تصوير الكلى: من الضوء إلى الفحص المجهري فائق الدقة

جهة الاتصال: ali.ma@wecistanche.com

ماريا لوسيا أنجيلوتي^1,2، جوليا أنتونيلي^1,2 كارولينا كونتي^1,2وباولا رومانياني^1,2

نبذة مختصرة

الإنجازات الهامة فيالكلىيمكن أن تُعزى الآليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية إلى حد كبير إلى التقدم في تقنية الفحص المجهري. الكثير مما نعرفه عن هندسةالكلىيعتمد على الأوصاف الأساسية لعلماء الميكروسكوب التشريحي باستخدام المجهر الضوئي ولاحقًا عن طريق تحليل البنية التحتية الذي يوفره الفحص المجهري الإلكتروني. تم استخدام هاتين الطريقتين لأنظمة التصنيف الأولى لأمراض الكلى ولتحديثها المستمر. في الآونة الأخيرة ، أضافت سلسلة من تقنيات التصوير الجديدة التحليل في أبعاد أخرى من الزمان والمكان. سمح لنا الفحص المجهري متحد البؤر بتصور الأقسام الضوئية بالتسلسل على طول المحور z وتوافر برنامج تحليل محدد قدم عرضًا ثلاثي الأبعاد لعينات الأنسجة السميكة. سمح لنا الفحص المجهري Multiphoton بالتحقيق في وقت واحدالكلىالوظيفة والهيكل في الوقت الفعلي. سمح لنا التصوير المجهري مدى الحياة الفلورية بدراسة التوزيع المكاني للمستقلبات. زاد الفحص المجهري فائق الدقة من الحساسية والدقة حتى مستويات النطاق النانوي. باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد ، يمكن للباحثين تصور الجزيئات الحيوية الفردية على المستويات الذرية مباشرة في الأنسجة وفهم تفاعلها على المستويات دون الخلوية. أخيرًا ، سمح مطياف الكتلة للتصوير بالليزر / التأين باستخدام المصفوفة بقياس مئات الجزيئات المختلفة في نفس الوقت على أقسام الأنسجة بدقة عالية. تقدم هذه المراجعة نظرة عامة على المتاحالكلىاستراتيجيات التصوير ، مع التركيز على التأثير المحتمل لأحدث التحسينات التكنولوجية.

الكلمات الدالة:المناعيةالكلىخزعة ،الأقربأنبوب صغير، الخلايا الجذعية

Cistanche herba لمرض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

المقدمة

الالكلىالتعقيد الهيكلي الرائع مطلوب لتحقيق وظائفه الفسيولوجية المتنوعة. في البداية ، دراسةالكلىاقتصرت على الملاحظات العيانية وكانت مساهمتها في تشخيص أمراض الكلى محدودة بلا شك. تم وصف المظاهر السريرية ولكن الآليات الممرضة الكامنة لم تكن معروفة. يمكن أن تُعزى الإنجازات في فهم فسيولوجيا الكلى والفيزيولوجيا المرضية إلى حد كبير إلى التقدم المستمر في مجال الفحص المجهري. محاولات فيالكلىبدأ التصوير منذ وقت طويل [1]. في عام 1666 ، قام عالم التشريح Malpighi بفحصهالكلىنسيج مع مجهر ضوئي تقدر قوته بـ 25-30 ووصف لأول مرة الكبيبة بأنها "غدة يفصل فيها البول عن الدم" [2]. تم تجاهل هذه المساهمة حتى عام 1842 عندما تم تفكيك هياكل النيفرون باستخدام مجهر ضوئي أقوى بعشر مرات بواسطة السير ويليام بومان. اكتشف بومان الكبسولة المحيطة بالكبيبة (التي سميت لاحقًا بكبسولة بومان) باعتبارها متصلة تشريحيًا بالجزء الأول من النبيب [3]. في عام 1862 ، وصف جاكوب هينلي المقطع النبيب الشبيه بالحلقة الذي أخذ اسمه ، والذي يربط النبيب القشري والحليمة الكلوية.

