تحديد ليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز العدلات كمؤشر حيوي بولولي مبكر جديد للإصابة الكلوية الإقفارية

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

جايا ميشرا ، * تشينغ ما ، * آن برادا ، * مارك ميتسنيفيس ، * كاميار زاهيدي ، * جون يانغ ، † جوناثان باراش ، † ، وبراساد ديفارجان *

* أمراض الكلى وارتفاع ضغط الدم ، المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال ، سينسيناتي ، أوهايو ؛ و † طب الكلى ، كلية الأطباء والجراحين ، جامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك

الملخص.

بَصِيركلوييظل الفشل (ARF) الثانوي للإصابة الإقفارية مشكلة شائعة ومدمرة. تم استخدام استراتيجية استجواب على مستوى النسخ لتحديد الجينات الكلوية التي يتم تحفيزها مبكرًا بعد نقص التروية الكلوية ، والتي قد تكون منتجاتها البروتينية بمثابة مؤشرات حيوية جديدة لـ ARF. تم تحديد سبعة جينات منتظرة بالإضافة إلى - 10- أضعاف ، تم الإبلاغ مؤخرًا عن تحفيز أحدها (Cyr61) بعد الإصابة بنقص التروية الكلوية. بشكل غير متوقع ، كان استقراء النصوص الستة الأخرى جديدًا في مجال ARF. في هذه الدراسة ، تم تمييز واحدة من هذه الجينات التي لم يتم التعرف عليها سابقًا ، وهي الليبوكالين المرتبط بالجيلاتينيز (NGAL) ، لأنه عبارة عن بولي ببتيد صغير مُفرَز ومقاوم للبروتياز ، وبالتالي يمكن اكتشافه بسهولة في البول. التنظيم الملحوظ لمستويات NGAL mRNA والبروتين في الفأر التالي للإقفار المبكرالكلىتم تأكيده. تم الكشف عن تعبير البروتين NGAL في الغالب في تكاثر خلايا النبيب القريبة الموجبة للمستضد النووي للخلايا ، في التوزيع السيتوبلازمي النقطي الذي تم توطينه مع علامات الإندوسومات المتأخرة. تم اكتشاف NGAL بسهولة في البول في أول إخراج للبول بعد نقص التروية في كل من نماذج الفئران والجرذان من ARF. ظهور NGAL في البول مرتبط بجرعة ومدةكلويالإقفار وسبق ظهور علامات بولية أخرى مثل N-acetyl - - D-glucosaminidase و 2- ميكروغلوبولين. تم تأكيد أصل NGAL من الخلايا الأنبوبية في خلايا الأنابيب البشرية القريبة المستزرعة التي تعرضت لإصابة نقص تروية في المختبر ، حيث تم تحفيز NGAL mRNA بسرعة في الخلايا وكان بروتين NGAL قابلاً للاكتشاف بسهولة في وسط المزرعة خلال ساعة واحدة من نضوب ATP المعتدل. كما كان من السهل اكتشاف NGAL في بول الفئران المصابة بالسمية الكلوية التي يسببها السيسبلاتين ، والتي تسبق ظهور N-acetyl - - D-glucosaminidase و 2- microglobulin. تشير النتائج إلى أن NGAL قد تمثل علامة بيولوجية بولية مبكرة وحساسة وغير جراحية للإقفار والتسمم الكلوي.كلويإصابة.

سيستانش هيربايمكن أن يعالج إصابة الكلى

احصل على مزيد من المعلومات حول المنتجات ذات الصلة بـ Cistanche

بَصِيركلويخزي(ARF) الثانوية للإصابة الدماغية أو السمية الكلوية لا تزال مشكلة شائعة ومدمرة في طب الكلى السريري ، مع استمرار ارتفاع معدل الوفيات على الرغم من التقدم الكبير في الرعاية الداعمة (1-4). سلطت الدراسات الرائدة على مدى عدة عقود الضوء على أدوار تضيق الأوعية المستمرة ، والانسداد الأنبوبي ، والتغيرات الهيكلية الخلوية والتمثيل الغذائي ، والاستجابة الالتهابية في التسبب في ARF (4-7). على الرغم من أن هذه الدراسات مهدت الطريق لمقاربات علاجية ناجحة في النماذج الحيوانية ، إلا أن جهود البحث المترجمة في البشر قد أسفرت عن نتائج مخيبة للآمال (2-4). قد تشمل أسباب ذلك الاستجابة متعددة الأوجه للكلى للإقفار والسموم الكلوية وندرة الواسمات المبكرة لـ ARF مع التأخير الناتج في بدء العلاج (4-8).

محاولات لكشف الأساس الجزيئي لهذه العديدة في وقت مبكركلويتم تسهيل الاستجابات من خلال التطورات الحديثة في الجينوميات الوظيفية التي أسفرت عن أدوات جديدة للتحليل على مستوى الجينوم للعمليات البيولوجية المعقدة مثل ARF الإقفاري (8-11). توفر طرق ميكروأري (كدنا) ملفات تعريف موازية وكمية لآلاف الجينات ، والتي عند دمجها مع أدوات المعلوماتية الحيوية يمكنها تحديد الجينات في مسار بيولوجي ، وتمييز وظيفة الجينات الجديدة ، واكتشاف الفئات الفرعية للمرض (9). باستخدام تقنية الفحص هذه ، حددنا مجموعة فرعية من سبعة جينات يتم تنظيم تعبيرها 0- أضعافًا خلال الساعات القليلة الأولى بعد الإصابة بالإقفاركلويإصابةفي نموذج الفأر. تم التأكيد مؤخرًا على أن أحد هذه النصوص ، وهو البروتين الغني بالسيستين 61 (Cyr61) ، ناتج عن نقص التروية الكلوية (8) ، لكن سلوك الجينات الستة الأخرى المعبر عنها تفاضليًا جديد بالنسبة لأدب ARF. في هذه الدراسة ، اخترنا توصيف واحد من هذه الجينات التي لم يتم التعرف عليها سابقًا ، وهي الليبوكالين المرتبط بالجيلاتينيز (NGAL) ، لأنه عبارة عن بولي ببتيد صغير يمكن اكتشافه في البول ، على وجه الخصوص ، لأنه مقاوم للبروتياز. تشير نتائجنا إلى أن NGAL قد تمثل علامة بيولوجية بولية جديدة مبكرة للإقفار والسمية الكلوية.كلويإصابة.

المواد والأساليب

نماذج الماوس لإصابة نقص التروية الكلوية وضخه

استخدمنا نماذج الفئران الراسخة التي تكون فيها العواقب الهيكلية والوظيفية لفترات وجيزةكلويتم توثيق نقص التروية سابقاً (11-15). باختصار ، تم إيواء ذكور فئران Swiss-Webster (Taconic Farms ، Germantown ، NY) التي تزن 25 إلى 35 جرامًا مع 12: 12- ضوء: دورة مظلمة ، وتم السماح لها بالوصول المجاني إلى الطعام والماء. تم تخدير الحيوانات ببنتوباربيتال الصوديوم (5 0 ملغم / كغم داخل الصفاق) ووضعت على طاولة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة المستقيم عند 37 درجة. تم استخدام ثلاثة بروتوكولات منفصلة: (1) إقفار أحادي الجانب بدون ARF ، (2) إقفار ثنائي مع ARF ، و (3) إقفار ثنائي خفيف تحت الإكلينيكي. بالنسبة لتجارب نقص التروية الأحادية الجانب ، تم غلق العنقة الكلوية اليسرى بمشبك وعائي غير رضحي لمدة 45 دقيقة ، وخلال هذه الفترة كانت الكلية دافئة ورطبة. ثم أزيل المشبك ، وتمت ملاحظة عودة تدفق الدم إلى الكلية ، وخياطة الشق. تم السماح للفئران بالتعافي في قفص دافئ ، وتم الحصول على مجموعات بول موقوتة. بعد 0 ، 3 ، 12 ، أو 24 ساعة من ضخه ، تم إعادة تخدير الحيوانات ، وفتح التجويف البطني ، وتم الحصول على الدم عن طريق ثقب الوريد الأجوف السفلي لقياس كرياتينين المصل عن طريق مجموعة الفحص اللوني الكمي (Sigma ، سانت لويس ، ميزوري). قُتلت الفئران ، وتم تثبيت نضح الكلى في الموقع بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني ، وتم حصاد الكليتين (كانت الكلية اليمنى بمثابة عنصر تحكم لكل حيوان). تم فحص ثلاثة حيوانات منفصلة على الأقل في كل فترة من فترات إعادة التدفق. تم تجميد نصف كل كلية في نيتروجين سائل وتخزينه عند 70 درجة حتى مزيد من المعالجة ؛ تم تثبيت عينة في الفورمالين ، ومضمنة بالبارافين ، ومقطعة (4 م). تم صبغ أقسام البارافين بهيماتوكسيلين يوزين وفحصت تشريحيا. أظهرت الكلى المقيدة التغيرات الشكلية المميزة الناتجة عن الإصابة بنقص التروية - ضخه ، كما نُشر سابقًا من قبل الآخرين (12-14) ونحن (11). تم دمج النصف الآخر من كل كلية في مركب OCT (Tissue-Tek) ، وتم الحصول على أقسام مجمدة (4 م) للكيمياء المناعية. بالنسبة للإقفار الثنائي مع تجارب ARF ، تم تثبيت الكليتين لمدة 30 دقيقة وفحصهما في فترات إعادة تدفق مختلفة كما هو مفصل أعلاه. تم تصميم هذه المجموعة المكونة من ثمانية حيوانات لتمثيل ARF الإكلينيكي وأظهرت ارتفاعًا ملحوظًا في الكرياتينين في الدم في 24 ساعة بعد الإصابة. بالنسبة لتجارب نقص التروية تحت الإكلينيكية الخفيفة الثنائية ، تم تثبيت الكليتين لمدة 5 أو 10 أو 20 دقيقة فقط وفحصهما في فترات ضخه مختلفة على النحو الوارد أعلاه. تم تصميم هذه الدرجة الخفيفة من الإصابة لمحاكاة نقص التروية الكلوي تحت الإكلينيكي ، ولم تظهر الفئران في هذه المجموعة أي ارتفاعات في الكرياتينين في الدم المقاسة في 24 ساعة بعد الإصابة.

