في تصميم السيليكو لقاح خيمري متعدد الحلقات ضد المتفطرة السلية الجزء 1

خلاصة

السل (TB) هو تهديد صحي عالمي ، يقتل ما يقرب من 1.5 مليون شخص كل عام. إن القضاء على المتفطرة السلية ، العامل المسبب الرئيسي لمرض السل ، يمثل تحديًا متزايدًا بسبب ظهور سلالات واسعة النطاق مقاومة للأدوية. يعتبر التطعيم وسيلة فعالة لحماية العائل من مسببات الأمراض ، لكن لقاح السل الوحيد المعتمد سريريًا ، Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ، يتمتع بحماية محدودة لدى البالغين. تم العثور على لقاحات متعددة الحاتمات لتعزيز المناعة ضد الأمراض عن طريق الجمع الانتقائي للحلمات من العديد من البروتينات المرشحة.

السل مرض معد تسببه بكتيريا المتفطرة السلية التي تصيب الرئتين بشكل رئيسي ولكنها قد تؤثر أيضًا على أعضاء أخرى. تلعب المناعة دورًا مهمًا في تطوير وعلاج مرض السل.

في حالة نقص المناعة ، يمكن أن تغزو المتفطرة السلية جسم الإنسان بسهولة وتتطور إلى مرض السل. على سبيل المثال ، يؤدي ضعف جهاز المناعة من أمراض أو علاجات طبية معينة إلى زيادة خطر الإصابة بعدوى السل. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤدي عوامل مثل سوء التغذية وسوء نوعية الحياة والإجهاد المفرط إلى إضعاف المناعة ، مما يؤدي إلى تطور مرض السل.

لذلك ، فإن الحفاظ على صحة جيدة وتقوية المناعة أمر مهم للغاية للوقاية من مرض السل. يمكن تعزيز المناعة من خلال اتباع نظام غذائي صحي ونمط حياة منتظم وممارسة الرياضة المناسبة والنوم الكافي ، مما يقلل بشكل فعال من خطر الإصابة بأمراض مختلفة ، بما في ذلك مرض السل.

تعتبر المناعة مهمة أيضًا للعلاج والشفاء عندما يكون السل قد حدث بالفعل. كلما كان جهاز المناعة أقوى ، زادت فعالية الجسم في الدفاع عن نفسه ضد هجوم من عصيات السل وينتج ما يكفي من الأجسام المضادة لمحاربة المرض. لذلك ، فإن الحفاظ على التغذية الكافية ، والتمارين المناسبة ، والسلوك الإيجابي يمكن أن يحسن المناعة ويعزز الشفاء.

في الختام ، هناك علاقة قوية بين المناعة والسل. يعد الحفاظ على صحة جيدة وتعزيز المناعة من الطرق المهمة للوقاية من مرض السل وعلاجه. دعونا نواجه الحياة بإيجابية ، ونحافظ على نمط حياة صحي ، ونبتعد عن الأمراض. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين مناعتنا. يمكن أن يحسن الكستانش المناعة بشكل كبير ، لأن رماد اللحوم يحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة بيولوجيًا ، مثل السكريات ، واثنين من عيش الغراب ، وهوانغ لي ، وما إلى ذلك. يمكن لهذه المكونات أن تحفز جهاز المناعة أنواعًا مختلفة من الخلايا في النظام ، وتزيد من نشاطها المناعي.

انقر فوق الفوائد الصحية من cistanche

هدفت هذه الدراسة إلى تصميم لقاح متعدد الحلقات ضد السل باستخدام نهج المعلوماتية المناعية. من خلال الإثراء الوظيفي ، حددنا ثمانية بروتينات تفرزها المتفطرة السلية التي تكون إما مطلوبة للإمراض ، أو تُفرز في الفضاء خارج الخلية ، أو كليهما. قمنا بعد ذلك بتحليل حواتم هذه البروتينات واخترنا 16 حاتمات لمفاوية T مساعدة مع نشاط تحفيز مضاد للفيروسات ، و 15 حاتمات لمفاوية تائية سامة للخلايا ، و 10 حاتمات خلية B خطية ، وقمنا بربطها مع حاتمة ملزمة و Pan HLA DR ملزمة (PADRE) باستخدام مناسب. الروابط.