بفضل إدخال المجهر الضوئي ، أصبح التصنيف النسيجي لـالكلىالأمراضأصبح ممكنا [1]. سمحت فرصة مراقبة ما كان يحدث في الكلى المريضة بفهم أن التغيرات المرضية تختلف اختلافًا كبيرًا بين المرضى الذين يعانون من مظاهر سريرية مماثلة. ومع ذلك ، أجريت الدراسات الأولى على التغيرات المرضية في أنسجة الكلى على عينات التشريح ، مما أدى في الغالب إلى وصف الأمراض المزمنة. أدى نقص المعلومات حول تطور أمراض الكلى والمشكلة التقنية لظواهر الانحلال الذاتي ، المرتبطة باستخدام أنسجة ما بعد الوفاة ، إلى الحد من معرفة الأمراض التي تصيب الإنسان. في عام 1951 ، تم تقديمالكلىسمحت الخزعة بالمراقبة المباشرة والدراسة ليس فقط لأمراض الكلى المزمنة ولكن أيضًا لأمراض الكلى الحادة. وفي الوقت نفسه ، أصبح الفحص المجهري أكثر تعقيدًا تدريجيًا مع زيادة الحساسية والدقة بشكل تدريجي حتى مستويات المقياس النانوي. في هذا الاستعراض ، سوف نقدم لمحة عامة عن الاكتشافات الأساسية للكلى التي أصبحت ممكنة بفضل التقدم في تقنية الفحص المجهري ، مع التركيز على الاحتمالات الناشئة من أحدث التطورات التقنية.

تصوير طب الجهاز المناعي للكلى

المجهري المناعي والفلوري

سمحت إمكانية الحصول على جزء تمثيلي من الأنسجة الحية بتطبيق التقنيات الناشئة التي تتطلب الحفاظ على الأنسجة القصوى ، مثل الطرق الكيميائية المناعية (الفلورية أولاً ، ثم الأنزيمية). في الواقع ، في عام 1950 ، طور Coons طريقة تصنيف الأجسام المضادة باستخدام الفلورسين أيزوسيانات ، أي التألق المناعي ، دون تدمير القدرة على التفاعل بشكل خاص مع مستضدات الأنسجة. منذ ذلك الحين تم دمج الفلورة المناعية في إجراءات التشخيص لتقييم عينات خزعة الكلى المجمدة. لأول مرة ، سمحت هذه التقنيات بملاحظة الغلوبولين المناعي داخل الكلى (Igs) والرواسب التكميلية في المرضى المصابين بالتهاب كبيبات الكلى ، مما ساهم في التمييز بين الفيزيولوجيا المرضية المختلفة الكامنة وراء بعض آفات الأنسجة غير المحددة ، على سبيل المثال ، في التهاب كبيبات الكلى الهلالي [4]. بالإضافة إلى ذلك ، أدت إمكانية ملاحظة نمط تلطيخ مميز واقتران الفلورسين بالأجسام المضادة بخلاف الغلوبولين المناعي G (IgG) إلى التعرف على رواسب الغلوبولين المناعي A (IgA) في اعتلال الكلية بالجلوبيولين المناعي A ، وكذلك الترسبات التكميلية في التهاب كبيبات الكلى التالي للعدوى والتهاب كبيبات الكلى التكاثري الغشائي [4].

المجهر متحد البؤر

خضع الفحص المجهري الفلوري لتحسين تقني كبير مع إدخال الفحص المجهري متحد البؤر في أواخر الثمانينيات. العناصر الرئيسية في الفحص المجهري متحد البؤر هي تركيز الإضاءة النقطية ومسحها ضوئيًا فوق العينة وفتحة متحد البؤر (الثقب) أمام الكاشف الذي يسمح بجمع الضوء من قسم رفيع فقط حول المستوى البؤري (يسمى القسم البصري). أتاح الفحص المجهري متحد البؤر إجراء الدراسات الأولى في الجسم الحي للكلية في النماذج التجريبية ومراقبة امتصاص ونقل جزيئات الفلورسنت عبر الأنابيب السليمة.الكلىبعد الوخز الدقيق. سمح هذا بدراسات الوظيفة الأنبوبية في الظروف الفسيولوجية والمرضية [5].

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 نانومتر ، بسبب حد الانعراج للضوء المرئي والتبييض الضوئي والسمية الضوئية.

