تعبير Human Alpha Defensin 5 في الكلى والمسالك البولية البشرية

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

جون ديفيد سبنسر وآخرون

الملخص

خلفية:الآليات التي تحافظ على العقم في المسالك البولية غير مفهومة تمامًا. أشارت الدراسات الحديثة إلى أهمية الببتيدات المضادة للميكروبات (AMP) في حماية المسالك البولية من العدوى. هنا ، نقوم بتمييز تعبير وأهمية AMP البشري alpha-defensin 5 (HD5) في الإنسانالكلىوالمسالك البولية في الأشخاص الطبيعيين والمصابين.

المنهجية / النتائج الرئيسية:باستخدام الحمض النووي الريبي المعزول عن الإنسانالكلىوالحالب وأنسجة المثانة ، أجرينا تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الكمي لإظهار أن DEFA5 ، الجين الذي يشفر HD5 ، يتم التعبير عنه بشكل أساسي في جميع أنحاء المسالك البولية. مع التهاب الحويضة والكلية ، زاد تعبير DEFA5 بشكل ملحوظ فيالكلى. باستخدام تحليل اللطخة المناعية ، زاد إنتاج HD5 أيضًا مع التهاب الحويضة والكلية. مناعة HD5 المترجمة إلى مجرى المثانة والحالب. في الكلى ، تم إنتاج HD5 بشكل أساسي في النيفرون البعيد والأنابيب المجمعة. باستخدام مقايسات immunoblot و ELISA ، لم يتم اكتشاف HD5 بشكل روتيني في عينات البول البشرية غير المصابة بينما يعني زيادة إنتاج HD5 البولي مع عدوى المسالك البولية بكتريا قولونية.

الاستنتاجات / الأهمية:يتم التعبير عن DEFA5 في جميع أنحاء المسالك البولية في الأشخاص غير المصابين. على وجه التحديد ، يتم التعبير عن HD5 في جميع أنحاء مجرى البول في الجزء السفلي من المسالك البولية وفي أنابيب التجميع فيالكلى. مع الإصابة ، يزداد تعبير HD5 فيالكلى، وتصبح المستويات قابلة للاكتشاف في البول. على حد علمنا ، تمثل النتائج التي توصلنا إليها أول من قام بتقدير تعبير HD5 وإنتاجه في الكلى البشرية. علاوة على ذلك ، يعد هذا أول تقرير يكشف عن وجود HD5 في عينات البول المصابة. تشير نتائجنا إلى أن HD5 قد يكون له دور مهم في الحفاظ على عقم المسالك البولية.

الآثار الجانبية Cistanche و Cistanche tubulosa لالكلىالمرض ، انقر هنا للحصول على العينة

مقدمة

عادة ما تكون المسالك البولية ، بصرف النظر عن صماخ مجرى البول ، معقمة على الرغم من قربها من الفلورا البرازية. الآليات الدقيقة التي تحافظ بها المسالك البولية على عقمها ليست مفهومة جيدًا. تشمل الآليات المقترحة التي تساهم في الدفاع عن المسالك البولية تدفق البول ، والتغيرات في درجة الحموضة والأسمولية في البول ، وإفراغ المثانة بانتظام ، ومكونات الدفاع الكيميائي للظهارة البولية ، وإفراز / تدفق الخلايا المناعية المستجيبة مع التحفيز البكتيري [1]. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت مؤخرًا أن الببتيدات المضادة للميكروبات تلعب دورًا مهمًا في الحفاظ على عقم المسالك البولية [2]. تعد مضادات الميكروبات ، التي تعمل كمضادات حيوية طبيعية تنتجها جميع الكائنات الحية تقريبًا ، مكونًا في كل مكان في الجهاز المناعي الفطري. AMPs هي جزيئات كاتيونية يتم التعبير عنها بواسطة الخلايا البيضاء البلعمية والخلايا الظهارية. في البشر والثدييات الأخرى ، تعتبر الديفينسين عائلة رئيسية من مركبات AMP. عادة ما يكون للديفينسين نشاط واسع النطاق مضاد للميكروبات ضد البكتيريا موجبة وسالبة الجرام والفيروسات والفطريات والأوليات [2،3]. يتم تصنيع الديفينسين في البداية كبروتينات مسبقة البروتين وتخضع للمعالجة لتصبح ببتيدات ناضجة ونشطة بيولوجيًا [4]. في البشر ، يتم تصنيف مركبات الدفاع عن النفس إلى واحدة من عائلتين اعتمادًا على نمط تجسير ثنائي كبريتيد - alpha-defensins أو beta-defensins [5].

