركيزات المشار إليها. بعد 48 ساعة ، كانت نصف الآبار ملطخة بكيميائيات مناعية لنشاط TRAcP ، كما هو موضح أعلاه ، لتقييم عدد الخلايا متعددة النوى لكل بئر. تم تبييض الآبار المتبقية لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا والسماح بقياس المناطق التي تم امتصاصها. تم تصوير المناطق التي تم امتصاصها تحت الفحص المجهري للضوء القياسي وتم استخدام برنامج Image J (المعاهد الوطنية للصحة ، Bethesda ، MD) لتحديد النسبة المئوية لمساحة هيدروكسيباتيت التي تمتصها ناقضات العظم.

2.7|فحوصات مراسل Luciferase

للتحقيق في تنشيط النسخ NFATc1 ، تم نقل خلايا RAW264.7 بشكل ثابت باستخدام بنية luciferasereporter متجاوبة NFATc1 (Cheng et al. ، 2018 ؛ van der Kraan et al. ، 2013). .5 × 105 خلية لكل بئر ومعالجة بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لمدة 1 ساعة. بعد المعالجة المسبقة ، تم تحفيز الخلايا باستخدام GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) لمدة 24 ساعة ، وتم قياس نشاط luciferase باستخدام نظام فحص مراسل luciferase وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Promega).

2.8|النسخ العكسي الكمي ‐ تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT ‐ PCR)

تم عزل RNA الكلي من الخلايا باستخدام كاشف Trizol وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Thermo Fisher Scientific). تم تصنيع الحمض النووي التكميلي باستخدام المنتسخة العكسية لفيروس سرطان الدم في مولوني مورين مع 1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي الريبي والبادئات oligo ‐ dT. تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراسيك لتسلسلات محددة باستخدام البرنامج التالي: 94 درجة لمدة 5 دقائق ، تليها 30 دورة من 94 درجة لمدة 40 ثانية ، و 60 درجة لمدة 40 ثانية ، و 72 درجة لمدة 40 ثانية ، وخطوة التمديد النهائية لمدة 5 دقائق في 72 درجة. يتم عرض المعلومات التفصيلية الخاصة بالبادئات المحددة في الجدول 1 ، وقد تم حساب مستويات RNA الخاصة بالرسول عن طريق التطبيع للتعبير عن جين التدبير المنزلي Hmbs.

2.9|تحليل لطخة غربية

تمت زراعة BMMs في وسط كامل باستخدام M ‐ CSF في ستة أطباق جيدة وتحفيزها باستخدام GST ‐ rRANKL (100 نانوغرام / مل) للأوقات المحددة. تم فصل الخلايا في المخزن المؤقت لتحلل الترسيب المناعي الإشعاعي والبروتينات التي تم حلها عن طريق الرحلان الكهربائي لجيل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم ونقلها إلى أغشية بولي (فلوريد فينيلدين) (GE Healthcare ، Silverwater ، أستراليا). تم حظر الأغشية في حليب مقشود بنسبة 5 في المائة لمدة ساعة واحدة ثم فحصها بأجسام مضادة أولية محددة مع اهتزاز لطيف طوال الليل عند 4 درجات. تم غسل الأغشية واحتضانها لاحقًا بأجسام مضادة ثانوية مترافقة ببيروكسيداز الفجل. ثم تم الكشف عن تفاعل الأجسام المضادة مع عامل التوهج الكيميائي المحسن (Amersham Pharmacia Biotech ، Piscataway ، NJ) وتم تصورها باستخدام صورة كمية LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|كشف ROS داخل الخلايا

تم الكشف عن مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام 2 ، 7′ ‐ dichlorofluorescein diacetate الخلوي ROS طقم فحص (Abcam ، ملبورن ، أستراليا). تمت زراعة BMMs (5 × 103 خلية لكل بئر) في أطباق بئر 96 وعولجت بـ RANKL (100 نانوغرام / مل) ، M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل) ، و CDP لمدة 72 ساعة. تم قياس مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام ثنائي كلورو فلورسين ثنائي الأسيتات ، والذي يتأكسد إلى فلورسنت DCF في وجود ROS. تم غسل الخلايا في المخزن المؤقت لـ Hank واحتضانها في الظلام لمدة 30 دقيقة بـ 10 ميكرومتر من DCFH - DA. تم الحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري (كنفوكل).