فهم حاجز الترشيح الكبيبي: المجهر الإلكتروني

كانت المحاولة الأولى للتغلب على حد دقة مجاهر الضوء والفلورة في عام 1931 عندما اخترع إرنست روسكا وماكس نول المجهر الإلكتروني (EM) ، والذي يستخدم شعاعًا من الإلكترونات المتسارعة ، بدلاً من شعاع من الضوء ، كمصدر للإثارة ، ولها قدرة تحليلية أعلى من المجاهر الضوئية (حتى 0. 2 نانومتر). لهذا الابتكار ، حصل إرنست روسكا في عام 1986 على جائزة نوبل في الفيزياء. بفضل قوة الاستبانة المتزايدة ، سرعان ما أصبح واضحًا أن الكبيبة لم تكن مجرد مرشح ميكانيكي ، ولكنها عضو معقد للغاية يتكون من ثلاث طبقات: الخلايا البطانية ، والغشاء القاعدي الكبيبي (GBM) ، والخلايا البادوسية [9]. سمح الإرسال EM (TEM) بتصور الخلايا الكبيبية من الداخل [10] وكشف أن الخلايا البطانية لها أجسام رقيقة من الخلايا المنشطة ، في حين أن الخلايا البادوسية لها أجسام خلوية كبيرة ، وتمتد عمليات "القدم" الأولية والثانوية المرتبطة بـ GBM والمترابطة من خلال التقاطعات الخطية (الحجاب الحاجز الطفيف) (الشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، فإن مسح EM (SEM) ، والتقاط الإلكترونات المتناثرة ، سمح بتصور الخلايا الكبيبية من سطحها الخارجي [10] وكشف أن عمليات القدم للخلايا البودوسية المجاورة تتداخل وتغطي GBM (الشكل 1C). ظلت EM أداة قوية ليس فقط لفهم البنية التحتية الكبيبية الدقيقة العادية ولكن أيضًا للفهمالكلىعلم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية [11]. كشفت العديد من الدراسات التي أجريت على عينات بشرية أو في نماذج تجريبية أن عمليات المرض المختلفة مرتبطة بمجموعة من الأنماط المميزة لتعديلات البنية التحتية ، مما يعني مزيدًا من التحديثات على نظام تصنيف متطورالكلىالأمراض. أيدت القدرة التقنية لتصور تعقيد إضافي للبنية التحتية للكلى تخصص أطباء أمراض الكلى.

سمحت تقنية SEM الحديثة ، القائمة على كاشف شديد الحساسية ، بدراسة الجزء الأعمق من الحجاب الحاجز الشق وكشفت أنه يتميز بمسام بأحجام مختلفة [12]. في الفئران ، ارتبط ظهور البيلة البروتينية بالمسام الكبيرة ، مما زاد من احتمالية أن تكون التغييرات في البنية التحتية للحجاب الحاجز الشقي سببًا للتغيرات في انتقائية الكبيبات [12]. كتقدم تقني إضافي ، سمحت كتلة الوجه SEM بالمرور من ثنائي الأبعاد إلى عرض ثلاثي الأبعاد لحاجز الترشيح الكبيبي بدقة كافية لمتابعة البنية النانوية لأرق العمليات الخلوية في الفئران السليمة ، والفئران المريضة ، وأثناءالكلىالتنمية [13 ، 14].

أخيرًا ، سمح اقتران EM بنظام التحليل المجهري بالأشعة السينية (الفحص المجهري بالأشعة السينية) بإجراء تحليل أولي للخلايا أو أجزاء من الخلايا على مستوى البنية التحتية. يستخدم الفحص المجهري بالأشعة السينية مسح TEM بشعاع إلكتروني ضيق لإثارة العينة. ينتج تأثير الإلكترونات عالية الطاقة من الحزمة مع الذرات في العينات طاقة على شكل فوتونات الأشعة السينية. تُستخدم إشارة الأشعة السينية هذه ، التي تم جمعها باستخدام كاشف أشباه الموصلات المشتتة للطاقة ، لتحديد العناصر الموجودة في العينة بدقة تبلغ ، في أحسن الأحوال ، 30 نانومتر. في الالكلىفي المجال ، تم استخدام التحليل المجهري بالأشعة السينية بنجاح بواسطة Beck و Thurau لدراسة النقل الأيوني للنبيبات عبر الظهارة [15] والتركيز العنصري داخل الخلايا في الخلايا الأنبوبية [16].

تصوير الفسيولوجيا الكلسية باستخدام مجهر متعدد الفوتونات

قدم الفحص المجهري Multiphoton (MPM) مزيدًا من التقدم فيالكلىالبحث ، وهذا هو ، إمكانية التحقيق في نفس الوقت وظائف الكلى والعلاقات الهيكلية في الوقت الحقيقي [17]. تختلف عن مجاهر الضوء التقليدية ، تعتمد الإثارة ثنائية الفوتون على الامتصاص المتزامن لفوتونين مع ضعف الطول الموجي للإثارة الضروري لإثارة الفلوروفور في الإثارة الكلاسيكية للفوتون الواحد (الشكل 1 د). أدى استخدام الأشعة تحت الحمراء النابضة المتاحة تجارياً ، وأشعة الليزر ذات الطاقة المنخفضة إلى زيادة اختراق الأنسجة العميقة وتقليل السمية الضوئية (الشكل 1 د). مكن هذا الباحثين من تصور العمليات الخلوية الديناميكية مباشرة في الحيوانات الحية ، وهي ميزة لم يكن من الممكن تحقيقها من قبل بأي تقنية أخرى. يسمح MPM بالقياس الكمي للوظائف الكلوية الأساسية والتعديلات المرضية مثل نفاذية الكبيبات وتدفق الدم الوعائي ومعدل الترشيح الكبيبي أحادي النيفرون والتدفق الأنبوبي [17] (الشكل 1E و F). بالإضافة إلى ذلك ، يسمح MPM بدراسة العمليات داخل الخلايا استجابة للإصابة ، بما في ذلك موت الخلايا وتساقطها ، ودحرجة كريات الدم البيضاء ، وتجنيد وتعطيل GBM [17]. سمحت التحسينات التقنية الإضافية بالتصوير داخل الحجاج لفترات طويلة على مدى أيام إلى أسابيع [18] والتي ، بالاشتراك مع الفئران المعدلة وراثيًا التي تعبر عن البروتينات الفلورية ، تم استخدامها لتتبع مصير الخلايا المفردة مباشرة في الجسم الحي في الكلى السليمة والمصابة [19] وكذلك فهم أفضل لآليات دوران الخلايا الكلوية وتجديدها.