في المسالك البولية ، يتم التعبير عن بيتا ديفينسين على نطاق واسع في جميع أنحاء الظهارة البولية. الخلايا الظهارية المبطنةالكلىحلقة من Henle والنبيبات البعيدة وقناة التجميع تعبر بشكل أساسي عن بيتا ديفينسين بشري 1 (hBD1). على الرغم من أن المستويات البولية لـ hBD1 غير كافية لقتل البكتيريا الغازية ، فإن hBD1 يوفر طلاء مضاد للميكروبات سريع المفعول من لومن أنبوبي ويمنع العدوى عن طريق تثبيط الارتباط البكتيري بالتهاب الأوعية الدموية [6]. تشير الدراسات الحديثة إلى أن حالة الأكسدة والاختزال لـ hBD1 تؤثر بشكل كبير على فاعلية مضادات الميكروبات ، بحيث يكون الببتيد المختزل أكثر فعالية من الشكل المؤكسد المرتبط بثاني كبريتيد [7]. لم يتم تحديد أهمية هذا على سطح الظهارة البولية. لا يتم التعبير عن ديفينسين آخر ، وهو بيتا ديفينسين 2 البشري (hBD2) بشكل أساسي في أنسجة الكلى السليمة ؛ ومع ذلك ، يحدث تعبير hBD2 عن طريق العدوى [8].

على عكس بيتا defensins ، فإن دور alpha-defensins المشتق من الظهارة غير موصوف بشكل جيد في المسالك البولية. تم الإبلاغ عن تعبير ووظيفة alpha-defensins HD5 و HD6 في الغالب في الأمعاء الدقيقة حيث يتم إفرازها بواسطة Panethcells في الخبايا المعوية وتساهم في توازن الجراثيم المعوية [9]. تم تحديد HD5 أيضًا في الجهاز التناسلي الذكري والأنثوي ، مع وجود أدلة تشير إلى أنه محفز ومهم في القضاء على العدوى [10،11،12]. تم الكشف عن HD5 البولي في المرضى الذين خضعوا لإعادة بناء المثانة اللفائفية وتحويل مجرى البول اللفائفي حيث يُنسب مصدر إنتاج HD5 بشكل أساسي إلى خلايا بانيث اللفائفية [13،14]. HD5 له نشاط مضاد للجراثيم ضد البكتيريا المسببة للأمراض البولية والبكتيريا سالبة الجرام [15]. يحتوي HD5 أيضًا على نشاط مضاد للميكروبات ضد الفيروسات المسببة للأمراض البولية مثل الفيروس الغدي وفيروس BK [16،17،18]. في هذه الدراسة ، نقدم الوصف الأولي والتقدير الكمي لتعبير HD5 في الإنسانالكلىوكذلك تحديد تعبيره في الجزء السفلي من المسالك البولية أثناء العقم والعدوى.

نتائج

يتم التعبير عن DEFA5 mRNA بشكل أساسي في المثانة والحالب والكلى البشرية

يوضح PCR الكمي في الوقت الحقيقي أن جميع المثانة والحالب والكلىالعينات غير المصابة بالعدوى المعبر عنها بشكل أساسي DEFA5. كان تعبير DEFA5 أكبر بشكل ملحوظ في الجزء السفلي من المسالك البولية منه في الجزء العلوي من المسالك البولية (ص=0. 014). في المثانة (ن=4) ، كان متوسط ​​تعبير DEFA5 4،656637 نسخة لكل 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي وفي الحالب (ن=4) يعني أن تعبير DEFA5 كان 4،1126170 نسخة لكل 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (الشكل 1 أ) . في الكلية (ن=6) ، كان متوسط ​​تعبير DEFA5 هو 29376274 نسخة لكل 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي. تم تحليل تعبير DEFA5 بشكل منفصل في قشرة الكلى ، النخاع ، والحوض. لم يختلف تعبير DEFA5 بشكل كبير حسب منطقة الكلى (ص=0 .45).

يزيد تعبير DEFA5 وتعبير الببتيد HD5 مع التهاب الحويضة والكلية

إجراء التحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCRمع أنسجة الكلىأظهر التهاب الحويضة والكلية زيادة كبيرة في تعبير DEFA5 مقارنة بأنسجة الكلى غير المصابة. Withpyelonephritis (n=6) ، يعني تعبير DEFA5 زاد إلى 7،82961،052 نسخة لكل 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (ص=0. 019) (الشكل 2 أ).

لمزيد من تقييم هذه الزيادة في التعبير عن التهاب الحويضة والتهاب الحويضة ، أجرينا تحليل اللطخة المناعية على نفس الشيءالكلىالأنسجة المستخدمة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتقييم الزيادات المتزامنة في إنتاج الببتيد HD5 (الشكل 2 ب ، اللوحة الوسطى). أظهر تحليل اللطخة المناعية ، باستخدام مضادات HD5 متعددة النسيلة ، إنتاج ببتيد HD5 أكبر بكثير في أنسجة الكلى المصابة بالتهاب الحويضة والكلية (ن {{5} }) مقارنة بغير مصابالكلىمناديل (ن=6). غير مصابالكلىعبرت الأنسجة عن 300625 نانوغرام HD5 / غرام من وزن الأنسجة الرطبة بينماالكلىالأنسجة المصابة بالتهاب الحويضة والكلية 6 0 0621 نانوغرام HD5 / غرام من وزن الأنسجة الرطبة (ص ، 0.0001). تم إعادة فحص البقع باستخدام GAPDH لتكون بمثابة عنصر تحكم في التحميل (الشكل 2 ب ، اللوحة الوسطى) وتم أيضًا إجراء وصمة عار فضية لتأكيد تحميل البروتين المتساوي (الشكل 2 ب ، اللوحة العلوية).

