تقوم خلايا TH17 البشرية بإشراك مسام Gasdermin E لتحرير IL-1 عند تنشيط NLRP3 Inflammasome

لقد ثبت أن الاستجابات المناعية الفطرية يمكن أن تتبنى خصائص تكيفية مثل الذاكرة. ما إذا كانت الخلايا التائية تستخدم مسارات الإشارات المناعية الفطرية لتنويع ذخيرتها من وظائف المستجيب غير معروفة. Gasdermin E (GSDME) هو جزيء مكون للمسام الغشائية وقد ثبت أنه ينفذ موت الخلايا الحرارية وبالتالي يكون بمثابة نقطة تفتيش محتملة للسرطان. في الدراسة الحالية، نظهر أن الخلايا التائية البشرية تعبر عن GSDME، ومن المثير للدهشة أن هذا التعبير يرتبط بالقدرة على البقاء وإعادة توظيفه لإطلاق إنذار إنترلوكين (IL) -1 . اقتصرت هذه الخاصية على مجموعة فرعية من الخلايا التائية المساعدة البشرية من النوع 17 مع خصوصية المبيضات البيضاء ويتم تنظيمها بواسطة الجسيم الالتهابي NLRP3 الموجود في الخلايا التائية، وإشراكها في سلسلة محللة للبروتين من الكاسبيز المتتالي -8، الكاسبيز {{6 }}، وانقسام GSDME بعد تحفيز مستقبلات الخلايا التائية ونضج الكالبين المرخص بالكالسيوم للنموذج المؤيد IL-1. تشير نتائجنا إلى أن تكوين مسام GSDME في الخلايا التائية هو آلية لإطلاق السيتوكينات غير التقليدية. يؤدي هذا الاكتشاف إلى تنويع فهمنا للذخيرة الوظيفية والمعدات الميكانيكية للخلايا التائية، كما أن له آثارًا على المناعة المضادة للفطريات.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

تعتبر الخلايا التائية المساعدة (خلايا TH) من العوامل المهمة لاستجابات المستجيب الخاص بمستضد معين من خلال إفرازها للسيتوكينات المتميزة. يتم التعرف على الخلايا التائية من النوع 17 المساعد (خلايا TH17)، على وجه الخصوص، لوظائفها المضادة للفطريات من خلال إفراز السيتوكين المميز الخاص بها IL-17A، والذي ينظمه عامل النسخ للمستقبلات اليتيمة المرتبطة بـ RAR (ROR)- t1. وهم أيضا السبب الرئيسي في التسبب في أمراض المناعة الذاتية2. ث1تم التعرف على 7 خلايا سابقًا لعرض عدم التجانس الوظيفي . يتم ممارسة الوظائف المؤيدة أو المضادة للالتهابات من خلال التعبير التفاضلي لـ IL -17 مع إما الإنترفيرون (IFN) - أو IL -10، على التوالي . بشكل عام، شكل هذا مفهوم ازدواجية خلية TH17 وحفز البحث في الإشارات والأهداف الجزيئية التي تتحكم في الانقسام بين نتيجتي خلية TH17 الوظيفية للتطبيقات العلاجية. ومع ذلك، فإن الفهم العميق للهوية والأساس الميكانيكي لمصائر خلايا TH17 المسببة للأمراض مقابل التنظيم المناعي لا يزال بعيد المنال. آليات المستجيب الإضافية التي لم يتم العثور عليها بعد والتي تتجاوز إنتاج IL-17 قد تعمل أيضًا في خلايا TH17 ذات خصائص مستهدفة مضادة للفطريات أو مضادة للبكتيريا. السيتوكينات IL-1، والتي يمثل IL-1 و IL-1 أبرز أعضائها، تمارس تأثيرات التهابية عميقة. عند إطلاقها من الخلايا المقدمة للمستضد (APCs)، فإنها لا تحفز استجابات التهابية فطرية سريعة فحسب، بل تعمل أيضًا على تنسيق المناعة التكيفية من خلال تعزيز استقطاب خلايا TH17 وإمراض الخلايا التائية عند الارتباط بمستقبل IL-1R1 المشترك 4,10,11 . يؤدي تحضير خلايا TH17 المستقلة IL-1-، والذي تم وصفه مسبقًا أيضًا، إلى إنتاج خلايا TH17 المضادة للالتهابات. وبالتالي فإن IL -1 من المصادر الخلوية الفطرية يعمل كعامل تبديل للانقسام بين مصائر خلايا TH17 المؤيدة مقابل المضادة للالتهابات. على عكس معظم السيتوكينات الأخرى، تفتقر السيتوكينات IL-1 إلى ببتيد الإشارة وبالتالي يتم إفرازها بواسطة آلية غير تقليدية للشبكة الإندوبلازمية (ER) – مستقلة عن جهاز جولجي.

يتطلب Pro-IL-1 انقسامًا إنزيميًا قبل إطلاقه في الفضاء خارج الخلية وتفاعل مستقبله. NLRP3 inflammasome عبارة عن مركب بروتين خلوي متعدد القسيمات يجمع العدوى الميكروبية والتلف الخلوي ويقوم بتجنيد الكاسبيز -1 للانقسام اللاحق المؤيد لـ IL -1 12. يتطلب خروج IL-1 أيضًا انقسام غاز الديرمين D (GSDMD) بوساطة كاسباس وتكوين المسام في عملية تسمى التهاب الحنجرة، وهو شكل التهابي لموت الخلايا 13،14. من ناحية أخرى، يُعتقد أن IL-1 تتم معالجته بشكل مستقل عن الجسيم الالتهابي NLRP3 من خلال نقاط التفتيش التنظيمية التي لا تزال غير مفهومة جيدًا. على الرغم من هذه المسارات المتميزة تمامًا لنضج وإطلاق IL-1 و IL-1 ، يتم إنتاج كلا السيتوكينات بشكل مشترك بواسطة خلايا الجهاز المناعي الفطري، مما يشير إلى وجود سيتوكينات لم يتم تحديدها بعد. الطرق التنظيمية المشتركة. في الدراسة الحالية، نظهر أن مجموعة فرعية من خلايا TH17 البشرية تشترك في سلسلة إشارات تعتمد على NLRP3- للحث على تكوين مسام الغشاء بواسطة GSDME، والذي يخدم الإطلاق الاستبدادي للـ IL-1 الالتهابي. يكشف هذا الاكتشاف عن وضع غير تقليدي لإفراز السيتوكين بواسطة الخلايا التائية البشرية، وبالتالي يؤدي إلى تنويع ذخيرة الخلايا التائية الوظيفية والميكانيكية.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

نتائج

يعد إنتاج IL-1 من سمات خلايا TH البشرية

للتحقيق في عدم تجانس المجموعة الفرعية لخلايا TH17 البشرية والكشف عن الوظائف المتميزة والتحكم الجزيئي فيها، أجرينا تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) لخلية واحدة (scRNA-seq) لخلايا TH17 البشرية المنشطة، والتي تم عزلها خارج الجسم الحي من الدم المحيطي وفقًا لـ تعبيرهم الفريد عن علامات سطح مستقبلات كيموكين . حدد التحليل الاستكشافي عن طريق التقريب والإسقاط المتنوع الموحد (UMAP) وتجميع ليدن لجميع خلايا TH17 ست مجموعات فردية (الشكل 1 أ). تم إثراء مجموعة متميزة ونادرة (6٪) من خلايا TH17 المعبرة عن IL1A بشكل انتقائي في المجموعة 1 (الشكل 1 أ، ب). كشفت مقارنة جميع الجينات في المجموعة 1 مع جميع المجموعات الأخرى عن تنظيم IL1A بشكل كبير (الجدول التكميلي 1). كان هذا غير متوقع نظرًا لأن IL-1 لا يعتبر ينتمي إلى ذخيرة السيتوكينات المستجيبة الأساسية للخلايا التائية، ولكنه يمثل بدلاً من ذلك إشارة خطر فطرية. ومع ذلك، لم يكن IL1A من بين أفضل الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) في المجموعة 1، مما استلزم استراتيجية بحث أعمق لكشف النقاب عن تنظيمه الكبير في مجموعة سكانية فرعية من خلايا TH17 (الشكل التكميلي 1). على مستوى البروتين، يتم أيضًا فصل استنساخ خلايا TH17 إلى IL-1 + و IL-1 - استنساخ الخلايا التائية، وبالتالي دعم عدم تجانس تعبير البروتين IL-1 على مستوى الخلية المفردة داخل عدد خلايا TH17 (الشكل 1 ج). لمقارنة تعبير IL1A بواسطة خلايا TH17 مع التعبير الموجود في أنواع الخلايا المناعية الأخرى، لا سيما منتجي IL-1 الحقيقيين الذين تم الإبلاغ عنهم مسبقًا، قمنا باستجواب العديد من مجموعات بيانات scRNA-seq العامة للخلايا أحادية النواة للدم المحيطي (PBMCs). والمثير للدهشة أن هذا لم يكشف عن أي تعبير IL1A في أنواع مختلفة من الخلايا المناعية لخلايا PBMCs المريحة، بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) وخلايا NKT والخلايا الوحيدة والخلايا الجذعية (الشكل التكميلي 2 أ، ب). حتى الخلايا الوحيدة لم تعرض أي تعبير IL1A على مستوى الخلية المفردة، ما لم يتم تطبيق حافز محدد يحفز IL1A، وتحديدًا عديد السكاريد الدهني (LPS)، على هذه الخلايا (الشكل التكميلي 2 ج، د)، والذي كشف قدرتها على إنتاج IL1A. وارتباط تعبير IL1A مع الاستجابة المناعية الفطرية المستمرة (الشكل التكميلي 2 هـ). ومن المثير للاهتمام أن المقارنة النصية أحادية الخلية لـ DEGs بين خلايا IL1A+ وIL1A- من خلايا TH17 مقابل الخلايا الوحيدة لم تظهر أي تداخل في التعايش الجيني (IL1A وCCL3)، والذي كان يوحي بشدة بوضع مختلف لتنظيم IL1A في T. الخلايا مقابل حيدات (الشكل 1 د). تكشف هذه النتائج مجتمعة عن وجود مجموعة سكانية فرعية متميزة من الخلايا المعبرة عن IL-1 - داخل المجموعة الفرعية لخلايا TH17.