كانت تقنيات التصوير الخالية من الملصقات ممكنة أيضًا مع MPM ، مستغلة التألق الذاتي الطبيعي لهيدرات نيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) لدراسة حالة الأكسدة والاختزال للخلايا الأنبوبية بعد الإصابة [20]. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام التوليد التوافقي الثاني من الكولاجين الليفي لتحديد ترسب الكولاجين ، وهو علامة على التليف الكلوي [21]. التوليد التوافقي الثاني هو عملية بصرية غير خطية يتفاعل فيها فوتونان مثيران لهما نفس الطول الموجي مع الهياكل غير المتناظرة المركزية في الأنسجة البيولوجية ، مثل الكولاجين أو الأنابيب الدقيقة ، وينتج عنها فوتون جديد بنصف الطول الموجي.

كان أحد الابتكارات الحديثة في التنظير المجهري داخل الحجاج هو إدخال منظار داخلي مصغر متعدد الفوتونات يستخدم بنجاح لتصوير الكلى في الفئران الحية المخدرة [22]. قد يمهد هذا MPM طفيف التوغل الطريق للتشخيص في الوقت الفعلي في الجسم الحي ، دون إزالة الأنسجة ، وفي وقت قصير جدًا.

الكلية ثلاثية الأبعاد: تقنيات إزالة الأنسجة وميكروسكوب التوسيع

على الرغم من التحسينات التكنولوجية ، فإن أحد القيود الرئيسية للتصوير الحجمي الأعمق هو عتامة الأنسجة الكلوية ، مما يجعلالكلىأحد أكثر الأعضاء صعوبة من الناحية البصرية. هذا هو السبب في أن تقنيات إزالة الأنسجة قد أثارت الكثير من الاهتمام [23]. الهدف من هذه الأساليب هو تحويل النسيج المعتم إلى نسيج شفاف ، مع الحفاظ على البروتينات ، وفي النهاية الواسمات الفلورية ، لتصوير شرائح الأنسجة السميكة. يوفر الجمع بين المقاصة الضوئية مع أحدث تقنيات الفحص المجهري إمكانية التحليل المورفومتري ، مثل القياس الكمي لحجم الكبيبات وعددها ، في الأنسجة السميكة أو حتى في الكلية السليمة [24]. تشمل التطبيقات الأخرى تحليل مقاطع الأنابيب المتميزة [25] ، ووظائفها [26] ، وتقدير خسارة خلية البودوسيت [27].

لتصوير كميات كبيرة من الأنسجة ، وفي نفس الوقت ، حل التفاصيل الهيكلية الدقيقة ، تم تقديم نهج تقني جديد مؤخرًا ، وهو الفحص المجهري للتوسع (ExM). تكمن الفكرة في توسيع عضو كامل ماديًا 4- 5- للطي مع الحفاظ على البنية العامة ومحتوى البروتين ثلاثي الأبعاد. باستخدام بوليمر موسع ، تم تصنيعه مباشرة داخل العينة ، يتم فصل الجزيئات الأقرب من حد الانعراج للضوء بشكل متناحي في الفضاء إلى مسافات أكبر ، وبالتالي يمكن حلها بصريًا حتى بواسطة مجهر الفلورسنت التقليدي. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر ExM شفافية بصرية أكبر ويقلل من تشتت الضوء ، مما يسمح للشخص بتصور حجم أكبر من الأنسجة. باستخدام هذا النهج ، يمكن تشريح البروتينات المتعددة في الحجاب الحاجز الشق و GBM حتى باستخدام مجهر متحد البؤر العادي [28]. على سبيل المثال ، يمكن أن تكشف عن محو عملية القدم في الفئران البروتينية ، في كل من 2D و 3D ، بدقة نانومتر لم يتم الوصول إليها من قبل [29]. تم استخدام ExM مؤخرًا لتقييم منطق الأنسجة السريرية للعينات المضمنة بالبارافين الملطخة بالفعل بالهيموكسيلين والأيوزين [30]. يمكن أن تؤدي هذه التقنية إلى رفع مستوى كفاءة عملية القدم على مستوى النانو الذي كان ممكنًا في السابق فقط مع EM. يسمح التقدم في التصوير الحجمي بتحليل ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعضو بأكمله بطريقة يتم الآن تمثيل القيد الرئيسي للتصوير العميق من خلال قدرة الأجسام المضادة على اختراق الأنسجة.