نموذج الفئران لإصابة نقص التروية الكلوية

استخدمنا نماذج راسخة من القوارضكلويإصابة نقص تروية ضخه (10). باختصار ، تم تخدير ذكور فئران Sprague-Dawley التي يتراوح وزنها بين 200 و 250 جم (مزارع تاكونيك) بالكيتامين (150 جم / جم) وزيلازين (3 جم / جم) وتعرضت لانسداد الشريان الكلوي الثنائي باستخدام مشابك الأوعية الدموية الدقيقة لمدة 30 دقيقة كما هو مفصل في بروتوكول الماوس. تم الحصول على مجموعات البول الموقوتة في 3 و 6 و 9 و 12 و 24 ساعة من ضخه ، وتم جمع الدم لقياس الكرياتينين في وقت القتل (24 ساعة).

نموذج الماوس للإصابة الكلوية التي يسببها سيسبلاتين

استخدمنا نماذج الفئران الراسخة التي تم فيها توثيق العواقب الهيكلية والوظيفية لإدارة سيسبلاتين مسبقًا (16-18). باختصار ، أعطيت الفئران حقنة واحدة داخل الصفاق من سيسبلاتين (20 مجم / كجم من وزن الجسم). ينتج عن هذا نخر الخلايا النبيبية وموت الخلايا المبرمج وارتفاع نيتروجين اليوريا في الدم خلال 3 أيام بعد حقن السيسبلاتين (16-18). تم إيواء الحيوانات في أقفاص أيضية ، وتم الحصول على مجموعات البول يوميًا.

عزل الحمض النووي الريبي

تم تعطيل أنسجة الكلى الكاملة للفأر (أو الخلايا الأنبوبية البشرية القريبة المستزرعة ؛ انظر أدناه) بإرهاب الأنسجة (Biospec Products ، Racine ، WI). تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الكلى الضابطة والإقفارية باستخدام RNeasy Mini Kit (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا) وقياسها عن طريق القياس الطيفي.

إجراءات ميكروأري

تم نشر الأوصاف التفصيلية لأجهزة وإجراءات جهاز ميكروأري سابقًا (11). باختصار ، لكل تجربة ، تم نسخ 1 0 جرامًا من الحمض النووي الريبي الكلي المنقى للفأر باستخدام النسخ العكسي Superscript II (Life Technologies ، Rockville ، MD) في وجود Cy 3- dUTP (Amersham ، بيسكاتواي ، نيوجيرسي) لعناصر التحكم و Cy 5- dUTP للعينات الدماغية. تمت تنقية عينات (كدنا) باستخدام مرشح Microcon YM -50 (Millipore ، Madison ، WI) وتهجينها إلى شرائح ميكروأري تحتوي على 8979 مجسات ماوس فريدة تم التحقق من تسلسلها (11). تم فحص ثلاثة حيوانات منفصلة لكل فترة من فترات إعادة التدفق ، وتم إجراء تجربتين ميكروأري مستقل على الأقل لكل حيوان. تم فحص شرائح المصفوفة باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري (GenePix 4000B ؛ Axon Instruments ، Foster City ، CA) للحصول على صور TIFF منفصلة لـ Cy3 و Cy5 مضان. تم تحديد شدة الإشارة لـ Cy3 و Cy5 للجينات الفردية باستخدام برنامج استخراج البيانات GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). تم الانتهاء من مراقبة الجودة وتحليل البيانات كما هو موضح سابقًا (11).

مصنع cistanche للكلى

النسخ العكسي شبه الكمي- PCR

تم نسخ كمية متساوية (1 زائد - جم) من إجمالي الحمض النووي الريبي من كليتي الفئران الضابطة والتجريبية باستخدام النسخ العكسي Superscript II (تقنيات الحياة) في وجود سداسي عشوائيين وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إنجاز PCR باستخدام مجموعة (Roche ، Indianapolis ، IN) والبادئات التالية: Mouse NGAL sense 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC -3 '، Mouse NGAL antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG -3' ، NGAL البشري بمعنى 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC -3 '، و Human NGAL antisense 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC -3'. تم الحصول على أزواج التمهيدي للماوس والبشر - أكتين و glyceraldehyde -3- نازعة هيدروجين الفوسفات (GAPDH) من Clontech (لا جولا ، كاليفورنيا). كانت ردود الفعل الوهمية الخالية من [كدنا] بمثابة ضوابط سلبية. تم تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز متبوعًا بالتلطيخ ببروميد الإيثيديوم وتم قياسها عن طريق قياس الكثافة. تم التعبير عن تغييرات الطية في تعبير NGAL mRNA في الكلى الإقفارية مقابل التحكم بعد التطبيع لتضخيم -actin أو GAPDH.

المجهر

بالنسبة لاكتشاف NGAL ، تم نفاذ المقاطع المجمدة باستخدام {0}. 2 بالمائة Triton X -100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق ، وتم حظرها بمصل الماعز لمدة ساعة واحدة ، وتم تحضينها بالأجسام المضادة الأولية لـ NGAL ( 1: 500 تخفيف) لمدة 1 ساعة. تم بعد ذلك تعريض الشرائح لمدة 30 دقيقة في الظلام إلى الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بـ Cy5 (أميرشام ، أرلينغتون هايتس ، IL) وتم تصورها باستخدام مجهر مضان (Zeiss Axiophot) مزود بمرشحات رودامين. من أجل التوطين المشترك لـ NGAL مع Rab11 ، تم تحضين الأقسام التسلسلية أولاً مع الجسم المضاد NGAL أو الجسم المضاد أحادي النسيلة لـ Rab11 (1: 500 التخفيف ؛ مختبرات النقل) ، ثم مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة إما بـ Cy5 (لـ NGAL) أو Cy3 (لـ Rab11 ) وتصور باستخدام مرشحات رودامين أو فلورسين ، على التوالي. من أجل التوطين المشترك لـ NGAL مع المستضد النووي الخلوي المتكاثر (PCNA) ، تم احتضان الأقسام بشكل مشترك مع الجسم المضاد NGAL والجسم المضاد أحادي النسيلة لـ PCNA (تخفيف 1: 500 ؛ Upstate) ، وتم الكشف عن طريق تلطيخ immunoperoxidase (نظام تلطيخ ImmunoCruz ، سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية). بالنسبة لاختبار TUNEL ، استخدمنا مجموعة اختبار ApoAlert DNA Fragmentation Kit (Clontech). تم إزالة مادة البارافين من خلال الزيلين والدرجات التنازلية من الإيثانول ، وتثبيتها بنسبة 4 في المائة من الفورمالديهايد / PBS لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات ، وتم نفاذها مع بروتيناز K في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة و 0.2 بالمائة Triton X -100 / PBS لمدة 15 دقيقة دقيقة عند 4 درجات ، وحضنت بمزيج من النيوكليوتيدات وإنزيم TdT لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة. تم إنهاء التفاعل بـ 2 SSC ، وتم غسل المقاطع باستخدام PBS وتركيبها مع Crystal / mount (Biomed ، Foster City ، CA). تم الكشف عن نوى موت الخلايا المبرمج إيجابية TUNEL عن طريق التصور باستخدام مجهر مضان.