يتم إنتاج HD5 الببتيد في جميع أنحاء الكلى والمسالك البولية البشرية

تم إجراء التلقيح المناعي لتوطين إنتاج HD5 في المسالك البولية. أظهرت الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) أن النشاط المناعي HD5 كان موجودًا في جميع أنحاء مجرى البول في الحالب والمثانة لجميع العينات التي تم فحصها (ن=4 ، الشكل 3). أظهرت IHC أيضًا أن HD5 تم إنتاجه في أنابيب قشرة الكلى والنخاع. العينات (ن=6 ، الشكل 4). أظهر التألق المناعي (IF) أن تعبير HD5 كان أعظم في النيفرون البعيد وأنابيب التجميع (الشكل 5). لم يُظهر الخلالي والكبيبات نشاط مناعي HD5. تم إجراء التلقيح المناعي الموضح في الأشكال 3 و 4 و 5 باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ HD5 (8C8) يتعرف على بروبتيد HD5 (Abcam ، Cambridge ، MA). كانت النتائج متشابهة عند استخدام الأجسام المضادة المضادة لـ HD5 الأرانب متعددة النسيلة التي تتعرف على بروبتيد HD5 والببتيد الناضج (البيانات غير معروضة) - مما يشير إلى أن HD5 يتم تخزينه على شكل بروبتيد.

مع التهاب الحويضة والكلية ، زادت المناعة المناعية HD5 بشكل ملحوظ. زادت نشاط المناعة HD5 في جميع أنحاء النيفرون القريب ، والنيفرون البعيد ، وأنابيب التجميع (الشكل 4 والشكل 5). كما هو الحال في العينات غير المصابة ، لم تظهر الكبيبات والنسيج الخلالي أي تعبير HD5 مع العدوى. أظهرت الضوابط السلبية عدم وجود نشاط مناعي لـ HD5.

يحتوي البول البشري المصاب على تركيزات قابلة للقياس من ببتيد HD5

حدد تحليل اللطخة المناعية ، باستخدام المصل المضاد متعدد النسيلة للأرانب الذي يكتشف السلائف proHD5 والأشكال المعالجة الإضافية ، مستويات قابلة للقياس من HD5 في 13 من عينات البول المختبرة الخمسة عشر المصابة بالإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (الشكل 6A و B). عند وجودها ، تراوحت مستويات HD5 ، التي تم تطبيعها مع كرياتينين البول ، من 299.8 - 669.7630 نانوغرام HD5 / ملغ بول Cr (110.67 نانوغرام / مل - 276.67 نانوغرام / مل) ، والتي تتوافق مع 11.10 - 27.67 نانومول / لتر. عينات البول المصابة بالعدوى (n=15) ، كان HD5 عند أو أقل من حد الكشف البالغ (، 50 نانوغرام). مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) على نفس عينات البول ، باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (8C8) الذي يكتشف فقط السلائف proHD5 ، اكتشف مستويات قابلة للقياس من proHD5 في 13 من 15 عينة مصابة تم اختبارها. تراوحت تركيزات proHD5 البولي من 122.78-490.060.03 نانوغرام HD5 / ملغ بول Cr (30.02 نانوغرام / مل - 200.5 نانوغرام / مل) عند وجودها (الشكل 7).

مناقشة

في هذه الدراسة ، نقدم التوصيف الأولي لـ HD5 في الإنسانالكلىوالحالب والمثانة. لقد ثبت أن HD5 هو AMP مهم يمنع العدوى الغازية في الأمعاء ويتم تنظيمه في الجهاز التناسلي أثناء الإصابة [11،18،19،20،21]. ثبت أن AMPs المشتق من الخلايا الظهارية ، مثل HD5 ، مهم في الحفاظ على العقم في المسالك البولية [8،22،23،24]. قد تؤدي أوجه القصور في هذه الدفاعات المخاطية الفطرية إلى عدوى حادة و / أو مزمنة [25 ، 26].

توضح نتائج PCR الكمية في الوقت الفعلي أن DEFA5 يتم التعبير عنه بشكل أساسي في الإنسانالكلىوالحالب والمثانة. يزداد تعبير DEFA5 من الجزء العلوي من المسالك البولية إلى الجهاز البولي السفلي - بعد تدفق مجرى البول وزيادة القرب من نقطة غزو الجراثيم. على حد علمنا ، هذه هي الدراسة الأولى لتحديد تعبير DEFA5 في الكلى والمثانة البشرية. في الآونة الأخيرة ، أثبت Townes et al أن الحالب البعيد الطبيعي يمكنه التعبير عن DEFA5 [14]. تشير نتائجنا أيضًا إلى أن DEFA5 يتم التعبير عنه بشكل أساسي بواسطة الحالب البعيد. على الرغم من أن تعبير DEFA5 في المسالك البولية يقل تقريبًا 100- أضعاف عن ذلك الموجود في أنسجة الجهاز الهضمي ، فإن تعبير الظهارة البولية القاعدية لـ DEFA5 يمكن مقارنته بالتعبير عن مضخمات المسار البولي الموصوفة سابقًا مثل cathelicidin ، hBD -1 ، hBD -2 وريبونوكلياز 7 [6،8،22،24،27].

