arلغة
الصفحة الرئيسية / معرفة / المحتوى

معرفة

الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة الناجم عن نقص الأكسجة في الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة من خلال MiR -545-3 p – TNFSF10

Mar 30, 2022

مي تشوان كو 1، وي آن تشانغ 2,3وآخرون


الملخص:يعتبر نقص الأكسجة أحد الآليات الفيزيولوجية المرضية لإصابة الكلى ومزيد من التطورالفشل الكلوي. يعتبر الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) في الأنابيب الكلوية عملية حاسمة لتليف الكلى. استخدمت هذه الدراسة تحليل الترنسكربيتوم للتحقيق في EMT الناجم عن نقص الأكسجة من خلال EMT المشكل بالـ microRNA (miRNA) في الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة (PTECs). كشف تسلسل الحمض النووي الريبي أنه تم تنظيم ثمانية جزيئات من الحمض النووي الريبي وتم تنظيم ثلاثة جزيئات من الحمض النووي الريبي في مجموعات PTEC المزروعة تحت نقص الأكسجة مقارنةً بنقص الأكسجة. من بين 11 miRNAs ، تتميز miR -545-3 p بأعلى تعبير في PTECs المعرضة لنقص الأكسجة ، وتعبير miR -545-3 p ligand المرتبط بعامل نخر الورم (TRAIL / TNFSF10). EMT الناجم عن نقص الأكسجة في PTECs من خلال تعديل miR -545-3 p – TNFSF10 ، و TNFSF 10- الموهن EMT الناتج عن نقص الأكسجة أو miR -545-3 محاكاة تعداء العدوى. قدمت هذه النتائج تصورات جديدة للتنظيم الفريد للتفاعل miR -545-3 p – TNFSF10 وتأثيراتها العلاجية المحتملة على إصابة الكلى التي يسببها نقص الأكسجة.

الكلمات الدالة: نقص الأكسجة. ميل -545-3 ص ؛ TNFSF10 ؛ الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة ؛ الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة. تحليل النسخ

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

cistanche can improve kidney function

فوائد cistanche الصحراء: تحسين وظائف الكلى وتخفيف إصابات الكلى

1 المقدمة

مرض كلويهي قضية صحية عالمية ، مما يزيد من معدلات الإصابة بالأمراض والوفيات ويزيد من تفاقم الأعباء المالية الثقيلة في جميع أنحاء العالم. يعتبر التليف الكلوي علامة بارزة في سوء تطور أمراض الكلى المختلفة ، مما يؤدي إلى مرض الكلى في مراحله الأخيرة [1].

يلعب نقص الأكسجة دورًا مهمًا فيأنسجة الكلى إصابةومزيد من التقدم إلى تليف الكلى [2]. نقص الأكسجة هو منظم فعال للعمليات الخلوية المتعددة ، بما في ذلك التمثيل الغذائي ، والنمو ، وبقاء الخلية من خلال آليات استشعار الأكسجين [3]. يتم التوسط في الاستجابات النسخية للحرمان من الأكسجين بشكل أساسي عن طريق العوامل المحفزة بنقص الأكسجة (HIF) ، والتي تعمل أثناء التطور الطبيعي وفي العمليات المرضية جنبًا إلى جنب مع انخفاض توافر الأكسجين [4]. يمكن أن يؤدي نقص الأكسجة المزمن إلى استجابة تلف الكلى ويسبب تحول نمط ظاهري لا رجعة فيه في الخلايا الظهارية الأنبوبية ، مما يؤدي إلى التليف الكلوي [5،6]. الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) هو عملية حاسمة لتليف الكلى حيث تفقد الخلايا الظهارية خصائصها الظهارية وتكتسب ميزات اللحمة المتوسطة [7،8]. قد يؤدي تنشيط إشارات HIF في الخلايا الظهارية الكلوية إلى تعزيز تكوين التليف عن طريق تسهيل EMT [9]. يظهر التغيير في مستويات الأكسجين وتنشيط الإشارات ناقصة التأكسج من خلال HIF كمحفزات ومعدلات مهمة لـ EMT [10]. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء EMT المحفز لنقص الأكسجة والتليف في الكلى ليست مفهومة تمامًا.

تعتبر MicroRNAs (miRNAs) ، كعوامل تنظيمية لما بعد النسخ ، منظمات قوية للتعبير الجيني والأنماط الظاهرية الخلوية. تظهر الأدلة المتراكمة أن نقص الأكسجة يعدل التكوّن الحيوي ونشاط الجزيئات المجهرية [11]. أبلغت بعض الدراسات عن تعبيرات مختلفة من الجزيئات الدقيقة وتأثيرها على تطور EMT والتليف في الكلى تحت نقص الأكسجة [12-14]. دو وآخرون. اقترح تقليل تنظيم miR -34 ترقية EMT في الخلايا الظهارية الأنبوبية [13]. شي وآخرون أشار إلى أن زيادة تنظيم miR -155 أدى إلى تليف في الأنابيب القريبة [14]. ومع ذلك ، ما إذا كانت miRNAs تتوسط في مسار الإشارات المسببة للأمراض من EMT الناجم عن نقص الأكسجة في الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة (PTECs) لم يتم استكشافها جيدًا باستخدام تحليل النسخ.