تعتبر المجموعة الفرعية المنتجة لـ IL-1 - من خلايا TH17 محفزة للالتهابات

لاستكشاف الأهمية الفسيولوجية للتعبير IL1A في خلايا TH17 البشرية، أجرينا مقارنة نصية غير متحيزة لخلايا IL1A+ وIL1A-TH17 بعد scRNA-seq. كشف تحليل تخصيب مجموعة الجينات (GSEA) للجينات المتعايشة مع IL1A في خلايا TH17، بالإضافة إلى تحليل التخصيب باستخدام DEGs، عن وجود ارتباط مذهل بين IL1A وتنشيط الخلايا التائية وانتشارها بعد استجواب غير متحيز لجميع مصطلحات علم الجينات المتاحة (GO) ( الشكل 2 أ والشكل التكميلي 3). تحدى هذا الاكتشاف الدور المعين مسبقًا لـ IL-1 في الشيخوخة وموت الخلايا في السياق الجديد للخلايا التائية. كشف تحليل التخصيب أيضًا عن زيادة قوية في تمثيل العديد من مصطلحات GO المتعلقة بـ "الالتهاب"، مما يشير إلى أن تعبير IL1A بواسطة خلايا TH17 ساهم في هوية الخلايا التائية المسببة للأمراض مع أدوار في الأمراض الالتهابية (الشكل 2 أ). تم دعم هذه الفكرة من خلال تنظيم الجينات المشروحة بمصطلح GO "الاستجابة الخلوية للإنترلوكين -1"، مع الأخذ في الاعتبار تأثير التبديل الالتهابي المُبلغ عنه مسبقًا لـ IL-1 على وظيفة خلية TH17 الشاملة والتأثير القمعي من autocrine IL -1 على تعبير IL -10 (البيانات الموسعة الشكل 1-أ). أظهرت المقارنة المباشرة بين خلايا IL1A + وخلايا IL1A-TH17 في جميع المجموعات أن خلايا IL1A + TH17 أظهرت بصمات معززة للالتهابات بشكل ملحوظ، ولكنها خفضت التوقيعات المضادة للالتهابات (الشكل 2 ب) 7. علاوة على ذلك، تم إثراء المجموعة 1، التي تم إثراؤها لخلايا IL1A + TH17. أكثر بكثير من الالتهابات وأقل مضادة للالتهابات من جميع المجموعات الخمس الأخرى، كما هو مبين في GSEA (الشكل 2 ب). من المثير للاهتمام أن المقارنة النصية السائبة للمجموعات الفرعية لخلايا TH17 المؤيدة مقابل المضادة للالتهابات كشفت أن IL1A من بين الجينات المنتظمة الأعلى في المجموعة الفرعية لخلايا TH17 المسببة للالتهابات (الشكل 2 ج ، د والبيانات الموسعة الشكل 2). بدلاً من ذلك، تم تنظيم IL10 بشكل كبير، كما هو متوقع وفقًا للتقارير السابقة . ولوحظ أيضًا هذا الارتباط المتبادل للتعبير IL -1 و IL -10 بواسطة خلايا TH17 على مستوى البروتين عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2 هـ). أظهر تحليل التخصيب باستخدام DEGs فرط تمثيل مسارات KEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينوم) لأمراض المناعة الذاتية مثل "التهاب المفاصل الروماتويدي" و"مرض الأمعاء الالتهابي" (الشكل 2f)، والذي دعم الطبيعة الالتهابية لـ IL1A- معبرًا عن TH17 مجموعة فرعية من الخلايا في الواقع، المرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل الشبابي مجهول السبب (JIA)، وهو شكل التهابي شديد من التهاب المفاصل الروماتويدي لدى الأطفال الذين تم ربط نشوئهم المرضي في السابق مع IL-1 و IL-1 18,19، قد كشفوا بشكل ملحوظ وقوي ارتفاع تعبير IL -1 بواسطة خلايا IL -17+ TH مقارنة بخلايا IL -17+ TH من دم التحكم الصحي (الشكل 2 ز). لم تتم ملاحظة أي زيادة في IFN داخل خلايا IL-17+ TH من دم المرضى الذين يعانون من التهاب مفاصل الأطفال مجهول السبب مقارنةً بالدم المتبرع به، بدلاً من ذلك، على الرغم من الارتباط المُبلغ عنه مسبقًا بين IFN- وإمراضية خلايا TH17 (الشكل 2 ز، اللوحة اليمنى). 4. علاوة على ذلك، أظهر تحليل السائل الزليلي المطابق للدم ترددات عالية جدًا لخلايا IL-1 + TH، مما يشير إلى أن الخلايا التائية، خارج الخلايا الفطرية، يمكن أن تمثل أيضًا مصدرًا خلويًا ذا صلة لخلايا IL{{74} المرتبطة بالمرض } في موقع الالتهاب.

فوائد cistanche tubulosa-تقوية جهاز المناعة

يتم تنظيم تعبير IL-1 بواسطة برنامج TH17

للتحقق مما إذا كان تعبير IL-1 خاصية عامة للخلايا التائية، قمنا بإثراء مجموعات فرعية من خلايا TH الفردية من PBMCs وفقًا لتعبيرها التفاضلي لمستقبلات الكيموكين (البيانات الموسعة الشكل 3) وقارنا IL-1 إفراز. تم إنتاج IL -1 على وجه التحديد بواسطة المجموعة الفرعية لخلايا TH17 ولكن ليس المجموعة الفرعية لخلايا TH1 أو المجموعة الفرعية لخلايا TH2 أو الخلايا التائية التنظيمية (خلايا Treg) (الشكل 3-أ). ومن المثير للدهشة أن مستوى إفرازه عند التحفيز باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ CD3 والمضادة لـ CD28 يتطابق مع مستوى الخلايا الوحيدة البشرية المحفزة باستخدام LPS والنيجيريسين، مما يشير إلى أن خلايا TH17 البشرية، على الرغم من هويتها المناعية التكيفية، تعمل كمصدر رئيسي لإشارة الخطر IL. -1 (الشكل 3 أ). كان التعبير البروتيني IL-1 داخل الخلايا غائبًا في خلايا TH المريحة المعزولة حديثًا ولكنه محفز على تنشيط مستقبل الخلايا التائية (TCR)، مع إثراء كبير في خلايا TH17 مقارنة بخلايا TH1 وTH2 وخلايا Treg الغنية بالخلايا (الشكل 3 ب). ، ج). يبدو أن هذه النتائج خاصة بجهاز المناعة البشري لأن التقارير السابقة استبعدت إنتاج IL -1 بواسطة خلايا T الماوس . دفعنا الارتباط الفريد لـ IL-1 مع المجموعة الفرعية لخلايا TH17 إلى تشريح تنظيم هذا السيتوكين ميكانيكيًا. ومن المثير للاهتمام أنه تم تقليل تعبير IL-1 بسبب تثبيط محدد لـ ROR- t، وهو عامل النسخ الرئيسي لخلايا TH17 (الشكل ثلاثي الأبعاد، هـ) 1. تتماشى هذه البيانات مع وجود مواقع ربط مفترضة لـ ROR- t و ROR- في مناطق المروج والمحسن IL1A (البيانات الموسعة الشكل 4 أ، ب). يتم تحديد مصير مجموعة فرعية معينة من خلايا TH من خلال البيئة المكروية السيتوكينية المستقطبة المميزة أثناء تحفيز الخلايا التائية الساذجة. لاحظنا أعلى تعبير وإفراز داخل الخلايا لـ IL -1 على تحضير الخلايا التائية الساذجة في ظروف استقطاب الخلايا TH17 (IL -1) وتحويل عامل النمو (TGF) -) (الشكل 3f ، ز). ومع ذلك، فإن العلاجات الفردية باستخدام IL-1 أو TGF- وحدها لم تؤدي إلى تعبير IL-1 كبير في الخلايا التائية الساذجة، مما يؤكد التأثير التآزري للسيتوكينات التوافقية لخلايا TH17 على تحريض دي نوفو لـ IL -1 (الشكل التكميلي 4). على النقيض من ذلك، لم تغير ظروف تحضير الخلايا TH1 (IL-12) وTH2 (IL-4) إفراز IL-1 بشكل ملحوظ مقارنة بالإفراز تحت التحفيز في غياب السيتوكينات المستقطبة. توضح هذه النتائج معًا أن الخلايا التائية الساذجة تكتسب القدرة على إنتاج IL-1 من خلال السيتوكينات المستقطبة للخلايا TH17. أظهرت خلايا الذاكرة TH أيضًا زيادة كبيرة في تنظيم السيتوكينات المستجيب IL -1 في البيئات الدقيقة IL -1 و TGF (الشكل 3 ح).

