تأثير تناول كميات منخفضة من البروتين أثناء الحمل على تعبير الرنا الميكروي للكلى الجنينية وخلايا سلف النيفرون للجنين الذكر

edmund.chen@wecistanche.com

مقدمة

قد يؤدي نقص المغذيات إلى تغيرات مؤشرة في المسارات المحورية خلال مراحل مختلفة من نمو الجنين ، مما قد يسبب اضطرابات لا رجعة فيها في الأعضاء والجهاز في مرحلة البلوغ [1]. تشير برمجة الجنين إلى أي إهانة أثناء التطور ، والتي تسبب تأثيرات طويلة المدى على بنية الكائن الحي أو وظيفته [2]. تؤدي الاضطرابات في البرمجة الجنينية إلى انخفاض الوزن عند الولادة وقلة عدد الكليونات وزيادة خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية وكلوياضطرابات في مرحلة البلوغ [3-6]. أظهرت الدراسات التي أجراها مؤلفون آخرون ونحن لدينا انخفاض الوزن عند الولادة ، وانخفاض النيفرون بنسبة 28 في المائةكلويإفراز الملح المزمنالفشل الكلوي، وارتفاع ضغط الدم الشرياني في تناول البروتين الحملي المنخفض (LP) مقارنةً بالبروتين القياسي (NP) في ذرية البلوغ [3-7]. تتضمن عملية تخليق الكلية تحكمًا صارمًا في التعبير الجيني ، وتخليق البروتين ، وإعادة تشكيل الأنسجة. أظهرت الدراسات أن أعداد النيفرون يتم تحديدها من خلال التفاعلات بين خلايا برعم الحالب (UB) والخلايا السلفية metanephros mesenchyme (MM) [8-10]. تحفز الإشارات من MM نموًا يحفزه UB وتفرع لنظام الأنابيب. في المقابل ، يتم توسط انتشار وتمايز MM ، الذي يشكل غطاء اللحمة المتوسطة (CM) ، بواسطة نهايات UB [11].

سيحسن القسطرة من أمراض الكلى / الكلى

كان هناك اهتمام جاد بدور التغيرات اللاجينية ، فيما يتعلق بالآثار طويلة المدى للإجهاد السابق للولادة ، على نمو الجنين [12]. MicroRNAs (miRNAs) عبارة عن جزيئات صغيرة غير مشفرة من الحمض النووي الريبي الجينومي بطول 22 نيوكليوتيد تقريبًا وتلعب دورًا أساسيًا في تنظيم ما بعد النسخ للتعبير الجيني المستهدف [13-16]. تتحكم miRNAs في التعبير الجيني بعد النسخ عن طريق تنظيم ترجمة mRNA أو الاستقرار في السيتوبلازم [17 ، 18]. تشير الدراسات الوظيفية إلى أن الجزيئات الدقيقة تشارك في العمليات البيولوجية الحرجة أثناء التطور وفي فسيولوجيا الخلية [13 ، 16]. وقد لوحظت التغييرات في تعبيرهم في العديد من الأمراض [16 ، 19]. وهكذا ، ساعد توصيف miRNAs في فهم تنظيم الجينات والتكاثر الخلوي والتمايز والاستماتة وشرح اضطرابات الفسيولوجيا المرضية ، بما في ذلكالكلىاضطرابات [20-22]. أفادت الدراسات أنه خلالالكلىلا يمكن الاستغناء عن جزيئات الحمض النووي الريبوزي الوراثي في ​​تطور النيفرون [23-26]. علاوة على ذلك ، فإن نقص التعبير عن بعض miR NAs في الخلايا السلفية MM يقلل من تكاثر الخلايا ، مما يؤدي إلى التمايز المبكر ، وبالتالي ، يقلل من عدد النيفرون [27 ، 28]. تتميز هذه الظاهرة بزيادة موت الخلايا المبرمج والتعبير العالي عن Bim في الخلايا السلفية [27]. وهكذا ، تعدل miRNA التوازن بين موت الخلايا المبرمج وتكاثر هذه الخلايا الأولية metanephric [29].

افترضنا أن التغييرات الجينية غير المعروفة وتنميط تعبير ميرنا مرتبطة بـالكلىاضطرابات النمو في ذرية الأمهات المقيدة البروتين. وبالتالي ، فإننا نهدف إلى تقييم أنماط ميرنا وتوقع التعبير الجيني في الجنينالكلىفي 17 يومًا من الحمل (17- DG) ذرية الذكور المقيدة البروتين لتحديد المسارات الجزيئية والاضطرابات التي ينطوي عليهاكلويتكاثر الخلايا والتمايز أثناءالكلىتطوير.