وهكذا ، في هذه الدراسة ، استخدمنا تحليل تسلسل صغير من الحمض النووي الريبي لـ PTECs تحت ظروف نورموكسيا ونقص الأكسجة لاستكشاف الآليات المحتملة لتنظيم مسارات الإشارات التي تتوسطها نقص الأكسجة لإصابة الكلى.

cistanche is good for choric kidney disease

cistanche tcmمفيد لأمراض الكلى المشيمية

2. المواد والأساليب

2.1. ثقافة الخلية ومراقبة الصرف

تمت زراعة خلايا PTEC البشرية (ATCC PCS {{0}}) في وسط قاعدي للخلايا الظهارية الكلوية (ATCC PCS400030 ™) بالإضافة إلى 0.5 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، وفقًا لاقتراح الشركة المصنعة. تم شراء خلايا HK -2 من American Type Culture Collection (ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت زراعة خلايا HK -2 في الخلايا الكيراتينية SFM (GIBCO) بتكملة 2 بالمائة من FBS. زرعت الخلايا تحت نورموكسيا (O2 ، 21 بالمائة) ونقص الأكسجة (O2 ، 1 بالمائة).

تم تحديد خصائص EMT في PTEC البشرية من خلال الملاحظات التسلسلية لتغيراتها المورفولوجية باستخدام المجهر الضوئي (Nikon ECLIPSE TE 20000- S ، Nikon ، طوكيو ، اليابان).

2.2. تحليل لطخة غربية

تم استخراج البروتين الكلي لخلايا HK -2 باستخدام محلول RIPA (مقايسة الترسيب المناعي الراديوي) (EMD Millipore ، Burlington ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم فصل البروتين المشوه عن طريق الرحلان الكهربي SDS-PAGE بنسبة 9-11 بالمائة ثم نقله إلى غشاء PVDF بعد الحجب والتكتل المناعي بواسطة أجسام مضادة أولية وثانوية محددة.

الأجسام المضادة ضد HIF -1 (Catalog #nb 100-105، Novus)، HIF -2 (Catalog # 7096s، Cell Signaling)، N-cadherin (Catalog # 610921، BD Biosciences) ، vimentin ( تم استخدام كتالوج # 550513 ، BD Biosciences) ، E-cadherin (كتالوج # 610182 ، BD Biosciences) ، سبيكة (كتالوج # 9585s ، تشوير الخلية) ، و GAPDH (كتالوج # MAB374 ، EMD Millipore). تم التقاط إشارات البقع باستخدام نظام Proteinsimple plus Fluorchem Q (Alpha Innotech ، سان لياندرو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب قياس كثافة البقع باستخدام برنامج Image J (Bethesda ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.3 تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير

HK-2 cells were cultured under hypoxia or normoxia conditions for 48 h. NGS was performed to examine the miRNA profiles of HK-2 cells. Trizol® Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA) was utilized to extract total RNA from the harvested cells, which were isolated for further RNA preparation and small RNA-seq by Welgene Biotechnology Company (Welgene, Taipei, Taiwan). The quality of the extracted RNA was evaluated by an RNA integrity number (RIN), which was measured using an Agilent Bioanalyzer (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA). Samples were prepared to manufacture the small RNA library and then to execute deep sequencing by the Illumina sample preparation kit. PCR amplification was performed to ligate total RNA with 30 and 50 adaptors and to reverse￾transcription into cDNA. cDNA constructs were separated using 6% polyacrylamide gel Biomolecules 2021, 11, 1032 3 of 14 electrophoreses, and 18–40 nucleotide RNA fragments (140–155 nucleotide in length with both adapters) were extracted. The sequencing of the libraries was performed using an Illumina GAIIx instrument (50 cycle single read) and then the results were processed by the Illumina software. The differentially expressed miRNAs between HK-2 cells treated with normoxia or hypoxia were defined at >2-fold change and >10 قراءات لكل مليون.

2.4 توافر البيانات

تم إيداع بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي التي تم إنشاؤها في هذا المنشور في GEO تحت الانضمام GSE178810.

2.5 عزل الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي والكمي في الوقت الحقيقي PCR (Q-PCR)

إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا المزروعة في ظل ظروف معيارية أو نقص الأكسجة أو عولجت بمثبط HIF -1 (CAY10585 ، (3- (2- (4- Adamantane -1- yl-phenoxy ) -اسيتيلامينو) تم عزل -4- إستر ميثيل حمض الهيدروكسي بنزويك) لمدة 48 ساعة (10 أمتار ، كتالوج رقم 400092 ، كاليوتشيم) باستخدام TRIzol و TRIzolLS Reagent (تقنيات الحياة) ، على التوالي. تم نسخ miRNAs باستخدام Mir-X ™ miRNA First-Strand Synthesis Kit (كتالوج # 638313 Takara ، اليابان). تم استخدام SYBR Green لتحليل miRNA الكمي باستخدام نظام QuantStudio 3Q-PCR (ThermoFisher Scientific ، مدينة فوستر ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). مستويات التعبير النسبي لميرنا تم تطبيع و RNA في الخلايا للتحكم الداخلي U6 أو GAPDH ، على التوالي. تم تقديم التعبيرات النسبية باستخدام طريقة 2 − ∆∆Ct. تم سرد البادئات المستخدمة في الجدول S1.