2.11|تحاليل احصائية

جميع البيانات تمثيلية لثلاث تجارب على الأقل أجريت بشكل متكرر ما لم يُذكر خلاف ذلك. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​± SD. تم استخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين متبوعًا باختبارات Student-Newman-Keulspost المخصصة لتحديد أهمية الفروق بين النتائج ، مع اعتبار p <{0}}. 05="" على="" أنها="">

3|النتائج

3.1|CDP يثبط تكوّن الأرومة العظمية المستحث بـ RANKL واندماج ناقضات العظم

لتحديد ما إذا كان CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمكن أن تمنع تكوّن العظم الناجم عن RANKL ، أجرينا أولاً اختبار تكوين الخلايا العظمية باستخدام BMMs للماوس (Liu et al. ، 2013 ؛ Song et al. ، 2016). تمت معالجة BMMs باستخدام RANKL و M ‐ CSF لمدة 5 أيام مع زيادة تركيزات CDP. خفض CDP عدد الخلايا متعددة النوى الإيجابية لـ TRAcP عند تركيز CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)وصلت إلى 5 ميكرومتر أو أعلى (الشكل 1 أ ، ب). لتقييم CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)سمية وتأكيد أن هذه النتائج لم تكن انعكاسا لموت الخلية أو عدد ، أجرينا اختبار MTS. تم علاج BMMs بـ RANKL و M ‐ CSF لمدة 48 ساعة بجرعات متفاوتة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). لم يكن CDPhad أي تأثير على انتشار BMM بتركيز 15 Mor أقل (الشكل 1 ج).

لاختبار تأثيرات CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)عند اندماج ناقضات العظم ، تم تحفيز ناقضات العظم باستخدام علاج RANKL و M ‐ CSF ، مع أو بدون جرعات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). كانت ناقضات العظم ملطخة بالرودامين ‐ phalloidin و DAPI لتقييم عدد النوى لكل ناقضة عظمية (الشكل 2 أ).(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)العلاج (5-10 ميكرومتر ، الشكل 2 ب ، ج). لذلك ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)كان له تأثيرات مثبطة على تكوّن العظم الناجم عن RANKL واندماج ناقضات العظم بطريقة تعتمد على الجرعة.

3.2|CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يخفف من نشاط ارتشاف osteoclastichydroxyapatite المستحث بـ RANKL

تم إجراء فحص امتصاص هيدروكسيباتيت للكشف عن تأثير CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)على وظيفة ناقضة العظم (الشكل 3 أ). بعد فترة الحضانة لمدة 24 ساعة ، لم يتغير عدد الخلايا الآكلة للعظم لكل بئر بينما انخفضت منطقة ارتشاف هيدروكسيباتيت بشكل كبير عن طريق المعالجة باستخدام 5 و 10 ميكرومتر CDP عند مقارنتها بمجموعات التحكم (الشكل 3 ب ، ج). توضح هذه النتائج أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)له تأثيرات مانعة قوية على كل من تكوين ناقضات العظم ونشاط امتصاص العظم دون أي تأثيرات سامة للخلايا.

3.3|CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمنع التعبير الجيني لعلامة ناقضة العظم

لمزيد من التحقيق في التأثيرات المثبطة لـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)تم علاج BMMs باستخدام RANKL و M ‐ CSF لمدة 5 أيام بتركيزات مختلفة من CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)ثم تم إجراء .RT ‐ PCR للكشف عن التعبير عن جينات osteoclastmarker. تم منع التعبير عن Nfatc1 ، وهو عامل نسخ حاسم في تكوين الخلايا العظمية ، بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)(5 و 10 ميكرومتر) قللت من تنظيم التعبير عن الجينات المرتبطة بارتشاف العظم ، بما في ذلك Mmp9 و Ctsk و Acp5 (الشكل 4 ب-د).