دراسة البروفايل الأيضي: مجهر تصوير المجال المتكرر مدى الحياة

الالكلىهو عضو استقلابي يحتوي على نسبة عالية من الميتوكوندريا. الشكل المخفض لـ NADH والمستقلبات الأخرى يتألق بشكل طبيعي ويمكن استخدام هذا التألق الذاتي كمؤشر لحالة الأكسدة والاختزال [20]. ومع ذلك ، فإن أطياف الانبعاث لهذه المركبات الفلورية الداخلية متداخلة ، وكان التعرف عليها بشكل منفصل مستحيلاً. ولكن تم العثور على فترات عمر التألق (أي وقت اضمحلال الفلورة) لتكون مختلفة بشكل كبير. ومن ثم يسمح الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة (FLIM) بدراسة ملامح التمثيل الغذائي [31]. في الآونة الأخيرة ، باستخدام مزيج من MPM و FLIM ، أصبح من الممكن توصيف التوقيعات الأيضية الخاصة بالخلايا ومراقبة التغيرات الأيضية في الجسم الحي أثناءالكلىمرض [32]. من المتوقع أن تقدم FLIM مزيدًا من الأفكار حولالكلىالتمثيل الغذائي في الجسم الحي في الصحة والمرض.

دفع القرار إلى ما وراء الحدود: التصوير عالي الدقة للكلى

يواجه الفحص المجهري للضوء القياسي حدًا للدقة الضوئية يتجاوز 200 نانومتر. التقنيات الجديدة ، التي يشار إليها باسم التصوير فائق الدقة ، تسمح الآن للفحص المجهري الفلوري بالتصوير بما يتجاوز حد الانعراج كنقطة انطلاق لعصر التنظير النانوي [33]. تجمع هذه الأساليب بين الدقة النانومترية ومزايا وضع العلامات الفلورية متعددة الألوان. تقديراً للتأثير المحتمل لهذه الابتكارات ، مُنحت جائزة نوبل في الكيمياء لعام 2014 لكل من Eric Betzig و Stefan Hell و William Moerner لتطوير الفحص المجهري الفائق الدقة. يمكن تطبيق استراتيجيات مختلفة للتصوير فائق الدقة لمعالجة أسئلة بيولوجية مختلفة. يمكن تصنيف هذه الأساليب إلى فئتين رئيسيتين ، اعتمادًا على ما إذا كان يتم استغلال الدقة الفائقة على مستوى الجزيئات المفردة أو المجموعات [33].

التقنيات القائمة على المجموعة

تكسر التقنيات القائمة على المجموعات حد الانعراج عن طريق تعديل شعاع ضوء الإثارة مؤقتًا ومكانيًا. من بينها ، التصوير الفائق الدقة لاستنفاد الانبعاث المحفز (STED) يستخدم ليزران ، ليزر إثارة وليزر استنفاد متراكب ، أحمر التحول ، مع شكل دونات ، لقمع انبعاث التألق من الفلوروفورز الموجود قبالة مركز الإثارة. يتم تحقيق هذا القمع من خلال الانبعاث المحفّز ويسمح بجمع الإشارة الناشئة فقط من نقطة محورية ذات بُعد أقل من حد الانعراج (الشكل 2 أ). تم استخدام التصوير STED لتصوير الحجاب الحاجز في مسح ضوئيالكلىالأنسجة (الشكل 2B-c ') والسماح بترجمة التوزيع المكاني للبودوسين والنيفرين بمقياس نانومتر يصل إلى 30 م على الأقل من العمق [34]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إمكانية مراقبة وقياس إفساد عملية القدم في نموذج تجريبي يمكن أن تجعل التصوير STED مفيدًا لدراسات حاجز الترشيح الكبيبي [34].

