كيف يعبر في الكلى والمسالك البولية البشرية عن طريق ديفينسين الإنسان 5

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

جون ديفيد سبنسر وآخرون

الملخص

خلفية:الآليات التي تحافظ على العقم في المسالك البولية غير مفهومة تمامًا. أشارت الدراسات الحديثة إلى أهمية الببتيدات المضادة للميكروبات (AMP) في حماية المسالك البولية من العدوى. هنا ، نقوم بتمييز تعبير وأهمية AMP البشري alpha-defensin 5 (HD5) في الإنسانالكلىوالمسالك البولية في الأشخاص الطبيعيين والمصابين.

المنهجية / النتائج الرئيسية:باستخدام الحمض النووي الريبي المعزول عن الإنسانالكلىوالحالب وأنسجة المثانة ، أجرينا تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الكمي لإظهار أن DEFA5 ، الجين الذي يشفر HD5 ، يتم التعبير عنه بشكل أساسي في جميع أنحاء المسالك البولية. مع التهاب الحويضة والكلية ، زاد تعبير DEFA5 بشكل ملحوظ فيالكلى. باستخدام تحليل اللطخة المناعية ، زاد إنتاج HD5 أيضًا مع التهاب الحويضة والكلية. مناعة HD5 المترجمة إلى مجرى المثانة والحالب. في الكلى ، تم إنتاج HD5 بشكل أساسي في النيفرون البعيد والأنابيب المجمعة. باستخدام مقايسات immunoblot و ELISA ، لم يتم اكتشاف HD5 بشكل روتيني في عينات البول البشرية غير المصابة بينما يعني زيادة إنتاج HD5 البولي مع عدوى المسالك البولية بكتريا قولونية.

الاستنتاجات / الأهمية:يتم التعبير عن DEFA5 في جميع أنحاء المسالك البولية في الأشخاص غير المصابين. على وجه التحديد ، يتم التعبير عن HD5 في جميع أنحاء مجرى البول في الجزء السفلي من المسالك البولية وفي أنابيب التجميع فيالكلى. مع الإصابة ، يزداد تعبير HD5 فيالكلى، وتصبح المستويات قابلة للاكتشاف في البول. على حد علمنا ، تمثل النتائج التي توصلنا إليها أول من قام بتقدير تعبير HD5 وإنتاجه في الكلى البشرية. علاوة على ذلك ، يعد هذا أول تقرير يكشف عن وجود HD5 في عينات البول المصابة. تشير نتائجنا إلى أن HD5 قد يكون له دور مهم في الحفاظ على عقم المسالك البولية.

Cistanche UK لمرض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

مقدمة

عادة ما تكون المسالك البولية ، بصرف النظر عن صماخ مجرى البول ، معقمة على الرغم من قربها من الفلورا البرازية. الآليات الدقيقة التي تحافظ بها المسالك البولية على عقمها ليست مفهومة جيدًا. تشمل الآليات المقترحة التي تساهم في الدفاع عن المسالك البولية تدفق البول ، والتغيرات في درجة الحموضة والأسمولية في البول ، وإفراغ المثانة بانتظام ، ومكونات الدفاع الكيميائي للظهارة البولية ، وإفراز / تدفق الخلايا المناعية المستجيبة مع التحفيز البكتيري [1]. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت مؤخرًا أن الببتيدات المضادة للميكروبات تلعب دورًا مهمًا في الحفاظ على عقم المسالك البولية [2]. تعد مضادات الميكروبات ، التي تعمل كمضادات حيوية طبيعية تنتجها جميع الكائنات الحية تقريبًا ، مكونًا في كل مكان في الجهاز المناعي الفطري. AMPs هي جزيئات كاتيونية يتم التعبير عنها بواسطة الخلايا البيضاء البلعمية والخلايا الظهارية. في البشر والثدييات الأخرى ، تعتبر الديفينسين عائلة رئيسية من مركبات AMP. عادة ما يكون للديفينسين نشاط واسع النطاق مضاد للميكروبات ضد البكتيريا موجبة وسالبة الجرام والفيروسات والفطريات والأوليات [2،3]. يتم تصنيع الديفينسين في البداية كبروتينات مسبقة البروتين وتخضع للمعالجة لتصبح ببتيدات ناضجة ونشطة بيولوجيًا [4]. في البشر ، يتم تصنيف مركبات الدفاع عن النفس إلى واحدة من عائلتين اعتمادًا على نمط تجسير ثنائي كبريتيد - alpha-defensins أو beta-defensins [5].