3.4|يمنع CDP نشاط NFATc1 وتعبير البروتين في مجرى النهر

لفحص تأثير CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)على نشاط NFATc1 الناجم عن RANKL ، تم إجراء اختبار مراسل aluciferase. العلاج بـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)، بتركيزات 5 ميكرومتر وأعلى ، تمنع بشكل كبير نشاط NFATc1 الناجم عن RANKL (الشكل 5 أ). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل اللطخة الغربية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)تعبير البروتين المكبوت بشكل كبير عن NFATc1 و c ‐ Fos في BMMs تعامل مع RANKL و M ‐ CSF لمدة 3 و 5 أيام (الشكل 5 ب). علاوة على ذلك ، تم تقليل التعبير عن البروتينات المرتبطة بوظيفة ناقضات العظم ، مثل V ATPase ‐ d2 و CTSK ، في وجود CDP.(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)مقارنة بمجموعات التحكم. ومع ذلك ، لم يكن لـ CDP أي تأثير على تعبير RANK (الشكل 5 ب).

3.5|يعزز CDP التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة لكبح إنتاج ROS أثناء تكوّن العظم الناجم عن RANKL

لاستكشاف الآلية الأساسية لتثبيط تكوّن العظم العظمي المعتمد على CDP ، تم علاج BMMs باستخدام RANKL (100 نانوغرام / مل) و M ‐ CSF (50 نانوغرام / مل) مع PBS أو CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لمدة 72 ساعة. قمنا بفحص تأثير CDP على إنتاج ROS داخل الخلايا الذي يحفزه RANKL. تمت زيادة مستويات ROS داخل الخلايا بواسطة علاج RANKL ، والذي تم تخفيفه بواسطة CDP (5 و 10 ميكرومتر ؛ الشكل 6 أ). تم تقليل كل من عدد الخلايا الإيجابية لـ ROS وشدة تلطيخ ROS بواسطة علاج CDP بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 6 ب ، ج). أظهر تحليل اللطخة الغربية أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)روجت ثيوردوكسين (TRX1) وتعبير اختزال الجلوتاثيون (GSR) أثناء قمع التعبير عن سينثاز أكسيد النيتريك المحرض (NOS2) في BMMs التي عولجت باستخدام RANKL و M ‐ CSF لمدة 3 أيام (الشكل 6 د).

لمزيد من استكشاف ما إذا كان CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)قمع تمايز ناقضات العظم عن طريق تقليل إنتاج ROS ، ثم عالجنا BMMs مع بيروكسيد (10 ميكرومتر) لتقليد حالة ROS المرتفعة في الخلايا. تم استنباط BMMs بواسطة RANKL و M ‐ CSF لمدة 3 أيام وأظهرت نتائج تحليل اللطخة الغربية و RT-PCR أن البيروكسيد عزز تعبير NFATc1 و c ‐ Fos مقارنة بمجموعات التحكم. تمشيا مع النتائج الواردة في الشكل 5 ، تم إيقاف تعبير NFATc1 و c ‐ Fos بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)بينما أنقذ البيروكسيد التأثير المثبط لـ CDP (الشكل 6 هـ ، و). أشارت هذه البيانات إلى أن CDP قمع تعبير NFATc1 و c ‐ Fos عن طريق مسح إنتاج ROS.

3.6|CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يقمع مسارات MAPK أثناء تكون الخلايا العظمية المستحثة بـ RANKL

بعد ذلك ، حققنا في تأثير CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)العلاج على تعبير RANKL ‐ بوساطة TRAF6 وتفعيل مسار MAPK. بعد حضانة وسط خال من المصل لمدة ساعتين ، تم تحفيز BMMs باستخدام RANKL ، مع أو بدون CDP ، لمدة 60 دقيقة. لم يكن للتحفيز باستخدام CDP (10 ميكرومتر) أي تأثير على تعبير TRAF6 والفسفرة المخففة لـ JNK2 وERK1 / 2 في 10 و 20 دقيقة (الشكل 7). بالإضافة إلى ذلك ، تم تثبيط الفسفرة p38 بشكل كبير بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)العلاج لمدة 60 دقيقة مقارنة بمجموعات التحكم (الشكل 7). تكشف هذه البيانات أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يقمع مسارات إشارات MAPK المستحثة من RANKL ، بما يتوافق مع تأثيره المثبط على تكوين ونشاط ناقضات العظم.