علاوة على ذلك ، توقعنا البنية الثلاثية لهذا اللقاح ، وتفاعله المحتمل مع مستقبلات Toll-like -4 (TLR4) ، والاستجابة المناعية التي قد يثيرها. أظهرت النتائج أن هذا اللقاح له تقارب قوي مع TLR4 ، والذي يمكن أن يحفز بشكل كبير خلايا CD4 plus و CD8 plus لإفراز عوامل المناعة والخلايا الليمفاوية B لإفراز الغلوبولين المناعي ، للحصول على مناعة خلطية وخلوية جيدة. بشكل عام ، كان من المتوقع أن يكون هذا البروتين متعدد الحاتمة مستقرًا وآمنًا ومستضديًا عاليًا وعاليًا مناعياً ، والذي لديه القدرة على العمل كلقاح عالمي ضد السل.

1 المقدمة

السل (TB) ، وهو مرض شديد العدوى تسببه المتفطرة السلية ، تصنفه منظمة الصحة العالمية (WHO) باعتباره السبب الأول للوفاة من عامل معدي واحد [1-3]. في عام 2021 ، بلغ العدد التقديري لوفيات السل والحالات الجديدة 1.6 مليون و 10.6 مليون على التوالي [4]. حاليًا ، العلاج السريري لمرض السل نادر نسبيًا ، ويستخدم بشكل أساسي مزيج من الأدوية المضادة للميكروبات المتعددة.
دورة العلاج الكيميائي هذه طويلة جدًا ، وعادة ما تستغرق من تسعة إلى اثني عشر شهرًا ، أو حتى أطول [5] ، مما يزيد من خطر حدوث طفرات مقاومة للأدوية في المتفطرة السلية [6،7]. في السنوات الأخيرة ، أصبح العلاج الكيميائي أقل فعالية بسبب ظهور وزيادة نسبة المتفطرة السلية متعددة الأدوية والمقاومة للأدوية على نطاق واسع [6]. قد يكون منع تطور مرض السل أكثر فعالية من علاجه. من المعروف أن التطعيم وسيلة فعالة لحماية العائل من البكتيريا المسببة للأمراض [8].

حاليًا ، Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ، الذي تم تطويره منذ أكثر من 100 عام ، هو لقاح السل الوحيد المعتمد إكلينيكيًا [9]. لسوء الحظ ، تحمي BCG الأطفال حديثي الولادة والرضع فقط وهي غير فعالة إلى حد كبير ضد المراهقين والبالغين [2،10] ، على الرغم من أن منظمة الصحة العالمية تشير إلى أن 89 بالمائة من حالات السل في عام 2021 كانت من البالغين [4]. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير لقاح جديد وفعال ضد السل ، خاصة للمراهقين والبالغين.

إن تطوير لقاح السل معقد بسبب السمات المتعددة للبكتيريا الفطرية ، مثل العدوى الكامنة ، والمثابرة ، والتهرب المناعي [11-13]. يجب تصميم لقاح مثالي ضد السل لاستهداف البروتينات / المسارات المسؤولة عن هذه الخصائص في المتفطرة السلية ويكون قادرًا على تحفيز الاستجابات المناعية بوساطة الخلايا التائية CD4 plus و CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية بكفاءة [14].

علاوة على ذلك ، يجب أن يستهدف اللقاح الفعال أيضًا معقدات التوافق النسيجي الرئيسية للمضيف (MHC) ، والتي تكون متعددة الأشكال بشكل كبير [15]. وضعت هذه الخصائص متطلبات عالية جدًا لتعدد استخدامات اللقاح ، والتي من الواضح أنه لا يمكن تحقيقها ببروتين طبيعي واحد. لقاح الحاتمة المتعددة ، وهو بروتين مؤلف يتكون من سلسلة من الحواتم المتداخلة (الببتيدات) [16] ، هو نوع جديد من اللقاح المرشح الذي قد يعالج القضايا المذكورة أعلاه.