جمع البول

تم وضع الفئران أو الجرذان في أقفاص استقلابية (نالجين ، روتشستر ، نيويورك) ، وتم جمع البول قبل وبعد كل ساعة.كلويانسداد الشريان. تم طرد عينات البول عند 5000 جم لإزالة الحطام ، وتم تحليل المادة الطافية بواسطة النشاف الغربي. تم قياس الكرياتينين البولي بواسطة مجموعة مقايسة لونية كمية (Sigma) لتطبيع العينات لتحديد NGAL البولي. تم الحصول على مجموعة الفحص اللوني لتقدير N-acetyl -D-glucosaminidase (NAG) في البول من Roche.

زراعة الخلايا

بشركلويتم الحصول على الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة (RPTEC) من Clonetics (سان دييغو ، كاليفورنيا). نمت الخلايا فيهاكلويالمتوسطة القاعدية الخلية الظهارية تستكمل معكلويمركب متوسط ​​نمو الخلايا الظهارية (REGM) ({0}. 5 لتر / مل هيدروكورتيزون ، 10 بيكوغرام / مل hEGF ، 0. 5 - غ / مل إبينفرين ، 6.5 بيكوغرام / مل ثلاثي يودوثيرونين ، 10 بالإضافة إلى - جم / مل ترانسفيرين ، 5 - جم / مل أنسولين ، 1 - جم / مل كبريتات الجنتاميسين ، و 2 بالمائة FBS) ، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.

نضوب خفيف من خلايا ATP المزروعة

قمنا بتعديل البروتوكولات الموصوفة سابقًا لنقص التروية في المختبر عن طريق استنفاد ATP مع مثبطات الفسفرة المؤكسدة (19 ، 20). في اليوم الثاني بعد التقاء ، تم تحضين خلايا RPTEC مع 1 متر من antimycin A (Sigma) لفترات زمنية متفاوتة تصل إلى 6 ساعات. لقد أظهرنا سابقًا أن هذا يؤدي إلى استنفاد خفيف جزئي للـ ATP قابل للانعكاس وعدم فقدان صلاحية الخلية في الأنواع الأخرى من الخلايا الظهارية الكلوية المستزرعة مثل MDCK (19) و 786- O (20) الخلايا. تمت مراقبة مستويات ATP باستخدام مجموعة مقايسة قائمة على luciferase (Sigma) وتم التعبير عنها كنسبة مئوية من قيم التحكم. تم حصاد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة لنضوب ATP وتحليلها للتعبير عن NGAL mRNA عن طريق النسخ العكسي – PCR (RT-PCR) وتعبير البروتين NGAL عن طريق التحليل الغربي. كما تم رصد إفراز NGAL في وسط الثقافة.

مواد وطرق أخرى

تم شراء جميع المواد الكيميائية من سيجما ما لم ينص على خلاف ذلك. بالنسبة إلى النشاف الغربي ، تم تحديد تركيزات البروتين بواسطة مقايسة برادفورد (Bio-Rad ، Hercules ، CA) ، وتم تحميل كميات متساوية من البروتين الكلي في كل ممر. تم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة لـ - - tubulin (Sigma) في 1:10 ، 000 التخفيف لتأكيد تحميل البروتين المتساوي ، وتم استخدام الجسم المضاد متعدد النسيلة لـ NGAL في 1: 500 (21). تم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة لـ 2- ميكروغلوبولين عند 1: 500 (سيغما). تم إجراء الكشف المناعي للبروتينات المنقولة باستخدام التلألؤ الكيميائي المعزز (أمرشام).

نتائج

توصيف النماذج الحيوانية للإصابة المبكرة بنقص التروية الكلوية

استخدمنا نماذج الفئران التي تم فيها توثيق العواقب الهيكلية والوظيفية لفترات قصيرة من نقص التروية الكلوية (11-15). كانت السمات النسيجية المرضية المميزة للإصابة الإقفارية واضحة بسهولة في 24- عينات ضخه بعد كل من الإقفار أحادي الجانب (45 دقيقة) والإقفار الثنائي (30 دقيقة). وشمل ذلك فقدان أغشية حدود الفرشاة ، وتمدد أنبوبي ، وظهارة أنبوبية مسطحة ، وحطام لمعي ، وتسلل خلالي (الشكل 1). لقد وثقنا وجود خلايا موت الخلايا المبرمج باستخدام اختبار TUNEL. تم تحديد موت الخلايا المبرمج في الغالب إلى الخلايا الأنبوبية البعيدة والطرف الصاعد من حلقة Henle ، سواء في الخلايا المنفصلة داخل التجويف وكذلك الخلايا المتصلة. كانت الخلايا الأنبوبية القريبة العرضية أيضًا موت الخلايا المبرمج ، لكن الكبيبات كانت خالية بشكل أساسي من موت الخلايا المبرمج. لم يتم الكشف عن أي خلايا إيجابية لـ TUNEL في الكلى الضابطة أو في العينات الإقفارية حيث تم حذف TdT (غير موضح). كانت التغيرات النسيجية والاستماتية المذكورة أعلاه غائبة عن الكلى التي تعرضت لدرجات معتدلة من نقص التروية (5 ، 10 ، أو 20 دقيقة من نقص التروية الثنائية ؛ غير معروض). كانت مستويات الكرياتينين في الدم تعكس التغيرات النسيجية المرضية التي لوحظت. وهكذا ، أظهرت الفئران المصابة بنقص تروية كلوي أحادي الجانب أو بدرجات خفيفة من نقص التروية الثنائي تحت الإكلينيكي مستويات الكرياتينين في الدم التي لا يمكن تمييزها عن الحيوانات الضابطة ، في حين أظهرت الفئران المصابة بنقص التروية الثنائية لمدة 30 دقيقة ارتفاعًا كبيرًا في كرياتينين المصل (الشكل 1).

الشكل 1. توصيف نموذج الفأر للإقفاركلويإصابة. تُظهر اللوحات اليسرى نتائج تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (أعلى) وتلطيخ TUNEL (أسفل) أقسام الكلى من الفئران الضابطة أو بعد 24 ساعة من نقص التروية - ضخه (IRI). (يمين) نتائج تحديد كرياتينين المصل في الفئران الضابطة (Con) ، بعد نقص التروية من جانب واحد لمدة 45 دقيقة (U45) ، أو بعد نقص التروية الثنائية لفترات مختلفة كما هو موضح. * P 0. 05 مقابل السيطرة. تشير الأرقام الموجودة داخل الأشرطة إلى عدد من الحيوانات.

يتم تحفيز NGAL mRNA بشكل ملحوظ في الكلى ما بعد الإقفار المبكر

عن طريق تحليل ميكروأري من الفئران مع من جانب واحدكلويوجد أن نقص التروية ، NGAL يحدث باستمرار (3.2 زائد - 0. 5- أضعاف ، 11.1 بالإضافة إلى - 1. 2- أضعاف ، و 4.3 زائد {{1 {{30} }}}. 6- أضعاف عند 3 و 12 و 24 ساعة من ضخه) في كلية الفأر الإقفارية عند مقارنتها مع كليتي التحكم من نفس الحيوان (متوسط ​​زائد - SD من ثلاثة حيوانات في كل نقطة زمنية). تم تأكيد هذه النتيجة بواسطة RT-PCR شبه الكمي ، باستخدام بروتوكول تطبيع مع كل من plus -actin و GAPDH. لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في التعبير مرنا سواء زائد-أكتين أو GAPDH في أي من فترات ضخه التي تم فحصها ، كما هو موضح سابقا (11). ومع ذلك ، باستخدام بادئات خاصة بالفأر ، اكتشفنا زيادة كبيرة في تنظيم تعبير NGAL mRNA (4.1 بالإضافة إلى -0. 5- أضعاف ، 9 زائد -0. 6- أضعاف ، و 4.2 زائد 0. 4- أضعاف عند 3 و 12 و 24 ساعة من ضخه ، على التوالي ، حيث تمثل القيم متوسط ​​زائد - SD من ثلاثة حيوانات منفصلة). تم توضيح هذه النتائج في الشكل 2 وهي متوافقة بشكل عام مع التغييرات التي تم الكشف عنها بواسطة تحليل النسخ.

الشكل 2. تحريض الفأر ليبوكالين (NGAL) مرنا بعد نقص التروية. (أعلى) النسخ العكسي التمثيلي - PCR (RT-PCR) مع الاشعال لأكتين الماوس و NGAL ، باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من كليتي الفئران الضابطة (C) أو بعد فترات ضخه مختلفة كما هو موضح (ساعات). يحتوي حارة M على 100- سلم DNA bp. (أسفل) زيادة أضعاف في تعبير NGAL mRNA في نقاط زمنية مختلفة من عنصر التحكم (CON). القيم التي تم الحصول عليها بواسطة ميكروأري (الخط الصلب) مقابل RT-PCR (الخط المنقط) هي وسائل SD من ثلاث تجارب في كل نقطة زمنية.