2.6. أدوات تحليل المعلوماتية الحيوية

تم توقع أهداف miRNAs باستخدام اثنين من مواقع المعلومات الحيوية ، وهما قاعدتا بيانات miRmap [15] و TargetScan [16] ، والتي يمكن أن توفر تنبؤات مستهدفة لـ miRNA لكائنات مختلفة. يصنف كل من برنامج miRmap و TargetScan أهدافًا محددة محتملة لـ miRNA ويشير إلى قوة القمع لهدف miRNA استنادًا إلى درجات miRmap والنسب المئوية للسياق بالإضافة إلى الدرجة [17].

تم تحليل الوظائف البيولوجية لأهداف miRNA المحددة باستخدام برنامج IPA (Ingenuity Systems ، Redwood City ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والذي يوفر "تحليلًا أساسيًا" للجينات / البروتينات. يمكن استخدام قوائم المسار والشبكة والسمية المتعارف عليها التي تم الحصول عليها من التحليل الأساسي لتحديد التسبب المحتمل للجينات / البروتينات [18].

2.7. تعداء عابرة

تم نقل miR -545-3 p mimic (200 nM) والتحكم السلبي mi للمقلد (miR-NC ، 200 نانومتر) (GE Healthcare ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى الخلايا باستخدام كاشف تعداء Lipofectamine ™ RNAiMAX (الكتالوج # 13778075 ، ThermoFisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة. يتم سرد تسلسل محاكيات miR -545-3 p المستخدمة في الجدول التكميلي S1.

2.8. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

تم قياس تركيزات TNFSF10 للمواد الطافية لخلايا HK -2 المزروعة تحت نورموكسيا أو نقص الأكسجة أو بعد ترنسفكأيشن مع محاكاة miR -545-3 تحت ظروف نقص الأكسجة لمدة 48 ساعة باستخدام مجموعة Quantikine1 ELISA المتاحة تجاريًا ( Catalog #DTRL 00 ، أنظمة البحث والتطوير) وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة ، كما في السابق

وصفها.

2.9 تحليل احصائي

تم التعبير عن المتغيرات المستمرة على أنها متوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) أو الوسيط (25 و 75 بالمائة) حسب الاقتضاء ، بينما تم التعبير عن المتغيرات الفئوية كنسب مئوية. تم فحص الارتباط بين المتغيرات المستمرة من خلال ارتباط سبيرمان. تم اختبار أهمية الاختلافات في المتغيرات المستمرة بين المجموعات باستخدام اختبار الطالب أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا باختبار ما بعد المخصص مع تصحيح Tukey حسب الاقتضاء. تم إجراء الجزيئات الحيوية الإحصائية 2 0 21 ، 11 ، 1032 4 من 14 تحليلًا باستخدام GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعيين الدلالة الإحصائية عند قيمة p ثنائية الجانب لـ<>

Cistanche has a good repairing effect on renal damage

مسحوق الأعشاب costancheله تأثير إصلاح جيد علىتلف كلوي

3. النتائج

3.1. يحفز نقص الأكسجة EMT في PTECs

تم الإبلاغ عن نقص الأكسجة للمشاركة في آليات الفيزيولوجيا المرضيةإصابة في الكلى[9]. للتحقيق في تغيير النمط الظاهري لخلايا PTEC الكلوية البشرية (RPTECs) وخلايا HK -2 في ظل ظروف نقص الأكسجة ، تمت زراعة الخلايا في ظروف طبيعية (O2 ، 21 بالمائة) ونقص الأكسجة (O2 ، 1 بالمائة) لمدة 48 ساعة. وجدنا أن تعبير HIF -1 و HIF -2 تم رفعهما في خلايا RPTECs و HK -2 تحت ظروف نقص الأكسجة لمدة 6 ساعات (الشكل 1 أ). لوحظت أشكال الخلية وتغيرت من شكل دائري إلى نمط ظاهري ممدود ومتحرك في ظل ظروف نقص الأكسجة مقارنة بظروف نورموكسيا (الشكل 1 ب).

تم استخدام النشاف الغربي لتقييم EMT في PTECs تحت ظروف نورموكسيا أو نقص الأكسجة. أدى نقص الأكسجة إلى ارتفاع تعبير N-cadherin و vimentin وخفض تعبير E-cadherin في خلايا PTEC البشرية (الشكل 1C) وخلايا HK -2 (الشكل 1D) بعد فترة حضانة 48- ساعة. لذلك ، يسبب نقص الأكسجة EMT في PTECs.