الكلمات الدالة:الفشل الكلوي؛ أنبوبي كلوي اضطرابات كلوية. تطور الكلى الكلى

المواد والمنهجية

الحيوان والوجبات الغذائيةأجريت التجارب على النحو الموصوف بالتفصيل سابقًا [5 ، 6] على فئران ذكور وإناث متطابقة العمر من جرذان Wistar HanUnib ذات الأشقاء (250-3 00 جم) نشأت من سلالة تربية قدمتها CEMIB / UNICAMP ، كامبيناس ، SP ، البرازيل. قدمت البيئة والسكن الظروف المناسبة لإدارة صحتهم ورفاههم أثناء الإجراء التجريبي. مباشرة بعد الفطام في عمر ثلاثة أسابيع ، تم الحفاظ على الحيوانات تحت درجة حرارة مضبوطة (25 درجة مئوية) وظروف إضاءة (07: 00 - 19:00) مع إمكانية الوصول المجاني إلى مياه الصنبور وطعام القوارض القياسي في المختبر (Purina Nuvital ، كوريتيبا ، العلاقات العامة ، البرازيل: Na plus المحتوى: 135 ± 3μEq / g ؛ K بالإضافة إلى المحتوى: 293 ± 5μEq / g) ، لمدة 12 أسبوعًا قبل التزاوج. وافقت لجنة الأخلاقيات المؤسسية بشأن استخدام الحيوان في جامعة ولاية ساو باولو (# 446- CEUA / UNESP) على البروتوكول التجريبي ، وتم اتباع الإرشادات العامة التي وضعتها الكلية البرازيلية للتجارب الحيوانية طوال فترة التحقيق. تم تحديد اليوم الأول من الحمل باعتباره اليوم الذي تظهر فيه المسحة المهبلية الحيوانات المنوية. بعد ذلك ، تم الحفاظ على السدود بالشهرة الكاملة طوال فترة الحمل على طعام معمل للقوارض متساوي البؤرة يحتوي على محتوى قياسي من البروتين [NP، n=36] (17 بالمائة بروتين) أو محتوى منخفض من البروتين [LP، n=51 ] (6٪ بروتين). تم تحديد الاستهلاك الغذائي للأمهات NP و LP يوميًا (تم تطبيعه لاحقًا لوزن الجسم) ، وتم تسجيل وزن جسم السدود أسبوعياً في كلا المجموعتين. في 17 يومًا من الحمل (17- DG) ، تم تخدير السدود بالكيتامين (75 مجم / كجم) وزيلازين (10 مجم / كجم) ، وتم تعريض الرحم. تمت إزالة الأجنة والموت الرحيم على الفور بقطع الرأس. تم وزن الأجنة وجمع الذيل والأطراف من أجل تحديد الجنس. تم جمع metanephros لتسلسل الجيل التالي (NGS) و RT-qPCR وتحليلات الكيمياء المناعية.

سيحسن الكستانش الفشل الكلوي / الفشل الكلوي

تحديد الجنستم إجراء الدراسة الحالية فقط في ذكور 17- ذرية DG ، وتم تحديد الجنس عن طريق تحليل تسلسل PCR التقليدي (تفاعل البوليميراز المتسلسل). تم استخلاص الحمض النووي عن طريق التحلل الأنزيمي ببروتيناز K و Phenol-Chloroform. للتفاعل ، تم استخدام Master Mix Colorless— Promega ، مع ظروف دوران الشركة المصنعة. قامت تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) بتوليف التسلسل التمهيدي التالي أدناه: Forward: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA -3 'Reverse: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG -3'.

إجمالي استخراج الحمض النووي الريبيتم استخراج الحمض النووي الريبي من NP (n=4) و LP (n=4) بالكاملالكلىباستخدام كاشف Trizol (Invitrogen) ، حسب التعليمات المحددة من قبل الشركة المصنعة. تم تحديد الكمية الإجمالية للحمض النووي الريبي عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي nanoVue (GE Healthcare ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم ضمان تكامل الحمض النووي الريبي من خلال الحصول على رقم تكامل الحمض النووي الريبي —RIN> 8 مع Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies ، ألمانيا) [30].

تسلسل ميرنا وتحليل البياناتتم إجراء التسلسل على منصة MiSeq (Illumina). اتبع البروتوكول إرشادات الشركة المصنعة المتوفرة بتنسيقباختصار ، يتضمن التسلسل إنشاء مكتبة ، وقد تم استخدام 1ug إجمالي RNA. في هذه الخطوة ، يتم توصيل المحولات ، 3 'و 5'. بعد ربط المحولات ، تم إجراء تفاعل النسخ العكسي لإنشاء (كدنا). تم تضخيمه بعد ذلك عن طريق تفاعل PCR القياسي ، والذي يستخدم بادئات تحتوي على فهرس تسلسل لتحديد العينة - مكتبة cDNA هذه ، التي تعرضت لرحلان هلام الاغاروز الكهربائي لعزل ميرنا. بعد القياس الكمي ، تم تطبيع تركيز المكتبة إلى 2 نانومتر باستخدام 10 نانومتر Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.5 ، وتم إجراء تسلسل النسخ بواسطة MiSeq Reagent Kit v2 (50 دورة).

تم إجراء تحليل البيانات بالتعاون مع Tao Chen ، Ph.D. من قسم علم السموم الوراثي والجزيئي ، المركز الوطني لأبحاث السموم ، جيفرسون ، أركنساس ، الولايات المتحدة الأمريكية. تم إنشاء البيانات من تسلسل الجيل التالي (NGS) من miRNAs بتنسيق FASTA واستيرادها إلى BaseSpace.com (Illumina ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقييم جودة البيانات باستخدام برنامج CASAVA للاتصال الأساسي الذي طورته الشركة المصنعة (Illumina). تم إجراء التحليلات عن طريق تحليل BaseSpace miRNA (من جامعة تورينو ، كندا) ورسم الخرائط التسلسلية لـ miRNAs المختلفة بواسطة RNA الصغير (Illumina ، الولايات المتحدة الأمريكية) لجينوم الفئران. تم تحليل دراسة miRNA المعبر عنها تفاضليًا باستخدام برنامج تحليل مسار الإبداع (Ingenuity ، الولايات المتحدة الأمريكية).