4|نقاش

جذب Cistanche ، المعروف باسم "الجينسنغ الصحراوي" ، الكثير من الاهتمام مؤخرًا لقدرته على تعديل المناعة والعمل بشكل وقائي أثناء الشيخوخة والإجهاد التأكسدي (Jia et al. ، 2012 ؛ Snytnikovaet al. ، 2012). ثبت أن Phenylpropanoid الجليكوسيدات المستبدلة ، المكونات النشطة الرئيسية لـ Cistanche ، تمنع عدم النشاط في الضامة (Ahn ، Chae ، Chin ، & Kim ، 2017). بالإضافة إلى ذلك ، أسيستانشيقلل المستخلص من الإجهاد التأكسدي في عضلة القلب المعاد تسريبه بعد نقص التروية ولعب دورًا مهمًا في تثبيط مسارات موت الخلايا المبرمج التي تؤدي إلى حماية القلب (Yu ، Li ، & Cao ، 2016). كعنصر مهم في Cistanche ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لديها مجموعة متنوعة من الوظائف الدوائية. توصلت دراستنا الحالية إلى أن CDP قام بقمع تمايز الخلايا العظمية المنشط لـ RANKL وتنشيطه عن طريق تخفيف إنتاج ROS وكذلك تنشيط NFAT و MAPK.

باعتباره الفوسفاتيز الحمضي ، يوجد TRAcP في مجموعة متنوعة من الخلايا وهو وفير في الخلايا الآكلة للعظام والضامة السنخية (Snipes ، Lam ، Dodd ، Gray ، & Cohen ، 1986). TRAcP هو إنزيم مميز من ناقضات العظم ويرتبط تعبيره ارتباطًا وثيقًا بوظيفة ناقضة العظم ، والتي تعتبر مؤشرًا لنشاط ناقضات العظم وارتشاف العظام (Minkin ، 1982). في دراستنا ، CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يثبط عدد الخلايا الإيجابية لـ TRAcP ، مما يشير إلى أنه تم حظر تكوين الخلايا العظمية المستحثة بـ RANKL بواسطة CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد). يعتمد تدهور مصفوفة العظام بواسطة ناقضات العظم على cathepsin K (CTSK) و MMPs (Gruber ، 2015). هنا ، قلل CDP بشكل كبير من التعبير عن الجينات الوظيفية لخلايا العظم مثل Mmp9 و Ctsk و Acp5.

يتم تنظيم تمايز الخلايا العظمية ووظيفتها من خلال مسارات إشارات متعددة (Boyle ، Simonet ، & Lacey ، 2003). بعد الارتباط بـ RANK ، تقوم RANKL بتجنيد بروتين المحول TRAF6 لتنشيط تعبير NFATc1 ، وهو عامل نسخ مهم لتشكيل ناقضات العظم ، مما يؤثر على التعبير الجيني الخاص بناض العظم ، بما في ذلك TRAcP و CTSK (X. Feng ، 2005 ؛ Takayanagi وآخرون ، 2002). في هذه الدراسة ، وجدنا أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)لم يكن له تأثير على تعبير RANK و TRAF6 في ناقضات العظم(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمنع تنشيط NFATc1 المستحث بـ RANKL أثناء تكوّن الأرومة العظمية لـ BMMs. إلى جانب ذلك ، تم إثبات أن ROS ، الذي تنتجه الميتوكوندريا في عملية توصيل الإلكترونات ، عزز تكاثر وتمايز الخلايا العظمية وتدهور مصفوفة العظام المنظم (Ha et al. ، 2004). وجدت دراسة حديثة أن RANKL تسبب في استيراد Bach1 النووي وتخفيف إنتاج إنزيم مضادات الأكسدة Nrf2 ، وبالتالي زيادة تعبير ROS داخل الخلايا وتكوين الأرومة العظمية في الفئران (Kanzaki et al. ، 2017). بالإضافة إلى ذلك ، زيادة توليد ROS داخل الخلايا عن طريق تكوين ونشاط الخلايا العظمية الهوموسيستين (Koh et al. ، 2006). وجدت دراستنا أن CDP قلل من تراكم ROS في الخلايا الآكلة للعظام عن طريق تثبيط تعبير NOS2 وتعزيز التعبير عن إنزيمات مضادات الأكسدة ، مثل TRX1 واختزال الجلوتاثيون. NFATc1 وجدنا أيضًا أن البيروكسيد أنقذ التأثير المثبط لتعبير CDPon NFATc1. لذلك ، تشير بياناتنا إلى أن CDP يمنع تراكم ROS لمنع تعبير NFATc1 ، ثم لقمع تكوين ووظيفة الخلايا العظمية.