على النقيض من الجهاز الهضمي الناضج حيث يتم التعبير عن DEFA5 بمستويات عالية في كل من حالات الصحة والعدوى / الالتهاب ، توضح بيانات PCR الكمية في الوقت الفعلي أن تعبير DEFA5 فيالكلىيتم تنظيمه بشكل كبير مع العدوى [27،28،29]. يشبه هذا النمط المحرض من التعبير تعبير DEFA5 في الجهاز التناسلي الأنثوي حيث يزداد تعبير DEFA5 مع التهاب البوق [30]. في المسالك البولية ، أظهر تاونز وزملاؤه اتجاهًا نحو التعبير الحالبي الأكبر لـ DEFA5 في المرضى الذين يعانون من عدوى المسالك البولية الذين خضعوا لتحويل مجرى البول اللفائفي [14]

يكمل تحليلنا للطبقة المناعية بيانات PCR في الوقت الفعلي من خلال إثبات أن إنتاج ببتيد HD5 يزداد مع التهاب الحويضة والكلية. هذا النمط المحرض من إنتاج HD5 مشابه للنمط الذي شوهد في بعض أفراد عائلة بيتا ديفينسين. يُظهر hBD2 نمطًا محفزًا للإنتاج مع عدوى المسالك البولية و / أو التهاب الحويضة والكلية المزمن [8،31،32]. لقد ثبت أن إنتاج HD5peptide يزداد في الجزء العلوي من الجهاز التناسلي الأنثوي ومجرى البول عند الذكور مع الالتهاب [11،30].

باستخدام التلوين المناعي ، نوضح أن HD5 يتم إنتاجه بشكل موحد في مجرى البول في الحالب والمثانة. نظرًا لأن الغالبية العظمى من عدوى المسالك البولية ناتجة عن الفلورا البرازية التي تصعد إلى المثانة ، فإن هذه النتائج تشير إلى وجود تعبير HD5 في الأماكن التي يحدث فيها التعرض الميكروبي بشكل متكرر [33]. لذلك ، يتم وضع HD5 بشكل مثالي لمنع العدوى الجرثومية المتصاعدة. في الالكلى، يتم إنتاج HD5 بشكل أساسي في النيفرون البعيد ونبيب التجميع. تشير هذه النتائج إلى أن HD5 يتم إنتاجه في المواقع التي سيتم وضعها بحيث يكون فيها النشاط الأمثل لمضادات الميكروبات. أظهرت الدراسات السابقة أن الخصائص المضادة للميكروبات للديفينسين تعتمد على تركيز الملح - مع تركيزات أعلى من الملح تقلل من النشاط المضاد للميكروبات [23 ، 34 ، 35]. نتوقع أن تركيزات الملح المنخفضة في النيفرون البعيدة وأنابيب التجميع توفر بيئة مواتية للنشاط المضاد للميكروبات HD5.

يوضح تحليل Immunoblot و ELISA أيضًا أن HD5 يفرز في البول بمستويات منخفضة. بالنظر إلى الحجم (8.1 كيلو دالتون و 3.7 كيلو دالتون) والشحنة الإيجابية لـ proHD5 والمعالجة الكاملة لـ HD5 ، فمن الممكن أن بعض ببتيد HD5 البولي ينشأ ، جزئيًا على الأقل ، من ترشيح البلازما. ومع ذلك ، هناك القليل من الأدلة التي تشير إلى أن HD5 يستمر في البلازما [27]. بالإضافة إلى ذلك ، لكي يظهر HD5 في البول ، سيحتاج إلى الهروب من آليات امتصاص الببتيد الفعالة في النبيبات القريبة [6،36]. أخيرًا ، خضعت عينات البول المستخدمة للطرد المركزي قبل إجراء الاختبارات ، مما أدى إلى إزالة المصادر الخلوية لـ HD5.

عند التركيزات المكتشفة ، من غير المحتمل أن يكون HD5 البولي مضادًا مباشرًا للميكروبات ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض البولية لأن HD5 المعالج بالكامل يحتوي على تركيز مثبط أدنى (MIC) بين 6-10 مجم / مل ضد البكتيريا الوراثية البولية سالبة الجرام الشائعة [15]. ومع ذلك ، من المرجح أن تكون تركيزات سطح الغشاء المخاطي أعلى. علاوة على ذلك ، يوضح تحليل اللطخة المناعية أن تركيزات HD5 أكبر بشكل ملحوظ فيالكلى. تشير هذه النتائج إلى أن HD5 متورط في الدفاع المخاطي في المسالك البولية. يُلاحظ نمط مشابه مع HBD1 ، حيث تكون التركيزات البولية لـ hBD1 غير كافية لإظهار نشاط مضاد للميكروبات ولكن تم اكتشاف تركيزات أعلى من الببتيد بالقرب من الأنابيب الكلوية [6،31].