في السنوات الأخيرة ، جذبت اللقاحات متعددة الحاتمة اهتمامًا كبيرًا نظرًا لمزاياها المتمثلة في ارتفاع المناعة وانخفاض الحساسية من اللقاحات التقليدية [17 ، 18]. حاليًا ، تم تصميم لقاحات متعددة الحاتمات ضد العديد من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض ، بما في ذلك Shigella spp. [19] ، فيروس مرض الحمى القلاعية [20] ، هيليكوباكتر بيلوري [21،22] ، فيروس التهاب الكبد B [23] ، التوكسوبلازما جوندي [24] ، الليشمانية الطفولية [25] ، فيروس نيباه [26] ، كلابية الذنب المنفتحة [27] ، Pseudomonas aeruginosa [28] ، وفيروس اللوكوز [29].

على وجه الخصوص ، أدى ظهور جائحة COVID -19 إلى تعزيز تطبيق هذه التكنولوجيا [16،30-32]. أما بالنسبة لمرض السل ، فقد تم تصميم العديد من اللقاحات متعددة الحاتمات لاستهداف السل النشط بطبيعته [33-39] والسل الكامن [40،41]. من بينها ، تم تصميم ثلاثة لقاحات مرشحة على شكل DNA [34،36،40] ، واثنان منهم قاما بدمج حواتم في العمود الفقري للبروتين لتوليد لقاحات معاد التركيب [34،36].

وتجدر الإشارة إلى أن البروتينات المرشحة لبعض اللقاحات متعددة الحاتمات المذكورة أعلاه يتم اختيارها عشوائيًا ، وتتطلب التغطية السكانية لهذه اللقاحات مزيدًا من الدراسات.

علاوة على ذلك ، تم تصميم اثنين من لقاح السل متعدد الحلقات مع تغطية سكانية واسعة ، وتم اختيار حلقة واحدة من بروتينات حويصلة خارجية مناعية ذات خصائص ممرضة [39] ، والآخر لا يركز على البروتينات المرشحة ، ولكنه يختار مباشرة بدرجة عالية من الحفظ والتحقق من صحتها تجريبياً حواتم من قاعدة بيانات حاتمة المناعة (IEDB) [38]. ومع ذلك ، فإن هذه البروتينات المرشحة تفتقر إلى الإثراء الوظيفي ، ولا يزال يتعين تحسين قدرة مرشحي اللقاح على تحفيز إفراز الإنترفيرون (IFN-).

استنتجت دراسة سابقة أن التحسين العقلاني للحواتم يمكن تحقيقه من خلال مزيج من قدرة ربط معقد التوافق النسيجي الكبير وقدرة الحاتمة على التفاعل مع مستقبلات الخلايا التائية [42]. علاوة على ذلك ، توقعوا أن اللقاحات التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) A1 و A2 و A3 و A24 و B7 ستغطي حوالي 100 بالمائة في المجموعات العرقية الرئيسية (السود والآسيويون والأسبان والقوقازيون).

ومع ذلك ، لا يوجد حتى الآن نهج مماثل لتصميم لقاح السل. في هذه الدراسة ، صممنا لقاحًا شديد الاختلاط متعدد الحلقات السل باستخدام خصائص مستضدية مختلفة لثمانية بروتينات غنية بالوظائف. يمتلك اللقاح الكيميري المرشح 15 حاتمة CTL ، و 16 حاتمة لمفاوية تائية مساعدة (HTL) مع خصائص تحفيز IFN - - ، و 10 حواتم خلايا B خطية. أظهر تحليل المعلوماتية المناعية أن هذا اللقاح المرشح "شامل" ، مما يجعله حجر الزاوية المحتمل لتحقيق "استراتيجية القضاء على السل".

2. المواد والطريقة

2.1. اختيار البروتين واسترجاع التسلسل

لإنشاء لقاح متعدد الحاتمات ضد السل ، اخترنا أولاً بروتينات مجمع M. tuberculosis ، والتي تم إيداعها في قاعدة بيانات IEDB [43] وتم التحقق من صحتها على أنها حواتم ملزمة من الصنف الأول والثاني من معقد التوافق النسيجي الكبير. تم الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية (البنية الأولية) للبروتينات من سلالة M. tuberculosis H37Rv من قاعدة بيانات UniProt [44]. تم الحصول على تنبؤات مستقلة عن المحاذاة للمستضدات المحتملة بناءً على الخواص الفيزيائية والكيميائية من خادم VaxiJen 2. 0 [45] ، والذي خضع للتحول التلقائي والتغاير المتبادل (ACC) لتسلسلات البروتين إلى ناقل منتظم من الأحماض الأمينية الرئيسية الخواص ، مع عتبة مولد الضد المحددة عند 0 .4 لكل بروتين بكتيري [45،46].