في المسالك البولية ، يتم التعبير عن بيتا ديفينسين على نطاق واسع في جميع أنحاء الظهارة البولية. الخلايا الظهارية المبطنةالكلىحلقة من Henle والنبيبات البعيدة وقناة التجميع تعبر بشكل أساسي عن بيتا ديفينسين بشري 1 (hBD1). على الرغم من أن المستويات البولية لـ hBD1 غير كافية لقتل البكتيريا الغازية ، فإن hBD1 يوفر طلاء مضاد للميكروبات سريع المفعول من لومن أنبوبي ويمنع العدوى عن طريق تثبيط الارتباط البكتيري بالتهاب الأوعية الدموية [6]. تشير الدراسات الحديثة إلى أن حالة الأكسدة والاختزال لـ hBD1 تؤثر بشكل كبير على فاعلية مضادات الميكروبات ، بحيث يكون الببتيد المختزل أكثر فعالية من الشكل المؤكسد المرتبط بثاني كبريتيد [7]. لم يتم تحديد أهمية هذا على سطح الظهارة البولية. لا يتم التعبير عن ديفينسين آخر ، وهو بيتا ديفينسين 2 البشري (hBD2) بشكل أساسي في أنسجة الكلى السليمة ؛ ومع ذلك ، يحدث تعبير hBD2 عن طريق العدوى [8].

على عكس بيتا defensins ، فإن دور alpha-defensins المشتق من الظهارة غير موصوف بشكل جيد في المسالك البولية. تم الإبلاغ عن تعبير ووظيفة alpha-defensins HD5 و HD6 في الغالب في الأمعاء الدقيقة حيث يتم إفرازها بواسطة Panethcells في الخبايا المعوية وتساهم في توازن الجراثيم المعوية [9]. تم تحديد HD5 أيضًا في الجهاز التناسلي الذكري والأنثوي ، مع وجود أدلة تشير إلى أنه محفز ومهم في القضاء على العدوى [10،11،12]. تم الكشف عن HD5 البولي في المرضى الذين خضعوا لإعادة بناء المثانة اللفائفية وتحويل مجرى البول اللفائفي حيث يُنسب مصدر إنتاج HD5 بشكل أساسي إلى خلايا بانيث اللفائفية [13،14]. HD5 له نشاط مضاد للجراثيم ضد البكتيريا المسببة للأمراض البولية والبكتيريا سالبة الجرام [15]. يحتوي HD5 أيضًا على نشاط مضاد للميكروبات ضد الفيروسات المسببة للأمراض البولية مثل الفيروس الغدي وفيروس BK [16،17،18]. في هذه الدراسة ، نقدم الوصف الأولي والتقدير الكمي لتعبير HD5 في الإنسانالكلىوكذلك تحديد تعبيره في الجزء السفلي من المسالك البولية أثناء العقم والعدوى.

نتائج

يتم التعبير عن DEFA5 mRNA بشكل أساسي في المثانة والحالب والكلى البشرية

يوضح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الكمي أن جميع عينات المثانة والحالب والكلى التي تم اختبارها دون الإصابة بالعدوى معبر عنها بشكل أساسي DEFA5. كان تعبير DEFA5 أكبر بشكل ملحوظ في الجزء السفلي من المسالك البولية منه في الجزء العلوي من المسالك البولية (ص=0. 014). في المثانة (ن=4) ، كان متوسط ​​تعبير DEFA5 4،656637 نسخة لكل 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي وفي الحالب (n=4) يعني أن تعبير DEFA5 كان 4،1126170 نسخة لكل 10 ncRNA (الشكل 1 أ) . في الكلية (ن=6) ، كان متوسط ​​تعبير DEFA5 هو 29376274 نسخة لكل 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي. تم تحليل تعبير DEFA5 بشكل منفصل في القشرة الكلوية ، النخاع ، والحوض. لم يختلف تعبير DEFA5 بشكل كبير حسب منطقة الكلى (ص=0 .45).