لأن IHC يوضح أن proHD5 هو شكل رئيسي من أشكال HD5 فيالكلىولأن كلا من البروتين الناضج و proHD5 يتم اكتشافهما في البول ، فإننا نتوقع أن HD5 يفرز بشكل أساسي جزيء سلائف ثم يخضع لمعالجة بروتينية لتوليد أشكال ناضجة - على غرار الجهاز الهضمي والمسالك البولية التناسلية [11،30،37]. في الأمعاء الدقيقة ، تنتج خلايا بانيث التربسين ، الذي يشق بروبتيد HD5 بحيث يكون الببتيد المعالج بالكامل هو الشكل السائد في تجويف الأمعاء [37]. في مجرى البول الذكري ، تكون إنزيمات المعالجة والتنشيط الرئيسية لـ HD5 هي بروتينات العدلات التي تساهم بها العدلات المعينة في موقع الإصابة [11]. لا يزال يتعين تحديد مساهمات التربسينوجين الظهاري والتريبسين البولي و / أو البروتياز العدلات في معالجة HD5 في المسالك البولية أثناء الإصابة. علاوة على ذلك ، فإن تأثيرات التغيرات في البيئة البولية على وظيفة HD5 (التغيرات في الأسمولية ، ودرجة الحموضة ، والتركيزات الموجبة) لا تزال قيد التحديد.

في الختام ، هذه هي الدراسة الأولى لتحديد وقياس تعبير وإنتاج HD5 في المسالك البولية. تشير نتائجنا إلى أن HD5 عبارة عن AMP مشتق من الظهارة والذي قد يلعب دورًا مهمًا في المناعة الفطرية للليوم البولي البشري الذي يمنع انتقال مسببات الأمراض الغازية إلى الدورة الدموية. قد يؤدي توضيح العوامل التي تنظم إنتاج HD5 إلى إضفاء نظرة ثاقبة على التسبب في التهابات المسالك البولية لدى المرضى المعرضين لخطر الإصابة بعدوى المسالك البولية والمرضى المصابين بالعدوى المزمنة.

طُرق

الموافقة على الدراسة

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى المشاركين في هذه الدراسة. بالنسبة للمواضيع التي تقل أعمارهم عن 18 عامًا ، تم الحصول على موافقة خطية من الوالدين / الوصي. وافق مجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى NationwideChildren (NCH) على هذه الدراسة جنبًا إلى جنب مع عملية الموافقة والمستندات (IRB 07-00383).

عينات البول والأنسجة البشرية

تم الحصول على أنسجة الحالب والمثانة القاصية غير المصابة (ن=4) من الأطفال الذين خضعوا لإعادة زرع الحالب لأسباب غير العدوى المتكررة. غير مصابالكلىتم الحصول على عينات (ن=6) من المرضى الذين خضعوا لعملية استئصال الكلية لأورام الكلى. كانت عينات الأنسجة خالية من العلامات العيانية للمرض أو الالتهاب.الكلىتم توفير الأنسجة المأخوذة من مرضى التهاب الحويضة والكلية المزمن بواسطة شبكة الأنسجة البشرية التعاونية (ن=6) [38]. أكد اثنان من أخصائيي علم الأمراض المستقلين التشخيص النسيجي لالتهاب الحويضة والكلية. تم تجميد عينات الأنسجة أو حفظها كأقسام مضمنة بالبارافين محايدة مثبتة بالفورمالين. تم تشريح أجزاء من أنسجة الكلى غير المصابة إلى القشرة أو النخاع أو الحوض الكلوي قبل التخزين (ن=4).

تم الحصول على عينات بول غير ملوث ومصاب بالعدوى من الأطفال الذين قدموا إلى قسم الطوارئ في NCH أو عيادة أمراض الكلى. تم تشخيص التهاب المسالك البولية من خلال ثقافة بول إيجابية وفقًا لمبادئ الأكاديمية الأمريكية لطب الأطفال [39]. كل عينات البول المصابة بها .106 CFU / مل من E.coli. تراوحت قيم الأس الهيدروجيني في البول من 5.5 إلى 8.5 (يعني البول 6.9). لم يتم قياس التركيب الأيوني البولي. تم الطرد المركزي لعينات البول لإزالة رواسب البول ، وأضيف كوكتيل مثبط البروتياز (Thermo Scientific ، Rockford ، IL ، USA).