Figure 1. Hypoxia induces EMT in PTECs. (A) HIF-1α and HIF-2α expression were assessed in RPTECs and HK-2 cells were incubated under normoxia (O2, 21%) and hypoxia (O2, 1%) conditions for 6 h using Western blotting. (B) The effect of hypoxia on morphological changes in RPTECs and HK-2 cells under normoxia and hypoxia conditions for 48 h. EMT markers (E-cadherin, N-cadherin, and vimentin) were examined in human RPTECs (C) and HK-2 cells (D) treated with normoxia and hypoxia for 48 h using Western blotting. The bar graph represents the mean ± SEM of at least three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by Student's t-test. Figure 1. Hypoxia induces EMT in PTECs. (A) HIF-1α and HIF-2α expression were assessed in RPTECs and HK-2 cells were incubated under normoxia (O2 , 21%) and hypoxia (O2 , 1%) conditions for 6 h using Western blotting. (B) The effect of hypoxia on morphological changes in RPTECs and HK-2 cells under normoxia and hypoxia conditions for 48 h. EMT markers (E-cadherin, N-cadherin, and vimentin) were examined in human RPTECs (C) and HK-2 cells (D) treated with normoxia and hypoxia for 48 h using Western blotting. The bar graph represents the mean ± SEM of at least three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by Student's t-test.

3.2 تحديد miR -545-3 p المشاركة في EMT المستحث بنقص الأكسجة في PTECs

يظهر الرسم البياني لاستكشاف miRNAs المحتملة التي يسببها نقص الأكسجة في الشكل 2A. تم تحديد ملف تعريف الحمض النووي الريبي الصغير من خلايا HK -2 المزروعة تحت نورموكسيا أو نقص الأكسجة لمدة 24 ساعة بواسطة NGS. تم العثور على واحد وعشرين miRNAs مع تغير ملحوظ 2- أضعاف في خلايا HK -2 المعرضة لنقص الأكسجة مقارنة بتلك المستنبتة تحت ظروف نورموكسيا.

من 21 miRNAs ، تم تنظيم 10 miRNAs وتم تنظيم 11 miRNAs. بعد استبعاد miRNAs مع عدد قراءة خام أقل من أو يساوي 10 ، تم عرض 11 miRNAs كبيرة (8 مرتبة و 3 خاضعة للتنظيم تحت ظروف نقص الأكسجة) عن طريق رسم خرائط الحرارة (الشكل 2B والجدول S1). استخدمنا RT-Q-PCR للتحقق من صحة تعبير miRNAs في نموذجين في المختبر ، بما في ذلك خلايا RPTEC البشرية وخلايا HK -2 في ظل ظروف معيارية ونقص الأكسجة. من بين 11 miRNAs ، تعذر اكتشاف miR -190 a -3 p و miR -1277-3 p بواسطة qT-PCR ، والتعبير غير المتسق لـ miR -1269 a ، miR { تم العثور على {18}} p و miR - 33 b -5 p و miR -33 a -5 p و miR -219 a -5 p في خلايا PTEC البشرية و HK -2 بعد العلاج بنقص الأكسجة (الشكل 2C-G). انخفضت مستويات miR -1266-5 p و miR -4474-3 p و miR -5579-3 p في كل من خلايا PTEC البشرية وخلايا HK -2 في ظل ظروف نقص الأكسجة (الشكل 2H-J). لم يكن تعبير miR -545-3 p هو الأعلى فقط بين 11 miRNAs في خلايا HK -2 التي تعرضت لنقص الأكسجة مقارنةً بتلك التي عولجت بنوروكسيا ولكن أيضًا كانت مرتفعة في PTECs البشرية تحت ظروف نقص الأكسجة (الشكل 2K). لقد فحصنا أيضًا ما إذا كان HIF -1 متورطًا في تنظيم تعبير miR -545-3 p (الشكل S1) ، ووجدنا أن مثبط HIF -1 منع ارتفاع miR -545-3 p في HK -2 من الخلايا التي يسببها نقص الأكسجة (الشكل 2L). أشارت النتائج المذكورة أعلاه إلى أن HIF -1 ينظم تعبير miR -545-3 p في الأنابيب القريبة تحت ظروف نقص الأكسجة.

Figure 2. Identification of miR-545-3p participating in hypoxia-induced EMT in PTECs. (A) Flowchart of the identification of potential miRNAs associated with hypoxia-induced EMT in HK-2 cells.

وفقًا لأعلى تعبير عن miR -545-3 p من بين 11 miRNAs في خلايا HK -2 المعرضة لنقص الأكسجة ، فإن الوظيفة الفيزيولوجية المرضية للأهداف المحتملة القائمة على miR -545-3 p ، مع درجة miRmap > 90 وفقًا لقاعدة بيانات miRmap ، تم تحليلها باستخدام تحليل أساسي لقاعدة بيانات IPA. كشفت العشرة الأوائل من المسارات المتعارف عليها لتحليل IPA أن الوظيفة الفيزيولوجية المرضية لـ miR -545-3 p تتضمن تنظيم EMT بواسطة عوامل النمو (الشكل 3 أ). أشار تحليل قائمة السموم إلى أن مير -545-3 ص كان مرتبطًا بإصابة الكلى واستجابة الإجهاد التأكسدي (الشكل 3 ب). استنادًا إلى نتائج تحليل المعلوماتية الحيوية ، قد يؤدي نقص الأكسجة إلى تحفيز EMT في PTECs من خلال تعديل miR -545-3 p.