تم تقييم التعليق التوضيحي الوظيفي للبروتينات باستخدام قاعدة البيانات للتعليق التوضيحي والتصور والاكتشاف المتكامل (DAVID) 6.8 [47]. تم إثراء البروتينات المفرزة بشكل أكبر باستخدام فئتين: الفضاء خارج الخلية والتسبب في المرض من خلال قواعد بيانات DAVID و BioCyc [48] ، على التوالي. تم تنزيل بروتين Homo sapiens GRCh38.p13 بتنسيق FASTA من قاعدة بيانات المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) [49]. تم استخدام BLASTp للتنبؤ بالتماثل (القيمة E =1 e -5) بين البروتينات المفرزة وبروتينات H. sapiens.

2.2. التنبؤ حاتمة الخلايا التائية

يعد التنبؤ واختيار الحلقات خطوات حاسمة في بناء لقاحات متعددة الحاتمات. جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير I تربط الببتيدات القصيرة (9-11 من الأحماض الأمينية) لأن شق ربط الببتيد لجزيئات معقد التوافق النسيجي الأول الذي يتكون من سلسلة واحدة مغلق [50]. تم استخدام NetMHCpan الذي يمكن الوصول إليه مجانًا -4. 1 [51] للتنبؤ بحلقات CTL ، والذي يستخدم NNAlign _ MA لإنشاء تصنيفات النسبة المئوية (الترتيب المئوي) استنادًا إلى مزيج من تقاربات ربط MHC I والروابط المستخرجة .

تم تحديد "ترتيب النسبة المئوية" لتسلسل الاستعلام عن طريق مقارنة درجة التنبؤ الخاصة به بتوزيع درجات التنبؤ الخاصة بـ MHC ذات الصلة المحسوبة باستخدام مجموعة من الببتيدات الأصلية المختارة عشوائيًا. الحلقات ذات الترتيب المئوي <0. 5٪ اعتبرت مواد رابطة قوية ، بينما الحلقات ذات الترتيب المئوي <2٪ اعتبرت روابط ضعيفة [51].

على الرغم من أنه يمكن توقع ما يصل إلى 12 حلقة من نوع MHC من الفئة الأولى على الخادم ، فقد استخدمنا فقط A1 و A2 و A3 و A24 و B7 لأن هذه الأنواع الخمسة الفائقة تغطي 1 0 0 بالمائة من الأجناس البشرية الرئيسية [42] . اخترنا مواد رابطة قوية وتوقعنا مولدها الضد باستخدام VaxiJen2.0 [45] ، ثم توقعنا مناعة من الدرجة الأولى باستخدام قاعدة بيانات Epitope الدولية (IEDB) [52] ، والتي تستخدم 3- التحقق المتبادل من أضعاف.

أخيرًا ، قمنا بترتيب الحلقات التي كانت مستضدية ومولدة للمناعة وفقًا لترتيب النسبة المئوية واخترنا 15 حاتمة منخفضة الدرجات ، ثلاثة لكل نوع فائق وواحد على الأقل لكل بروتين مرشح ، باستثناء البروتين المرشح الذي لا يمكن أن يحتوي على حاتمة ربط CTL قوية هذا هو المستضد والمناعة. أخيرًا ، تم توقع قيم IC5 0 لكل حلقة CTL من NetMHC -4. 0 [53].
ترتبط جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية بالببتيدات المستضدية ، ويمكن التعرف على المركب الناتج بواسطة HTL. بشكل نموذجي ، يتراوح طول الببتيدات المستضدية من 12 إلى 20 وحدة بنائية من الأحماض الأمينية ، ولكن كثيرًا ما يتم ملاحظة الببتيدات التي يتراوح طولها بين 13 و 16 وحدة بنائية [54].