الشكل 1|يمكن لمجموعة فرعية مميزة من خلايا TH17 البشرية التعبير عن IL-1 .

تتميز هوية المجموعات الفرعية لخلايا TH أيضًا بخصائص هجرة مميزة، والتي ترتبط بالتعبير التفاضلي لمستقبلات كيموكين. لاحظنا أنه تم إثراء تعبير IL-1 في خلايا CCR6+ ولكن ليس خلايا CCR6– T وانخفض في خلايا CXCR3– T مقارنةً بخلايا CXCR3+ T، على الرغم من عدم وجود اختلاف في تعبير IL -1 بين خلايا CCR 4+ وCCR4 – T (الشكل 3i). توضح هذه البيانات أن الخلايا المنتجة لـ IL-1 - تعرض نمط الترحيل الذي تم تعيينه مسبقًا للخلايا المنتجة لـ IL-17-15. تُظهر هذه البيانات مجتمعة باستمرار أن IL-1 هي وظيفة فريدة لخلايا TH17 البشرية.

الشكل 2|IL-1 التي تنتج خلايا TH17 هي خلايا مسببة للالتهابات

شكل 3|يقتصر إنتاج IL-1 بواسطة الخلايا التائية على مصير خلية TH17

يعد Calpain شرطًا أساسيًا لإفراز IL-1 بواسطة خلايا TH17

لاستكشاف آلية إفراز IL-1، عالجنا خلايا TH17 باستخدام مثبط تصدير البروتين brefeldin A (BFA) ووجدنا أن إفراز IL-1 لم يتأثر، على عكس السيتوكينات التقليدية، مثل مثل IL-17A (البيانات الموسعة الشكل 5 أ-ج). وهذا يدعم وجود مسار غير تقليدي مستقل عن ER-Golgi لإفراز IL-1 بواسطة الخلايا التائية ويتماشى مع التقارير السابقة لأنواع الخلايا الفطرية . الخاصية الفريدة التي تم تخصيصها مسبقًا لـ IL-1 هي توطينها المتزامن في السيتوبلازم وغشاء البلازما . ومع ذلك، وجدنا أن خلايا TH17، على عكس الخلايا الوحيدة، لم تعرض IL-1 المرتبط بالغشاء (البيانات الموسعة الشكل 5 د). على الرغم من أن انقسام pro-IL-1 مطلوب لتوليد IL-1 نشط حيويًا خارج الخلية، فمن المعروف أن IL-1 يتم إطلاقه بشكل سلبي عند موت الخلية وممارسة إمكاناته النشطة بيولوجيًا بعد الارتباط بـ IL{ {19}}RI في صورته غير المشقوقة أو المشقوقة24. لتحديد ما إذا كان pro-IL-1 يخضع للمعالجة داخل الخلايا من أجل الإطلاق المتحكم فيه بواسطة الخلايا التائية البشرية، قمنا بتقييم الأشكال الكاملة والناضجة من IL-1 في طاف خلايا TH17 المنشطة. لاستبعاد أي حيدات ملوثة كمصدر محتمل لإفراز IL -1 ، أنشأنا استنساخ خلايا TH17 على مدى أسبوعين وأعدنا تحفيزها باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ CD3 والمضادة لـ CD28 لمدة 5 أيام أخرى قبل التطعيم المناعي. في جميع الحيوانات المستنسخة الستة لخلايا TH17 التي تم اختبارها، وجدنا إثراء تفضيلي للشكل المشقوق من IL-1 في طاف الثقافة (الشكل 4 أ). على النقيض من ذلك، أظهرت lysates خلية TH17 إثراء تفضيلي للشكل المؤيد لـ IL-1 غير الملتصق، كما هو متوقع (الشكل التكميلي 5 أ). تستبعد هذه النتائج الإطلاق السلبي لـ pro-IL-1 أثناء نخر الخلايا كطريقة خروج IL-1 الافتراضية في الخلايا التائية، وبدلاً من ذلك، تشير إلى أن خلايا TH17 البشرية يجب أن تمتلك آلية جزيئية لـ pro-IL{{ 46}} الانقسام لتمكين الإطلاق المتحكم فيه خارج الخلية لهذا الجزيء النشط بيولوجيًا بواسطة خلايا T قابلة للحياة ، على عكس الخلايا الفطرية (الشكل التكميلي 5 ب). ومع ذلك، فإن هذا لا يستبعد مساهمة إضافية لنخر الخلايا التائية في تحرير الشكل المؤيد النشط بيولوجيًا لـ IL -1 (الشكل التكميلي 5 أ). يمكن تحفيز معالجة Pro-IL-1 في مواقع الانقسام المتميزة بواسطة العديد من البروتياز 17،25،26. Calpain عبارة عن بروتياز السيستين المعتمد على الكالسيوم والذي يمكن أن يؤدي إلى جزء IL -1 p17 الناضج 26، والذي حددناه هنا. اكتشفنا نشاط كالبين في خلايا TH17. زاد عند التنشيط باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ CD3 والمضادة لـ CD28 (الشكل 4 ب). كان إفراز IL -1 بواسطة خلايا TH17 يعتمد على نشاط الكالبين الداخلي للخلايا التائية لأن تثبيط الكالبين الدوائي قلل من إفراز IL -1 عن طريق خلايا TH17 المنشطة في الفضاء خارج الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 4 ج) . في المقابل ، أدى تثبيط الكالبين إلى تراكم الخلايا المؤيدة لـ IL -1 (الشكل 4 د). لتأكيد اعتماد إفراز IL-1 على الكالبين، قمنا أيضًا بإخراج الكالبين وراثيًا في خلايا TH17 البشرية باستخدام تكرارات متناظرة قصيرة متفاوتة المسافات بانتظام (CRISPR) –Cas9. كشف هذا عن دور CAPN2، ولكن ليس CAPN1، في إفراز IL-1 بواسطة خلايا TH17 البشرية (الشكل 4 هـ). في المقابل ، لم يكن إفراز IL -1 الناجم عن LPS- / nigericin بواسطة حيدات يعتمد على calpain (الشكل 4f). كانت هذه البيانات متوافقة مع التعبير التفضيلي لـ CAPN2 ولكن ليس CAPN1 بواسطة مجموعات فرعية من الخلايا التائية البشرية على عكس الخلايا الجذعية، والتي عرضت نمط تعبير جيني كالبين معكوس (الشكل التكميلي 6). زاد إفراز IL-1 في خلايا TH17 عند تراكم الكالسيوم داخل الخلايا وتثبيط sarco-/ER Ca2+ ATPase مع thapsigargin (الشكل 4g) وانخفض في عملية إزالة معدن ثقيل من الكالسيوم خارج الخلية مع (إيثيلينبيس (أوكسينيتريد) ) رباعي الأسيتات (EGTA) (الشكل 4 ح)، بما يتوافق مع الوظيفة المعتمدة على الكالسيوم لإفراز الكالبين وإفراز IL -1 المعتمد على TCR. أظهرت هذه البيانات معًا أن نشاط التحلل البروتيني لبروتياز كالبين المعتمد على الكالسيوم هو شرط أساسي لإفراز IL-1 غير التقليدي بواسطة خلايا TH17 البشرية التي يتم تنشيطها بواسطة TCR.