يتطلب الفحص المجهري STED بروتوكولات محددة لإعداد العينات ، وفلوروفور خاص ، والتدريب الفني. لهذا السبب ، تم إيلاء المزيد من الاهتمام على مدار السنوات القليلة الماضية لتقنية أخرى فائقة الدقة ، وهي الفحص المجهري للإضاءة المهيكلة (SIM) ، والتي يمكنها تمديد حد الانعراج بمعامل اثنين على الصعيدين الجانبي والمحوري. تستخدم SIM إعدادًا مجهرًا واسع النطاق بنمط إضاءة مخطط دقيق ، مما يسمح بالتقاط معلومات عالية التردد (المقابلة للتفاصيل الدقيقة في العينة) بترددات مكانية منخفضة. من خلال الحصول على صور متعددة مع أنماط الإضاءة لمراحل وتوجهات مختلفة ، يمكن إعادة بناء صورة عالية الدقة (الشكل 3 أ). تتوافق بطاقة SIM مع الفلوروفورات القياسية ، ولا تتطلب إعداد عينة محددًا ، وتسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد. نظرًا لكل هذه المزايا ، تم إجراء دراسات مختلفة لتقييم إمكانية استخدام بطاقة SIM كأداة تشخيصية سريعة ، على سبيل المثال ، مع وقت استجابة محتمل أقصر من EM. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام بطاقة SIM ثلاثية الأبعاد ومعالجة الصور الآلية كأداة تشخيصية سريعة لإمحاء عملية القدم باستخدام أقسام البارافين الروتينية من خزعات المرضى الذين يعانون من الحد الأدنى من مرض التغيير [36] (الشكل 3 ب وج). هذه القدرة على التعرف بنجاح على التغيرات في الأمراض المعروفة بإظهار علم الأمراض النانوي أكدت أن SIM هي أداة واعدة للتشخيص الروتيني.

طرق التصوير المعتمدة على التوطين أحادي الجزيء

تعتمد هذه التقنيات على إمكانية التشغيل الدوري وإيقاف تشغيل جزيئات الفلورسنت الفردية القريبة جدًا من الحل. في هذه الأساليب ، يمكن تنشيط الجزيئات داخل منطقة محدودة الانعراج في نقاط زمنية مختلفة بحيث يمكن تصويرها بشكل فردي ثم توطينها بدقة نانومترية من خلال إيجاد مراكزها حسابيًا (الشكل ثلاثي الأبعاد). من بين هذه الأساليب ، تم تقديم الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM) لأول مرة فيالكلىالبحث في عام 2013 ، مع دراسة كشفت عن التنظيم الجزيئي المعقد لـ GBM بدقة نانومترية ، بما في ذلك اتجاه الجزيئات داخل [37]. في نموذج فأر لمتلازمة الكلوية الخلقية النادرة ، كشفت STORM عن التكامل والتوجيه الصحيح للامينين 521 داخل GBM بعد الحقن في الوريد ، مما يفتح الطريق لخيارات علاجية متقدمة للمرضى [38]. وصفت دراسة أخرى تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين في خلايا podocytes بدقة المقياس الجزيئي [39] (الشكل 3E-I). كإكتشاف جديد ، تحتوي الخلايا البودوسية على حزم أكتين مقلصة متصلة بحزم أكتين غير مقلصة في عمليات القدم. في نماذج إصابات خلايا القدم ، تم تفكيك بنية الأكتين في عمليات القدم ، مما أدى إلى انهيار الهيكل الانقباضي في الجسم الرئيسي [39].

تصوير الهياكل ثلاثية الأبعاد للجسيمات الحيوية الأساسية على المستوى الذري: مجهر CRYO-ELECTRON

حتى وقت قريب ، كانت إمكانية دراسة بنية الجزيئات الحيوية الأساسية مقصورة على الفحص المجهري الإلكتروني ، بدقة تبلغ بضعة نانومترات. عقبات تقنية ، مثل تلف العينة بسبب شعاع الإلكترون الشديد ، والتباين المنخفض للصور ، وحركات الجزيئات بعد التفاعل مع الإلكترونات أو صعوبات في الحفاظ على الماء في العينات البيولوجية في الفراغ المطبق داخل غرفة EM ، مما يجعل من المستحيل حل الجزيئات التي تقل عن هذا الحجم . يمكن أن يقلل تبريد العينة من تبخر الماء والأضرار التي يسببها الإلكترون [40]. من هذه الفكرة ، تم تقديم cryo-EM في الخمسينيات من القرن الماضي. قبل بضع سنوات ، دفع إدخال كاشف عد إلكترون واحد جديد في النهاية إلى تجاوز الحدود السابقة. في عام 2017 ، مُنحت جائزة نوبل في الكيمياء لجاك دوبوشيه ، ويواكيم فرانك ، وريتشارد هندرسون عن `` تطوير مجهر إلكتروني بالتبريد من أجل تحديد الهيكل عالي الدقة للجزيئات الحيوية في المحلول ''. تتيح هذه التطورات الآن التحديد الهيكلي للجزيئات الحيوية في المحلول [41].