التحقق من صحة التعبير ميرناتم استخدام أربعة ذكور من مواليد مختلفة في كل مجموعة من أجل miRNA (miR {{0}} p، -144-3 p، -298-5 p، let -7 a {{ 4}} p و -181 a -5 p و -181 c -3 p و -199 -5 p) تحليل التعبير. باختصار ، تم نسخ 450 نانوغرام RNA عكسيًا ، دون تضخيم مسبق ، باستخدام مجموعة TaqMan1 Micro RNA Reverse Transcription Kit ، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة. تم تضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مقايسات TaqMan MicroRNA (تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع TaqMan1 Universal PCR Master Mix ، بدون AmpErase1 UNG (2x) على نظام StepOnePlusTM Real-Time PCR (Applied BiosystemsTM) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام التعبير الجيني النسبي الذي تم تقييمه باستخدام طريقة القياس الكمي المقارن (Pfaffl ، 2001). بناءً على تحليل الاستقرار ، تم استخدام U6 snRNA و U87 scaRNA كجينات مرجعية. تم تقييم جميع الكميات النسبية باستخدام برنامج DataAssist ، الإصدار 3.0 ، باستخدام طريقة ΔΔCT. تم إنشاء بيانات ميرنا باتباع إرشادات MIQE [31].

سيحسن الكستانش وظيفة الكلى / وظيفة التجشؤ

RT-qPCR للجينات المستهدفة المتوقعةلتوليف (كدنا) ، تم استخدام مجموعة النسخ العكسي عالية السعة (تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية). تفاعلات RT-qPCR لكل من Bax و Bim و Caspase -3 و Collagen 1 و GDNF و PCNA و TGF -1 و Bcl -2 و Bcl -6 و c-Myc و c -ret و cyclin A و Map2k2 و PRDM1 و Six -2 و Ki -67 و MTOR و -catenin و ZEB1 و ZEB2 و NOTCH1 و IGF1 بواسطة SYBR Green Master Mix (Life Technologies ، الولايات المتحدة الأمريكية ) المقدمة من IDT1 Integrated DNA Technologies (الجدول 1). تم إجراء التفاعلات بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر باستخدام 2 ميكرولتر من cDNA (المخفف 1:30) ، و 10 ميكرولتر SYBER Green Master Mix (تقنيات الحياة ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و 4 ميكرولتر من كل تمهيدي محدد (5 نانومتر). تم إجراء التضخيم والكشف باستخدام نظام StepOnePlusTM Real-Time PCR (Applied BiosystemsTM). تم تحويل قيم Ct إلى قيم تعبير نسبي باستخدام طريقة Ct مع بيانات نسل metanephros التي تم تطبيعها باستخدام GAPDH كجين مرجعي [32].

المناعيةتمت إزالة الجنين (ن {0}} لكل مجموعة) وتثبيته فورًا في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة (0.1 مليون فوسفات ، ودرجة الحموضة 7.4). تم تجفيف المواد وتعطيلها وتضمينها في paraplast ، وتم تقطيع الكتل إلى أقسام بسماكة 5- ميكرومتر. تم إزالة المقاطع النسيجية ومعالجتها من أجل التألق المناعي و immunoperoxidase. كانت المقاطع

المحتضنة بمحلول مانع (8 في المائة من مصل الأبقار الجنيني ، و 2.5 في المائة من الألبومين البقري ، و 2 في المائة من مسحوق الحليب منزوع الدسم في برنامج تلفزيوني). بعد ذلك ، ضع الجسم المضاد الأولي (مضاد ستة -2) مخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 في المائة من الحليب منزوع الدسم طوال الليل تحت التبريد. بعد الغسل باستخدام PBS ، تم تحضين المقاطع بجسم مضاد ثانوي محدد ، مترافق مع Alexa 488 fluorophore ، مخفف في نفس المخزن المؤقت ، يحتوي على 1 في المائة من الحليب لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. بعد عمليات الغسل المتتالية باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم تركيب الشرائح بأغطية باستخدام وسيط التجميع الفلوري Vectashield (Vector Laboratories ، Inc. Burlingame). تم الكشف عن التألق في العينة عن طريق الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر. تم الحصول على الصور باستخدام نظام Focus Imagecorder Plus. تم إجراء الكيمياء المناعية للبروتينات c-Myc و Ki -67 و Bcl -2 و TGF -1 و - catenin و ZEB1 و ZEB2 و Caspase 3 المشقوق و cyclin A و WT1. تم ترطيب الشرائح ، وبعد غسلها في PBS pH 7.2 لمدة 5 دقائق ، تم إجراء استرداد المستضد باستخدام محلول السترات pH 6. 0 لمدة 25 دقيقة في قدر الضغط. تم غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، تم إجراء حصار بيروكسيداز داخلي مع بيروكسيد الهيدروجين والميثانول لمدة 10 دقائق في الظلام. تم إعادة غسل الأقسام في برنامج تلفزيوني. تم بعد ذلك منع الربط غير النوعي ، وتم تحضين الشرائح بمحلول مانع (مسحوق حليب منزوع الدسم بنسبة 5 في المائة ، في PBS) لمدة ساعة واحدة. تم تحضين المقاطع بالجسم المضاد الأولي (الجدول 2) ، وتم تخفيفه في 1 بالمائة من مساحة سطح الجسم طوال الليل في الثلاجة. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم تعريض المقاطع للجسم المضاد الثانوي المحدد لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم غسل الشرائح باستخدام برنامج تلفزيوني. تم الكشف عن الشرائح باستخدام DAB (3،3'- ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد ، سيجما- Aldrich CO1 ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد الغسيل المتتالي في المياه الجارية ، تمت مواجهة الشرائح بالهيموكسيلين ، وتجفيفها ، وتثبيتها بغطاء ، باستخدام Entellan1. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر الضوئي (أوليمبوس BX51) أو متحد البؤر Zeiss LSM 780- NLO على مجهر Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG ، ألمانيا) من المعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا على الضوئيات المطبقة على الخلية علم الأحياء (INFABIC) في جامعة ولاية كامبيناس.