يتم إفراز البروتين NGAL بشكل ملحوظ في الأنابيب القريبة من كلى الفئران الإقفارية المبكرة

كان من المهم بعد ذلك تحديد ما إذا كان التعبير التالي للإقفار عن بروتين NGAL في الكلى يوازي ذلك الخاص بـ mRNA. من خلال التحليل الغربي ، كان NGAL قابلاً للاكتشاف فقط باعتباره 25- كيلو دالتون من الببتيد المناعي في كلى الفئران الضابطة. تم تحديد هوية هذا النطاق باسم NGAL في مجموعة منفصلة من التجارب ، حيث أدى الحضانة المسبقة للجسم المضاد الأولي مع ليبوكالين الماوس المؤتلف إلى منع نشاط المناعة تمامًا (غير موضح). في تجارب نقص التروية الأحادية الجانب ، تم تحفيز التعبير NGAL من ثلاثة إلى أربعة أضعاف عن طريق قياس الكثافة في الكلية الإقفارية من خمسة حيوانات منفصلة في غضون 3 ساعات من الإصابة ، كما هو موضح في الشكل 3. تم تعزيز هذه الاستجابة بشكل كبير في تجارب نقص التروية الثنائية من ثمانية حيوانات منفصلة . تم تحفيز NGAL في هذه الفئران ثلاث مرات بعد 3 ساعات من ضخه ، وبلغ ذروته عند 12- ضعف في 24- عينات ، وانخفض إلى المستويات الطبيعية بحلول 72- فترة التعافي (الشكل 3) .

الشكل 3. تحريض بروتين NGAL للكلية الفأرية بعد نقص التروية الأحادي أو الثنائي. (أعلى) لطخات غربية تمثيلية مع عينات كلية كاملة تم الحصول عليها من الفئران الضابطة (Con) أو بعد فترات ضخه كما هو موضح (ساعات) ، تم فحصها باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة لـ NGAL أو جسم مضاد أحادي النسيلة لتوبولين (لإثبات تحميل بروتين متساوٍ). علامات الوزن الجزيئي على اليسار. (أسفل) زيادة أضعاف في تعبير البروتين NGAL في نقاط زمنية مختلفة من السيطرة (CON). القيم التي تم الحصول عليها عن طريق قياس الكثافة هي وسائل SD من خمسة حيوانات للإقفار أحادي الجانب وثمانية حيوانات للإقفار الثنائي

باستخدام تقنيات المناعية الكيميائية ، أوضحنا بعد ذلك أن بروتين NGAL كان بالكاد قابلاً للاكتشاف في كليتي الفأر المتحكم به ، ولكنه يتم تنظيمه في الغالب في الأنابيب القريبة خلال 3 ساعات من نقص التروية كما هو موضح في الشكل 4. واستند تحديد الأنابيب القريبة في هذه الأقسام إلى وجود فرشاة غشاء الحدود ، ونسبة حجم النواة إلى حجم الخلية ، والتشكل الخلوي. ظهر NGAL المستحث في التوزيع السيتوبلازمي النقطي داخل خلايا النبيبات القريبة ، تذكرنا بالبروتين المفرز. كان هذا النمط من التعبير متطابقًا في كل من النماذج الأحادية والثنائية لإصابة نقص التروية وضخه ، وكان واضحًا باستمرار في كل حيوان تمت دراسته. كانت الكبيبات خالية من تعبير NGAL ، ولم تكن العدلات التي تعبر عن NGAL واضحة. نظرًا لأنه تم إظهار NGAL في خلايا الكلى السرطانية في ويلمز لتتوضع على الأقل جزئيًا مع الإندوسومات الداخلية (21) ، قمنا بفحص توزيع NGAL و Rab11 في الأقسام التسلسلية (علامة على إعادة التدوير المتأخر للداخلية). أظهرت الصور المدمجة توطينًا مشتركًا مهمًا لـ NGAL مع Rab11 (الشكل 4). لاستكشاف الأهمية الوظيفية لتعبير NGAL المحسن بعد نقص التروية ، قمنا بفحص أقسام الكلى التسلسلية للتعبير عن NGAL أو النوى الإيجابية لـ TUNEL أو النوى الإيجابية لـ PCNA. في حين أن الخلايا الأنبوبية المفرطة في التعبير عن NGAL لم تكن موجبة لـ TUNEL (غير معروض) ، كان التوطين المشترك الكبير لـ NGAL و PCNA واضحًا في تكاثر الخلايا وتجديدها في فترة إعادة التدفق 48- ساعة (الشكل 4).

الشكل 4. تحريض بروتين الفئران NGAL الكلى بعد نقص التروية. (أعلى) نتائج الكيمياء المناعية التمثيلية على الأجزاء المجمدة من كلى الفأر التي تم الحصول عليها من الفئران الضابطة أو بعد فترات متفاوتة من إعادة التدفق كما هو موضح (ساعات) ، تم فحصها باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة إلى NGAL. G ، الكبيبة. اللوحة المسمى HP عبارة عن تضخم عالي الطاقة 100 زائد ، والألواح الأخرى عند 20. (أسفل) تُظهر اللوحان الأيسران أنبوبًا صغيرًا بعد 3 ساعات من ضخه ، معربًا عن NGAL (أحمر) أو Rab11 (أخضر). تعرض اللوحة الثالثة صورة مدمجة ، تشير إلى التوطين المشترك باللون الأصفر. تُظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليمين توطين مشترك لـ NGAL مع مستضد نواة الخلية المتكاثر في الأنابيب بعد 48 ساعة من إعادة التدفق.

يتم اكتشاف البروتين NGAL بسهولة في البول مباشرة بعد تحريض ARF في الفئران

كان من الأهمية بعد ذلك تحديد ما إذا كان يمكن اكتشاف التعبير التالي للإقفار عن بروتين NGAL في البول ، مما يشير إلى فائدته كعلامة بيولوجية مبكرة غير باضعة للإقفار.كلويإصابة. مع استخدام تركيزات الكرياتينين البولية لمعادلة تحميل العينة ، كان NGAL غائبًا عن البول قبل نقص التروية. في تناقض صارخ ، ظهر NGAL على شكل 25- نطاق كيلو دالتون خلال ساعتين من الإصابة (في أول إخراج للبول بعد نقص التروية) في جميع الحيوانات التي تم فحصها (خمسة مع حالة أحادية الجانب وثمانية مصابة بنقص التروية الثنائية) ، كما هو موضح في الشكل 5. تم تحديد هوية هذا النطاق على أنه NGAL في مجموعة منفصلة من التجارب ، حيث أدى الحضانة المسبقة للجسم المضاد الأولي مع ليبوكالين الفأر المؤتلف إلى منع هذا النشاط المناعي تمامًا (غير موضح). بشكل ملحوظ ، كان يمكن اكتشاف NGAL بسهولة في أقل من 1 لتر من البول غير المعالج عن طريق التحليل الغربي واستمر طوال المدة التي تم فحصها (24 ساعة من ضخه). ثم قمنا بمقارنة إفراز NGAL في البول بإفراز علامات الإصابة السابقة ، مثل 2- micro globulin و NAG. في حين أن NGAL البولي كان واضحًا خلال ساعتين من نقص التروية ، كان 2- ميكروغلوبولين يمكن اكتشافه في نفس العينات البولية فقط بعد 12 ساعة من أحادية الجانب و 8 ساعات من نقص التروية الثنائية (الشكل 5). وبالمثل ، تم زيادة إفراز NAG البولي بشكل كبير فقط بعد 12 ساعة من جانب واحد و 8 ساعات من نقص التروية الثنائية بالمقارنة مع حيوانات التحكم غير الإقفارية (الشكل 5).

الشكل 5. الكشف المبكر عن بروتين NGAL في البول في الفئران المصابة بنقص تروية حادكلويفشل (ARF). (أعلى) تم الحصول على بقع غربية تمثيلية لعينات بول غير معالجة (1 إلى 2 زائد - لتر لكل ممر ، تم تطبيعها لمحتوى الكرياتينين) في فترات إعادة التروية كما هو موضح (ساعات) ، بعد جانب واحد أو ثنائيكلويتحامل الشريان. علامات الوزن الجزئي مبين على اليسار. تم فحص البقع باستخدام NGAL (أعلى) أو {0} ميكروغلوبولين (بيتا 2- M ؛ وسط). (أسفل) قرارات البول N-acetyl--D-glucosaminidase (NAG) في فترات إعادة ضخ مختلفة كما هو محدد ، من خمسة حيوانات للإقفار أحادي الجانب وثمانية حيوانات للإقفار الثنائي. القيم تعني SD. * P 0.05 مقابل التحكم في كل نقطة زمنية ، ANOVA.