يزيد تعبير DEFA5 وتعبير الببتيد HD5 مع التهاب الحويضة والكلية

أظهر التحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR الذي تم إجراؤه على أنسجة الكلى المصابة بالتهاب الحويضة والكلية زيادة كبيرة في تعبير DEFA5 مقارنة بأنسجة الكلى غير المصابة. Withpyelonephritis (n=6) ، يعني تعبير DEFA5 زاد إلى 7،82961،052 نسخة لكل 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (ع=0. 019) (الشكل 2 أ).

لمزيد من تقييم هذه الزيادة في التعبير عن التهاب الحويضة والكلية ، أجرينا تحليلًا للطبقة المناعية على نفس أنسجة الكلى المستخدمة لتحليل PCR في الوقت الحقيقي لتقييم الزيادات المتزامنة في إنتاج الببتيد HD5 (الشكل 2 ب ، اللوحة الوسطى). أظهر تحليل اللطخة المناعية ، باستخدام مضادات HD5 متعددة النسيلة ، إنتاج ببتيد HD5 أكبر بشكل ملحوظ في أنسجة الكلى المصابة بالتهاب الحويضة والكلية (ن=6) مقارنة بأنسجة الكلى غير المصابة (ن=6). عبّرت أنسجة الكلى غير المصابة عن 3 0 0625 نانوغرام HD5 / غرام من وزن الأنسجة الرطبة بينما عبّرت أنسجة الكلى المصابة بالتهاب الحويضة والكلية عن 600621 نانوغرام HD5 / غرام من وزن الأنسجة الرطبة (ع ، 0.0001). تم إعادة فحص البقع باستخدام GAPDH لتكون بمثابة عنصر تحكم في التحميل (الشكل 2 ب ، اللوحة الوسطى) وتم أيضًا إجراء وصمة عار فضية لتأكيد تحميل البروتين المتساوي (الشكل 2 ب ، اللوحة العلوية).

يتم إنتاج HD5 الببتيد في جميع أنحاء الكلى والمسالك البولية البشرية

تم إجراء التلقيح المناعي لتوطين إنتاج HD5 في المسالك البولية. أظهرت الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) أن النشاط المناعي HD5 كان موجودًا في جميع أنحاء مجرى البول في الحالب والمثانة لجميع العينات التي تم فحصها (ن=4 ، الشكل 3). أظهرت IHC أيضًا أن HD5 تم إنتاجه في أنابيب قشرة الكلى والنخاع. العينات (ن=6 ، الشكل 4). أظهر التألق المناعي (IF) أن تعبير HD5 كان أعظم في النيفرون البعيد وأنابيب التجميع (الشكل 5). لم يُظهر الخلالي والكبيبات نشاط مناعي HD5. تم إجراء التلقيح المناعي الموضح في الأشكال 3 و 4 و 5 باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ HD5 (8C8) يتعرف على بروبتيد HD5 (Abcam ، Cambridge ، MA). كانت النتائج متشابهة عند استخدام الأجسام المضادة المضادة لـ HD5 الأرانب متعددة النسيلة التي تتعرف على بروبتيد HD5 والببتيد الناضج (البيانات غير معروضة) - مما يشير إلى أن HD5 يتم تخزينه على شكل بروبتيد.

مع التهاب الحويضة والكلية ، زادت المناعة المناعية HD5 بشكل ملحوظ. زادت نشاط المناعة HD5 في جميع أنحاء النيفرون القريب ، والنيفرون البعيد ، وأنابيب التجميع (الشكل 4 والشكل 5). كما هو الحال في العينات غير المصابة ، لم تظهر الكبيبات والنسيج الخلالي أي تعبير HD5 مع العدوى. أظهرت الضوابط السلبية عدم وجود نشاط مناعي لـ HD5.