Figure 3. TNFSF10 as a direct target of miR-545-3p. (A) Top ten canonical pathways of the potential genes targeted by miR-545-3p using IPA analysis.



بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل الشبكة للأهداف المحتملة لـ miR -545-3 p أن miR -545-3 p و TNFSF10 ، كأهداف تنظمها miR -545-3 p ، كانت متورطة أيضًا في الانتشار الخلوي والخلية دورة (الجدول 3).

Table 1. Canonical pathway of the predicted target genes of miR-545-3p according to the IPA database.

تم استخدام miRmap و TargetScan (الإصدار 7.1) لإجراء تنبؤات المعلومات الحيوية ، والتي أشارت إلى أن 3 / UTR لـ TNFSF10 احتوت على تسلسل البذور المستهدفة لربط miR -545-3 ص. تشير درجات mipmap الاحتمالية إلى احتمال وجود الجينات المستهدفة المتوقعة لـ miR -545-3 p (الشكل 3C). يظهر في الشكل ثلاثي الأبعاد تسلسل بذور mi المحفوظة بالنوع -545-3 p في 3 / UTR من TRAIL. خفض علاج نقص الأكسجة مستوى TNFSF10 مرنا لخلايا PTEC البشرية (الشكل 3E) وخلايا هونج كونج -2 (الشكل 3F). بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على مستوى منخفض من TNFSF10 mRNA في المواد الطافية المشتقة من خلايا HK -2 تحت نقص الأكسجة مقارنة بنوروكسيا (الشكل 3 G). علاوة على ذلك ، تحاكي تعداء miR -545-3 p تعبير TNFSF10 mRNA المخفض في المادة الطافية لخلايا HK -2 (الشكل 3H). عكس مثبط HIF -1 تعبير TNFSF10 mRNA المنخفض في خلايا HK -2 التي يسببها نقص الأكسجة (الشكل 3I). وبالتالي ، فإن تعبير miR -545 الذي ينظم نقص الأكسجين ، والذي أدى لاحقًا إلى تقليل تعبير TNFSF10 ، وقد يعدل HIF -1 مسار miR -545-3 p – TNFSF10.

Table 2. Tox list of the predicted target genes of miR-545-3p according to the IPA database.


3.4. يحث نقص الأكسجين على EMT في خلايا HK عن طريق تعديل miR -545-3 p – TNFSF10

لتقييم ما إذا كان miR -545-3 p معدل EMT المحفز لنقص الأكسجة في النبيبات القريبة ، قمنا بتقييم التأثيرات البيولوجية لـ miR -545-3 p و TNFSF10 في خلايا HK -2. أولاً ، لم يؤثر العلاج باستخدام TNFSF10 (20 نانوغرام / مل) على صلاحية خلايا خلايا HK -2 (الشكل 4 أ). لقد درسنا أيضًا تعبير slug ، كواحد من عوامل النسخ لتنظيم EMT. تمت زيادة تعبير Slug في خلايا HK -2 بعد ترنسفكأيشن باستخدام miR -545-3 p (الشكل 4B) وتم قمعه في خلايا HK -2 المعالجة بـ TNFSF10 (الشكل 4C) تحت ظروف نورموكسيا. بعد ترنسفكأيشن لمحاكاة miR -545-3 ، كان تعبير E-cadherin خاضعًا للتنظيم ، وتم تنظيم تعبير N-cadherin و vimentin في خلايا HK -2 تحت ظروف نورموكسيا (الشكل 4 د). ومع ذلك ، عكس TNFSF10 تأثير miR -545-3 ص في تحريض EMT في خلايا HK -2. بالإضافة إلى ذلك ، منع العلاج باستخدام TNFSF10 (20 نانوغرام / مل) تقليل تنظيم E-cadherin وقمع تنظيم N-cadherin و vimentin ، وعكس EMT في خلايا HK -2 التي يسببها نقص الأكسجة في خلايا HK -2 (الشكل 4E). تعني هذه النتائج أن نقص الأكسجين ساهم في EMT في PTECs من خلال تعديل مسار miR -545-3 p-TNFSF10 ، ويمكن لـ TNFSF10 أن يخفف EMT في PTECs الناجم عن نقص الأكسجة و miR -545-3 ص.

Figure 4. Hypoxia induces EMT in HK-cells by miR-545-3p–TNFSF10 modulation. (A) Cell viability activity was examined in HK-2 cells treated with normal control or TNFSF10 (20 ng/mL) for 48 h using the WST-1 assay.