يسهل اكتشاف البروتين غير الطبيعي في البول حتى بعد الإصابة بنقص التروية الكلوي الخفيف في الفئران

لتحديد حساسية اكتشاف NGAL البولي في حالة عدم وجود ARF الصريح ، استخدمنا بروتوكولات حيث تعرضت مجموعات منفصلة من الفئران لـ 5 أو 10 أو 20 دقيقة فقط من العلاج الثنائي.كلويانسداد الشريان. تم تصميم هذه الدراسات لتقييم إفراز NGAL البولي بعد نقص التروية الكلوي تحت الإكلينيكي الخفيف. تم قياس الكرياتينين في الدم بعد 24 ساعة من إعادة التدفق ضمن الحدود الطبيعية في كل هذه الفئران (الشكل 1). ملفت للنظر ، تم اكتشاف NGAL بسهولة في أقل من 1 لتر من البول غير المعالج في هذه الحيوانات (الشكل 6) ، على الرغم من تأخر ظهوره إلى حد ما مقارنة بالحيوانات ذات ARF الصريح. وهكذا ، في حين أن 30 دقيقة من الإقفار الثنائي أدى إلى إفراز NGAL البولي في غضون ساعتين (الشكل 5) ، فإن الفئران التي تعاني من 20 أو 10 دقيقة من نقص التروية الثنائية تظهر NGAL البولي بعد 4 ساعات وتلك التي لديها 5 دقائق من نقص التروية تفرز NGAL فقط بعد 6 ساعات ( الشكل 6). وبالتالي ، فإن ظهور NGAL في البول يرتبط بجرعة ومدة نقص التروية الكلوية.

يتم اكتشاف البروتين NGAL بسهولة في البول مباشرة بعد تحريض ARF في الفئران

الشكل 6. الكشف عن بروتين NGAL في البول في الفئران المصابة بنقص التروية الكلوي تحت الإكلينيكي. لطخة غربية تمثيلية لعينات بول غير معالجة (1 إلى 2 لتر لكل ممر ، تم تطبيعها لمحتوى الكرياتينين) تم الحصول عليها في فترات ضخه كما هو موضح (ساعات) ، بعد 5 أو 10 أو 20 دقيقة من لقط الشريان الكلوي الثنائي. علامات الوزن الجزئي مبين على اليسار. عرضت هذه الحيوانات كرياتينين المصل الطبيعي عند 24 ساعة من إعادة التدفق.

نظرًا لوجود نقاش حول الاختلافات بين الأنواع في الاستجابات لانسداد الشريان الكلوي (22) ، قمنا بعد ذلك بفحص سلوك NGAL في نموذج حيواني مختلف ، وهو نموذج الفئران الراسخ لإصابة نقص التروية الكلوية - ضخه. مع استخدام تركيزات الكرياتينين البولية لمعادلة تحميل العينة ، كان NGAL غائبًا عن البول قبل نقص التروية. في تناقض ملحوظ ، ظهر NGAL على شكل ببتيد مناعي 25- كيلو دالتون في غضون 3 ساعات من الإصابة (في أول إخراج للبول بعد نقص التروية) ، كما هو موضح في الشكل 7. وبالمقارنة ، فإن كرياتينين المصل في هذا النموذج تم رفع الإصابة الدماغية فقط بعد 24 ساعة من ضخه (غير معروض). مرة أخرى ، كان NGAL قابلاً للاكتشاف في 1 لتر من البول غير المعالج واستمر طوال المدة التي تم فحصها (24 ساعة من ضخه).

الشكل 7. الاكتشاف المبكر لبروتين NGAL في البول في الفئران المصابة بنقص تروية ARF. لطخة غربية تمثيلية لعينات بول غير معالجة (1 إلى 2 لتر لكل ممر ، تم تطبيعها لمحتوى الكرياتينين) تم الحصول عليها في فترات إعادة التروية كما هو موضح (ساعات) ، بعد 30 دقيقة من لقط الشريان الكلوي الثنائي في الفئران. علامات الوزن الجزئي مبين على اليسار. أظهرت هذه الحيوانات زيادة كبيرة في الكرياتينين في الدم في 24 ساعة من إعادة التدفق.

يتم تحفيز NGAL mRNA في خلايا Tubule البشرية المستزرعة بعد نقص التروية الخفيف المبكر

لتأكيد أصل NGAL من الخلايا الأنبوبية القريبة الدماغية ، قمنا بتعديل البروتوكولات الموصوفة سابقًا لنقص التروية في المختبر عن طريق استنفاد ATP في خلايا الأنابيب البشرية القريبة المستزرعة (RPTEC). الحضانة 1- متر من مضادات الميسين أدت إلى استنفاد جزئي بسيط للاعبي التنس المحترفين إلى ما يقرب من 83 زائد 3 في المائة من التحكم في غضون ساعة واحدة ، مع انخفاض تدريجي بدرجة أكبر إلى 75 تقريبًا بالإضافة إلى - 3 بالمائة من التحكم بمقدار 6 ساعات ( متوسط ​​SD من أربع تجارب). لم تكن هناك عواقب مورفولوجية لاستنفاد ATP المعتدل هذا. كان NGAL mRNA قابلاً للاكتشاف فقط في خلايا الراحة. ومع ذلك ، بعد استنفاد ATP الجزئي ، كان الحث السريع والمعتمد على المدة لـ NGAL mRNA واضحًا بواسطة RT-PCR ، كما هو موضح في الشكل 8.

يتم اكتشاف البروتين NGAL بسهولة في الوسط بعد نقص التروية المبكرة في المختبر

قمنا بعد ذلك بفحص تعبير البروتين NGAL في خلايا RPTEC ووسط الثقافة بعد استنفاد ATP المعتدل. كان بروتين NGAL قابلاً للاكتشاف في خلايا RPTEC الضابطة ، وزاد تعبيره بعد استنفاد ATP بطريقة تعتمد على المدة ، كما هو موضح في الشكل 8. لم يتم العثور على بروتين NGAL المناعي في وسط المزرعة من خلايا التحكم ، ولكن يمكن اكتشاف NGAL بسهولة في غضون 1 ح من نضوب ATP الخفيف (الشكل 8). لوحظت زيادات أخرى في وفرة البروتين NGAL ذات الصلة بمدة استنفاد ATP. تشير هذه النتائج إلى أن بروتين NGAL المستحث يتم إفرازه بسرعة في الوسط ، على غرار المظهر السريع لـ NGAL في البول بعد نقص التروية الكلوية في الجسم الحي.

الشكل 8. تحريض NGAL مرنا بعد نقص التروية في المختبر. (أعلى) الممثل RT-PCR مع الاشعال لـ NGAL البشري ، باستخدام RNA المستخرج من الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة الكلوية (RPTEC) بعد فترات مختلفة من استنفاد ATP الجزئي كما هو موضح (ساعات). يحتوي حارة M على 100- سلم DNA bp. (الأوسط) زيادة في تعبير NGAL mRNA في نقاط زمنية مختلفة من عنصر التحكم (0) ، تم تطبيعه لتعبير نازعة هيدروجين الفوسفات -3-. القيم المعروضة هي وسائل SD من ثلاث تجارب في كل نقطة زمنية. (أسفل) لطخة غربية تمثيلية مع عينات RPTEC بعد فترات مختلفة من استنفاد ATP الجزئي كما هو موضح (ساعات) ، تم الحصول عليها من كميات متساوية من كريات الخلية (Pel) أو وسط الاستزراع (Sup) ، تم فحصها باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة لـ NGAL. علامات الوزن الجزيئي على اليسار. الرقم يمثل ثلاث تجارب منفصلة.

يتم اكتشاف البروتين NGAL بسهولة في البول في وقت مبكر بعد تحريض السمية الكلوية التي يسببها سيسبلاتين

كنا نرغب بعد ذلك في تحديد ما إذا كان يمكن اكتشاف NGAL في البول بعد أشكال أخرى من إصابة الخلايا الأنبوبية. في نموذج الماوس الراسخ للسمية الكلوية سيسبلاتين ، تم اكتشاف NGAL بسهولة في البول خلال 1 د من إدارة سيسبلاتين (الشكل 9). في المقابل ، كان الغلوبولين المكروي 2- البولي بالكاد يمكن اكتشافه بعد يومين ولا يمكن اكتشافه بشكل موثوق حتى اليوم الرابع إلى الخامس بعد السيسبلاتين. وبالمثل ، فإن زيادة إفراز NAG البولي لم يكن واضحًا حتى اليومين الرابع والخامس بعد تناول سيسبلاتين (الشكل 9).

