MiR-214 يخفف من إصابة الكلى الحادة الناجمة عن الإنتان عن طريق الالتهام الذاتي المنظم PTEN / AKT / mTOR

edmund.chen@wecistanche.com

تجريدي. وقد أشارت دراسات سابقة إلى أن الإجهاد التأكسدي والالتهام الذاتي يؤديان إلى حالات حادةإصابة الكلى (AKI) أثناء الإنتان والحمض النووي الريبي الميكروي (miR)-214 يؤدي دورا حيويا في حمايةكلىيتعرض للإجهاد التأكسدي. هدفت هذه الدراسة إلى اختبار ما إذا كانت حماية miR-214 مرتبطة بالالتهام الذاتي في الإنتان. تم التحقيق في دور الالتهام الذاتي في نموذج الفأر من ربط cecal وثقب (CLP). تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) لتحليل التعبير عن miR-214. هيكل ووظيفةكلىتم تقييم حصادها من الفئران.كليةتم الكشف عن مستويات الالتهام الذاتي مع المناعة النسيجية الكيميائية والفلورسنت المناعي والنشاف الغربي. وقد وجد أن miR-214 يمكن أن يخفف من AKI في الفئران الإنتانية عن طريق تثبيط مستوىكليةالالتهام الذاتي. علاوة على ذلك ، منع miR-214 الالتهام الذاتي عن طريق إسكات تعبير PTEN فيكليةأنسجة الفئران الصرف الصحي. أشارت هذه النتائج إلى أن miR-214 خفف من AKI الناجم عن CLP عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي وتثبيط الالتهام الذاتي من خلال تنظيم مسار PTEN / AKT / mTOR.

الكلمات الرئيسيه:microRNA-214 ، تعفن الدم ، إصابة الكلى الحادة ، الالتهام الذاتي ، الكلى

مقدمة  شديدإصابة الكلى(AKI) هي واحدة من أكثر مضاعفات الإنتان شيوعا وتحدث في 40-50 ٪ من مرضى الصرف الصحي ، مع معدل وفيات يصل إلى 60 ٪ (1). ومع ذلك ، فإن التسبب في AKI الناجم عن الإنتان لا يزال غير واضح. تم الإبلاغ عن أن الالتهام الذاتي يؤدي دورا رئيسيا في AKI الناجم عن الإنتان ويؤدي تثبيط الالتهام الذاتي إلى تطور AKI أثناء الإنتان (2,3). أكدت الدراسات السابقة (4,5) أن الإنتان يحفز الالتهام الذاتي في أعضاء متعددة ، بما في ذلككلية(6) وتشارك عمليات الالتهام الذاتي في إزالة الميتوكوندريا التالفة والإجهاد التأكسدي (7). ومع ذلك ، يمكن أن يسبب الالتهام الذاتي المفرط موت الخلايا غير المرغوب فيه والضار (8). لذلك ، فإن المستوى المعتدل من الالتهام الذاتي هو المفتاح للحد من AKI الناجم عن الإنتان. وقد أفادت دراسات سابقة أن miR-214 يخفف من AKI الناجم عن نقص التروية عن طريق تثبيط موت الخلايا المبرمج (9) و miR-214 يقمع الإجهاد التأكسدي في اعتلال الكلية السكري عبر أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) / AKT / mTOR مسار الإشارات (10). وجدت الدراسة الحالية أن miR-214 يمكن أن يخفف من خلل عضلة القلب الناجم عن الإنتان في الفئران عن طريق تثبيط الالتهام الذاتي (11). ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح ما إذا كان miR-214 يمكنه تحسين AKI الناجم عن الإنتان. في هذه الدراسة ، تم افتراض أن miR-214 يخفف من AKI الناجم عن CLP عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي وتثبيط الالتهام الذاتي من خلال تنظيم مسار PTEN / AKT / mTOR.

سيستانش سوف يحسن أمراض الكلى / الكلى

المواد والأساليب

الحيوانات.تم استخدام ما مجموعه 100 من ذكور كونمينغ (الوزن ، 20.40±2.92 جم ؛ العمر ، 6-8 أسابيع) التي قدمها مركز المختبرات الطبية بجامعة خبي الطبية (شيجياتشوانغ ، الصين) في هذه الدراسة. تأقلمت جميع الفئران مع دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة عند 24 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ وتم منحها حرية الوصول إلى الطعام والماء في ≥1 أسبوع قبل التجارب. تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بما يتفق بدقة مع إرشادات المعهد الوطني للصحة (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 85-23 ، المنقح 1996) وموافقة لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى تشانغتشو المركزي (الموافقة رقم 2017-020-01). تم إجراء جميع العمليات الجراحية تحت التخدير وتم بذل كل جهد ممكن لتقليل المعاناة.