فيالكلىالبحث ، تم تحديد هياكل البروتينات الأساسية على المستوى الذري [42 ، 43]. من بينها ، بنية البوليسيستين البشري -2 ، والتي تكون طفراتها مسؤولة عن تعدد الكيسات الصبغي الجسدي السائدالكلىالمرض [44] ، وبنية مستقبلات عابرة محتملة للقنوات الأيونية الستة ، التي تسبب طفراتها FSGS في البشر [43] ، مع دقة عدد قليل من الأنجستروم [44].

فهم الأساس الجزيئي لأمراض الكلى: مجهر الكلى المتكامل

شهدت السنوات القليلة الماضية اهتمامًا متزايدًا بالنُهج الخالية من الملصقات القادرة على تحديد الطيف الكلي للجزيئات في الأنسجة بشكل محدد ومتزامن [45]. من بينها ، يسمح مقياس الطيف الكتلي للتصوير بالتأين / امتصاص المصفوفة بالليزر (MALDI-IMS) بقياس مئات الجزيئات المختلفة في نفس الوقت مباشرة على أقسام الأنسجة بدقة عالية. في تجربة MALDI-IMS ، يتم تغليف جزء رقيق من الأنسجة ، مجمّد أو مضمن بالبارافين ، بمصفوفة تمتص طاقة الليزر وتعزز تأين تحليلات الأنسجة. يولد التحليل في مطياف الكتلة طيفًا لكل إحداثي x / y. بعد قياس MALDI ، يمكن تلوين قسم الأنسجة نفسه بالإجراءات الكيميائية النسيجية والكيميائية المناعية التقليدية لدمج النمط الجزيئي مع التفاصيل النسيجية. في أبحاث الكلى ، يستخدم MALDI-IMS لدراسة الأدوية ، والمستقلبات ، والدهون ، والببتيدات ، والبروتينات في الأنسجة السليمة والمريضة [45].

أحد التطبيقات الأكثر شيوعًا لـ MALDI-IMS هو تحديد الواسمات الجزيئية لتصنيف سرطان الخلايا الكلوية [46] ولتحديد الهامش الحقيقي بين الأنسجة السرطانية والعادية على المستوى الجزيئي وكذلك النسيجي [47]. تم استخدام MALDI-IMS أيضًا بنجاح لدراسة سمية الأدوية الكلوية لتوفير الكشف المبكر عن السمومالكلىآليات الضرر بوساطة الأدوية المرشحة [48]. علاوة على ذلك ، يتم استخدام MALDI-IMS لدراسة الدهون ودورها في أمراض الكلى ، مثل اعتلال الكلية السكري [49] ، وإصابة الكلى الحادة [50] ، وتعدد الكيسات.الكلىالمرض [51] ، وكذلك للكشف عن ملامح التمثيل الغذائي الذاتية من أجل فهم أعمق للآليات المتعلقة بالأمراض [52]. تم أيضًا الانتهاء من تحديد الملامح الجزيئية للواسمات الحيوية المحتملة التي يمكن أن تكون علامات بيولوجية تشخيصية وإنذارية جديدة محتملة [53 ، 54].

الاستنتاجات وآفاق المستقبل

أدت التحسينات المستمرة في تقنيات التصوير إلى حل العديد من الحواجز التقنية الهامة بشكل تدريجي فيالكلىوقد سمحت الأبحاث بتصوير ديناميكي للهيكل والوظيفة في الكلى السليمة والمريضة. في الواقع ، أدى ظهور تقنيات الفحص المجهري الجديدة إلى تمكين الاكتشافات العلمية الأساسية ، وبالتالي غير وجهة نظرنا في فسيولوجيا الكلى والفيزيولوجيا المرضية التي يمكن تصورها الآن في صورة ثلاثية الأبعاد وحتى تصويرها في مقاطع فيديو ، حيث يمثل الوقت البعد الرابع. مع الابتكارات التكنولوجية الحديثة للفحص المجهري فائق الدقة والتقدم في تقنيات التصوير الجزيئي ، يمكن للباحثين الآن تصور الجزيئات الحيوية الفردية مباشرة في الأنسجة وتحديد كيفية تفاعلها على المستويات الخلوية وتحت الخلوية.

إمكانية تطبيق هذه الأدوات على الأمراضالكلىيجب أن تساعد العينات ، التي تركز على التفاصيل الجزيئية وتحت الخلوية في الخزعات السريرية ، في إعادة تصنيف المرض. إذا ومتى سيحدث هذا تأثيرًا على تشخيص أمراض الكلى أو حتى على إدارة المريض ، فهو غير واضح حاليًا.