كانت {0} mers أكثر حواتم MHC II وفرة لمرض السل وتم ترسيبها في IEDB. نتيجة لذلك ، استخدمنا NetMHCIIpan -4. 0 [51،55] للتنبؤ بربط 15- ببتيدات مير بمستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA-DR) ، HLADQ ، HLA-DP ، و H -2 - أليل واحد. استند التوقع أيضًا إلى NNAlign _ MA بترتيب نسبة <2٪ و <10٪ يعتبران روابط قوية وضعيفة ، على التوالي [51].

كما توقعنا 15- حاتمات تحفيز IFN للبروتينات المرشحة باستخدام خادم IFNepitope [56] ، والذي يستخدم نهجًا هجينًا لآلة متجهية يسمح بالفحص الافتراضي لـ IFN - - الذي يحفز الببتيد / الحاتمة في الببتيد مكتبة تتألف من مُجلدات IFN - - المستحثة وغير المستحثة MHC II التي تنشط الخلايا التائية المساعدة. ثم توقعنا مولد الضد للحلقات المحفزة لـ IFN [45] ، وأخيرًا ، اخترنا أكثر 16 حاتمة مختلطة كانت مرتبطة بقوة MHC-II ، وتحفز IFN ، ومستضد.

من المهم ملاحظة أنه تمت إزالة ببتيدات الإشارة من البروتينات المرشحة قبل التنبؤ الحاتمة. في هذه الدراسة ، تم فحص ببتيدات الإشارة باستخدام SignalP 5. 0 [57] و TargetP2. 0 [58].

2.3 توقع حاتمة الخلية B الخطية

تم توقع حلقات الخلايا البائية الخطية (16- مير) باستخدام ABCpred [59،6 0] بحد افتراضي يبلغ 0 .51. علاوة على ذلك ، لزيادة موثوقية نتائج التنبؤ ، استخدمنا أيضًا BepiPred 2. 0 [61] للتنبؤ بحلقات الخلايا البائية الخطية. تعرضت الحواتم التي تم الحصول عليها من هذين البرنامجين لمزيد من التنبؤ باستنباط الأنتيجين باستخدام VaxiJen2.0 [45]. أخيرًا ، اخترنا عشرة حاتمات خطية من الخلايا B بناءً على درجات ABCpred العالية ومستضدات ، مع اختيار حاتمة واحدة على الأقل لكل بروتين مرشح.

2.4 بناء لقاح متعدد الحاتمات مرشح بخصائص خيالية

يحتوي اللقاح المصمم متعدد الحاتقات على مادة مساعدة HBHA (هيماجلوتينين مرتبطة بالهيبارين) ، وحلقة ربط Pan HLA DR (PADRE) ، و 15 CTL ، و 16 HTL ، و 10 حاتمات خلايا B خطية ، وعلامة واحدة له × 6 (الشكل. 3). تم استخدام الوصلات للانضمام إلى الحلقات ، ومنع إنتاج حواتم الوصلات ، وتعزيز موكب وتجديد الحاتمات الفردية في اللقاحات الكيميرية [62].

لبناء هذا اللقاح المرشح ، تم وضع المادة المساعدة HBHA (معرف UniProt: P9WIP9) في الطرف N وتم ربطها بـ PADRE المصب عبر رابط EAAAK. بعد ذلك ، تم ربط حلقات HTL التي انضمت إليها روابط GPGPG بـ PADRE. علاوة على ذلك ، تم توصيل حلقات CTL التي تم ضمها بواسطة رابط AAY بحلقات HTL عبر رابط HEYGAEALERAG ، والذي انضم أيضًا إلى وحدة حلقية CTL إلى حلقات خلية B خطية مرتبطة باستخدام روابط KK. أخيرًا ، تم إرفاق علامة His × 6 بالطرف C للبروتين الخيمري.

2.5 الأنتيجين ، الحساسية ، والخصائص الفيزيائية والكيميائية

تم توقع مولد الضد للقاح الحاتمة المتعددة والبروتينات المكونة الثمانية بواسطة خادم VaxiJen 2. 0 [45] ، بينما تم توقع الحساسية لهذه البروتينات بواسطة خادم AllerTOP 2. 0 [ 63]. AllerTOP 2. 0 يستخدم واصفات E للأحماض الأمينية ، وتحويل ACC لتسلسل البروتين ، وجيران k الأقرب (kNN) لتصنيف مسببات الحساسية.