يتم تنظيم إفراز IL-1 بواسطة خلايا TH17 عن طريق تنشيط NLRP3 inflammasome

على الرغم من الدور الأساسي لـ calpain في النضج المؤيد لـ IL-1، إلا أن الآلية المؤدية إلى الخروج خارج الخلية لـ IL-1 المشقوق ظلت غير معروفة وبالتالي تمت معالجتها بعد ذلك. ارتبط إطلاق IL-1 خارج الخلية بواسطة الخلايا النخاعية سابقًا بتنشيط NLRP3 inflammasome والنشاط غير الأنزيمي لـ caspase-1 وإطلاق IL-1 16,27. اختبرنا ما إذا كانت خلايا TH17 البشرية تمتلك السقالة الجزيئية للجسيم الالتهابي NLRP3 ووجدنا تعبيرًا بروتينيًا لـ NLRP3 وجزيء المحول، وهو بروتين يشبه البقع المرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على CARD (ASC)، في خلايا TH17 البشرية (البيانات الموسعة الشكل 6 أ، ب). لاحظنا التنشيط الالتهابي المستمر في خلايا TH17 المنشَّطة بـ TCR من خلال تحديد بقع ASC باستخدام تقنية ImageStream (الشكل 5 أ، ب) 28،29. ومن اللافت للنظر أن الترددات المتزايدة لبقع ASC كانت محصورة بشكل فريد في المجموعة الفرعية لخلايا TH17 (الشكل 5 ب، اليسار). حتى أن خلايا TH17 قد قامت بتقريب تكوين بقع ASC من الخلايا البلعمية المحفزة بـ LPS وATP (الشكل 5 ب، على اليمين). في المقابل، عرضت مجموعات فرعية من خلايا TH1 وTH2 مستويات ASC-spect الخلفية (الشكل 5 ب، اليسار). علاوة على ذلك، تم إلغاء تكوين ASC-speck وNLRP3- تمامًا في وجود مثبط NLRP3 المحدد للجسيم الالتهابي MCC950، مما يثبت وجود تنشيط NLRP3 المستمر للجسيم الالتهابي في خلايا TH17 (الشكل 5 ب، البيانات اليسرى والممتدة الشكل 1). 6 ج). تم دعم المشاركة الانتقائية للـ NLRP3 الالتهابي بواسطة خلايا TH17 بشكل أكبر من خلال الحث القوي لنصوص NLRP3 على تحفيز الخلايا التائية في وجود السيتوكينات المستقطبة للخلايا TH17 IL -1 و TGF- (الشكل 5 ج). الأهم من ذلك، تم تقليل إفراز IL-1 بواسطة خلايا TH17 بشكل كبير عن طريق تثبيط محدد للجسيم الالتهابي NLRP3 باستخدام MCC950 (الشكل 5 د)، مما يدل على الدور الحاسم للجسيم الالتهابي NLRP3 في إفراز IL-1 بواسطة خلايا TH17 البشرية. Caspase -1 هو بروتين المستجيب الكنسي في مجمع NLRP3 الالتهابي . لاحظنا تعبيرًا مؤيدًا لـ caspase -1 في خلايا TH17 البشرية النشطة (الشكل 5 هـ). ومع ذلك ، على عكس النتائج التي توصلت إليها الخلايا الوحيدة المحفزة بـ LPS والنيجيريسين ، لم يتم اكتشاف أي كاسباس مشقوق -1 في محللات خلايا TH17 البشرية (الشكل 5 هـ). تم تأكيد هذه الملاحظة من خلال عدم وجود تلطيخ caspase -1 FLICA في خلايا TH17 التي تم تحفيزها في وجود أو عدم وجود IL -1 الذي يعزز محفزات السيتوكين (البيانات الموسعة الشكل 7 أ – هـ). استبعدنا أيضًا الإطلاق خارج الخلية لـ caspase -1 بواسطة ELISA بعد تحفيز خلايا TH17 باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ CD3 والمضادة لـ CD28 لمدة 5 أيام (الشكل 5f). حتى في ظل وجود المحفز IL-1 IL-1 ، لم يكن إفراز caspase -1 محفزًا وظل منخفضًا مثل ذلك في حيدات الراحة (الشكل 5f). التثبيط الدوائي لـ caspase -1 مع Ac-YVAD-CMK لم يقلل من إفراز IL-1 في وجود أو عدم وجود تحريض IL-1 بواسطة IL-1 . بدلاً من ذلك، لاحظنا ارتفاعًا طفيفًا في إفراز IL-1 عند تثبيط كاسباس -1 (الشكل التكميلي 7 أ، ب). الأهم من ذلك أن خلايا TH17 لم تظهر أي تغيير في إفراز IL-1 عند استنفاد CRISPR-Cas9- هندسيًا لتعبير CASP1 (الشكل 5 ز). تماشيًا مع غياب الكاسبيز النشط بيولوجيًا -1، لم نلاحظ أي إفراز لـ IL-1 بواسطة خلايا TH17 البشرية. كان هذا على النقيض من الحالة في الخلايا الوحيدات، التي أظهرت إفراز IL-1 المعتمد على الكاسبيز عند التحفيز باستخدام LPS وATP (البيانات الموسعة الشكل 7f). علاوة على ذلك، لم يكن هناك IL-1 داخل الخلايا يمكن اكتشافه أو تحفيزه بواسطة السيتوكينات المستقطبة IL-1 - في خلايا TH17 أو مستنسخات خلايا TH17 أو يمكن اكتشافه في خلايا TH17 المنشطة عن طريق تحليل scRNA-seq (البيانات الموسعة الشكل 7g,h, أنا). كان هذا على النقيض من اكتشاف الخلايا الوحيدة، التي تعايشت مع IL-1 و IL-1 على مستوى الخلية الواحدة، بما يتوافق مع الإفراز المقترح مسبقًا ونمط التنظيم الأساسي المفترض لكل من IL-1 السيتوكينات (البيانات الموسعة الشكل 7 ز) 16،27. بشكل تراكمي، توضح هذه البيانات أن خلايا TH17 البشرية تنتج IL-1 بشكل مستقل عن caspase-1 و IL-1 ، على عكس الوحيدات والخلايا المناعية الفطرية الأخرى المفترضة، على الرغم من التورط الواضح للجسيم الالتهابي NLRP3.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

يخرج IL-1a من خلايا TH17 عبر مسام GSDME

تنتمي غازديرمين إلى عائلة من جزيئات المستجيب المكونة للمسام التي تم تحديدها مؤخرًا والتي تمكن من إطلاق وسطاء الالتهابات . كشف تحليلنا للنسخة النصية عن تنظيم انتقائي للتعبير GSDME في مجموعة فرعية من خلايا TH17 المحفزة للالتهابات IL-1 -، ولكن لا يوجد تنظيم لأي عضو آخر في عائلة الغاسترين (الشكل 6 أ). كان هذا مفاجئًا بالنظر إلى أن تعبير GSDME لم يتم الإبلاغ عنه من قبل في الخلايا التائية الأولية. في المقابل، GSDMD، المعروف أنه يتم تنظيمه بواسطة NLRP3 inflammasome وأنه هدف لـ caspase -1 (المرجع 31)، لم يتم تنظيمه، مما يدعم فكرة الإشارة غير الملتهبة NLRP3. سبق أن ثبت أن GSDME يشكل مسام غشائية في الخلايا المناعية الفطرية التي قد تكون بمثابة قنوات لإطلاق الإنذارات خارج الخلية والبدء في موت الخلايا الحرارية المشابهة لـ GSDMD32. لاختبار ارتباط GSDME بالمجموعة الفرعية لخلايا TH17، قمنا بتقييم ما إذا كانت السيتوكينات المستقطبة لخلايا TH17 تنظم GSDME. فقط مزيج TGF- مع IL-1 (TH17)، ولكن ليس IL-12 (TH1) أو IL-4 (TH2)، زاد مستويات نسخة GSDME كما تم تقييمها عن طريق النسخ العكسي - الكمي PCR (RT – qPCR) (الشكل 6 ب). تم دعم ذلك من خلال وجود مواقع ربط مفترضة لعوامل النسخ المرتبطة بالخلية TH17 ROR- و BATF (عامل نسخ سحاب الليوسين الأساسي، يشبه ATF) في المناطق المروجة لـ GSDME (البيانات الموسعة الشكل 8 أ، ب) . في المقابل، لم يتم تنظيم تعبير GSDMD بواسطة السيتوكينات المستقطبة للخلايا التائية (الشكل التكميلي 8). دفعتنا هذه النتيجة إلى تقييم تعبير GSDME على مستوى البروتين في خلايا TH17 البشرية. كان النموذج المؤيد لـ GSDME قابلاً للتحفيز على تنشيط TCR. كان تحريض بروتين GSDME استجابةً لهذه الإشارة المناعية التكيفية غير متوقع، ولكنه كان مدعومًا أيضًا بوجود مواقع ربط مفترضة لعوامل النسخ المستجيبة لإشارات TCR مثل NFAT وFOS وJUN وRELA في المناطق المروجة لـ GSDME (البيانات الموسعة الشكل 8 أ). ،ب). تم التعبير عن GSDME في وقت مبكر بعد 24 ساعة من التحفيز متعدد النسيلة. كان GSDME المكون للمسام N- المشقوق قابلاً للاكتشاف في نقاط زمنية متأخرة ، 3-4 أيام بعد تحفيز TCR لخلايا TH17 (الشكل 6 ج). تم إحداث GSDMD كامل الطول بشكل متزامن عند تنشيط الخلايا التائية. في المقابل، لم يلاحظ أي انقسام GSDMD، كما هو متوقع من غياب إفراز caspase -1 و IL -1، مما يترك دور GSDMD في خلايا TH17 مفتوحًا لمزيد من التحليل (الشكل 6 ج). نهدف بعد ذلك إلى استكشاف ما إذا كانت مسام GSDME تعمل كقنوات لإطلاق IL-1 خارج الخلية في خلايا TH17. لذلك قمنا بإخراج GSDME باستخدام تقنية CRISPR–Cas9 وراقبنا إطلاق IL-1 في الطاف بمرور الوقت بواسطة ELISA. إن غياب GSDME، ولكن ليس GSDMD، يمنع بشكل كبير إطلاق IL -1 بواسطة خلايا TH17 (الشكل 6 د). يوضح هذا بوضوح أن تكوين مسام GSDME يعمل كآلية لإطلاق IL-1 غير التقليدي بواسطة خلايا TH17 البشرية.