تقدير التشكل الكميبارافين 5 ميكرومترالكلىتم تحليل المقاطع باستخدام برنامج CellSens Dimension من مجهر ضوئي (Olympus BX51). الالكلىتم الوصول إلى شرائح لتحديد المنطقة الكلوية ، وبروتين CM و UB ورقم الخلية ، وهيماتوكسيلين إيوزين ملون في 17- جنين DG LP (n=5) مقارنة بنسل NP المطابق للعمر (n {{4}) }}) من أمهات مختلفات. قمنا بتحديد كل CM و UB لكل metanephros التي تم تحليلها (4NP و 4LP من أمهات مختلفات) ، وتم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة اختبار t ، وتم التعبير عن القيم على أنها متوسط ​​± SD. تم اعتبار p� 0. 05 مهمًا. تم استخدام GraphPad Prism v01 Software، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية ، للتحليل الإحصائي وبناء الأشكال.

تحليل احصائيتم استخدام اختبار t ، وتم التعبير عن القيم على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (SD). تم اعتبار P� 0. 05 مهمًا. تم استخدام برنامج GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software ، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية) للتحليل الإحصائي وبناء الأشكال.

نتائج

التعبير عن miRNAs بواسطة miRNA-Seqلفهم تغيرات الرنا الميكروي المرتبطة بنقص البروتين لدى الأمهاتكلويالبرمجة ، أجرينا التعبير عن تحليل التنميط ميرنا العالمي. تم تحديد 44 miRNAs محررة من التنظيم (p 0. 05) ، منها 19 و 25 miRNAs ، على التوالي ، تم تنظيمها لأعلى أو لأسفل (الجدول 3). تم تحديد أعلى miRNAs ووظائفها ومساراتها وشبكاتها باستخدام برنامج Ingenuity (الجدول 4).

التحقق من صحة تعبير ميرنافي حيوانات مجموعة LP ، تم تنظيم -7 a -5 p، miR -181 a -5 p، miR -181 c -3 p ، بينما تم تنظيم miR -127-3 p و miR -144-3 p و miR -199 a -5 p بالنسبة إلى حيوانات NP. لا تظهر النتائج أي اختلاف في تعبير miR -298 ، مقارنة بين المجموعتين (الشكل 1). كشف الجدول 5 عن القيم التي تم الحصول عليها من خلال تسلسل miRNAs مع بيانات التحقق من صحة RT-qPCR. على الرغم من وجود اختلاف كبير في تعبير miRNA في LP بالنسبة إلى نسل NP ، إلا أن تغيير الطية (FC) لـ miRNAs المصادق عليه كان مشابهًا لكلتا الطريقتين.

أهداف الجين ميرنا

لم تختلف جينات التعبير للأهداف المتوقعة للـ miRNA المختلفة مثل Six -2 و Bcl -2 و PRDM1 و cyclin A و PCNA و GDNF و Collagen 1 و Caspase 3 و Bim في LP بشكل كبير عن NP الجنين. ومع ذلك ، تم تنظيم التعبير الجيني Bax و TGF -1 Bcl -6 و c-ret و Map2k2 و Ki -67 و mTOR و -catenin و ZEB1 و ZEB2 و IGF1 في {{15 }} مجموعة DG LP مقارنة بعناصر التحكم المطابقة للعمر. على العكس من ذلك ، تم تنظيم c-Myc و NOTHC1 في ذرية الأمهات المقيدة بالبروتين (الشكل 2).

كتلة جسم الجنين وقياس شكل الكليةلم تختلف كتلة الجسم 17- DG LP عن نسل NP المطابق للعمر. ومع ذلك ، أظهرت اللحمة المتوسطة metanephros في LP مساحة مخفضة بنسبة 7.6 في المائة وتخفيض بنسبة 29 في المائة في سمك القشرة مقارنة بمجموعة NP (الشكل 3).المناعيةفي هذه الدراسة ، أظهر الجنين LP انخفاضًا كبيرًا (حوالي 69 بالمائة) من ستة -2 غطاء مضان من ذرية NP (الشكل 4).