الشكل 9. الكشف المبكر عن بروتين NGAL في البول في الفئران المصابة بإصابة يسببها السيسبلاتين. (أ) اللطخات الغربية التمثيلية على عينات البول غير المعالجة (1 إلى 2 لتر لكل ممر ، تم تطبيعها لمحتوى الكرياتينين) التي تم الحصول عليها في أيام كما هو موضح بعد إعطاء سيسبلاتين ، مع فحص الجسم المضاد لـ 2- ميكروغلوبولين أو NGAL. علامات الوزن الجزئي مبين على اليسار. (ب) قرارات NAG البولية في أيام مختلفة بعد إعطاء سيسبلاتين (ن 4). القيم تعني plus -SD. * P 0. 0 5 مقابل اليوم 0.

مناقشة

استخدمنا استراتيجية استجواب على مستوى النسخ لتحديد الجينات الكلوية التي يتم تحفيزها مبكرًا بعد نقص التروية الكلوية ، والتي قد تكون منتجاتها البروتينية بمثابة مؤشرات حيوية جديدة لـ ARF. حددنا سبعة جينات مُنظَّمة 10- أضعاف ، تم الإبلاغ مؤخرًا عن تحفيز إحداها (Cyr61) بعد الإصابة بنقص التروية الكلوية (8). بشكل غير متوقع ، كان استقراء النصوص الستة الأخرى جديدًا في مجال ARF. في هذه الدراسة ، اخترنا توصيف أحد هذه الجينات غير المعترف بها سابقًا ، وهي NGAL.

ينتمي NGAL إلى عائلة ليبوكالين الفائقة - 20 من البروتينات المُفرزة ذات الصلة بنيويًا والتي يُعتقد أنها تنقل مجموعة متنوعة من الروابط داخل الكأس ذي البرميل (23). تم تحديد NGAL البشري في الأصل على أنه 25- بروتين كيلو دالتون مرتبط تساهميًا بالجيلاتيناز من العدلات البشرية ، حيث يمثل أحد البروتينات الحبيبية الثانوية للعدلات (24 ، 25). كشفت دراسات الاستنساخ الجزيئي أن NGAL البشري مشابه لجين الفأر 24p3 ​​الذي تم تحديده لأول مرة في الثقافات الأولية لكلى الفئران التي تم تحفيزها على التكاثر (26). يتم التعبير عن NGAL عند مستويات منخفضة جدًا في الأنسجة البشرية الأخرى ، بما في ذلك الكلى والقصبة الهوائية والرئتين والمعدة والقولون (27). يتم إحداث تعبير NGAL بشكل ملحوظ في ظهارة محفزة. على سبيل المثال ، يتم تنظيمه في الخلايا الظهارية القولونية في مناطق الالتهاب أو الأورام ولكنه غائب من التدخل في المناطق غير المتأثرة أو داخل الآفات النقيلية (28). ترتفع تركيزات NGAL في مصل المرضى المصابين بعدوى بكتيرية حادة (29) ، وبلغم الأشخاص المصابين بالربو أو مرض الانسداد الرئوي المزمن (30) ، والسائل القصبي من الرئة المنتفخة (31). في كل هذه الحالات ، يُفترض أن تحريض NGAL هو نتيجة التفاعلات بين الخلايا الالتهابية والبطانة الظهارية ، مع ظهور انتظام في التعبير NGAL في كل من العدلات والظهارة (28-32).

حتى الآن لم يتم وصف زيادة تنظيم NGAL في الكلى الناضجة. تشير عدة سطور من الأدلة المستقاة من دراستنا إلى أن تحريض NGAL المكتشف يمثل استجابة ذاتية جديدة لخلايا النبيبات القريبة من الكلى للإصابة الدماغية ولا يتم اشتقاقها فقط من العدلات المنشطة. أولاً ، تكون الاستجابة سريعة للغاية ، مع ظهور NGAL في البول خلال ساعتين من الإصابة (في أول إخراج للبول بعد انسداد الشريان الكلوي) ، وعادة ما يتم ملاحظة تراكم العدلات الكلوية في هذا النموذج من ARF الإقفاري لأول مرة في 4 ساعات بعد الاصابة (33-35). ثانياً ، الأنماط الزمنية لتحريض NGAL وتراكم العدلات متباينة. لوحظ NGAL mRNA وتعبير البروتين إلى أقصى حد عند 12 ساعة من إعادة التدفق ، في حين أن تراكم العدلات يبلغ ذروته في 24 ساعة (33-35) ، وفي ذلك الوقت انخفض التعبير NGAL بشكل ملحوظ. ثالثًا ، لم يتم اكتشاف أي عدلات معبرة عن NGAL عن طريق التألق المناعي في عينات الكلى التي تم فحصها (الشكل 4). الرابع والأكثر إقناعًا ، تم توثيق NGAL mRNA وتحريض البروتين في خلايا الأنابيب البشرية القريبة المستزرعة بعد نقص التروية في المختبر ، مع إفراز NGAL في وسط الاستزراع خلال ساعة واحدة من استنفاد ATP ، في نظام تكون فيه العدلات غائبة تمامًا. ومع ذلك ، فإن دراساتنا في الجسم الحي لا تسمح لنا باستبعاد بعض المساهمة تمامًا من تسلل العدلات المنشطة إلى تنظيم NGAL المرصود. في الواقع ، من الممكن أن يتم تحفيز التنظيم الأعلى لـ NGAL في خلايا النبيبات الكلوية عن طريق الإطلاق المحلي للسيتوكينات من العدلات المحاصرة في دوران الأوعية الدقيقة في وقت مبكر بعد الإصابة الدماغية.

ما هو القسط؟ سيستانشيمكن أن يعالجكلويإصابة

كان هناك نقص في التفسير المناسب لتحريض NGAL عن طريق الظهارة المحفزة ، وما إذا كان NGAL وقائيًا أو قريبًا من الإصابة أو حتى متفرجًا بريئًا لا يزال غير واضح. تشير الدلائل الحديثة إلى أنه ، على الأقل في مجموعة فرعية من أنواع الخلايا ، قد تمثل NGAL جزيء proapoptotic (36-38). في خط الخلايا اللمفاوية الموالية للماوس B ، أدى انسحاب السيتوكين إلى تحريض ملحوظ لـ NGAL وكذلك بداية موت الخلايا المبرمج (36،37). كما تم ربط NGAL بموت الخلايا المبرمج في الأنسجة التناسلية. تعبر الخلايا الظهارية في الغدة الثديية والرحم عن مستويات عالية من NGAL ، والتي تتزامن مؤقتًا مع فترة موت الخلايا المبرمج القصوى (38). من المحتمل أن NGAL ينظم مجموعة فرعية من مجموعات الخلايا عن طريق إحداث موت الخلايا المبرمج. قد تؤدي الظهارة المحفزة إلى زيادة تنظيم NGAL للحث على موت الخلايا المبرمج من العدلات المتسللة ، وبالتالي السماح للخلايا المقيمة بالبقاء على قيد الحياة في خراب الاستجابة الالتهابية. بدلاً من ذلك ، قد تستخدم الخلايا الظهارية هذه الآلية لتنظيم زوالها. ومع ذلك ، من المثير للاهتمام أن نلاحظ في دراساتنا أن تحريض NGAL بعد إصابة نقص التروية الكلوية المبكرة - إعادة التروية يحدث في الغالب في خلايا الأنابيب القريبة التي لم تعرض نوى TUNEL إيجابية.

كشفت دراسات حديثة أخرى أن NGAL يعزز النمط الظاهري الظهاري. يتم التعبير عن NGAL بواسطة برعم الحالب المخترق ويؤدي إلى تكوين الكلية عن طريق تحفيز تحويل الخلايا اللحمية المتوسطة إلى ظهارة كلية (21). تم إثبات أن ليبوكالين آخر ، وهو الجليكودلين ، يحفز النمط الظاهري الظهاري عند التعبير عنه في خلايا سرطان الثدي البشري (40). هذه النتائج وثيقة الصلة بشكل خاص بالكلية الناضجة ، حيث تتمثل إحدى الاستجابات الموثقة جيدًا للإصابة الدماغية في المظهر الرائع للخلايا الظهارية غير المتمايزة التي تبطن الأنابيب القريبة (41). يتضمن أحد الجوانب المهمة لتجديد الكلى وإصلاحها بعد الإصابة الدماغية إعادة اكتساب النمط الظاهري الظهاري ، وهي عملية تلخص العديد من جوانب التطور الطبيعي (42). يشير هذا إلى أنه يمكن التعبير عن NGAL بواسطة النبيب التالف للحث على إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري. يُستمد دعم هذه الفكرة من التحديد الأخير لـ NGAL كبروتين ناقل للحديد مكمل للترانسفيرين أثناء تكوّن الكلية (21). من المعروف جيدًا أن توصيل الحديد إلى الخلايا أمر بالغ الأهمية لنمو الخلايا وتطورها ، ومن المفترض أن يكون هذا أمرًا بالغ الأهمية لتجديد الكلى بعد الإقفار تمامًا كما هو الحال أثناء مرحلة تكون الجنين. نظرًا لأن NGAL يبدو أنه يربط وينقل الحديد (21) ، فمن المحتمل أيضًا أن يعمل NGAL كمغسلة للحديد الذي يتم التخلص منه من الخلايا الظهارية القريبة التالفة. لأن NGAL يمكن أن يلتحم بواسطة النبيب القريب (K. Mori و J. Barasch ، ملاحظات غير منشورة) ، يمكن للبروتين إعادة تدوير الحديد إلى خلايا قابلة للحياة. قد يحفز هذا النمو والتطور ، بالإضافة إلى إزالة الحديد ، وهو جزيء تفاعلي ، من موقع إصابة الأنسجة ، وبالتالي الحد من السمية الخلوية التي يتوسطها الحديد. تظهر نتائجنا أن التوطين المشترك لـ NGAL في الخلايا الأنبوبية المتكاثرة إيجابية PCNA يقدم مزيدًا من الدعم لهذه الفرضية.