ربط وثقب سيكال (CLP).تم إجراء CLP على الفئران لإنشاء نموذج تعفن الدم الفئراني ، كما هو موضح سابقا (12). بعد التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (المستحث بنسبة 3٪ والحفاظ عليه عند 0.5٪) ، تم قطع شق خط الوسط 1 سم. تم ربط الأعور المكشوف (على بعد 1 سم من النهاية) بثقبين باستخدام إبرة قياس 23. قذف الأعور بلطف كمية صغيرة من البراز وتم وضعه مرة أخرى في وضعه التشريحي. تم خياطة جدار البطن في طبقات مع جديلة حريرية 3-0. بعد الإجراء ، تم حقن 1 مل من محلول ملحي بنسبة 0.9٪ تحت الجلد. تم تزويد الفئران بحرية الوصول إلى الماء فقط. تم تشغيل الفئران نموذج الشام بنفس الطريقة التي تم بها تشغيل نموذج CLP بدون CLP.

التصميم التجريبي.تم تعيين الفئران (n = 6 للجراحة الصورية و CLP) عشوائيا إلى سبع مجموعات: مجموعة الشام ، مجموعة CLP ، بروتين الفلورسنت الأخضر للفيروس الغدي (Ad) (GFP) + مجموعة CLP ، Ad-miR-214 + مجموعة CLP ، مجموعة anti-miR-214 + CLP ، مثبطات PTEN + مجموعة CLP و Ad-miR-214 + مثبطات PTEN + مجموعة CLP. تعرضت فئران مجموعة شام لنفس الإجراء ولكن دون ربط وثقب الأعور. تلقت الفئران في المجموعات الأخرى ربط cecal وثقب. تم تخدير جميع الفئران بسرعة عن طريق استنشاق الأيزوفلوران لجمع الدم والبول وكليةعينات 24 ساعة بعد العلاج الأخير.

Ad-miR-214 بوساطة الفيروسات الغدية أو مكافحة miR-214 أو Ad-GFPنقل الجينات في الجسم الحي وحقن مثبطات PTEN.  تم تسليم Ad-miR-214 ، anti-miR-214 ، أو Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co.، Ltd.) إلى تجويف البطن للفئران قبل 4 أيام من CLP. لفترة وجيزة ، تم تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران. تم إعطاء قسطرة تحتوي على 200 ميكرولتر من الفيروس الغدي (2x1011 pfu ، معبرا عن miR-214 أو anti-miR-214 أو Ad-GFP) للفئران العادية عن طريق الحقن داخل الصفاق. مثبط PTEN (VO-OHpic ، داخل الصفاق ، سيغما ألدريتش ؛ Merck KGaA) لفئران CLP التي تلقت مضاد ل miR-214 عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة واحدة من 10 ميكروغرام / كجم 30 دقيقة قبل إعطاء الفيروس الغدي.

تقييم وظائف الكلى. تم حصاد عينات الدم من قلب الفئران ، تليها الطرد المركزي (في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة عند 3000 × غرام) لجمع المصل. تم تحديد مستويات مصل نيتروجين اليوريا في الدم (BUN) والكرياتينين في الدم (Cr) باستخدام محلل هيتاشي 7600 التلقائي (هيتاشي، المحدودة). تم استخدام ELISA لتحليل مستوياتإصابة الكلىجزيء-1 (KIM-1; cat. no. RKM100; أنظمة البحث والتطوير ، وشركة) وليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز العدلة (NGAL; cat. no. DY3508; أنظمة البحث والتطوير ، وشركة) في عينات البول.