التمويل

تم توفير التمويل من قبل مجلس البحوث الأوروبي في إطار برنامج البحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي Horizon 2020 (اتفاقية المنحة 648274).

المراجع

1. وينينج جي جي ، جينيت جيه سي. المعالم التاريخية في أمراض الكلى. قوس فيرشوس 2012 ؛ 461: 3-11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura Practice anatomica. بولونيا 1666

3. بومان دبليو حول هيكل واستخدام أجسام Malpighian منالكلى، مع ملاحظات على الدورة الدموية عبر تلك الغدة. Philos Trans R Soc A 1842 ؛ 132: 57-80

4. D'Agati VD، Mengel M. ظهور أمراض الكلى في أمراض الكلى: الهيكل يضيء الوظيفة. أنا Jالكلىديس 2013 ؛ 61: 1016-1025

5. Ohno Y، Birn H، Christensen EI. في الجسم الحي ليزر متحد البؤر المسح المجهري والوخز الدقيق في الفئران السليمة. نفرون إكس نفرول 2005 ؛ 99: e17-e25

6. يعيد حصار Romoli S و Angelotti ML و Antonelli G. CXCL12 بشكل تفضيلي تجديد الخلايا البودوسية المفقودة في النيفرون القشري عن طريق استهداف آلية التغذية المرتدة للخلايا السلفية الجوهرية.الكلىكثافة العمليات 2018 ؛ 94: 1111-1126

7. Lazzeri E ، Angelotti ML ، Paired A et al. تضخم الخلايا الأنبوبية المرتبط بالدورة الداخلية وتكاثر السلف يستعيدان وظائف الكلى بعد الحادةالكلىإصابة. نات كومون 2018 ؛ 9: 1344

8. LeHir M، Kriz W. رؤى جديدة في الأنماط الهيكلية المصادفة في تصلب الكبيبات. العملة Opin Nephrol Hypertens 2007 ؛ 16: 184 - 191 9. تشر CC. التشريح الوظيفي للالكلى. هوسب براكت 1978 ؛ 13

10. Liapis H. المجهر الإلكتروني فيالكلىالبحث: الرؤية هي تصديق. البنية التحتية باثول 2013 ؛ 37: 340-345

11. قوي ML، Evers P. البعد الثالث في التشخيص الكلوي. المسح بالمجهر الإلكتروني للكلى السليمة وغير الطبيعية. S Afr Med J 1979 ؛ 55: 174 - 177

12. Gagliardini E ، Conti S ، Benigni A et al. تصوير البنية التحتية المسامية لشق الترشيح الظهاري الكبيبي. J آم سوك نفرول 2010 ؛ 21: 2081 - 2089

13. Lausecker F ، Tian X ، Inoue K et al. الفينكولين ضروري للحفاظ على سلامة الحاجز الكبيبي.الكلىكثافة العمليات 2018 ؛ 93: 643-655

14. إيشيمورا ك ، كاكوتا إس ، كاواساكي واي وآخرون. كشفت العملية المورفولوجية لتطور الخلايا البودوسية عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني لمسح الوجه الكتلي. J Cell Sci 2017 ؛ 130: 132 - 142

15. ريك آر ، دورجي أ ، بيك إف إكس وآخرون. التحليل المجهري للأشعة السينية بالمسبار الإلكتروني لنقل الأيونات بطريق الظهارة Ann N YAcad Sci 1986 ؛ 483: 245-259

16. Thurau K ، Dorge A ، Mason J et al. تركيزات العناصر داخل الخلايا في الخلايا الأنبوبية الكلوية. تحليل ميكروبروب إلكتروني. كلين ووتشينشر 1979 ؛ 57: 993-999

17. Peti-Peterdi J ، Kidokoro K ، Riquier-Brison A. تقنيات جديدة في الجسم الحي للتصورالكلىالتشريح والوظيفة. الكلى الدولية 2015 ؛ 88: 44-51

18. Schuh CD ، Haenni D ، Craigie E ، وآخرون. الإثارة طويلة الموجة متعددة الفوتونات مفيدة للداخلالكلىالتصوير.الكلىكثافة العمليات 2016 ؛ 89: 712-719

19. Hackl MJ ، Burford JL ، Villanueva K et al. تتبع مصير الخلايا الظهارية الكبيبية في الجسم الحي باستخدام التصوير المسلسل متعدد الفقرة في نماذج الماوس الجديدة مع علامات النسب uorescent. نات ميد 2013 ؛ 19: 1661–1666

20. Hall AM ، Unwin RJ ، Parker N ، et al. يكشف التصوير المتعدد الفوتونات عن اختلافات في وظيفة الميتوكوندريا بين مقاطع النيفرون. J آم سوك نفرول 2009 ؛ 20: 1293-1302