يتعلق أحد الآثار الرئيسية لنتائجنا بإمكانية كون NGAL علامة بيولوجية بولية جديدة لمرض نقص تروية الدم.كلويإصابةيقارن بشكل إيجابي مع المؤشرات الحيوية الأخرى التي تم وصفها. ربما يكون أفضل مثال تمت دراسته هو جزيء إصابة الكلى -1 (KIM -1) ، وهو جزيء التصاق مفترض يشارك في تجديد الكلى (43،44). في نموذج الفئران لإصابة نقص التروية - ضخه ، وجد أن KIM -1 قد تم تنظيمه بعد 24 إلى 48 ساعة من الإهانة الأولية ، مما يجعله علامة موثوقة ولكنها متأخرة إلى حد ما لتلف الخلايا الأنبوبية. أظهرت الدراسات الحديثة الأنيقة أنه يمكن اكتشاف كيم -1 في خزعة الكلى وبول المرضى المصابين بالنخر الأنبوبي الحاد الإقفاري (45). ومع ذلك ، تم توثيق هذا الاكتشاف في المرضى الذين يعانون من تلف كلوي إقفاري مؤكد ، ولم يتم التحقق من فائدة قياس KIM -1 البولية للكشف عن الإصابة المبكرة تحت الإكلينيكية حتى الآن. في مثال حديث آخر ، تم العثور على Cyr61 ليكون بروتينًا غنيًا بالسيستين مُفرزًا يمكن اكتشافه في البول من 3 إلى 6 ساعات بعد الإصابة الكلوية الإقفارية (8). ومع ذلك ، فإن هذا الاكتشاف يتطلب خطوة تنقية حيوية باستخدام حبات الهيبارين-سيفاروز ، وحتى بعد هذا التنقية ، كانت العديد من الببتيدات المتفاعلة واضحة. في المقابل ، توضح دراستنا أنه تم اكتشاف NGAL بسهولة وسرعة كببتيدات مناعية نظيفة نسبيًا في البقع الغربية مع أقل من 1 لتر من أول إخراج بول غير معالج بعد نقص التروية الكلوي في كل من الفئران والجرذان. بالإضافة إلى ذلك ، كان NGAL البولي واضحا حتى بعد إقفار كلوي خفيف جدا "تحت الإكلينيكي" ، على الرغم من مستويات الكرياتينين الطبيعية في الدم. علاوة على ذلك ، فإن اكتشاف NGAL البولي قد سبق ظهور الواسمات التقليدية في البول ، بما في ذلك 2- ميكروغلوبولين و NAG.

أخيرًا ، تجدر الإشارة إلى أن NGAL كان قابلاً للاكتشاف أيضًا في البول مبكرًا بعد إعطاء سيسبلاتين ، في وقت كانت فيه المؤشرات المورفولوجية والكيميائية الحيوية الأخرىكلويإصابةكانت غائبة. وبالتالي ، قد يمثل التنظيم والإفراز البولي لـ NGAL استجابة سريعة لخلايا النبيبات الكلوية لمجموعة متنوعة من الإهانات ، وقد يمثل اكتشاف NGAL في البول أداة سريرية غير باضعة قابلة للتطبيق على نطاق واسع للتشخيص المبكر لإصابة الخلايا الأنبوبية.

باختصار ، تشير بياناتنا إلى أن NGAL يمثل علامة بيولوجية جديدة وحساسة وغير غازية للإقفار الكلوي. سيكون من المهم في العمل الترجمي المستقبلي فحص تعبير NGAL في بول المرضى الذين يعانون من أشكال خفيفة ومبكرة من نقص ترويةكلويإصابة. من المأمول أن يمكّن هذا الاكتشاف المبكر الأطباء من بذل جهود تداخلية في الوقت المناسب في ARF ، وهي حالة لا تزال مرتبطة بالتشخيص الكئيب الذي يحتاج بشدة إلى علاجات جديدة. علاوة على ذلك ، من المأمول أن يكون هذا الكشف السريع والبسيط عن NGAL البولي في المرضى الذين يعانون من نقص تروية تحت الإكلينيكية الدقيقة.كلويإصابة(على سبيل المثال ، عمليات زرع الكلى ذات الصلة بالحياة ، وجراحة الأوعية الدموية ، وأحداث القلب والأوعية الدموية) أو أضرار التسمم الكلوي تحت الإكلينيكي (على سبيل المثال ، استخدام عوامل التباين والأمينوغليكوزيدات) ستنبه الطبيب لإجراء مناورات تهدف إلى منع التقدم إلى ARF الصريح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى إلى PD (DK53289 ، DK52612) و JB (DK55388 و DK58872).

Cistanche tubulosaيمكن أن يعالجإصابة كلوية

مراجع
1. Thadani R ، Pascual M ، Bonventre JV: الفشل الكلوي الحاد. إن إنجل جي ميد 334: 1448-1460، 1996
2. نجم RA: علاج الحالات الحادةكلويخزي. الكلية الدولية 54: 1817-1831 ، 1998
3. Liaño F ، Pascual J: العوامل التنبؤية والتسجيل. في: الفشل الكلوي الحاد ، تم تحريره بواسطة Molitoris BA ، و Finn WF ، فيلادلفيا ، دبليو بي سوندرز ، 2001 ، ص 507-518
4. Molitoris بكالوريوس: الانتقال إلى العلاج في الفشل الكلوي الحاد الإقفاري. J Am Soc Nephrol 14: 265–267، 2003
5. برادي إتش آر ، برينر بي إم ، كلاركسون إم آر ، ليبيرثال دبليو: فشل كلوي حاد. في: الكلى ، الطبعة السادسة ، تحرير برينر بي إم ، فيلادلفيا ، دبليو بي سوندرز ، 2000 ، ص 1201-1262
6. Sutton TA ، Molitoris BA: آليات الإصابة الخلوية في الفشل الكلوي الحاد الإقفاري. سيمين نفرول 18: 490-497 ، 1998
7. شيريدان إيه إم ، Bonventre JV: بيولوجيا الخلية والآليات الجزيئية للإصابة في نقص التروية الحادةكلويخزي. العملة الرئيسية Opin Nephrol Hypertens 9: 327–334 ، 2000
8. Muramatsu Y، Tsujie M، Kohda Y، Pham B، Perantoni AO، Zhao H، Jo SK، Yuen PST، Craig L، Hu X، Star RA: الكشف المبكر عن البروتين الغني بالسيستين 61 (CYR61، CCN1) في البول بعد إصابة نقص التروية الكلوية ضخه. الكلية الدولية 62: 1601-1610 ، 2002

9. Kurella M، Hsiao LL، Yishida T، Randall JD، Chow G، Sarang SS، Jensen RV، Gullans SR: تحليل ميكروأري للحمض النووي للعمليات البيولوجية المعقدة. J آم سوك نيفرول 12: 1072-1078 ، 2001

10. Yoshida T، Kurelia M، Beato F، Min H، Ingelfinger JR، Stears RL، Swinford RD، Gullans SR، Tang SS: مراقبة التغيرات في التعبير الجيني في نقص التروية الكلوية - ضخه في الفئران. الكلية الدولية 61: 1646–1654 ، 2002