حققت الطريقة دقة 85.3 بالمائة مع 5- أضعاف التحقق من الصحة. تم استخدام خادم ExPASy ProtParam [64] للتنبؤ بالخصائص الفيزيائية والكيميائية مثل نصف العمر ، والنقطة الكهربية ، ومؤشر عدم الاستقرار ، والمؤشر الأليفاتي ، والمتوسط ​​الكبير للإثارة المائية (GRAVY) لهذا اللقاح متعدد الحاتمات.
علاوة على ذلك ، تم تقييم قابلية ذوبان ببتيد اللقاح متعدد الحاتمات باستخدام خادم البروتين Sol (PROSO II) [65] استنادًا إلى المصنف الذي يستغل الفروق الدقيقة بين البروتينات غير القابلة للذوبان المعروفة من TargetDB والبروتينات القابلة للذوبان من كل من TargetDB و PDB [ 66]. عند تقييمها باستخدام 10- أضعاف التحقق من الصحة ، حققت دقة 71. 0 بالمائة (المنطقة الواقعة أسفل منحنى ROC=0. 785).

2.6. المحاكاة المناعية

لتوصيف ملف الاستجابة المناعية واستمناع اللقاح ، تم إجراء المحاكاة المناعية في السيليكو باستخدام خادم C-ImmSim [67]. يتنبأ C-ImmSim بالتفاعلات المناعية باستخدام مصفوفات التسجيل الخاصة بالموقع المشتقة من تقنيات التعلم الآلي للتنبؤ بالببتيد.
وهو يحاكي في نفس الوقت ثلاث حجرات تمثل ثلاث مناطق تشريحية منفصلة موجودة في الثدييات: (1) نخاع العظم ، حيث تمت محاكاة الخلايا الجذعية المكونة للدم لإنتاج الخلايا الليمفاوية والخلايا النخاعية الجديدة ؛ (2) الغدة الصعترية ، حيث تم اختيار الخلايا التائية الساذجة لتجنب المناعة الذاتية ؛ و (3) العضو الليمفاوي مثل الغدد الليمفاوية.

لتجهيز اللقاح وتعزيزه بشكل فعال ، اتبعنا نهج [68] حيث تم إعطاء حقنتين بفاصل أربعة أسابيع. تم تعيين جميع معلمات المحاكاة على القيم الافتراضية ، مع ضبط الخطوات الزمنية على 10 و 94 (كل خطوة زمنية هي ثماني ساعات).

2.7. التنبؤ بالمنطقة المضطربة

المناطق المضطربة جوهريًا (IDRs) موجودة في العديد من البروتينات. تم التنبؤ بالمنطقة المضطربة باستخدام DISOPRED3 [69] ، والتي تستخدم DISOPRED2 ووحدتين أخريين تعتمدان على التعلم الآلي تم تدريبهما على IDRs كبيرة لتحديد المخلفات المضطربة. كانوا بعد ذلك أنو

2.8 التنبؤ بالهيكل الثانوي والثالثي

تم التنبؤ بالبنية الثانوية للقاح المصمم بواسطة خادم PSIPRED 4. 0 [70] ، والذي يستخدم أولاً PSI-BLAST لتحديد التسلسلات وثيقة الصلة ببروتين الاستعلام. تم التنبؤ بالبنية الثلاثية لهذا اللقاح باستخدام خادم تحسين تجميع الخيوط التكرارية (I-TASSER) [71].

هناك أربع خطوات رئيسية في نمذجة ITASSER ؛ أ) تحديد قالب الخيوط ؛ ب) محاكاة تجميع الهيكل التكراري ؛ ج) اختيار النموذج وصقله ؛ و د) الشرح الوظيفي القائم على الهيكل [72 ، 73].

أنتجت I-TASSER خمسة نماذج ، تم فحصها باستخدام ProSA-web [74] ، وتم اختيار الطراز الذي يحتوي على أدنى درجة Z لمزيد من التحسين. يقارن ProSA-web درجات النموذج التي تم الحصول عليها من الهياكل التي تم التحقق منها تجريبياً والمودعة في PDB. تساعد مؤامرة نقاط الجودة المحلية في تحديد المناطق التي بها مشكلات في النموذج ، وتم تمثيل نفس الدرجات باستخدام رمز اللون في عرض الهيكل ثلاثي الأبعاد. هذا مفيد في التحديد والتحسين الهيكلي المبكر.