4. مناقشة

يسبب نقص الأكسجين خللاً وظيفيًا مورفولوجيًا وفسيولوجيًا مرضيًا فيالكلى، مما أدى إلى انخفاض سريع فيوظائف الكلى[16]. استخدمت هذه الدراسة تحليل النسخ للتحقيق في miRNAs المحتملة المشاركة في عملية EMT التي يسببها نقص الأكسجة في PTECs ، وأوضحت أن miR -545-3 p قد تم تنظيمه في PTECs التي تمت معالجتها بنقص الأكسجة ، و HIF -1 miR معدل {{ 4}} p و TNFSF10 تعبير. أدى تنظيم miR -545-3 p إلى EMT في PTECs تحت نقص الأكسجة. علاوة على ذلك ، قام TNFSF10 بتحسين EMT في PTECs المعالجة بنقص الأكسجة. لذلك ، حصلنا على تصورات جديدة من خلال تحقيق التنظيم الفريد لـ miR -545-3 p – TNFSF10 ، والذي يمكننا من خلاله تفسير تطور مرض الكلى (الشكل 5).

Figure 5. Illustration of the mechanism by which hypoxia induced EMT in PTECs through miR-545-3p–TNFSF10.

أظهرت النتائج التي توصلنا إليها تعبير miR -545-3 الذي ينظم نقص الأكسجة في الأنابيب القريبة. من المعروف أن miRNAs تلعب دورًا مهمًا في تعديل التعبير الجيني أو نشاطه ، كما أنها تنظم الآليات الفيزيولوجية المرضية لظهور الأمراض أو تطورها [19]. كشفت الدراسات السابقة أن miR -545 كان يعمل كمحفز للورم ، والذي ينظم تكاثر الخلايا ، والغزو ، والهجرة ، مما أدى أيضًا إلى سرطان الخلايا الكبدية [20،21]. تسببت miR -545 في إجراء عملية تعديل وساهمت في تليف الكبد المرتبط بالتهاب الكبد B من خلال استهداف Tim -3 [22]. على العكس من ذلك ، قامت miR -545-3 p بإغلاق lncRNA XIST جزئيًا وعزز موت الخلايا المبرمج للخلايا العضلية القلبية الناتجة عن نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة [23]. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف ما إذا كانت miR -545 تشارك في التسبب في أمراض الكلى أم لا. أظهرت بعض الدراسات أن miR -545-3 p شارك في إصابة الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان [24،25]. تان وآخرون. ذكرت أن Circ _0091702 بمثابة إسفنج من miR -545-3 p لقمع موت الخلايا المبرمج لخلايا HK -2 الناجم عن عديد السكاريد الدهني (LPS) من خلال تنظيم ثرومبوسبوندين 2 [24]. هو وآخرون. وجد أن فرط التعبير عن السرطان 2 الطويل غير المشفر خفف من موت الخلايا المبرمج الناجم عن LPS في خلايا HK -2 من خلال تنظيم محور مستقبلات منشط p / peroxisome المنشط من miR -545-3 [25]. شي وآخرون. أشار إلى أن circprkci تم إنقاذها في إصابة ammatory الناجم عن LPs في خلايا hk -2 عن طريق قمع mir -545/zinc re-nger e-box homebox 2 [26]. أشارت هذه الدراسة الحالية لأول مرة إلى تأثير miR -545-3 p على EMT الناجم عن نقص الأكسجة في الكلى. أدى نقص الأكسجين إلى رفع مستويات miR -545-3 p ، وتعبير HIF -1 الضبط miR -545-3 p في PTECs. تسببت miR -545-3 في ارتفاع سبيكة الارتفاع وتعزيز EMT بشكل أكبر ، بما في ذلك قمع تعبير miR -545-3 p E-cadherin وتعزيز تعبير N-cadherin و vimentin في PTECs. أظهرنا مسار إشارة جديدًا لتعديل عملية EMT في الأنابيب القريبة تحت نقص الأكسجة.

تم الإبلاغ عن نقص الأكسجة أيضًا لتعديل تعبير TNFSF10 والعملية الفسيولوجية [27 ، 28]. فانغ وآخرون. اقترح أن HIF -1 زاد TNFSF 10- الناجم عن موت الخلايا المبرمج عن طريق زيادة تعبير مستقبل الطعم 1 (DcR1) TNFSF10 في إصابات الدماغ الرضية [27]. Harashima et al. أشار إلى أن HIF -2 يزيد من قابلية خلايا سرطان البنكرياس للإصابة بـ TNFSF10 في ظل ظروف نقص الأكسجة [28]. ومع ذلك ، ليس من الواضح كيفية تنظيم TNFSF10 من خلال النسخ اللاحق للـ miRNAs ، خاصةً في إصابة الكلى التي يسببها نقص الأكسجة. تقدم نتائجنا رؤية جديدة في أن نقص الأكسجة يعدل تعبير TNFSF10 في الأنابيب القريبة من خلال miR -545-3 ص. زاد نقص الأكسجة من مستويات miR -545-3 p ، وبالتالي قمع تعبير TNFSF10 في PTECs والمواد الطافية للحث على عملية EMT. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أيضًا أن نقص الأكسجة يعدل مسار miR -545-3 p – TNFSF10 في الأنابيب القريبة عبر HIF -1. ومع ذلك ، ليس واضحًا ما إذا كان HIF -2 ينظم هذا المسار في الكلى تحت بيئة نقص الأكسجة. من الضروري إجراء مزيد من الدراسة لاستكشاف تأثير الأنواع الفرعية لعوامل نسخ HIF على تنظيم miR -545-3 p – TNFSF10 في إصابة الكلى.