فحص لالتهاب المصل السيتوكين.مصل TNF-α (القط رقم. H052) و IL-6 (القط رقم. H007) باستخدام مجموعات ELISA التجارية (معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.قياس علامات الإجهاد التأكسدي. تم استخدام مجموعة الفحص المقابلة (معهد نانجينغ جيانتشنغ للهندسة الحيوية ، نانجينغ ، الصين) لقياس مستويات مالونديالدهيد (MDA) واختبار نشاط ديسموتاز الفائق الأكسيد (SOD) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

علم الأنسجة ودرجة الإصابة الأنبوبية. تعرضت جميع الفئران لكليةالتروية تحت التخدير 24 ساعة بعد CLP. الكليةتم تثبيت العينات في 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 72 ساعة عند 4 درجات مئوية. ثم تم تجفيف عينات الأنسجة في سلسلة متدرجة من محاليل الإيثانول ، مدمجة في البارافين وقطع إلى أقسام 4-μm. تم قطع المقاطع (4 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم وكانت أقسام الأنسجة ملطخة بالهيماتوكسيلين (5 دقائق) والإيوسين (1 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة للفحص النسيجي. تم تقييم الشرائح وتصنيفها باستخدام المجهر (BX51 ، شركة أوليمبوس).الكلويتم الحكم على الأنسجة ذات التغيرات النسيجية المرضية التالية مصابة: فقدان حدود الفرشاة ، والفجوات ، وتكوين الزهر ، والتمدد الأنبوبي والاضطراب ، وتحلل الخلايا والنخر الخلوي. تم فحص تلف الأنسجة بطريقة عمياء وسجل من خلال النسبة المئوية للأنابيب التالفة: 0 ، لا ضرر ؛ 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4، >75٪ (13).

المجهر الإلكتروني الناقل (TEM).طازجكلىتم غسلها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، ومقطعة إلى مكعبات 1 مم ومثبتة بالتتابع في 2.5٪ glutaraldehyde لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. تم غمر الأقسام في رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 1٪ لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية ، ومجففة في الإيثانول المتدرج وجزءا لا يتجزأ من الإيبوكسيرين. وأخيرا ، تمت مضاعفة المقاطع الرقيقة جدا (60 نانومتر) ملطخة بخلات اليورانيل وسترات الرصاص عند 20 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. وأجريت الملاحظة على مجهر إلكتروني ناقل (Tecnai; هيتاشي المحدودة) عند 80 كيلو فولت باستخدام فيلم المجهر الإلكتروني 4489 (قاعدة سميكة ESTAR ؛ كوداك).

الكيمياء النسيجية المناعية (IHC).طازجكليةتم تثبيت الأنسجة في 4٪ بارافورمالديهايد (لمدة 72 ساعة عند 4 درجات مئوية) وجزءا لا يتجزأ من البارافين. تم تقطيع العينات إلى أقسام بسماكة 4 ميكرومتر وإزالة البارافينات في الزيلين. بعد غسل أجزاء الأنسجة باستخدام PBS ، تم غليها في مخزن مؤقت سيترات 10 mM (الرقم الهيدروجيني 6.0) لمدة 4 دقائق لاسترجاع المستضدات ثم تم حظرها باستخدام مصل الماعز بنسبة 10٪ في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. الجسم المضاد الأساسي (anti-LC3B ؛ 1:400 ؛ القط رقم 4412 ؛ تكنولوجيا إشارات الخلية ، وشركة) تمت إضافته وفقا للتعليمات وتم تحضينه عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة. الجسم المضاد الثانوي (الماعز المضاد للأرانب HRP ؛ 1: 2000 ؛ القط. BS13278; Bioworld Technology ، Inc.) تمت إضافته وتحضينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تمت إضافة DAB (100 ميكرولتر) وتمت ملاطخته لمدة 5 دقائق مع التلطيخ الذي لوحظ تحت المجهر الضوئي (نموذج CX31-P; شركة أوليمبوس). تم تحديد شدة التلطيخ الإيجابي ، الذي بدا بنيا ، باستخدام برنامج تحليل الصور Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics، Inc.). تم حساب الكثافة البصرية المتكاملة (IOD) لتمثيل الكثافة. زادت قيم IOD مع زيادة التعبير عن البروتين.