تنتمي ERK و JNK و p38 إلى عائلة MAPK ، والتي تشارك أيضًا في تنظيم تمايز ناقضات العظم (Seger & Krebs ، 1995). ينشط RANKL مسار MAPK عن طريق زيادة فسفرة ERK و JNK و p38 (Mizukami et al. ، 2002). أظهرنا ذلك CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)قمع الفسفرة بوساطة RANKL للبروتينات الرئيسية في مسار MAPK ، مما يساهم في التأثير المثبط لـ CDP على التعبير عن جينات علامة ناقضة العظم. على حد علمنا ، هذه هي الدراسة الأولى التي تظهر التأثيرات المثبطة لـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)على إنتاج ROS و NFAT و MAPK ، مما يمثل آليات جديدة لعمل CDP في المختبر.

باختصار ، لقد أظهرنا أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يخفف تكوّن الخلايا العظمية وارتشاف هيدروكسيباتيت ، والتعبير عن جينات علامة ناقضات العظم بما في ذلك Ctsk و Mmp9 و Acp5. CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)كان قادرًا على قمع إنتاج ROS بوساطة RANKL ، وكذلك تنشيط NFAT و MAPK (الشكل 8). بشكل جماعي ، تشير نتائجنا إلى أن CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)قد يمثل دواءً مرشحًا لعلاج الحالات المرتبطة بخلايا العظم المصحوبة بإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية.

الشكل 8 رسم تخطيطي لـ CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)وظيفة في تمايز ناقضات العظم. CDP(سيستانشالصحراءعديد السكاريد)يمنع إنتاج ROS المستحث بـ RANKL ، وكذلك تنشيط NFATc1 و MAPK ، وبالتالي تثبيط تكون الأرومة العظمية. CDP ،سيستانشالصحراءعديد السكاريد؛ MAPK ، بروتين كيناز المنشط بالميتوجين ؛ NFATc1 ، العامل النووي للخلية التائية النشطة ؛ RANKL ، منشط مستقبلات العامل النووي κBligand ؛ ROS ، أنواع الأكسجين التفاعلية [يمكن الاطلاع على الشكل الملون في wileyonlinelibrary.com]

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة علوم الطبيعة في الصين (81572164) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير التكنولوجي الرئيسي في الصين (2017YFC1103300) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جوانجشي (2016GXNSFAA380295) ، ومشروع أبحاث العلوم والتكنولوجيا بجامعة جوانجشي (KY2015YB054) ). كما يتم دعمها جزئيًا من قبل مشروع جوانجكسي للبحوث العلمية وخطة تطوير التكنولوجيا (GKG13349003 ، 1598013-15) ، وصندوق البنية التحتية للبحوث الطبية والصحية في أستراليا الغربية ، ومؤسسة التهاب المفاصل الأسترالي ، وجوائز التعاون البحثي لجامعة غرب أستراليا (UWA) ، وصندوق الصحة والطب الأسترالي. مجلس البحوث (NHMRC ، رقم 1107828 و 1027932).

تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح

من: 'سيستانشالصحراءعديد السكاريديخفف تكوّن الخلايا العظمية وارتشاف العظام عن طريق تثبيط إشارات RANKL وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة Dezhi Song et al

--- © 2018 Wiley Periodicals، Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018 ؛ 233: 9674-9684