تظهر الأدلة المتراكمة أن أفراد عائلة TNF الفائقة متورطون بنشاط في الفيزيولوجيا المرضية لتطور وتطور أمراض الكلى [29]. ينظم أفراد عائلة TNF الفائقة أداء الخلية ، مثل التمايز ، والتكاثر ، والنخر ، والاستماتة ، أو التليف ، اعتمادًا على المراحل المختلفة لتلف الكلى [30،31]. TNFSF10 ، كعامل علاجي محتمل مضاد للسرطان ، يمكن أن يمنع نمو الخلايا ويعزز موت الخلايا المبرمج للخلايا من خلال الارتباط بمستقبلات موت عبر الغشاء من النوع الأول ، وبالتالي المساعدة في فعالية العلاج الكيميائي لأنواع مختلفة من السرطان [29 ، 32]. وجدت الدراسات الحديثة علاقة سلبية بين مصل TNFSF10 والنتائج السريرية في الأمراض غير السرطانية [33 ، 34]. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف دور TNFSF10 في أمراض الكلى بشكل كامل. تم العثور على تعبير مرتفع عن TRAIL المتداول في المرضى الذين يعانون من بعض أمراض الكلى ، مثل مرض الكلى السكري ومرض تغير المكورات الصغرى [35 ، 36]. تثبيط TNFSF10 الضرر الموهن في نموذج في الجسم الحي من نقص التروية - ضخه الكلى [37]. على العكس من ذلك ، انخفض TNFSF10 المنتشر في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المتعدد الكيسات السائد مقارنة بالأفراد الطبيعيين [38]. خلاف ذلك ، تم الإبلاغ أيضًا عن التأثيرات غير المتسقة لـ TNFSF10 على أمراض الكلى. على النقيض من تأثير موت الخلايا المبرمج على PTECs في اعتلال الكلية السكري [30] ، نجوين وآخرون. ذكرت أن TNFSF10 مارس استجابة غير طبيعية وانتشار الخلايا في التهاب الكلية الذئبي [39]. قد تكون هذه العبارات المتناقضة مرتبطة باللوائح المختلفة لـ TNFSF10 بين أنواع ومراحل مختلفة من أمراض الكلى. حتى الآن ، لا يزال من الصعب استنتاج الدور الفعلي لـ TNFSF10 في تطور أمراض الكلى وتطورها. وجدت هذه الدراسة الحالية أن TNFSF10 لم يؤثر على جدوى PTEC ، مما يشير إلى أنه لم يحفز موت الخلايا المبرمج في هذا النوع من الخلايا. يمكن أن يؤدي الإفراط في التعبير عن TNFSF10 إلى تحسين EMT الناجم عن نقص الأكسجة في الأنابيب القريبة ، مما يشير إلى التأثير العلاجي المحتمل لـ miR -545-3 p-TNFSF10 في إصابة الكلى المرتبطة بنقص الأكسجة.


5. الاستنتاجات

أوضحت هذه الدراسة أن نقص الأكسجين ساهم في EMT من خلال تعديل miR -545-3 p-TNFSF10 ، وتثبيط miR -545-3 p و TNFSF10 عكس EMT الناجم عن نقص الأكسجة في PTECs. لذلك ، توفر هذه النتائج رؤى جديدة حول التنظيم الفريد لـ miR -545-3 p-TNFSF10 وتأثيرها العلاجي المحتمل في إصابة الكلى التي يسببها نقص الأكسجة.

Cistanche can regulate chronic kidney disease, click here to learn more

سيستانشيمكن أن تنظم المزمنةمرض كلوي، انقر هنا لمعرفة المزيد

مراجع

1. ليو م. ليو ، إل. باي ، م. تشانغ ، إل. أماه ، واو ؛ يانغ ، العاشر ؛ التنشيط الناجم عن الشمس ، S. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 2018، 495، 2324–2330.

2. Heyman، SN؛ الخمايسي ، م. روزين ، س. Rosenberger ، C. نقص الأكسجة المتني الكلوي ، استجابة نقص الأكسجة وتطور مرض الكلى المزمن. أكون. نيفرول. 2008 ، 28 ، 998-1006.

3. Giaccia، AJ؛ سيمون ، م. جونسون ، ر. بيولوجيا نقص الأكسجة: دور استشعار الأكسجين في التطور والوظيفة الطبيعية والمرض. تطوير الجينات. 2004 ، 18 ، 2183-2194.

4. موفافاغ ، س. كروك ، س. Vo، K. تنظيم العامل المحرض لنقص الأكسجة -1 بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية: تطورات جديدة في نقاش قديم. J. الخلية Biochem. 2015 ، 116 ، 696-703.