11. Supavekin S ، Zhanh W ، Kucherlapati R ، Kaskel FJ ، Moore LC ، Devarajan P: التعبير الجيني التفاضلي بعد نقص التروية الكلوية / ضخه. الكلية الدولية 63: 1714-1724 ، 2003
12. Nogae S، Miyazaki M، Kobayashi N، Saito T، Abe K، Saito H، Nakane PK، Nakanishi Y، Koji T: تحريض موت الخلايا المبرمج في نموذج نقص التروية - ضخه لكلية الفأر: احتمال تورط فاس. J آم سوك نفرول 9: 620-631 ، 1998
13. دايمن مارك ، فان دي فين إم دبليو سي إم ، هاينمان إي ، بورمان واشنطن: مشاركة إنترلوكين داخلي -10 وعامل نخر الورم - في إصابة نقص التروية الكلوية - ضخه. زرع 67: 792-800 ، 1999
14. Kelly KJ ، Plotkin Z ، Dagher PC: مكملات Guanosine تقلل من موت الخلايا المبرمج وتحميكلويتعمل في وضع الإصابة الدماغية. ياء كلين إنفست 108: 1291-1298 ، 2001
15. Burne NJ ، Rabb H: المساهمات الفيزيولوجية المرضية من fucosyltransferases في إصابة نقص التروية الكلوية وضخه. J إمونول 169: 2648-2652 ، 2002
16. Megyesi J، Safirstein RL، Price PM: يؤثر تحريض p21WAF1 / CIP / SD1 في خلايا الأنابيب الكلوية على مسار الحادة المستحثة بالسيسبلاتينكلويخزي. ياء كلين إنفست 101: 777-782 ، 1998
17. Shiraishi F، Curtis LM، Truong L، Poss K، Visner GA، Madsen K، Nick HS، Agarwal A: Heme Oxygenase -1 يعدل أو التعبير الجيني موت الخلايا المبرمج الكلوي الناجم عن السيسبلاتين. Am J Physiol 278: F726 – F736، 2000
18. راميش جي ، ريفز دبليو بي: TNF- يتوسط التعبير الكيميائي والخلوي وكلويإصابةفي السمية الكلوية سيسبلاتين. ياء كلين إنفست 110: 835-842 ، 2002
19. Feldenberg LR، Thevananther S، del Rio M، De Leon M، Devarajan P: يؤدي استنفاد ATP الجزئي إلى موت الخلايا المبرمج Fas و caspase في خلايا MDCK. Am J Physiol 276: F837 – F846، 1999
20. Devarajan P، De Leon M، Talasazan F، Schoenfeld AR، Davidowitz EJ، Burk RD: المنتج الجيني von Hippel-Lindau يثبط موت الخلايا المبرمج للخلايا الكلوية عبر المسارات التابعة لـ Bcl -2-. J بيول كيم 276: 40599-40605 ، 2001
21. Yang J ، Goetz D ، Li JY ، Wand W ، Mori K ، Setlik D ، Du T ، ErdjumentBromage H ، Tempst P ، Strong R ، Barasch J: مسار توصيل الحديد بوساطة ليبوكالين. خلية مول 10: 1045-1056 ، 2002
22. Molitoris BA ، Weinberg JM ، Venkatachalam MA ، Zager RA ، Nath KA ، Goligorsky MS: الفشل الكلوي الحاد II. النماذج التجريبية للفشل الكلوي الحاد: غير كاملة لكن لا غنى عنها. Am J Physiol 278: F1-F12، 2000
23. Flower DR، North AC، Sansom CE: عائلة بروتين الليبوكالين: نظرة عامة هيكلية ومتسلسلة. Biochim Biophys Acta 1482: 9-24 ، 2000
24. Kjeldsen L ، Cowland JB ، Borregaard N: العدلات البشرية المرتبطة بالجيلاتيناز والبروتينات المتماثلة في الجرذان والفئران. Biochim Biophys Acta 1482: 272-283 ، 2000
25. Xu S ، Venge P: Lipocalins كعلامات كيميائية حيوية للمرض. بيوتشيم بيوفيز أكتا 1482: 298-307 ، 2000
26. Hraba-Renevey S، Turler H، Kress M، Salomon C، Weil R: SV 40- التعبير المستحث عن جين الفأر 24p3 ​​يتضمن آلية ما بعد النسخ. الورم 4: 601-608 ، 1989
27. Cowland JB ، Borregaard N: التوصيف الجزيئي ونمط التعبير النسيجي لجين ليبوكالين العدلات المرتبط بالجيلاتيناز من البشر. علم الجينوم 45: 17-23 ، 1997
28. Nielson BS، Borregaard N، Bundgaard JR، Timshel S، Sehested M، Kjeldsen L: تحريض تخليق NGAL في الخلايا الظهارية لأورام القولون والمستقيم البشرية وأمراض الأمعاء الالتهابية. القناة الهضمية 38: 414-420 ، 1996
29. Xu SY ، Pauksen K ، Venge P: تميز قياسات مصل الليبوكالين البشري العدلة (HNL) بين الالتهابات البكتيرية والفيروسية الحادة. Scand J Clin Lab Invest 55: 125-131 ، 1995
30. Keatings VM، Barnes PJ: علامات تنشيط الخلايا الحبيبية في البلغم المستحث بالمقارنة بين مرض الانسداد الرئوي المزمن والربو والأشخاص الطبيعيين. Am J Respir Crit Care Med 155: 449-453 ، 1997
31. Betsuyaky T، Nishimura M، Takeyabu K، Tanino M، Venge P، Xu S، Kawakami Y: بروتينات حبيبات العدلات في سائل غسل القصبات الهوائية من الأشخاص المصابين بانتفاخ الرئة تحت الإكلينيكي. Am J Respir Crit Care Med 159: 1985-1991 ، 1999
32. Carlson M، Raab Y، Severus L، Xu S، Hallgren R، Venge P: العدلات البشرية ليبوكالين هي علامة فريدة على التهاب العدلات في التهاب القولون التقرحي والتهاب المستقيم. الأمعاء 50: 501-506 ، 2002
33. Chiao H، Kohda Y، McLeroy P، Craig L، Housing I، Star RA: - هرمون منشط للخلايا الصغرى يحمي منكلويإصابةبعد نقص التروية في الفئران والجرذان. ياء كلين إنفست 99: 1165-1172 ، 1997
34. Rabb H ، Ramirez G ، Saba SR ، Reynolds D ، Xu J ، Flavell R ، Antonia S: إصابة نقص تروية الكلى - ضخه في الفئران التي تعاني من نقص L-selectin. Am J Physiol 271: F408-F13، 1996
35. Rabb H، Star R: الاستجابة الالتهابية وعواقبها الحادةكلويخزي. في: الفشل الكلوي الحاد ، تم تحريره بواسطة Molitoris BA ، و Finn WF ، فيلادلفيا ، دبليو بي سوندرز ، 2001 ، ص 89 - 100
36. Devireddy LR، Teodoro JG، Richard FA، Green MR: تحريض موت الخلايا المبرمج عن طريق ليبوكالين المفرز والذي ينظمه نسخ IL -3 الحرمان. Science 293: 829-834 ، 2001
37. Persengiev SP ، Devireddy LR ، Green MR: تثبيط موت الخلايا المبرمج بواسطة ATFx: دور جديد لعضو من عائلة ATF / CREB لعوامل نسخ bZIP للثدييات. جينات ديف 16: 1806-1814 ، 2002
38. Ryon J ، Bendickson L ، Nilsen-Hamilton M: تعبير عالي في الأنسجة التناسلية الملتوية لـ uterocalin / 24p3 ​​، وهو بروتين ليبوكالين وبروتين المرحلة الحادة. Biochem J 367: 271-277 ، 2002
39. حذف في الإثبات.
40. Kamarainen M، Seppala M، Virtanen I، Andersson LC: يؤدي التعبير عن الجليكودلين في خلايا سرطان الثدي MCF -7 إلى التمايز في ظهارة أسينار المنظمة. لاب إنفست 77: 565-573 ، 1997
41. Witzgall R ، Brown D ، Schwarz C ، Bonventre JV: توطين مستضد الخلية النووية المتكاثر ، vimentin ، c-fos ، و clusterin في الكلية بعد الإقفار: دليل على استجابة وراثية غير متجانسة بين قطاعات النيفرون ، ومجموعة كبيرة من الانقسامات الانقسامية الخلايا النشطة وغير المتمايزة. ياء كلين إنفست 93: 2175-2188 ، 1994
42. هامرمان إم. الكلية الدولية 57: 742-755 ، 2000
43. Ichimura T، Bonventre JV، Bailly V، Wei H، Hession CA، Cate RL، Sanicola M: جزيء إصابة الكلى -1 (KIM -1) ، جزيء التصاق الخلية الظهارية المفترض الذي يحتوي على غلوبولين مناعي جديد المجال ، يتم تنظيمه في الخلايا الكلوية بعد الإصابة. J Biol Chem 271: 4135-4142، 1998
44. Bailly V، Zhang Z، Meier W، Cate R، Sanicola M، Bonventre JV: التخلص من جزيء إصابة الكلى -1 ، وهو بروتين التصاق مفترض يشارك في تجديد الكلى. جي بيول كيم 277: 39739-39748 ، 2002
45. Han WK ، Bailly V ، Abichandani R ، Thadani R ، Bonventre JV: جزيء إصابة الكلى -1 (KIM -1): علامة بيولوجية جديدة لإصابة النبيبات الكلوية القريبة البشرية. الكلية الدولية 62: 237-244 ، 2002