النسخ العكسي الكمي(RT-q) تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي منأنسجة الكلىبعد تحريض النموذج باستخدام كاشف TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). وفقا لتعليمات مجموعة النسخ العكسي TaqMan (cat. no. N8080234; إنفيتروغن. Thermo Fisher Scientific, Inc.) ، تم نسخ الحمض النووي الريبي عكسيا إلى cDNA. تم استخدام ظروف التدوير الحراري التالية (miR-214): تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تليها 40 دورة من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية والاستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تم إجراء RT-qPCR باستخدام نظام ABI Prism 7500 للكشف عن التسلسل (PerkinElmer، Inc.) ومجموعة SYBR Green PCR القياسية (Toyobo Life Science). تم استخدام U6 كرقابة داخلية ل miR-214. كانت تسلسلات التمهيدي على النحو التالي: miR-214 ، إلى الأمام ، 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' والعكس ، 5'-AAAGGTGTGTTCTCCCTCTCAC-3' ؛ U6 ، إلى الأمام ، 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' والعكس ، 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. تم تكرار هذه التجارب ست مرات. تم تحليل النتائج باستخدام طريقة 2-ΔΔCq (14). تم تقييم مستويات تعبير mRNA من LC3 و p62 و PTEN و AKT و mTOR عبر RT-qPCR. مع β-أكتين كمرجع داخلي لهذه الجينات ، تم استخدام 2-ΔΔCq لقياس التعبير النسبي للجينات المستهدفة. تم توليف تسلسلات التمهيدي الموضحة في الجدول الأول من قبل شركة Sangon Biotech Co.، Ltd.

النشاف الغربي. كليةتم خلط الأنسجة مع RIPA lysate (معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية) لجعل التجانس وتم إيقاف التحلل عندما لم يلاحظ أي نسيج مرئي. تم طرد العينات مركزيا عند 13000 × g لمدة 10 دقائق عند -4 درجة مئوية وتم استرداد supernatant لتحليل اللطخة الغربية. باختصار ، تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين الدقيقة BCA (Thermo Fisher Scientific ، Inc.). تم إخضاع عينات البروتين (80 ميكروغرام لكل عينة) للفصل عن طريق تقليل 12٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميدجيل الكهربائي ثم نقلها إلى أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيلدين عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تم نقل البروتينات المنفصلة إلى أغشية PVDF. بعد حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة ، تم تحضين الأغشية بين عشية وضحاها (عند 4 درجات مئوية) بأجسام مضادة أولية. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية (جميع تكنولوجيا إشارات الخلايا، Inc.) : سلسلة الضوء 3B (1:1,000; cat. no. 4412), p62 (1:1,000; cat. no. 4412), Anti-PTEN (1:1,000; cat. no. 9188), anti-phosphorylated (p)-AKT (Ser473) (1:1,000; cat. no. 4060), anti-AKT (1:1,000; cat. no. 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cat. no. 5536), anti-mTOR (1:1,000; cat. no. 2972) and β-actin (1:2,000; cat. no. 4970). بعد الغسيل ، تم احتضان الأغشية (في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة) مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب المترافقة مع HRP (1: 3000 ؛ القط. A0208; معهد بيوتايمر للتكنولوجيا الحيوية). تم الكشف عن نطاقات البروتين باستخدام Immobilon Western (MilliporeSigma) وتم تحليلها باستخدام Total-Lab TL120 soft-ware (الديناميكيات غير الخطية ، 2.01). تم تطبيع التعبير عن البروتين إلى β الأكتين.

التحليل الإحصائي. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). وقدمت جميع البيانات كوسيلة ± الانحراف المعياري أو الوسيطات (النطاقات الربيعية) للمتغيرات المستمرة، اعتمادا على توزيعاتها. تمت مقارنة خصائص خط الأساس ونتائجه باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق ، أو اختبار Kruskal-Wallis متبوعا باختبار Dunn حسب الاقتضاء. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

النتائج

النقطة الزمنية 24 ساعة بعد CLP. وقد أفادت الدراسات السابقة (6،15،16) أن التحليل الكيميائي الحيوي (أي LC3 و p62) يكشف أن تدفق الالتهام الذاتي يتم قمعه مع تطور الإنتان بعد 6-8 ساعات من CLP. في هذه الدراسة ، عدد الأليسومات الذاتية فيكليةمن الفئران المعالجة ب CLP زادت في غضون 24 ساعة بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، تحليل علاماتإصابة الكلىأظهر أنوظائف الكلىتضررت بشدة 24 ساعة بعد CLP. لذلك ، تم اختيار النقطة الزمنية 24 ساعة بعد CLP للتجارب التالية.

التأثير التنظيمي على miR-214 في أنسجة الكلى. تم استخدام تحليل RT-qPCR للكشف عن تعبير miR-214 في الفئران المعالجة ب CLP. وقد وجد أن التعبير miR-214 كان أعلى قليلا فيكليةالأنسجة بعد جراحة CLP 24 ساعة ، مقارنة بالمجموعة الصورية (1.47 ضعف ، P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">كليةالأنسجة ، بالمقارنة مع مجموعة صورية (كلاهما P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).