5. مانوثام ، ك. تاناكا ، ت. ماتسوموتو ، م. أوهس ، تي ؛ إناجي ، ر. مياتا ، ت. كوروكاوا ، ك. فوجيتا ، تي. إنجل أونجر ، جيه آر ؛ Nangaku ، M. تحويل الخلايا الأنبوبية المستزرعة الناجم عن نقص الأكسجة. الكلى Int. 2004، 65، 871–880.

6. غرامة ، LG ؛ بانديوبادياي ، د. نورمان ، جيه تي هل هناك آلية مشتركة لتطور أنواع مختلفة من أمراض الكلى غير البيلة البروتينية؟ نحو موضوع موحد لنقص الأكسجة المزمن. الكلى Int. ملحق. 2000 ، 75 ، S22-S26.

7. Li، Y .؛ كانغ ، واي إس ؛ داي ، سي ؛ قبلة ، ليرة لبنانية ؛ ون ، العاشر ؛ ليو ، واي.الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة هو مسار محتمل يؤدي إلى خلل وظيفي في البودوسيت والبيلة البروتينية. أكون. J. باتول. 2008 ، 172 ، 299-308.

8. ياماغوتشي ، واي. إيوانو ، م. سوزوكي ، د. ناكاتاني ، ك. كيمورا ، ك. هارادا ، ك. كوبو ، أ. أكاي ، واي. تويودا ، م. كاواجوتشي ، م. وآخرون. الانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة كتفسير محتمل لنضوب الخلايا القرنية في اعتلال الكلية السكري. أكون. J. الكلى ديس. 2009 ، 54 ، 653-664.

9. هيغينز ، DF ؛ كيمورا ، ك. برنهاردت ، WM ؛ شريمانكر ، ن. أكاي ، واي. هوهنشتاين ، ب. سايتو ، واي. جونسون ، RS ؛ كريتزلر ، م. كوهين ، سي دي ؛ وآخرون. يعزز نقص الأكسجة التكوين في الجسم الحي عن طريق تحفيز HIF -1 للانتقال الظهاري إلى الوبائي. J. كلين. التحقيق. 2007 ، 117 ، 3810-3820.

10. Haase، VH Oxygen ينظم التحول الظهاري إلى اللحمة المتوسطة: نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية وعلاقتها بالمرض. الكلى Int. 2009 ، 76 ، 492-499.

11. Nallamshetty، S. تشان ، سي ؛ Loscalzo، J. Hypoxia: منظم رئيسي لتكوين الحمض النووي الريبي ونشاطه. راديك مجاني. بيول. ميد. 2013 ، 64 ، 20-30.

12. زيل ، إس. شميت ، ر. ذكاء ، إس. كريبي ، سمو ؛ حسين ، ك. Becker، JU Hypoxia يستحث التعبير الجيني الوسيط في الخلايا الطلائية الأنبوبية الكلوية: نموذج في المختبر لتليف زرع الكلى. نفرون إكسترا 2013 ، 3 ، 50-58.

13. دو ، ر. الشمس ، دبليو. شيا ، إل. تشاو ، أ. يو ، واي. تشاو ، إل. وانغ ، ح. هوانغ ، سي ؛ التنظيم السفلي الناجم عن Sun و S. بلوس وان 2012 ، 7 ، e30771.

14. Xie، S. تشين ، هـ. لي ، ف. وانغ ، س. Guo، J. يحفز الرنا الميكروي الناجم عن نقص الأكسجة -155 التليف في خلايا الأنابيب القريبة. مول. ميد. مندوب. 2015، 11، 4555–4560.

15. متاح على الإنترنت:

16. متاح على الإنترنت:

17. تساي ، واي سي ؛ كو ، مولودية ؛ هونغ ، WW ؛ وو ، LY ؛ وو ، PH ؛ تشانغ ، واشنطن ؛ كو ، بل ؛ يحفز Hsu و YL High Glucose موت الخلايا المبرمج من خلال miR -15 b -5 p ويعزز اعتلال الكلية السكري عن طريق توصيل الحويصلة خارج الخلية. مول. هناك. 2020 ، 28 ، 963-974.

18. ليوينجتون ، AJ ؛ سيردا ، ياء ؛ ميهتا ، RL زيادة الوعي بإصابة الكلى الحادة: منظور عالمي لقاتل صامت. الكلى Int. 2013 ، 84 ، 457-467.

19. شيتوود ، DH ؛ Timmermans ، MC الهدف يقلدون تعديل miRNAs. نات. جينيه. 2007 ، 39 ، 935-936.

20. Changjun، L .؛ Feizhou ، H. ؛ Dezhen ، P. ؛ تشاو ، إل. ينظم محور Xianhai، M. MiR -545-3 p / MT1M تكاثر الخلايا والغزو والهجرة في سرطان الخلايا الكبدية. بيوميد. فارماكوثر. 2018 ، 108 ، 347–354.


قد يعجبك ايضا