يحتوي بول الإنسان المصاب على قابلية للقياس

تركيزات HD5 الببتيد

حدد تحليل اللطخة المناعية ، باستخدام المصل المضاد متعدد النسيلة للأرانب الذي يكتشف السلائف proHD5 والأشكال المعالجة الإضافية ، مستويات قابلة للقياس من HD5 في 13 من عينات البول المختبرة الخمسة عشر المصابة بالإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (الشكل 6A و B). عند وجودها ، تراوحت مستويات HD5 ، التي تم تطبيعها مع كرياتينين البول ، من 299.8 - 669.7630 نانوغرام HD5 / ملغ بول Cr (110.67 نانوغرام / مل - 276.67 نانوغرام / مل) ، والتي تتوافق مع 11.10 - 27.67 نانومول / لتر. عينات البول المصابة بالعدوى (ن=15) ، كان HD5 عند أو أقل من حد الكشف البالغ (، 50 نانوغرام). مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) على نفس عينات البول ، باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (8C8) الذي يكتشف فقط السلائف proHD5 ، اكتشف مستويات قابلة للقياس من proHD5 في 13 من 15 عينة مصابة تم اختبارها. تراوحت تركيزات proHD5 البولي من 122.78-490.060.03 نانوغرام HD5 / ملغ بول Cr (30.02 نانوغرام / مل - 200.5 نانوغرام / مل) عند وجودها (الشكل 7).

مناقشة

في هذه الدراسة ، نقدم التوصيف الأولي لـ HD5 في الكلى والحالب والمثانة البشرية. لقد ثبت أن HD5 هو AMP مهم يمنع العدوى الغازية في الأمعاء ويتم تنظيمه في الجهاز التناسلي أثناء الإصابة [11،18،19،20،21]. ثبت أن AMPs المشتق من الخلايا الظهارية ، مثل HD5 ، مهم في الحفاظ على العقم في المسالك البولية [8،22،23،24]. قد تؤدي أوجه القصور في هذه الدفاعات المخاطية الفطرية إلى عدوى حادة و / أو مزمنة [25 ، 26].

تُظهر نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الكمية في الوقت الفعلي أن DEFA5 يتم التعبير عنه بشكل أساسي في الكلى والحالب والمثانة البشرية. يزداد تعبير DEFA5 من الجزء العلوي من المسالك البولية إلى الجهاز البولي السفلي - بعد تدفق مجرى البول وزيادة القرب من نقطة غزو الجراثيم. على حد علمنا ، هذه هي الدراسة الأولى لتحديد تعبير DEFA5 في الكلى والمثانة البشرية. في الآونة الأخيرة ، أثبت Townes et al أن الحالب البعيد الطبيعي يمكنه التعبير عن DEFA5 [14]. تشير نتائجنا أيضًا إلى أن DEFA5 يتم التعبير عنه بشكل أساسي بواسطة الحالب البعيد. على الرغم من أن تعبير DEFA5 في المسالك البولية أقل 100- أضعاف من ذلك الموجود في أنسجة الجهاز الهضمي ، فإن تعبير الظهارة البولية القاعدية لـ DEFA5 يمكن مقارنته بالتعبير عن مضخمات المسار البولي الموصوفة سابقًا مثل cathelicidin، hBD -1، hBD -2 وريبونوكلياز 7 [6،8،22،24،27]. على عكس الجهاز الهضمي الناضج حيث يتم التعبير عن DEFA5 بمستويات عالية في كل من الحالة الصحية والعدوى / الالتهاب ، في الوقت الفعلي الكمي لدينا تُظهر بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل أن تعبير DEFA5 في الكلى يتم تنظيمه بشكل كبير من خلال العدوى [27 ، 28 ، 29]. يشبه هذا النمط المحرض من التعبير تعبير DEFA5 في الجهاز التناسلي الأنثوي حيث يزداد تعبير DEFA5 مع التهاب البوق [30]. في المسالك البولية ، أظهر Townes et al اتجاهًا نحو التعبير الحالب الأكبر لـ DEFA5 في المرضى الذين يعانون من عدوى المسالك البولية الذين خضعوا لتحويل مجرى البول اللفائفي [14].