عزل الحمض النووي والنسخ العكسي

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الأنسجة المجمدة باستخدام نظام عزل الحمض النووي الريبي PromegaTotal (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية). تخليق ForcDNA ، تم نسخ 4-8 ملغ من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام النسخ العكسي الفائق الثالث باستخدام oligo- (dT) 12-18primer وفقًا لبروتوكول المورد (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

استنساخ البلازميدات الخاصة بالجينات لمنحنيات معيارية

تم استنساخ ترميز (كدنا) DEFA5 و GAPDH في 4- ناقل بلازميد توبو (Invitrogen) وفقًا لتعليمات الشركات المصنعة. تم ترتيب تسلسل البلازميدات لتأكيد صحة ذلك

تم الحصول على بنيات. تم قياس كمية التخفيفات التسلسلية للبلازميدات الخاصة بالجينات (عن طريق الامتصاص الطيفي عند 260 والرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز الملون ببروميد الإيثيديوم) واستخدمت في الوقت الحقيقي PCR لتوليد منحنيات قياسية لكل تفاعل.

الوقت الحقيقي الكمي PCR

تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي الكمي باستخدام (كدنا) أحادي الخيط من الإنسانالكلى، والحالب ، وأنسجة المثانة مع أزواج محددة من الأوليغنوكليوتيد التمهيدي باستخدام 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصميم بادئات امتداد تقاطع PCR exon وتأكيد التسلسلات باستخدام DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (DEFA5 الأمامي التمهيدي : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA -39 و DEFA5 التمهيدي العكسي 59- GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA -39).

باختصار ، كان (كدنا) المقابل لـ 1 0 نانوغرام من الحمض النووي الريبي بمثابة قالب في تفاعل 25 مل يحتوي على 2. 0 ملي مولار من كل مادة أولية و 16 مزيجًا من Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green. كانت شروط PCR هي: تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعًا بـ 40 دورة مع كل دورة تتكون من تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 64 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تمت مراقبة انبعاث التألق من دورة إلى دورة عند 530 نانومتر وتحليلها باستخدام 7500Software V2.0.3 (النظم البيولوجية التطبيقية). تم تضمين معايير البلازميد الخاصة بالجينات مع كل مجموعة من التفاعلات. كعنصر تحكم إيجابي ، تم تضمين الحمض النووي الريبي اللفائفي الطرفي مع كل مجموعة من التفاعلات ، وتمت مقارنة النتائج بالمعايير المنشورة مسبقًا [27].

لتأكيد تضخيم PCR للمنتج المقصود ، تم تحليل العينة التمثيلية بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام agarose بنسبة 1.5 بالمائة. تم تصور المنتجات عن طريق اختبار بروميد الإيثيديوم ومقارنتها بمعايير حجم الحمض النووي لتأكيد حجم المنتج المتوقع (غير معروض). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد منحنى درجة حرارة الانصهار لكل تفاعل PCR في نهاية كل تفاعل.

الأجسام المضادة HD5

تم تحديد البروببتيد HD5 (AA 20-94) والأشكال المعالجة جزئيًا (AA 36-94 و 56–94) باستخدام الجسم المضاد لـ HD5 أحادي النسيلة المتاح تجاريًا (8C8) (Abcam). تم التعرف على الببتيد الناضج (AA 63-94) باستخدام مصل مضاد متعدد الأضلاع للأرنب الموصوف سابقًا [13،40].

لطخة مناعية

أقسام من نفسهالكلىتم سحق العينات المستخدمة للتحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR (3-6 مجم بالوزن الرطب) باستخدام ملاط ​​ومدقة في النيتروجين السائل وتم إذابتها في محلول RIPA مع مثبطات الأنزيم البروتيني. تم استخراج البروتينات البولية من عينات البول باستخدام مجموعة البروتينات الصغرى لتركيز بروتين البول (Norgen Biotek Corporation ، Thorold ، ON ، كندا). تم قياس تركيزات بروتين الكلى والبول باستخدام اختبار برادفورد المعدل وتم تأكيده باستخدام قراءة anOD280 نانومتر. تم تحميل تركيزات متساوية من أنسجة الكلى أو البروتين البولي على 18 بالمائة من المواد الهلامية المتدرجة لكبريتات دوديسيل الصوديوم وتعريضها للرحلان الكهربي. لضمان التحميل المتساوي للبروتين ، تم عمل صبغة فضية.