سيستانش سوف يحسن الفشل الكلوي / الكلوي

تأثير miR-214 على الاختلال الوظيفي الكلوي في الفئران الإنتانية.تم التضحية بجميع الفئران لجمع الدم والبول وكليةعينات 24 ساعة بعد جراحة CLP. BUN و Cr هي مؤشرات مهمة على شدةالكلويضعف (17). وعلاوة على ذلك، تم تحديد NGAL و KIM-1 كمؤشرات حيوية محددة لإصابة الكلىويرتبط تعبيرها المتزايد مع وقت مبكرالكلويإصابة أنبوبية في AKI (17). كما هو موضح في الشكل 2A-D ، زادت مستويات BUN و CR و KIM-1 و NGAL بشكل كبير بعد جراحة CLP مقارنة بالمجموعة الوهمية. ومع ذلك ، انخفض Ad-miR-214 بشكل كبير من مستويات BUN و CR و KIM-1 و NGAL مقارنة بمجموعة CLP (جميع P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">وظائف الكلىالبارامترات. ومع ذلك ، بعد المعالجة المسبقة بمثبط PTEN ، تم تعزيز آثار الحماية ل Ad-miR-214. تظهر النتائج أن miR-214 يخفف من اختلال وظائف الكلى في الفئران الإنتانية.

تأثير miR-214 على التهاب الكلى والإجهاد التأكسدي.وكما هو مبين في الشكلين 3 ألف وباء، فإن CLP رفعت بشكل كبير مستويات TNF-α وIL-6، في حين أن Ad-miR-214 خفضت بشكل ملحوظ مستويات هذه العلامات. مقارنة مع

تأثير miR-214 على الالتهام الذاتي الكلوي في الفئران الإنتانية.بحثت هذه الدراسة التغيرات في LC3 فيكليةالأنسجة عن طريق تلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. كما هو موضح في الشكل 6 ، زادت شدة LC3 للتلطيخ الإيجابي بشكل ملحوظ في مجموعة CLP مقارنة بالمجموعة الصورية (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">

miR-214 ينشط مسار AKT/mTOR لمنعالالتهام الذاتي عن طريق إسكات PTEN في أنسجة الكلى.تأثير CLP على الالتهام الذاتي فيكليةتم التحقيق في الأنسجة من خلال تقييم مستويات LC3-II / I و p62. يخدم مسار إشارات PTEN / AKT / mTOR دورا مهما في الالتهام الذاتي (18). للتحقيق في تأثير miR-214 على مسار PTEN-AKT / mTOR ، تم تحليل مستويات البروتين من LC3-II / I و p62 و AKT و p-AKT و mTOR و p-mTOR و PTEN من خلال النشاف الغربي و RT-qPCR الشرجي. كما هو موضح في الشكل 7A-C ، يحدث تعديل في هذه البروتينات بسرعة ، مع زيادة في معدل LC3-II / LC3-I ، وانخفاض في مستويات p62 (كلاهما P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">كليةالأنسجة (كلاهما P>0.05). لم يكن لمؤشري LC3-II/LC3-I و p62 فرق كبير بين مجموعة Ad-miR-214 ومجموعة مثبطات PTEN ومجموعة مثبطات Ad-miR-214 + PTEN (جميعها P>0.05). أظهرت هذه النتائج أن الالتهام الذاتي كان مستحثا بواسطة CLP ، وأن الإفراط في التعبير عن miR-214 يمكن أن يثبطه جزئيا.

كما هو موضح في الشكل 7A و D-F ، مستوى التعبير عن PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">كليةالأنسجة (جميع P>0.05). لم يكن هناك فرق دلالي غير قادر على المؤشرات المذكورة أعلاه بين مجموعة Ad-miR-214 ومجموعة مثبطات PTEN ومجموعة مثبطات Ad-miR-214 + PTEN (جميعها P>0.05). تشير هذه النتائج إلى أن CLP يحفزكليةالالتهام الذاتي للأنسجة عن طريق تثبيط مسار AKT / mTOR. قام Ad-miR-214 بتنشيط مسار AKT / mTOR عن طريق إسكات PTEN فيكليةالانسجه. ومع ذلك ، بالمقارنة مع مجموعة CLP ، لم يمنع anti-miR-214 بشكل كبير التعبير عن mTOR. لذلك ، تم استخدام RT-qPCR أيضا لتحديد التعبير عن mRNA للجينات المتعلقة بمسار إشارات PTEN / AKT / mTOR. وفقا لنتائج RT-qPCR (الشكل 8) ، بالمقارنة مع مجموعة الشام ، زادت مستويات تعبير mRNA من p62 و LC3 و PTEN بشكل ملحوظ ، في حين انخفض تعبير mRNA ل AKT و mTOR في مجموعة CLP. مقارنة مع مجموعة CLP ، Ad-miR-214 ، PTEN