الشكل 4|يعد Calpain شرطًا أساسيًا لإطلاق IL -1 المشقوق بواسطة خلايا TH17 البشرية

شكل 5|ينظم التنشيط الالتهابي NLRP3 غير التقليدي إنتاج IL-1 بواسطة خلايا TH17 البشرية

يعمل شلال الانقسام caspase-8/3 GSDME على تمكين إفراز NLRP3- المعتمد على IL-1

اكتشفنا بعد ذلك إمكانية وجود تداخل ميكانيكي بين تنشيط NLRP3 الملتهب وانقسام GSDME في خلايا TH17 البشرية. لقد ثبت مؤخرًا أن Caspase -3 يلتصق بـ GSDME، والذي يعد بدوره هدفًا لـ NLRP3 inflammasome Interactor caspase -8 (المراجع 34،35). في الواقع، تم اكتشاف كل من pro-caspase-8 وpro-caspase-3 في خلايا TH17. لقد وجدنا أن انقسام كلا الكاسبيز حدث عند تحفيز TCR وسبق انقسام GSDME (الشكل 6 هـ). في المقابل، لم يتم اكتشاف أي منتجات مشقوقة من كاسباس -8 وكاسباس -3 في حيدات محفزة بالنيجيريسين وLPS (الشكل 6 هـ). لتأسيس دور مسبب لهذه الكاسبيزات في انقسام GSDME وإفراز IL-1 بواسطة الخلايا التائية، قمنا بحظر نشاط كاسباس -3 أو كاسباس -8 دوائيًا باستخدام مثبط Z-DEVD -FMK أو Z-IETD-FMK، على التوالي. أدى تثبيط نشاط caspase -8 باستخدام Z-IETD-FMK إلى إلغاء انقسام الهدف المصب caspase -3، وذلك تمشيا مع التقارير السابقة عن أنواع الخلايا الأخرى . قلل كلا العلاجين من انقسام GSDME مع إلغاء إفراز IL -1 أيضًا (الشكل 6f-i والبيانات الموسعة الشكل 9 أ، ب). بدلاً من ذلك، لم يؤثر تثبيط كاسباس -1 على كاسباس -3 أو انقسام GSDME (الشكل التكميلي 9). أظهرت هذه البيانات بوضوح أن محور caspase-8 –caspase-3 –GSDME كان يعمل في خلايا TH17 البشرية عند تنشيط TCR وأنه ينظم إفراز IL-1 في هذه الخلايا. لإنشاء الرابط أخيرًا بين سلسلة الانقسام المحلل للبروتين هذه والجسيم الالتهابي NLRP3، طبقنا MCC950 على خلايا TH17 المحفزة، والتي أنتجت بالفعل انخفاضًا كبيرًا في انقسام الكاسبيز -3 وانقسام GSDME في اليوم الخامس (الشكل 6f،ز). والبيانات الموسعة الشكل 9 ج). ومع ذلك، كان الانخفاض في انقسام كاسباس -8 أقل وضوحًا في نفس نقطة التحليل الزمنية، والذي كان يتماشى مع نافذة وقت التنشيط السابقة (الشكل 6 هـ، و). باختصار، أدى التثبيط المستهدف لكل لاعب جزيئي فردي إلى إنشاء سلسلة NLRP3 inflammasome-caspase-8– caspase-3–GSDME باعتبارها المسار المحلل للبروتين المتضمن في الإطلاق خارج الخلية لـ IL-1 النشط بيولوجيًا بواسطة الإنسان خلايا TH17.

شكل 6|تؤدي سلسلة الانقسام NLRP3–casp8/3 إلى مسام GSDME لإصدار IL-1

تتميز خلايا TH17 بالمرونة في مقاومة التهاب الحنجرة على الرغم من مسام GSDME

سبق أن ارتبط تكوين مسام جاديرمين بموت الخلايا الحمرة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا . لقد وجدنا تعبيرًا عن وحدة N-GSDME المكونة للمسام المشقوقة في غشاء البلازما ولكن ليس في العصارة الخلوية، والتي تدعم وظيفة تكوين المسام لـ GSDME في الخلايا التائية (الشكل 7 أ). من المثير للدهشة أن المقارنة النصية لخلايا TH17 البشرية السائبة التي تم تحريرها من الجينات GSDME وCRISPR-Cas9 والتي تعاني من نقص GSDME بواسطة GSEA استبعدت الاختلافات في أشكال مختلفة من موت الخلايا؛ ومع ذلك، على وجه الخصوص، فقد كشفت أن العمليات والمسارات المتأثرة في خلايا TH17 التي تعاني من نقص GSDME كانت مرتبطة بشكل أساسي بالجينات التي تتحكم في نقل الغشاء، وذلك تمشيا مع قنوات تشكيل المسام التي شكلتها N-GSDME (الشكل 7 ب والشكل التكميلي 10). . دعمت المقارنة النصية أحادية الخلية لخلايا TH17 الفردية المختارة للوجود مقابل عدم وجود تعبير GSDME جدوى خلايا TH17 المعبرة عن GSDME من خلال إثراء مجموعة الجينات الخاصة بها للتكاثر (الشكل 7 ج). لقد تحققنا أخيرًا من صحة مرونة خلايا TH17 البشرية التي تعبر عن GSDME في الإصابة بالتحلل الحراري من خلال إظهار عدم وجود أي اختلاف في إطلاق هيدروجين اللاكتات (LDH) عبر خلايا TH17 المحررة جينيًا CRISPR-Cas9 والناقصة GSDME والسليمة GSDME على تحفيز TCR (الشكل .7 د). قمنا بعد ذلك بمقارنة خلايا IL-1 + وIL-1 - TH17 فيما يتعلق بقدرتها على البقاء وإمكانية الانتشار، لأن خلايا TH17 لم تعرض أي تعبير سطحي لـ IL-1 على النقيض من IL{{36 }} إنتاج خلايا من سلالات خلوية أخرى، مثل الخلايا الوحيدة (البيانات الموسعة الشكل 5 د). استلزمت هذه المقارنة بين IL-1 + وIL-1 – خلايا TH17 إنشاء اختبار إفراز IL-1 - محلي الصنع، مما يتيح عزل خلايا TH17 القابلة للحياة IL-1 + - عن طريق التقاط الخلايا المفرزة autocrine IL-1 إلى سطح الخلية بعد خلات phorbol -12- ميريستات -13- (PMA) وتحفيز الأيونوميسين. لم يلاحظ أي اختلاف في كفاءة استنساخ خلايا TH17 التي تم إيداعها كخلايا مفردة بعد الفرز لوجود أو عدم وجود السطح IL -1 (الشكل التكميلي 11). استبعد هذا الاكتشاف الاختلافات في صلاحية وتوسيع خلايا IL -1 + و IL -1 - TH17 على مستوى الخلية المفردة. قمنا أيضًا بإعادة استنساخ TH17 التي تم فحصها، بناءً على درجات متفاوتة من تعبير IL-1 داخل الخلايا، وراقبنا كفاءة الاستنساخ الخاصة بكل منها. إذا كان إطلاق IL-1 الممكّن بواسطة GSDME مرتبطًا بموت الخلايا الحمرة، فإن العلاقة العكسية بين تعبير IL-1 في استنساخ الخلايا التائية وتواتر الحيوانات المستنسخة المتنامية عند إعادة استنساخها الفردي (كفاءة الاستنساخ) كانت من المتوقع. ومع ذلك، كانت كفاءة استنساخ الخلايا التائية مستقلة عن مستويات التعبير IL-1 في استنساخ الخلايا TH17 وكانت بدلاً من ذلك مشابهة لتلك الخاصة باستنساخ الخلايا التائية، والتي تم اختيارها على أساس مستويات التعبير المتفاوتة لـ IFN- في غياب IL -1 التعبير المشترك (الشكل 7 هـ). الأهم من ذلك أن استنساخ خلايا IL -1 + TH17 استمر في إعادة التعبير عن IL -1 في دورات إعادة تنشيط TCR المتكررة (الشكل 7f). وبالتالي، تم استبعاد الخسارة المرتبطة بموت الخلايا للخلايا المنتجة لـ IL-1 - من مجموعة الخلايا التائية المستنسخة الخاصة بها عند الاستعادة. والجدير بالذكر أن هذه النتيجة تشير إلى وجود ذاكرة خلوية للخلية التائية من أجل IL-1 المحفز. لقد أجرينا مقارنة نصية بين خلايا IL-1 + السائبة وIL-1 - TH17 ولاحظنا إثراءًا أكبر لمجموعات جينات الانتشار في IL-1 + مقارنة بخلايا IL-1 - TH17 الحيوانات المستنسخة (الشكل 7 ز). أكدت المقارنة النصية أحادية الخلية لخلايا IL1A + مقابل خلايا IL1A – TH17 التخصيب النسخي للتكاثر. كان هذا هو الحال أيضًا بالنسبة للمقارنة بين مجموعة ليدن 1، والتي تم إثراؤها لخلايا TH17 المعبرة عن IL1A والتوقيعات الالتهابية، مع جميع المجموعات الأخرى (الشكل 7 ح). عرضت خلايا IL-1 + TH17 تعبير Ki67 أعلى وفقًا لتحليل التدفق الخلوي مقارنة بـ IL-1 - نظيراتها بعد 5 أيام من التحفيز متعدد النسيلة (الشكل 7i)، مما يدعم مرة أخرى فكرة أنه في خلايا TH17 البشرية IL{ {96}} لا يرتبط الخروج بموت الخلايا، على عكس الخلايا الفطرية. بشكل تراكمي، تستبعد هذه البيانات ارتباط إنتاج IL-1 بموت الخلايا (البيروبتوتيك) حتى على مستوى الخلية المفردة وتثبت أن الخلايا التائية البشرية لديها ذاكرة خلوية لإنتاج IL-1 عند إعادة تحفيز TCR المتكررة .