يكمل تحليلنا للطبقة المناعية بيانات PCR في الوقت الفعلي من خلال إثبات أن إنتاج ببتيد HD5 يزداد مع التهاب الحويضة والكلية. هذا النمط المحرض من إنتاج HD5 مشابه للنمط الذي لوحظ في بعض أفراد عائلة بيتا ديفينسين. يُظهر hBD2 نمطًا محفزًا للإنتاج مع عدوى المسالك البولية و / أو التهاب الحويضة والكلية المزمن [8،31،32]. لقد ثبت أن إنتاج HD5peptide يزداد في الجزء العلوي من الجهاز التناسلي الأنثوي ومجرى البول عند الذكور مع الالتهاب [11،30].

باستخدام التلوين المناعي ، نوضح أن HD5 يتم إنتاجه بشكل موحد في مجرى البول في الحالب والمثانة. نظرًا لأن الغالبية العظمى من التهابات المسالك البولية ناتجة عن الفلورا البرازية التي تصعد إلى المثانة ، فإن هذه النتائج تشير إلى وجود تعبير HD5 في الأماكن التي يحدث فيها التعرض الميكروبي بشكل متكرر [33]. لذلك ، يتم وضع HD5 بشكل مثالي لمنع تصاعد العدوى الميكروبية. في الكلى ، يتم إنتاج HD5 بشكل أساسي في النيفرون البعيد ونبيب التجميع. تشير هذه النتائج إلى أن HD5 يتم إنتاجه في المواقع التي سيتم وضعها بحيث يكون فيها النشاط الأمثل لمضادات الميكروبات. أظهرت الدراسات السابقة أن الخصائص المضادة للميكروبات للديفينسين تعتمد على تركيز الملح - مع تركيزات أعلى من الملح تقلل من نشاط مضادات الميكروبات [23 ، 34 ، 35]. نتوقع أن تركيزات الملح المنخفضة في النيفرون البعيدة وأنابيب التجميع توفر بيئة مواتية لنشاط مضادات الميكروبات HD5.

يوضح تحليل Immunoblot و ELISA أيضًا أن HD5 يفرز في البول بمستويات منخفضة. بالنظر إلى الحجم (8.1 كيلو دالتون و 3.7 كيلو دالتون) والشحنة الإيجابية لـ proHD5 والمعالجة الكاملة لـ HD5 ، فمن المحتمل أن بعض ببتيد HD5 البولي ينشأ ، جزئيًا على الأقل ، من ترشيح البلازما. ومع ذلك ، هناك القليل من الأدلة التي تشير إلى أن HD5 يستمر في البلازما [27]. بالإضافة إلى ذلك ، لكي يظهر HD5 في البول ، سيحتاج إلى الهروب من آليات امتصاص الببتيد الفعالة في النبيبات القريبة [6،36]. أخيرًا ، خضعت عينات البول المستخدمة للطرد المركزي قبل إجراء الاختبارات ، مما أدى إلى إزالة المصادر الخلوية لـ HD5. عند التركيزات المكتشفة ، من غير المحتمل أن يكون HD5 البولي مضادًا مباشرًا للميكروبات ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض البولية لأن HD5 المعالج بالكامل له تركيز مثبط أدنى (MIC) بين 6-10 مجم / مل ضد البكتيريا المسببة للأمراض البولية سالبة الجرام [15]. ومع ذلك ، من المرجح أن تكون تركيزات سطح الغشاء المخاطي أعلى. علاوة على ذلك ، يوضح تحليل اللطخة المناعية أن تركيزات HD5 أعلى بشكل ملحوظ في الكلى. تشير هذه النتائج إلى أن HD5 متورط في الدفاع المخاطي في المسالك البولية. يظهر نمط مشابه مع HBD1 ، حيث تكون التركيزات البولية لـ hBD1 غير كافية لإظهار نشاط مضاد للميكروبات ولكن تم اكتشاف تركيزات أعلى من الببتيد بالقرب من الأنابيب الكلوية [6،31].