بعد الفصل الكهربي ، تم نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز. بعد التثبيت باستخدام 0. 05٪ من الجلوتارالدهيد في TBS ، تم حظر الأغشية في حليب خالٍ من الدهون بنسبة 5٪ لمدة 30 إلى 60 دقيقة واحتضانها في 1: 1 ، 000 تخفيف من مصل الأرانب polyclonal HD5 antiserum بين عشية وضحاها . بعد الغسيل ، تم تخفيف الجسم المضاد الثانوي ، وهو مضاد للأرنب مترافق مع بيروكسيديز مضاد للأرانب ، بنسبة 1:10 ، 000 (تقنية تشوير الخلية ، دانفرز ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، تم تطبيقه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. المناعية منالكلىتم فحص الأنسجة أيضًا باستخدام الجسم المضاد لـ GAPDH (Sigma Aldrich) لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ثم تم تحضينها باستخدام الجسم المضاد الثانوي الموصوف أعلاه. تم تصور البروتينات باستخدام نظام الكشف عن ECL وفيلم التلألؤ الكيميائي وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (BioExpress ، Kaysville ، UT ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم قياس كمية HD5 من خلال مقارنة شدة النطاق الناتجة بالتخفيف التسلسلي لبروتين proHD5 المعياري المؤتلف (Peptides International ، Louisville ، KY ، USA).الكلىتم توحيد تركيزات HD5 لوزن الأنسجة الرطب. تم تقسيم تراكيز HD 5 في البول على الكرياتينين في البول لتحديد نسب HD البول المعيارية 5- إلى الكرياتينين (mg / mg) لحساب تخفيف البول. تم تحديد تركيزات الكرياتينين في البول باستخدام مقايسة الكرياتينين الصفيحة الدقيقة من Oxford Biomedical Research (روتشستر هيلز ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية).

المناعية

بعد إزالة الكافيين ، والإماهة ، واسترجاع المستضد ، تم إجراء كتلة البيوتين وكتلة البروتين الخالية من المصل (Superblock ، ScyTek Laboratories ، Logan ، UT ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضين الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة HD5 (8C8) للفأر (1: 2 {{1 {12}}} 0 ؛ Abcam) أو مصل أرنب متعدد النسيلة (1: 500) متبوعًا بجسم مضاد مضاد متعدد التكافؤ مضاف إليه أحيائياً. Streptavidin / HRP (مختبرات ScyTek). تم تطوير المقاطع باستخدام 0.1 بالمائة من ديامينوبنزيدين رباعي كلوريد مع 0.02 بالمائة من بيروكسيد الهيدروجين ومقاومة الهيماتوكسيلين. تم تحضين أقسام الضوابط السلبية بمصل غير مناعي بدلاً من الأجسام المضادة لـ HD5.

تألق مناعي

تم إجراء تألق مناعي مزدوج المسمى للمساعدة في توطين تعبير HD5 فيالكلى. تم وضع علامة مزدوجة على قناة التجميع للخلايا الرئيسية ذات الجسم المضاد الماعز متعدد الأضلاع للأكوابورين {2}} (Santa Cruz Biotechnology ، سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) [41]. تم وضع علامة مزدوجة على حلقة Henle مع الجسم المضاد uromodulin المضاد للفئران (Sigma-Aldrich) وتم وضع علامة مزدوجة على النبيب القريب مع الماعز polyclonalantihuman aquaporin -1 (سانتا كروز) [41،42]. المضادة للماعز الحمير رودامين (Jackson ImmunoResearch Laboratories ، West Grove ، PA ، USA) ، و Rhodamine goat anti-mouse (JacksonImmunoResearch Laboratories) ، و FITC حمار متعدد الأضلاع للأرانب (سانتا كروز) بمثابة الأجسام المضادة الثانوية.

تم إعداد جميع الأقسام على النحو المبين أعلاه. تم تحضينها بمزيج من مضادات الفأر ضد HD5 (1: 200) (Abcam) ، AQP -2 (1: 500) ، uromodulin (1: 500) ، AQP -1 (1: 400) في الغرفة درجة الحرارة لمدة 90 دقيقة. تم تطبيق الجسم المضاد الثانوي لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتم تركيب المقاطع باستخدام وسائط تركيب مع DAPI. تم استخدام مصل غير مناعي كعنصر تحكم سلبي. تم فحص الشرائح باستخدام مجهر aLeica DM4000B وتم تصويرها رقميًا باستخدام كاميرا / برنامج Spot RT (أدوات التشخيص ، SterlingHeights ، MI ، الولايات المتحدة الأمريكية).

إليسا

Link Biotin Antibody Labeling Kit ، Novus Biologicals) تمت إضافة جسم مضاد أحادي النسيلة للماوس لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، تمت إضافة بيروكسيداز الفجل الستربتافيدين-حصان (بيوليجند ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة بمحلول الركيزة TMB لمدة 15 دقيقة (Kem-En-Tec Diagnostics) ، تم إنهاء التفاعل بمحلول STOP (تقنية تشوير الخلية ، Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وقراءتها بطول موجة 450 نانومتر. تم تقسيم تركيزات HD5 من مقايسة ELISA بواسطة urinecreatinine لتحديد نسب HD بول معيارية 5- إلى كرياتينين (mg / mg) لحساب تخفيف البول كما هو موضح أعلاه.

مراجع

1. Weichhart T ، Haidinger M ، Horl WH ، Saemann MD (2008) المفاهيم الحالية لآليات الدفاع الجزيئي الفعالة أثناء عدوى المسالك البولية. المجلة الأوروبية للتحقيق السريري 38 ملحق 2: 29-38.

2. Zasloff M (2007) الببتيدات المضادة للميكروبات والمناعة الفطرية والمسالك البولية المعقمة بشكل طبيعي. J Am Soc Nephrol 18: 2810-2816.