أظهر تحليل ستة -2 immunoperoxidase عددًا مخفضًا للخلايا (14 بالمائة) في LP CM من المرتبط بستة خلايا مخفضة بنسبة 28 بالمائة -2 مقارنة بمنطقة الغطاء مقارنة بنسل NP (الشكل 4). أظهرت الدراسة الحالية أيضًا انخفاضًا كبيرًا في نسبة الخلايا الملطخة بالمناعة c-Myc CM و UB (أقل من 14 بالمائة) في LP بالنسبة إلى ذرية NP (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، كانت النسبة المئوية للمنطقة المسمى Ki -67 في CM أقل بنسبة 48 بالمائة في LP مقارنة بجنين NP ، بينما لم يكن نشاط مناعي Bcl -2 و caspase المشقوق -3 مختلفين عن كلا المجموعتين (التين التين) 5 و 6). أظهرت الدراسة الحالية أيضًا انخفاضًا كبيرًا في نسبة الخلايا الملطخة بالمناعة c-Myc CM و UB (أقل من 14 بالمائة) في LP بالنسبة إلى ذرية NP (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، كانت النسبة المئوية للمنطقة المسمى Ki -67 في CM أقل بنسبة 48 في المائة في LP مقارنة بجنين NP ، بينما لم يكن نشاط المناعة Bcl -2 و caspase المشقوق -3 مختلفين عن كلا المجموعتين (التين التين). 5 و 6). من ناحية أخرى ، في LP ، تم رفع المناطق المسمى CM و UB -catenin بنسبة 154 و 85 في المائة ، على التوالي ، مقارنة بتلك المتوفرة في ذرية NP (الشكل 7). في الوقت نفسه ، احتل توزيع نشاط المناعة mTOR أيضًا مساحة أكثر اتساعًا في LP CM (139 بالمائة) و ​​UB (104 بالمائة) مقارنة بجنين NP (الشكل 7). في نسل LP ، زاد TGF -1 في تلطيخ خلايا UBS (حوالي 30 بالمائة) ، بينما في CM ، لم تكن الخلايا الملطخة بالمناعة مختلفة فيما يتعلق بمجموعة NP (الشكل 8). عززت ZEB1 metanephros الملطخة ، الموجودة في خلايا نوى CM ، 30 بالمائة في LP مقارنةً بالجنين NP (الشكل 8). في الوقت نفسه ، كان التألق المناعي ZEB2 ، على الرغم من وجوده في هياكل metanephros الكاملة ، متشابهًا في كلتا المجموعتين التجريبيتين (الشكل 8). الدراسة الحالية ، مع الأخذ بعين الاعتبار التعبير ميرنا و mRNA والبروتينات

مناقشة

زادت المعرفة حول الآليات الخلوية والجزيئية لتكوين الكلية [33-37]. ومع ذلك ، فإن العديد من العوامل التنظيمية ومسارات الإشارات تشارك فيكلويالتكوّن الجنيني يبقى غير واضح [38]. تلعب miRNAs دورًا مهمًا في تنظيم التعبير الجيني أثناءكلويالتنمية [25 ، 39-41]. على حد علمنا ، لم يتم إجراء تحليلات تعبير mRNA و mRNA في تناول خلايا LP الأمومية 17- خلايا اللحمة المتوسطة للذكور DG. نقترح آلية جزيئية جديدة تشارك في تثبيط تكوّن الكلية المبكر ، مما يؤدي إلى انخفاض عدد النيفرون. استخدمنا NGS لتقييم تعبير miRNA ووجدنا أن 19 miRNAs كانت أعلى و 25 تم ضبطها في 17- DG LP مقارنةً بـ NP metanephros. من بين أفضل 10 miRNAs تم إلغاء تنظيمها ، اخترنا 7 miRNAs مع أهداف بيولوجية تشارك في الانتشار والتمايز والاستماتة الخلوية. كشف كل من تحليل بيانات miRNA-Seq و TaqMan عن تغييرات متسقة ومحددة في تعبير ميرنا في حيوانات LP بالنسبة للتحكم في الحيوانات المتطابقة مع العمر NP.

تتكون عائلة miR -181 من أربعة أعضاء يتمتعون بدرجة عالية من الحفظ ، وهم miR -181 a و miR -181 b و miR -181 c و miR -181 d [ 42]. في الخلايا الورمية ، يعمل miR -181 كمثبط للورم ، مما يمنع التكاثر الخلوي والهجرة ويسبب موت الخلايا المبرمج الخلوي [43]. كشفت هذه الدراسة عن زيادة التعبير عن miR -181 a -5 p في 17- DG LP بالنسبة إلى نسل NP المطابق للعمر. على الرغم من أن تعبير caspase mRNA لم يتغير ، فإن الزيادة المزدوجة في نسبة Bax / Bcl -2 mRNA في LP مقارنة بنسل NP تشير إلى زيادة موت الخلايا المبرمج في CM ، مما يشير إلى أن موت الخلايا المبرمج يتم تنظيمه بعد النسخ. أظهرت الدراسات أن عائلة BCL تعزز إطلاق السيتوكروم من الميتوكوندريا ثم تمنع تنشيط Casp3 ، وبالتالي تمنع موت الخلايا المبرمج الخلوي [44]. لي وآخرون. استخدم نموذج إصابة الرئة الحادة للكشف عن أن الإفراط في التعبير عن miR -181 a مرتبط بانخفاض مستوى بروتين Bcl -2 ؛ على العكس من ذلك ، فإن miR -181 منعًا أدى إلى زيادة مستويات Bcl -2 [45]. أكدت هذه الدراسة نتائج Lv وآخرون ، الذين أوضحوا أن miR -181 c ينظم التعبير عن ستة -2 التعبير وتكاثر الخلايا بشكل سلبي ، بالتوازي مع فقدان النمط الظاهري لخلايا اللحمة المتوسطة أثناءالكلىالتنمية في LP 17- نسل DG [25].