يساهم IL-1 المشتق من الخلايا التائية في دفاع المضيف المضاد للفطريات

إن اكتشافنا أن خلايا TH17 البشرية تنتج إشارة الخطر الفطرية IL-1 وتعيد توظيف آلية الإشارة الفطرية لإطلاقها خارج الخلية مما يؤدي إلى طمس التمييز بين الاستجابات المناعية التكيفية مقابل الاستجابات المناعية الفطرية، وبالتالي توسيع الذخيرة الوظيفية الشاملة للخلايا التائية. الميزة الحاسمة التي تظل مميزة لاستجابات الذاكرة التكيفية هي خصوصية المستضد الذي يتمتع بـ TCR. لذلك قمنا بالتحقق مما إذا كانت قدرة خلايا TH17 البشرية على إنتاج IL-1 مقتصرة على خصائص مستضد محددة. سبق أن ثبت أن خلايا TH17 غنية بدرجة عالية داخل الخلايا الخاصة بـ C. albicans ومستضدات المكورات العنقودية الذهبية . ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا تعبيرًا وإفرازًا أكبر بكثير لـ IL -1 بواسطة C. albicans مقارنة باستنساخ خلايا TH17 الخاصة بـ S. aureus (الشكل 8 أ). قمنا بعد ذلك بالتحقق مما إذا كانت الخلايا التائية الساذجة التي تتعرف على C. albicans بدلاً من S. aureus سيتم تحضيرها بواسطة مستضدها المشابه لإنتاج IL -1 بشكل انتقائي. تم زراعة خلايا TH الساذجة (CD45RA + CCR 7+) مع وحيدات ذاتية نابضة بمستضدات C. albicans أو S. aureus المعطلة للحرارة أو تم تحفيزها متعدد النسيلة باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ CD3 و CD28 ، ثم تم استنساخها في اليوم السابع. مع الخلايا المغذية خيفي. تمت إعادة تحفيز جميع الحيوانات المستنسخة في اليوم 14 باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ CD3 و CD28 لمدة 5 أيام من أجل ELISA لطافها. ومن اللافت للنظر أننا وجدنا أن C. albicans ، ولكن ليس S. aureus أو تنشيط TCR متعدد النسيلة ، تسبب في إنتاج de novo IL -1 في خلايا TH17 البشرية المتمايزة (الشكل 8 ب). لذلك فإن نهجنا المشترك في الاستدعاء خارج الجسم الحي ونهج التحضير في المختبر يثبت أن القدرة على إنتاج IL-1 تقتصر على الخلايا التائية ذات خصوصية TCR لـ C. albicans. لقد اختبرنا أخيرًا ما إذا كانت القدرة المميزة لخلايا TH17 الخاصة بـ C. albicans على إنتاج IL -1 مرتبطة بدور فسيولوجي في دفاع المضيف المضاد للفطريات. من أجل هذا، قمنا بزراعة حيدات بشرية مع مواد طافية من خلايا TH17 البشرية بعد إعادة تحفيزها متعدد النسيلة باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ CD3 والمضادة لـ CD28 لمدة 5 أيام. لاحظنا زيادة كبيرة في البلعمة من المبيضة المسمى FITC بواسطة حيدات باستخدام قياس التدفق الخلوي. الأهم من ذلك، أن زيادة بلعمة C. albicans بواسطة طاف خلية TH17 كانت تعتمد على IL-1 كما هو موضح من خلال الإلغاء الكبير لبلعمة C. albicans إذا كانت طاف خلية TH17 خالية من IL-1 بعد الامتصاص المناعي أو CRISPR-Cas{ {46}} استنزاف IL -1 المستهدف في خلايا TH17 (الشكل 8 ج). أثبتت الخلايا الحية في التصوير المختبري أيضًا زيادة امتصاص وإزالة C. albicans بواسطة حيدات في وجود IL -1 - يحتوي على طاف خلية TH17 (الشكل 8 د ، بيانات الفيديو). مجتمعة، تشير هذه النتائج بقوة إلى أن خلايا TH17 تزيل عدوى المبيضة البيضاء ليس فقط من خلال إنتاجها لـ IL-17، كما كان يُعتقد سابقًا، ولكن أيضًا، إلى حد كبير، من خلال قدرة مجموعة فرعية فريدة من خلايا TH17 على إنتاج IL-1 . بشكل تراكمي، فإن النتائج التي تحدد تكوين مسام GSDME في الخلايا التائية كإستراتيجية خروج لـ IL-1 المسببة للالتهابات وتنظيم GSDME بواسطة محور NLRP3 inflammasome–caspase-8–caspase-3 تكشف عن وجود جديد وضع إفراز السيتوكينات في الخلايا التائية المرتبط بمجموعة فرعية من الخلايا المسببة للالتهابات من خلايا TH17 ذات خصائص TCR المضادة للفطريات. يوفر هذا أهدافًا علاجية جديدة لتعديل خلايا TH17 البشرية ذات الصلة بالدفاع المضاد للفطريات وقد تشارك أيضًا في التسبب في الأمراض الالتهابية المزمنة.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