نظرًا لأن IHC يوضح أن proHD5 هو شكل رئيسي من أشكال HD5 في الكلى ولأن كلا من البروتين الناضج و proHD5 يتم اكتشافهما في البول ، فإننا نتوقع أن يتم إفراز HD5 بشكل أساسي كجزيء سلائف ثم يخضع لمعالجة بروتينية لتوليد أشكال ناضجة - على غرار الجهاز الهضمي والمسالك البولية التناسلية [11،30،37]. في الأمعاء الدقيقة ، تنتج خلايا بانيث التربسين ، الذي يشق بروبتيد HD5 بحيث يكون الببتيد المعالج بالكامل هو الشكل السائد في تجويف الأمعاء [37]. في مجرى البول الذكري ، تكون إنزيمات المعالجة والتنشيط الرئيسية لـ HD5 هي البروتياز العدلات الذي يساهم به

تجنيد العدلات في موقع الإصابة [11]. لا يزال يتعين تحديد مساهمات التربسينوجين الظهاري والتريبسين البولي و / أو البروتياز العدلات في معالجة HD5 في المسالك البولية أثناء الإصابة. علاوة على ذلك ، فإن تأثيرات التغيرات في البيئة البولية على وظيفة HD5 (التغيرات في الأسمولية ، ودرجة الحموضة ، والتركيزات الموجبة) لا تزال قيد التحديد.

في الختام ، هذه هي الدراسة الأولى لتحديد وقياس تعبير وإنتاج HD5 في المسالك البولية. تشير نتائجنا إلى أن HD5 عبارة عن AMP مشتق من الظهارة والذي قد يلعب دورًا مهمًا في المناعة الفطرية للظهارة البولية البشرية التي تمنع انتقال مسببات الأمراض الغازية إلى الدورة الدموية. قد يؤدي توضيح العوامل التي تنظم إنتاج HD5 إلى إضفاء نظرة ثاقبة على التسبب في التهابات المسالك البولية لدى المرضى المعرضين لخطر الإصابة بعدوى المسالك البولية والمرضى المصابين بالعدوى المزمنة.

طُرق

الموافقة على الدراسة

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى المشاركين في هذه الدراسة. بالنسبة للمواضيع التي تقل أعمارهم عن 18 عامًا ، تم الحصول على موافقة خطية من الوالدين / الوصي. وافق مجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى NationwideChildren (NCH) على هذه الدراسة جنبًا إلى جنب مع عملية الموافقة والمستندات (IRB 07-00383).

عينات البول والأنسجة البشرية

تم الحصول على أنسجة الحالب والمثانة القاصية غير المصابة (ن=4) من الأطفال الذين خضعوا لإعادة زرع الحالب لأسباب غير العدوى المتكررة. تم الحصول على عينات الكلى غير المصابة (ن=6) من المرضى الذين خضعوا لعملية استئصال الكلية لأورام الكلى. كانت عينات الأنسجة خالية من العلامات العيانية للمرض أو الالتهاب. تم توفير أنسجة الكلى من مرضى التهاب الحويضة والكلية المزمن من قبل شبكة الأنسجة البشرية التعاونية (ن=6) [38]. أكد اثنان من أخصائيي علم الأمراض المستقلين التشخيص النسيجي لالتهاب الحويضة والكلية. تم تجميد عينات الأنسجة أو حفظها كأقسام مضمنة بالبارافين محايدة مثبتة بالفورمالين. تم تشريح أجزاء من أنسجة الكلى غير المصابة في القشرة أو النخاع أو الحوض الكلوي قبل التخزين (ن=4).

تم الحصول على عينات بول غير ملوثة وملوثة من الأطفال الذين قدموا إلى قسم الطوارئ في NCH أو عيادة أمراض الكلى. تم تشخيص التهاب المسالك البولية من خلال ثقافة بول إيجابية وفقًا لمبادئ الأكاديمية الأمريكية لطب الأطفال [39]. احتوت جميع عينات البول المصابة على 106 زيمبابوي / مل من بكتريا القولون. تراوحت قيم الأس الهيدروجيني في البول من 5.5 إلى 8.5 (يعني البول 6.9). لم يتم قياس التركيب الأيوني البولي. تم الطرد المركزي لعينات البول لإزالة رواسب البول ، وأضيف كوكتيل مثبط للبروتياز (Thermo Scientific ، Rockford ، IL ، USA).