أظهرت مجموعات مثبطات Ad-miR-214 + PTEN انخفاضا في تعبير mRNA عن LC3 و PTEN ، ولكنها زادت من تعبير mRNA عن p62 و AKT و mTOR (جميع P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). وبالتالي ، قد يحدث تأثير p62 على الالتهام الذاتي على مستوى النسخ بدلا من مستوى ما بعد النسخ. أظهرت النتائج الحالية أن miR-214 خفض تنظيم التعبير عن PTEN وتنشيط مسار إشارات AKT / mTOR.

مناقشة

وجدت الدراسة الحالية أن الالتهام الذاتي المفرط كان ضارا بوظائف الكلىفي الفئران الصرف الصحي. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن miR-214 يرتبط بزيادة الانتشار والانبثاث والغزو ويعمل كجين ورمي للخلايا والأنسجة (19-22). تشير الدراسات إلى أن miR-214 يخدم دورا وقائيا ضد AKI عن طريق موت الخلايا المبرمج المخفف والإجهاد التأكسدي والعوامل الالتهابية المخفضة التنظيم (21,23). كما درست هذه الدراسة الآليات الكامنة وراء التأثير الوقائي ل miR-214 على AKI الناجم عن الإنتان من خلال التركيز على المشاركة المحتملة ل miR-214 في تعديل الالتهام الذاتي. أظهرت النتائج أن الإجهاد التأكسدي حدث فيكليةبعد إجراء جراحة CLP. وفي الوقت نفسه ، يحدث تنشيط الالتهام الذاتي فيكلية.ارتفاع LC3 II / I والحد من p62 فيكليةلوحظ بعد العلاج مع جراحة CLP. كما هو متوقع ، فإن التعبير المفرط عن miR-214 خفف بشكل كبيركليةالإصابات المرضية وكليةالخلل الناجم عن الإنتان. ومع ذلك ، أظهر تثبيط miR-214 ميلا معاكسا للحماية من الرينوب. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعزيز تأثير الحماية ل Ad-miR-214 بواسطة مثبط PTEN.

في الصرف الصحيكلية، ويرافق الاشتعال المفرط زيادات هائلة في إنتاج ROS وعدد كبير من ROS يؤدي إلى تغييرات في بنية الميتوكوندريا ويضعف وظيفة الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى دخول الجسم في حلقة مفرغة تؤدي إلى تفاقمكليةالضرر (24,25). لذلك ، قد يكون الإجهاد التأكسدي أحد الآليات المرضية الرئيسية ل AKI الناجم عن الإنتان. قدمت هذه الدراسة المزيد من الأدلة التي تثبت الإجهاد التأكسدي المفرط ، والذي أشير إليه من خلال زيادة إنتاج MDA وانخفاض نشاط SOD فيكليةالأنسجة بعد جراحة CLP. علاوة على ذلك ، وجد أن التعبير المفرط عن miR-214 يمكن أن يحميكليةضد الإصابة التأكسدية الناجمة عن CLP ، والتي تشارك في تثبيط البلعمة الذاتية. وهذا يتفق مع الدراسات السابقة التي تفيد بأن miR-214 يحمي الخلايا والأنسجة المختلفة من الإجهاد التأكسدي (26,27).