مناقشة

باختصار، تكشف النتائج التي توصلنا إليها عن مسار بيولوجي غير معروف سابقًا وطريقة إفراز السيتوكينات في الخلايا التائية البشرية التي تعمل على تنويع الوظائف العامة لمجموعة الخلايا التائية. لقد وجدنا أن تعبير IL-1 كان محصورًا بشكل فريد في مصير خلية TH17، كما يتضح من تعايشه مع IL-17A، والتنظيم بواسطة ROR- t، والتحريض بواسطة السيتوكينات المجهزة لخلايا TH17 IL{{ 6}} وTGF- ومن خلال ملف تعريف التعبير عن مستقبلات الكيمياء المرتبطة بالخلايا TH17. تتوافق هذه النتائج مع وجود مواقع ربط لـ ROR- t و ROR- في مناطق المعزز والمروج IL1Α كما هو موضح في هذه الدراسة ومع مواقع ربط ROR- t المبلغ عنها مسبقًا في منطقة المروج NLRP3 . لاحظنا أيضًا أن السيتوكينات المجهزة للخلايا TH17 زادت من تعبير NLRP3 و GSDME. وفقًا لذلك، عرض المنظمون الرئيسيون لمصير خلية TH17، مثل ROR- وBATF، بالإضافة إلى عوامل النسخ المتعددة المحفزة لـ TCR، مواقع ربط مفترضة في مناطق مُحسِّن GSDME. وبالتالي فإن استقطاب خلية TH17 لم يشجع فقط تعبير IL-1 ولكن أيضًا على خروجه خارج الخلية (البيانات الموسعة الشكل 10، ملخص رسومي). بشكل غير متوقع، وجدنا NLRP3 inflammasome نشطًا وتم إعادة توظيفه لإطلاق IL-1 بدلاً من IL-1 في خلايا TH17 المنشطة بواسطة TCR. على عكس الخلايا الفطرية، فإن الخلايا التائية ليست متخصصة في استشعار الخطر الفطري، والذي يُعرف بأنه يؤدي إلى تجميع مكونات NLRP3 الملتهبة. ومع ذلك، فقد ثبت سابقًا أن ارتفاع السيتوبلازم Ca 2+ يتخطى إشارات الخطر الفطرية لتنشيط NLRP3 الجسيم الالتهابي . يتوافق هذا مع اكتشافنا أن تنشيط TCR، المصحوب بتدفق الكالسيوم، يعد متطلبًا لإطلاق IL-1 بواسطة خلايا TH17 البشرية. لاحظنا أن خلايا TH17 تتفاعل مع سلسلة إشارات NLRP3 بديلة عبر تفاعل caspase-8. ربما تم تسهيل ذلك من خلال غياب انقسام caspase -1 لأنه تم إثبات توظيف caspase -1 التنافسي مقابل caspase -8 سابقًا . لقد وجدنا أيضًا pro-caspase-1 وGSDMD غير مشقوق في خلايا TH17 البشرية، ولكن لا يوجد دليل على انقسام NLRP3 المنظم للالتهاب أو إنتاج IL-1. يثير التعبير عن سلائفها سؤالًا حول ما إذا كانت إشارات الالتهاب NLRP3 الكلاسيكية وإطلاق IL-1 قد تعمل أيضًا في خلايا TH17 البشرية إذا تم تطبيق محفزات بديلة لم يتم تحديدها بعد. هذا يعني أن الآليات المضادة للتنظيم المعتمدة على كاسباس -8- مقابل كاسباس -1- قد تتحكم في انقسام إنتاج IL-1 مقابل إنتاج IL-1 بواسطة الخلايا التائية، مما يعزز الأدوار المقترحة مسبقًا للجسيم الالتهابي NLRP3 في إطلاق IL -1 في خلايا TH1 البشرية وخلايا TH17 الفأرية . كانت الملاحظة المثيرة للاهتمام لدراستنا هي تحديد تعبير GSDME والانقسام في الخلايا التائية. وكشف هذا أن إفراز السيتوكينات غير التقليدية عبر مسام الغشاء يمكن أن يحدث في الخلايا التائية. ارتبطت العديد من الوظائف التي تم تعيينها مؤخرًا لـ GSDME بالتهاب الحنجرة والتحسين اللاحق لموت الخلايا السرطانية والبيئة المكروية الالتهابية 32،44. من المثير للدهشة أننا وجدنا أن خلايا TH17 المعبرة عن GSDME أظهرت بدلاً من ذلك قابلية البقاء المحفوظة والتكاثر المستمر على تحفيز TCR المتكرر مقارنةً بالخلايا التائية التي تعاني من نقص GSDME. وقد لوحظت نفس النتائج بالنسبة لـ IL -1 + مقارنة بخلايا IL -1 - T. كانت هذه النتائج غير متوقعة، مع الأخذ في الاعتبار أن إنتاج IL-1 يعتبر حتى الآن سمة مميزة للشيخوخة وبالتالي للخلايا المتوقفة عن التكرار أو الموت. يثير هذا فكرة أن إشارة الخطر IL-1 يمكن أن تكون جزءًا من ذاكرة السيتوكينات المرتبطة بالخلايا التائية والتي يمكن إعادة استثارتها عند التعرف على المستضد المشابه . علاوة على ذلك، قد تخدم مسام GSDME وظيفة فسيولوجية لتمكين خلايا TH17 من إطلاق جزيئات إضافية غير محددة بعد تتجاوز IL-1 والتي يتم تحديدها حسب حجمها أو شحنتها. سيكون هذا متسقًا مع نتائج المقارنة النصية غير المتحيزة لخلايا GSDME السليمة أو CRISPR-Cas9-المهندسة، وخلايا TH17 التي تعاني من نقص GSDME، والتي كشفت عن أدوار متعددة لـ GSDME في نقل الغشاء ولكن ليس موت الخلايا. الآلية التي يتم من خلالها الحفاظ على صلاحية وذاكرة السيتوكين IL -1 طويلة المدى في الخلايا التائية ذات مسام GSDME، لا يزال يتعين استكشافها في المستقبل. يثير توفر IL-1 من مصادر خلوية مختلفة، خاصة من APCs الفطرية، تساؤلًا حول المساهمة النسبية لـ IL-1 المشتقة من الخلايا التائية في صحة الإنسان ومرضه. على الرغم من أن خلايا IL-1 + T لا تشكل سوى مجموعة فرعية صغيرة ضمن سلالة الخلايا التائية، إلا أن قدرتها على إنتاج IL-1 كانت قابلة للمقارنة كميًا مع قدرة الخلايا الوحيدة المحفزة بـ LPS، مما يدعم المفهوم الجديد القائل بأن الخلايا التائية يمكن أن تخدم كمصدر ذي صلة بالالتهابات IL-1 . تكشف النتائج التي توصلنا إليها من التحليلات النصية والوظيفية أن IL-1 مرتبط بالمصير الالتهابي لخلايا TH17. أظهرت المجموعة الفرعية IL-1 + من خلايا TH17 البشرية بصمات نصية لتعزيز القدرة المرضية الالتهابية والارتباطات بالأمراض الالتهابية المزمنة. إن التعبير المعزز بشكل كبير عن IL-1 من خلال تعميم خلايا TH17 من المرضى الذين يعانون من التهاب مفاصل الأطفال مجهول السبب وتوطينهم الوفير في السائل الزليلي الملتهب يدعم هذه الإمكانية المسببة للأمراض لمجموعة IL-1 + الفرعية من خلايا TH17. لا يزال يتعين إنشاء علاقة سببية صارمة بين خلايا IL-1 - المنتجة لخلايا TH17 والتسبب في التهاب مفاصل الأطفال مجهول السبب، ويتم التحقق من صحة التأثير النسبي لخلايا IL-1 + TH17 في التجارب السريرية المستقبلية. وكانت الملاحظة اللافتة للنظر هي أن إنتاج IL-1 بواسطة الخلايا التائية يتم ربطه بشكل وثيق من خلال خصوصية TCR الخاصة بها. على الرغم من أن إنتاج IL-1 من المصادر الخلوية الفطرية يتم تشغيله بواسطة محفزات إجهاد غير محددة، فقد وجدنا أن إنتاج IL-1 بواسطة خلايا TH17 البشرية يرتبط بخصوصية TCR لـ C. albicans. بدلاً من ذلك، أظهرت خلايا TH17 الخاصة بالمكورات العنقودية الذهبية انخفاضًا ملحوظًا في إنتاج IL-1. تتوافق هذه النتائج مع المتطلبات التفاضلية لـ IL-1 لتوليد خلايا C. albicans - ولكن ليس خلايا TH17 الخاصة بـ S. aureus، كما تم الإبلاغ سابقًا 4، وبالتالي، مع الدور الحاسم لـ IL {{126} } لتحريض تعبير IL-1، كما هو مذكور هنا. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن إفراز IL-1 يعتمد على تحفيز TCR وإشارات الكالسيوم، مما يؤكد ارتباطه الوثيق بإشارات مناعية تكيفية محددة عبر TCR. من المعروف أن خلايا TH17 هي الأبطال في إزالة عدوى C. albicans من خلال إفرازها لـ IL -17، والذي يتجلى في خلل بكتيريا C. albicans في إعدادات نقص IL -17 الوراثي أو العلاجي . لقد وجدنا منتج خلية TH17 IL-1 متورطًا في إزالة C. albicans لأن غيابه في المواد الطافية لخلايا TH17 قلل بشكل كبير من البلعمة C. albicans بواسطة الخلايا الوحيدة. يشير هذا إلى أن وظائف المستجيب لخلايا TH17 المضادة للفطريات لا يتم تنفيذها فقط من خلال IL-17A/F، كما تم اقتراحه مسبقًا، ولكن أيضًا من خلال IL-1 بطريقة خاصة بـ TCR. ما إذا كان التنظيم الشاذ للمسار الجزيئي المؤدي إلى إنتاج IL-1 بواسطة خلايا TH17 يمكن أن يؤهب لدفاع مضيف مضاد للفطريات معرض للخطر، فسوف يحتاج بالتالي إلى اختباره في المستقبل. بشكل تراكمي، تمهد النتائج التي توصلنا إليها الطريق لإجراء تحقيق منهجي في مساهمات IL-1 -إنتاج خلايا TH17 في العديد من الأمراض الالتهابية والدفاع المضاد للفطريات. لا يمثل محور TCR – NLRP3 inflammasome – caspase -8 –caspase -3 – GSDME فقط وضعًا تم التغاضي عنه سابقًا للإشارة المناعية وتعليمات المصير في خلايا TH ولكنه يوفر أيضًا أهدافًا جزيئية إما لتعطيل خلية TH17 المسببة للأمراض الهوية أو تسخيرها للدفاع عن المضيف.

شكل 7|تتميز خلايا TH17 بالمرونة في مقاومة التهاب الحنجرة على الرغم من مسام غشاء البلازما GSDME.

شكل 8|تتحكم خصوصية TCR في إنتاج IL-1 الذي يساهم في إزالة C. albicans

مراجع

1. إيفانوف، الثاني وآخرون. يوجه المستقبل النووي اليتيم RORgammat برنامج التمايز للخلايا التائية المساعدة IL-17+ المسببة للالتهابات. الخلية 126، 1121-1133 (2006).

2. Zwicky, P., Unger, S. & Becher, B. استهداف الإنترلوكين -17 في الأمراض الالتهابية المزمنة: منظور سريري. جي إكسب. ميد. 217، هـ20191123 (2020).

3. Stockinger، B. & Omenetti، S. الطبيعة الثنائية للخلايا التائية المساعدة 17. نات. القس إيمونول. 17، 535-544 (2017).

4. زيلينسكي، CE وآخرون. تنتج خلايا TH17 البشرية المستحثة بمسببات الأمراض IFN-gamma أو IL-10 ويتم تنظيمها بواسطة IL-1 بيتا. طبيعة 484، 514-518 (2012).

5. جوريشي، ك. وآخرون. توليد خلايا TH17 المسببة للأمراض في غياب إشارات TGF-beta. طبيعة 467، 967-971 (2010).

6. نوستر، ر. وآخرون. خلل تنظيم وظائف خلايا TH17 البشرية المسببة للالتهابات مقابل المضادة للالتهابات في متلازمة شنيتزلر ذاتية الالتهاب. J. عيادة الحساسية. إيمونول. 138، 1161-1169.e1166 (2016).