شيانغ وآخرون. أوضح أن زيادة التعبير miR -144 يقمعكلويانتشار السرطان ، مما يؤدي إلى أقصر مرحلة G2 / M. علاوة على ذلك ، Xiang et al. كشف أن الإفراط في التعبير عن miR -144 يثبط تعبير جين mTOR والبروتين [46]. نيجلاند وآخرون أظهر أن الزيادة في إشارات mTOR أمر بالغ الأهمية لتحديد عدد النيفرون في الأجنة التي تعرضت أمهاتها لتقييد المغذيات [47]. الهدف من الثدييات لمركب الرابامايسين 1 (mTORC1) ضروري لنمو الجنين ؛ ومع ذلك ، كيف ينظم هذا المركب التوازن بين النمو والالتهام الذاتي في ظل الظروف الفسيولوجية والضغوط البيئية لا تزال غير معروفة [48]. لذلك ، قد تشارك إشارات mTOR في الاستجابات الخلوية في الحيوانات المعرضة لمدخول LP أثناء الحمل ؛ في الإدراك والحث وإنهاء الالتهام الذاتي ؛ واستجابة لتوافر المغذيات داخل الخلايا [46]. افتراضيًا ، أثناء تقييد البروتين الشديد ، قد يترافق انخفاض التعبير عن miR -144-3 p مع زيادة تعبير mTOR ، حوالي 139 بالمائة و 104 بالمائة في خلايا CM و UB ، على التوالي ، للتعويض عن فقدان النيفرون في {{ 11}} ذرية DG LP Chen et al. تعريف miR -127 كمنظم جديد لشيخوخة الخلية من خلال Bcl -6 [49]. بان وآخرون. ذكرت أن ضعف التعبير miR -127 يرتبط بزيادة تكاثر الخلايا في خلايا الكبد [50]. أظهرت هذه الدراسة انخفاضًا في تكاثر الخلايا وانخفاضًا ملحوظًا في الخلايا المصنفة بشكل إيجابي لـ Ki -67 في CM للحيوانات المقيدة بالبروتين. علاوة على ذلك ، لوحظ انخفاض في المنطقة الكلوية والانتشار في ذرية LP ، وهو ما يتوافق مع نتائج Menendez-Castro et al. في 8.4 في المائة من ذرية مقيدة بالبروتين [51 ، 52]. وبالتالي ، فإن زيادة تعبير Ki -67 و Bcl -6 mRNA ، المصحوب بتعبير miR -127-3 p مخفض في 17- DG LP cap يمكن أن يقترن بآليات التنظيم المضاد للحفاظ على الانتشار.

صن وآخرون. أوضح أن الإفراط في التعبير عن miR -199 a -5 p يقلل من تكاثر الخلايا الكيسية ويؤدي إلى موت الخلايا المبرمج ، بالإضافة إلى التحكم في دورة الخلية [53]. في هذه الدراسة ، تم تقليل التعبير عن miR -199 a -5 p في 17- DG LP مصحوبًا بزيادة نسخ Ki -67 ، وعلامة الانتشار الخلوي ، و Map2k2 يرتبط بانخفاض تفاعل -67 Ki في LP 17- DG metanephros. وبالتالي ، فإن نقص التغذية أثناء الحمل يعزز التمايز من خلال آلية ما بعد النسخ. والجدير بالذكر أن النتائج التي توصلنا إليها تكشف عن دور قمعي لصندوق البريد الإلكتروني المرتبط بإصبع الزنك 1 (ZEB1) ، وهو محفز EMT ، والذي يحافظ على قدرة الخلايا الجذعية أثناء تمايز الخلايا الجذعية الجنينية. من المعروف أن الكاتينين ينشط نسخ ZEB1 النووي مما يؤدي إلى تعبير ZEB1 [34]. يمكن لمسار إشارات TGF ، أحد أفضل المسارات التي تمت دراستها ، تحفيز EMT أثناء التطور الجنيني. مطلوب العديد من روابط TGF للتطور الجنيني. ومع ذلك ، لا تعتمد جميع التأثيرات التي تتم بوساطة TGF على EMT على ZEB1 / 2 ، يمكن لخلايا خروج المغلوب أن تحفز التعبير عن جينات اللحمة المتوسطة فيبرونيكتين و N-cadherin. ومع ذلك ، لم يعد E-cadherin خاضعًا للتنظيم ، وتشكلت ألياف الأكتين أيضًا [54]. كارنر وآخرون. ذكرت ذلك خلالكلويالتنمية ، Wnt9b / -catenin

مسار الإشارة ، المعبر عنه في كل من UB و CM ، مطلوب لكل من تجديد خلايا سلف النيفرون والتمايز ، وهو ضروري لتكوين النيفرون أثناء التطور الجنيني [55]. يلعب مسار Wnt9b / -catenin المحفوظ تطوريًا دورًا مهمًا في تطوير الأعضاء والأنسجة وإصلاح الإصابات في الكائنات متعددة الخلايا. أظهرت دراسة أن c-Myc هو هدف نسخي للكاتينين ، الذي ينظم انتشار وتمايزكلويظهارة أنبوبي [56]. زاد التعبير عن الكاتينين على مستوى الجين والبروتين خلال فترات الدراسةكلويالتنمية في 17- جنين DG LP. بان وآخرون. ذكرت أن Myc تتعاون مع -catenin لتعزيز تجديد خلايا سلف النيفرون [10]. هنا مقارنة بنسل NP المطابق للعمر ، أظهر LP تعبيرًا أقل لـ c-Myc. لذلك ، قد تحتوي هذه الحيوانات على احتياطي أقل من الخلايا المتجددة اللازمة للتكاثر والبقاء وقد تعكس العدد الأصغر من النيفرون في نموذج LP. علاوة على ذلك،