الالتهام الذاتي بمثابة "سيف ذو حدين" في تطور الإنتان: يمكن للالتهام الذاتي القاعدي أن يمارس تأثيرات وقائية عن طريق إزالة البروتينات المؤكسدة السامة ، ولكن الالتهام الذاتي المفرط قد يؤدي إلى موت خلوي ذاتي تحت ضغط شديد ، مثل ثوران ROS (28,29). وقد تبين أن الالتهام الذاتي يتم تنشيطه في البداية في الإنتان ، تليها مرحلة لاحقة من الخلل الوظيفي بسبب موت الخلايا ذاتية الالتهام (30) ، مما يؤدي إلى تفاقم الإصابة التأكسدية الناجمة عن الإنتان. في هذه الدراسة ، أظهر مثبط PTEN أو التعبير المفرط عن miR-214 حماية مضادة للأكسدة في الفئران المعالجة ب CLP. ومع ذلك ، أظهر تثبيط miR-214 ميلا معاكسا للحماية من مضادات الأكسدة. لذلك يمكن أن يسبب الالتهام الذاتي المفرط أو غير الكافيتلف الكلى; كلاهما غير قابل للتكيف ويثير في نهاية المطاف موت الخلايا. وبالتالي ، فإن الحفاظ على مستويات معتدلة من الالتهام الذاتي هو المفتاح لتخفيف الإصابة التأكسدية في حالة الصرف الصحي.

سيستانش سوف يحسن آلام الكلى / الكلى

وقد أشارت الأدلة المتراكمة إلى أن miR-214 يمنع الالتهام الذاتي في مختلف الخلايا والأنسجة (31-33). في هذه الدراسة ، وجد أن الإفراط في التعبير عن miR-214 يثبط الالتهام الذاتي الناجم عن CLP فيأنسجة الكلى ،كما هو موضح في التغيرات في علامات البروتين ، مثل LC3-II / I و p62. علاوة على ذلك ، أظهرت النتائج أن الإفراط في التعبير عن miR-214 خفف من الإصابة التأكسدية الناجمة عن CLP عن طريق تثبيط الالتهام الذاتي المفرط. بحثت هذه الدراسة أيضا في الآليات الجزيئية التي يعدل بها miR-214كليةالالتهام الذاتي في AKI الناجم عن الإنتان. PTEN / AKT / mTOR هو مسار إشارة مهم ينظمكليةالالتهام الذاتي (34,35) والذي يخدم دورا رئيسيا في AKI الناجم عن الإنتان ، و PTEN هو مثبط سلبي لمسار إشارات PI3K / AKT / mTOR. ذكرت دراسات سابقة أن miR-214 يمكنه تنظيم الالتهام الذاتي من خلال مسار إشارات PI3K / AKT / mTOR في نماذج مختلفة (36-38). وجد ما وآخرون (39 عاما) أن miR-214 يمكن أن ينظم الالتهام الذاتي في الكلى السكرية. لذلك ، تم افتراض أن آثار miR-214 على AKI الناجم عن CLP قد تشارك في تنظيم مسار PTEN / AKT / mTOR. والجدير بالذكر أن نتائج الدراسة الحالية أظهرت أن جراحة CLP رفعت بشكل كبير مستويات PTEN ولكنها خفضت مستويات p-AKT و p-mTor ، مما يشير إلى أن جراحة CLP عطلت مسار AKT / mTOR. بالإضافة إلى ذلك ، أدى الإفراط في التعبير عن miR-214 إلى تنشيط مسار AKT / mTOR عن طريق إسكات PTEN في الالتهام الذاتي الناجم عن CLP فيكليةالانسجه. ومع ذلك ، فإن anti-miR-214 لم يمنع بشكل كبير التعبير عن mTOR في تحليلات اللطخة الغربية. وهكذا ، تم استخدام RT-qPCR أيضا لتحديد التعبير عن mRNA للجينات المتعلقة بمسار إشارات PTEN / AKT / mTOR. حددت هذه الدراسة أن miR-214 قلل من تنظيم التعبير عن PTEN ونشط مسار إشارات AKT / mTOR لتثبيط الالتهام الذاتي. ومع ذلك ، ينبغي إجراء المزيد من الدراسات الشاملة للحصول على تفاصيل إضافية تتعلق بآليةكليةالالتهام الذاتي في حالة الصرف الصحي.

وفي الختام، أشارت نتائج هذه الدراسة إلى أن miR-214 أدى دورا وقائيا ضد الإنتان الناجم عن الإنتان.إصابة الكلىعن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي وتثبيط الالتهام الذاتي من خلال تنظيم مسار PTEN / AKT / mTOR. تشير النتائج الحالية إلى أن miR-214 قد يكون هدفا علاجيا محتملا ل AKI الناجم عن الإنتان. ومع ذلك ، استخدمت الدراسة الحالية الفئران التي يتراوح عمرها بين 6 و 8 أسابيع ، لذلك هناك حاجة إلى مزيد من البحث حول آلية miR-214 في الفئران البالغة.