7. أشنبرينر، D. وآخرون. برنامج تنظيم المناعة والأنسجة المعدل بواسطة c-MAF في خلايا TH17 البشرية. نات. إيمونول. 19، 1126–1136 (2018).

8. وو، سي وآخرون. تحريض خلايا TH17 المسببة للأمراض عن طريق كيناز SGK1 المستشعر للملح. طبيعة 496، 513-517 (2013).

9. ماتياس، J. وآخرون. يولد الملح خلايا Th17 المضادة للالتهابات ولكنه يزيد من القدرة المرضية في البيئات الدقيقة السيتوكينات المسببة للالتهابات. جيه كلين. يستثمر. 130، 4587–4600 (2020).

10. كافالي، ج. وآخرون. Interleukin 1alpha: مراجعة شاملة لدور IL-1alpha في التسبب في أمراض المناعة الذاتية والأمراض الالتهابية وعلاجها. المناعة الذاتية. القس 20، 102763 (2021).

11. Acosta-Rodriguez, EV, Napolitani, G., Lanzavecchia, A. & Sallusto, F. Interleukins 1beta و 6 ولكن ليس عامل النمو بيتا المتحول ضروريان للتمايز بين الخلايا التائية المساعدة البشرية المنتجة للإنترلوكين 17- . نات. إيمونول. 8، 942-949 (2007).

12. Latz، E.، Xiao، TS & Stutz، A. تنشيط وتنظيم الجسيمات الالتهابية. نات. القس إيمونول. 13، 397-411 (2013).

13. شي، J. وآخرون. إن انقسام GSDMD بواسطة الكاسبيزات الالتهابية يحدد موت الخلايا الحنجرة. طبيعة 526، 660-665 (2015).

14. ليو، X. وآخرون. يسبب ديرمين الغاز المنشط بالالتهاب الالتهابي عن طريق تكوين مسام الغشاء. طبيعة 535، 153-158 (2016).

15. أكوستا رودريغيز، إيف وآخرون. النمط الظاهري السطحي والخصوصية المستضدية لخلايا الذاكرة التائية المساعدة المنتجة للإنترلوكين البشري 17-. نات. إيمونول. 8، 639-646 (2007).

16. جروس وآخرون. تحفز المنشطات الالتهابية إفراز الإنترلوكين- 1ألفا عبر مسارات متميزة ذات متطلبات مختلفة لوظيفة الأنزيم البروتيني للكاسبيز-1. الحصانة 36، 388-400 (2012).

17. Malik, A. & Kanneganti, TD وظيفة وتنظيم IL-1alpha في الأمراض الالتهابية والسرطان. إيمونول. القس 281، 124-137 (2018).

18. سيماز، ر. التهاب المفاصل الشبابي مجهول السبب الجهازي. المناعة الذاتية. القس 15، 931-934 (2016).

19. Fong، KY، Boey، ML، Koh، WH & Feng، PH تركيزات السيتوكين في السائل الزليلي والبلازما لمرضى التهاب المفاصل الروماتويدي: الارتباط مع التآكلات العظمية. كلين. الخبرة. الروماتول. 12، 55-58 (1994).

20. Eyerich، S. & Zielinski، CE تحديد مجموعات فرعية من خلايا Th بطريقة كلاسيكية وخاصة بالأنسجة: أمثلة من الجلد. يورو. جي إمونول. 44، 3475–3483 (2014).

21. Monteleone، M.، Stow، JL & Schroder، K. آليات الإفراز غير التقليدي للسيتوكينات العائلية IL-1. السيتوكين 74، 213-218 (2015).

22. Keller, M., Ruegg, A., Werner, S. & Beer, HD Active caspase-1 هو منظم لإفراز البروتين غير التقليدي. الخلية 132، 818-831 (2008).

23. كورت جونز، EA، بيلر، DI، Mizel، SB & Unanue، ER تحديد الإنترلوكين المرتبط بالغشاء 1 في البلاعم. بروك. ناتل أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 82، 1204-1208 (1985).

24. موسلي، B. وآخرون. يرتبط مستقبل الإنترلوكين-1 بمقدمة إنترلوكين ألفا البشرية-1 وليس بمقدمة بيتا للإنترلوكين-1. جي بيول. الكيمياء. 262، 2941-2944 (1987).

25. Carruth، LM، Demczuk، S. & Mizel، SB تورط البروتياز الشبيه بالكالبين في معالجة سلائف إنترلوكين الفئران 1alpha. جي بيول. الكيمياء. 266، 12162–12167 (1991).

26. كوباياشي، Y. وآخرون. تحديد البروتياز المحايد المنشط بالكالسيوم باعتباره إنزيم معالجة للإنترلوكين البشري 1 ألفا. بروك. ناتل أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 87، 5548-5552 (1990).

27. فيتيلشوس، أ. وآخرون. يستهدف تنشيط الجسيم الالتهابي وIL-1beta IL-1alpha للإفراز بدلاً من التعبير السطحي. بروك. ناتل أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية 108، 18055-18060 (2011).

28. Franklin، BS، Latz، E. & Schmidt، FI الوظائف داخل وخارج الخلية لبقع ASC. إيمونول. القس 281، 74-87 (2018).

29. Nagar, A., DeMarco, RA & Harton, JA Inflammasome and caspase-1 توصيف وتقييم النشاط: كشف وتقييم قائم على مقياس التدفق الخلوي للتصوير لبقع الالتهاب وتنشيط caspase-1. جي إمونول. 202، 1003-1015 (2019).

30. Rathinam، VA & Fitzgerald، KA مجمعات الالتهاب: الآليات الناشئة ووظائف المستجيب. الخلية 165، 792-800 (2016).

31. Broz، P.، Pelegrin، P. & Shao، F. العقل المدبر هو عائلة بروتينية تنفذ موت الخلايا والالتهابات. نات. القس إيمونول. 20، 143-157 (2020).

32. تشانغ، Z. وآخرون. يمنع Gasdermin E نمو الورم عن طريق تنشيط المناعة المضادة للورم. طبيعة 579، 415-420 (2020).

33. شرامل، بو وآخرون. يتحكم عامل النسخ AP-1 BATF في تمايز TH17. طبيعة 460، 405-409 (2009).

34. أنتونوبولوس، سي وآخرون. Caspase-8 كمؤثر ومنظم لإشارات NLRP3 الالتهابية. جي بيول. الكيمياء. 290، 20167–20184 (2015).

35. فاجالا، بي آر وآخرون. يقوم محول الالتهاب ASC بتحفيز خيوط مجال مستجيب الموت procaspase-8. جي بيول. الكيمياء. 290، 29217–29230 (2015).

36. ستينيكي، HR وآخرون. يعتبر Pro-caspase-3 هدفًا فسيولوجيًا رئيسيًا لـ caspase-8. جي بيول. الكيمياء. 273، 27084-27090 (1998).

37. دينغ، دبليو وآخرون. يقسم الذيفان B البيروجيني الناتج عن المكورات العقدية GSDMA ويؤدي إلى التهاب الحنجرة. طبيعة 602، 496-502 (2022).

38. بويل، أ. وآخرون. داء المبيضات الجلدي المخاطي المزمن عند البشر الذين يعانون من أخطاء فطرية في مناعة الإنترلوكين -17. العلوم 332، 65-68 (2011).

39. Billon، C.، Murray، MH، Avdagic، A. & Burris، TP RORgamma ينظم NLRP3 inflammasome. جي بيول. الكيمياء. 294، 10-19 (2019).

40. لي، ع وآخرون. ينظم مستقبل استشعار الكالسيوم الجسيم الالتهابي NLRP3 من خلال Ca2+ وcAMP. طبيعة 492، 123-127 (2012).

41. جاو، Y. وآخرون. يحدد التنميط النسخي caspase -1 باعتباره منظمًا جوهريًا للخلية التائية للتمايز Th17. جي إكسب. ميد. 217، هـ20190476 (2020).

42. أربور، ج. وآخرون. تتطلب مناعة T helper 1 نشاطًا ملتهبًا NLRP3 مدفوعًا في خلايا CD 4+ T. العلوم 352، Aad1210 (2016).

43. مارتن، BN وآخرون. يعزز ASC الموجود في الخلايا التائية بشكل حاسم التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي بوساطة TH17-. نات. إيمونول. 17، 583-592 (2016).

44. وانغ، Y. وآخرون. تعمل أدوية العلاج الكيميائي على تحفيز الانحلال الحراري من خلال انقسام الكاسبيز -3 للعقل المدبر. طبيعة 547، 99-103 (2017).

45. ويغينز، كا وآخرون. يتحكم انقسام IL-1 بواسطة الكاسبيزات الالتهابية للالتهاب غير الكنسي في النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة. خلية الشيخوخة 18، ​​e12946 – e12946 (2019).

46. ​​هيلمستتر، سي وآخرون. تمتلك الخلايا التائية المساعدة الفردية ذاكرة سيتوكينية كمية. الحصانة 42، 108-122 (2015).

47. شيا، س. وآخرون. يكشف هيكل مسام Gasdermin D عن الإطلاق التفضيلي للإنترلوكين الناضج -1. طبيعة 593، 607-611 (2021).