قد تنسق مسارات إشارات Wnt / -catenin و Notch تنظيم ستة تعبيرات -2 وتشارك في تقليل تنظيم تعبير ستة -2 في خلايا سلف النيفرون. أثبتت الدراسات أن المستويات المنخفضة من الكاتينين قد تكون مطلوبة للحفاظ على ستة -2 تعبير وخلايا سلف CM في حالة غير متمايزة. علاوة على ذلك ، فإن المستويات المرتفعة من - الكاتينين تحدد مصير خلية سلف النيفرون [57 ، 58]. وبالتالي ، نفترض أن انخفاض إشارات cMyc و Notch ، المصحوب بزيادة تعبير الكاتينين ، قلل من تعبير Six -2 بنسبة 28 بالمائة في 17- نسل DG LP وارتبط بتمايز خلايا CM المبكر وتقليل الخلايا الجذعية و رقم النيفرون في مرحلة البلوغ. علاوة على ذلك ، قد تحافظ بياناتنا على أنه ، في خلايا LP التابعة لـ MM ، قد يؤدي زيادة تعبير Let -7 -5 p و -catenin وإشارة Notch المنخفضة إلى تعديل c-Myc ، ستة -2 ، و Ki -67 ، مما يؤدي إلى تقليل التجديد الذاتي للخلايا السلفية. يؤدي استنفاد الخلايا السلفية المتبقية إلى انخفاض في أعداد النيفرون وتطور ارتفاع ضغط الدم الشرياني وكلوياضطرابات في مرحلة البلوغ (الشكل 10). تمشيا مع نتائج Boivin et al. ، تشير نتائجنا إلى أن زيادة CM -catenin يعطل نمو UB وتكوين الكلية [59]. أظهرت الدراسات أن عامل النمو العصبي المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF) ، وهو منظم حاسم لنمو UB ، إشارات من خلال مستقبل c-Ret tyrosine kinase والمستقبل المشترك Gfra1 [60 ، 61]. في 17- نسل DG LP ، يعتبر ملف

الزيادة في ترميز مستقبلات c-Ret mRNA ستؤدي نظريًا إلى زيادة نمو UB. على أي حال ، في هذه الدراسة ، لم يتغير تعبير GDNF ، مما يشير إلى أنه على الرغم من الزيادة في cRet mRNA ، فقد تم تقليل تفرع UB. سابقًا ، لاحظنا انخفاضًا بنسبة 28.3 في المائة في فروع برعم الحالب بعد 14.5 يومًا من تقييد بروتين الحمل [4] ، والذي يمكن أن يترافق مع انخفاض بنسبة 28 في المائة في ستة -2 علامات من خلايا MM ، على الرغم من عدم حدوث تغيير في GDNF النسخ. من المحتمل أن يتفاعل -catenin مع مستقبل c-ret ويتم نقله إلى نواة خلية UB ، مما يعزز تعبير TGF -1 في الخلايا الظهارية ، ويمنع تفرع UB ويسبب تمايزًا مبكرًا لخلية السلف CM ، كما هو موضح في {{11} } ذرية DG LP [62-64]. لذلك ، قد لا يكون GDNF ضروريًا في التوسط في إشارات اللحمة المتوسطة إلى برعم الحالب ؛ ومع ذلك ، لا تزال الآلية بحاجة إلى توضيح. في الواقع ، لقد أظهرنا أن MM من 17- نسل DG LP أظهر زيادة محددة في تعبير miRNA -7 ، مما أدى إلى ضعف كبيرالكلىالتطور ، وبالتالي تأكيد الدور المعدل لهذه الجينات في التوقيت التطوري لتكوين الكلية [65].