3. Lehrer RI، Lichtenstein AK، Ganz T (1993) Defensins: الببتيدات المضادة للميكروبات والسامة للخلايا لخلايا الثدييات. Annu Rev Immunol 11: 105-128.

4. Valore EV، Ganz T (1992) معالجة ما بعد الترجمة للديفينسين في الخلايا النخاعية البشرية غير الناضجة. الدم 79: 1538-1544.

5. Liu L، Zhao C، Heng HH، Ganz T (1997) يتم ترميز بيتا ديفينسين -1 وألفا ديفينسين بواسطة جينات متجاورة: عائلتان من الببتيد لهما طوبولوجيا ثنائي كبريتيد مختلفة تشتركان في أصل مشترك. علم الجينوم 43: 316-320.

6. فالور إي في ، بارك سي إتش ، كويل إيه جيه ، وايلز كر ، مكراي بي بي ، جونيور ، وآخرون. (1998) بيتا ديفينسين الإنسان -1: ببتيد مضاد للميكروبات للأنسجة البولي التناسلي. J كلين إنفست 101: 1633-1642.

7. شرودر بو ، وو زد ، نيودنج إس ، جروسورث إس ، مارسينوفسكي إم ، وآخرون. (2011) الحد من روابط ثاني كبريتيد يكشف عن نشاط مضاد للميكروبات من بيتا ديفينسين الإنسان 1. الطبيعة 469: 419-423.

8. Lehmann J ، Retz M ، Harder J ، Krams M ، Kellner U ، et al. (2002) التعبير عن بيتا ديفينسين 1 و 2 في الكلى مع عدوى بكتيرية مزمنة. BMC تصيب ديس 2:20.

9. Bevins CL (2006) Paneth cell defensins: جزيئات المستجيب الرئيسية للمناعة الفطرية. معاملات جمعية الكيمياء الحيوية 34: 263-266.

10. Quayle AJ ، Porter EM ، Nussbaum AA ، Wang YM ، Brabec C ، et al. (1998) التعبير الجيني ، التمركز المناعي ، وإفراز الديفينسين البشري -5 في الجهاز التناسلي للأنثى البشرية. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E ، Yang H ، Yavagal S ، Preza GC ، Murillo O ، et al. (2005) ملامح ديفينسين مميزة في النيسرية البنية والتهاب الإحليل الكلاميديا ​​الحثرية تكشف عن تفاعلات جديدة بين الخلايا الظهارية والعدلات. تصيب المناعة 73: 4823-4833.

12. Com E ، Bourgeon F ، Evrard B ، Ganz T ، Colleu D ، et al. (2003) التعبير عن مضادات الميكروبات الدفاعية في الجهاز التناسلي الذكري للجرذان والفئران والبشر. بيولوجيا التكاثر 68: 95-104.

13. بورتر إم ، بولس إم إيه ، لي جي إس ، نايتوه جي ، بيفينز سي إل ، إت آل. (1998) عزل defensins المعوية البشرية من بول المثانة اللفائفية. رسائل FEBS 434: 272-276.

14. Townes CL ، Ali A ، Robson W ، Pickard R ، Hall J (2011) يرتبط تحمل البيلة الجرثومية بعد تحويل البول بنشاط الببتيد المضاد للميكروبات. طب المسالك البولية 77: 509 e501-508.

15. Wang AP، Su YP، Wang S (2010) الحساسية المضادة للبكتيريا وآلية ألفا ديفينسين 5 البشري المؤتلف ضد السلالات السريرية المقاومة للمضادات الحيوية. Afr J Microbiol Res 4: 626-633.

16. Gropp R ، Frye M ، Wagner TO ، Bargon J (1999) الدفاعات الظهارية تضعف العدوى الفيروسية الغدية: الآثار المترتبة على العلاج الجيني بوساطة الفيروس الغدي. العلاج الجيني البشري 10: 957-964.

17. Smith JG ، Nemerow GR (2008) آلية تحييد الفيروس الغدي بواسطة الإنسان ألفا ديفينسينس. مضيف الخلية والميكروب 3: 11-19.

18. Dugan AS ، Maginnis MS ، Jordan JA ، Gasparovic ML ، Manley K ، et al. (2008) يمنع ألفا ديفينسينس الإنسان عدوى فيروس BK عن طريق تجميع الفيروسات ومنع الارتباط بالخلايا المضيفة. مجلة الكيمياء البيولوجية 283: 31125-31132.

19. Zhang D ، Liu ZH ، Liao QP ، Ma JM ، Sun YF ، وآخرون. (2009) دراسة المناعة المحلية لعدوى الجهاز التناسلي السفلي. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13-15.

20. Quayle AJ (2002) الاستجابة المناعية الفطرية والمبكرة لتحدي العوامل الممرضة في الجهاز التناسلي الأنثوي والدور المحوري للخلايا الظهارية. مجلة علم المناعة التناسلية 57: 61-79.