في دراسات عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF) الأولية ، تم توضيح الأدوار السائدة لـ IGF -1 و -2 في نمو الجنين من خلال الأدلة الوفيرة ، ولكن غير المباشرة في الغالب. تم العثور على IGFs للعمل كعوامل تكاثر وتمايز في خلايا الجنين المستنبت وأجنة ما قبل الانغراس. علاوة على ذلك ، تم العثور على IGFs ليتم إفرازها بواسطة الخلايا الجنينية المستنبتة والإكسبلنتس في المختبر [66]. يمكن لعوامل النمو ، بما في ذلك IGF ، أن تسبب انتقالًا جزئيًا أو كاملًا بين الظهارة واللحمة المتوسطة. يؤدي تنشيط مسارات IGF إلى زيادة تنظيم EMT عن طريق تحفيز تعبير ZEB1 [67]. على الرغم من وجود العديد من عوامل النمو المرشحةالكلىالتطور ، سواء كانوا متورطين في تكوّن الكلية غير معروف. قد تكون هناك حاجة إلى عوامل نمو مختلفة في أوقات مختلفة. قد تكون بعض عوامل النمو زائدة عن الحاجة في هذا السياق. أثناء التطور الجنيني ، هناك حاجة إلى جولات متسلسلة من EMT و MET للتمييز بين أنواع الخلايا المتخصصة وإنشاء بنية ثلاثية الأبعاد. في هذه الدراسة ، تم العثور على قابلية التحويل البيني اللحمية الظهارية للحفاظ على مرونة الخلية ، مما يشير إلى وجود نظام محفز للغاية في ظروف LP للجنين. تمت دراسة التعبير عن عائلة Let -7 miRNA على نطاق واسع في أنسجة جنينية مختلفة. ترتبط الزيادة في تعبير Let -7 miRNA بانخفاض التكاثر والزيادة المبكرة في تمايز خلايا MM ، وبالتالي انخفاض أعداد النيفرون [27 ، 15 ، 68-71]. تم إظهار تعبير أعلى -7 في الكائنات الحية الأعلى خلال المرحلة الأخيرة من التطور الجنيني الدماغي في القوارض [72 ، 73]. ناجالاكشمي وآخرون كشف أن Let -7 تعبير miRNA غيّر مصير الخلية الظهارية UB من حالة سابقة إلى حالة متباينة [71]. على النقيض من ذلك ، Yermalovich et al. أوضح أن الإفراط في التعبير عن Lin28b ، وهو بروتين مرتبط بـ RNA ، مرتبط بـ Let -7 miRNAs. على الرغم من أن lin28 و Let -7 منظمان معروفان للتوقيت الجيني في اللافقاريات ، إلا أن دورهما في نمو أعضاء الثدييات غير مفهوم [65]. في هذه الدراسة ، يمكن أن ترتبط الزيادة في تعبير Let -7 a -5 p miRNA في جنين LP بانخفاض تكاثر خلايا CM ، مما يضر بتكوين الكلية بالنسبة لمجموعة NP. وبالتالي ، فإننا نفترض أن قمع تكاثر الخلايا CM والوقف المبكر لتكوين الكلية الناجم عن زيادة Let -7 miRNA قد تحدث بشكل مباشر أو غير مباشر من خلال التعبير المختزل بشكل عابر لـ Lin28b في 17- DG LP. هذا التأثير قد يضعف بشكل كبيرالكلىالتطوير في 17- DG LP ، مما يؤكد أن هذا الجين ينظم توقيت النمو أثناء تكوّن الكلية. في هذه الدراسة ، تتزامن زيادة تعبير Let -7 a {2}} p miRNA مع انخفاض في تعبير c-Myc. يشارك Myc في الانتشار والنمو والاستماتة وتمايز الخلايا أثناءكلويتكوين الأعضاء [74-76]. في نسل LP 17- DG ، تم تقليل التعبير الجيني MM c-Myc ، وكانت مساحة نشاط المناعة CM c-Myc أصغر بنسبة 14 بالمائة مقارنةً بنسل NP. في الوقت نفسه ، لوحظ انخفاض بنسبة 14 بالمائة في عدد خلايا CM لتقليل نشاط مناعة Ki بنسبة 48 بالمائة -67 في LP بالنسبة إلى ذرية NP. باستمرار ، أظهرت الدراسات أن c-Myc يلعب دورًا مهمًا في المرحلة النهائية من تفرع UB وفي تحفيز تكاثر الخلايا السلفية CM [74].

سيحسن القسطرة من التهاب الكلى / التهاب الجلد

انخفاض مستوى الخلايا الجذعية ، والحفاظ عليها في حالة غير متمايزة. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، ظهر تعبير قوي عن Let -7 a -5 p miRNA في تعبير c-Myc المنظم من CM ، مما يقلل من تكاثر الخلايا السلفية وتمايز الخلايا المبكر في LP 17- DG النسل (الشكل 10). دراسات علىالكلىأظهرت الفئران المعدلة وراثيًا c-Myc انخفاضًا متزامنًا في خلايا CM C-Myc و S-ix {3}} المناعية المرتبطة بانخفاض تكاثر الخلايا الجذعية [74]. تظهر هذه الدراسة انخفاضًا ملحوظًا (28 بالمائة) في ستة -2 خلايا إيجابية محددةكلويعلامة الخلايا الجذعية ، مثل الانخفاض الملحوظ في أعداد النيفرون ، في CM لنسل 17- DG LP مقارنة بنسل NP. في عام 2009 ، Fogelgren et al. أظهر أن ستة -2 تعبير جيني ينخفض ​​أثناء تكوين الجنين عندما يرتبط بانخفاض أعداد النيفرون وارتفاع ضغط الدم والمزمنالفشل الكلوي[77]. وبالتالي ، فإن التعبير الجيني الستة -2 المخفَّض في الخلايا السلفية لـ CM يشير إلى قمع التمايز الناجم عن الإشارة أثناءكلويالتنمية في 17- نسل DG LP. ومع ذلك ، يجب استخدام التكرار بحذر - فقد تتضح العيوب الدقيقة في تكوّن الكلية بتحليل أكثر تفصيلاً أو في ظل ظروف مختلفة. كانت مستويات IGF1 mRNA هي الأعلى خلال الفترة الأولية لتطور metanephric ، مع اكتشاف النصوص في جميع أنحاء MM ، بينما انخفضت مستوياتها أثناء التطوير الإضافي. ومع ذلك ، خلالالكلىالتطور الجنيني ، وهو توازن دقيق بين عوامل النمو التي تسهل النيفرون (IGF1) وعوامل النمو المثبطة (TGF -1) التي تنظم تفرع UB.

استنتاج

على الرغم من أن العديد من المؤلفين قد درسوا عملية تكوّن الكلية [34 ، 37 ، 78] ، لا يُعرف الكثير عن الآليات التي تحدد أعداد النيفرون. توضح هذه الدراسة أن العديد من mRNAs و mRNAs والبروتينات الخلوية السلفية MM يتم تغييرها في نسل 17- DG LP ، مما يؤدي إلى تقليل الانتشار والتمايز المبكر للخلايا (الشكل 11). هذا التوازن الدقيق بين تجديد السلف النيفرون والتمايز ضروريالكلىالتطور لأن الفشل في تحقيق الأعداد الكافية من النيفرون هو عامل خطر للمزمنكلوياضطراب.