2.9 صقل الهيكل الثلاثي

تم تنقيح النموذج "الخشن" ثلاثي الأبعاد للقاح المرشح الذي حصلت عليه شركة ITASSER على مرحلتين باستخدام خادمين ؛ أولاً مع ModRefiner [75] متبوعًا بـ GalaxyRefine [76]. يستخدم ModRefiner آثار C للتأثير على بناء وصقل البروتينات التي تم الحصول عليها عن طريق تقليل الطاقة على المستوى الذري من خطوتين.

أولاً ، تم استخدام آثار C لبناء السلسلة الرئيسية ، تليها صقل دوارات السلسلة الجانبية وذرات العمود الفقري باستخدام حقول القوة المركبة القائمة على الفيزياء والمعرفة. يستخدم GalaxyRefine قوالب متعددة لإنشاء هياكل أساسية موثوقة ، بينما تم إنشاء حلقات أو محطات غير موثوقة من خلال النمذجة القائمة على التحسين.

2.10. التحقق من البنية الثلاثية

تم التحقق من صحة البنية المكررة للقاح المرشح بواسطة مخططات راماشاندران التي تم إنشاؤها من قاعدتي بيانات PROCHECK [77] و MolProbity [78]. تقيم مخططات راماشاندران تشكيل العمود الفقري للبروتينات عن طريق تقسيم بقايا الأحماض الأمينية إلى منطقتين: مسموح بها وغير مسموح بها. تستخدم PROCHECK الكيمياء الفراغية لتقييم الجودة الصافية لهياكل البروتين من خلال مقارنتها بالتركيبات المكررة بنفس الدقة ثم تقديم المناطق التي تتطلب مزيدًا من التحليل.

تقوم Molprobity بالتحقق من صحة نماذج الجزيئات الكبيرة المحلية والعالمية (البروتينات والأحماض النووية) من خلال مزيج من معايير الأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي والحاسوب ومعايير cryoEM [79]. يتم استخدام القوة والحساسية لتحسين وضع الهيدروجين وتحليل التلامس الشامل على نطاق واسع في نسخة محدثة من معايير الهندسة التساهمية وزاوية الالتواء [80].

2.11. حواتم الخلية B المتقطعة

تم التنبؤ بحلقات الخلية B غير المستمرة في بنية البروتين الأصلية باستخدام ElliPro [81]. يطبق ElliPro ثلاث خوارزميات لتقريب شكل البروتين كمجسم بيضاوي ، ويحسب مؤشر بروز المخلفات (PI) ، ويجمع البقايا المجاورة بناءً على قيم PI الخاصة بها. يوفر ElliPro كل حاتمة إخراج بدرجة موصوفة على أنها متوسط ​​قيمة PI لبقايا الحاتمة. المجسم الإهليلجي ذو قيمة PI تبلغ 0. 9 يتكون من 90 بالمائة من مخلفات البروتين الموجودة ، بينما تقع نسبة 10 بالمائة المتبقية خارج الشكل الإهليلجي. لكل بقايا حاتمة ، يتم حساب قيمة PI من مركز كتلة البقايا الموجودة خارج أكبر مجسم إهليلجي ممكن.

2.12. الالتحام الجزيئي للبروتينات الكيميرية

تم إجراء الالتحام الجزيئي للقاح المصمم (يجند) بمستقبلات مناعية تشبه Toll-Like -4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) باستخدام Patchdock [82]. تم بعد ذلك تنقيح النماذج العشرة الأولى باستخدام FireDock [83]. يستبدل PatchDock تمثيل سطح نقطة Connolly للجزيئات ببقع مقعرة ومحدبة ومسطحة.

ثم تم تسجيل النماذج بناءً على التوافق الهندسي والتفكيك الذري. [82]. يعمل FireDock على تحسين توافق السلسلة الجانبية وتوجيه الجسم الصلب ويولد ناتجًا من مجمع مكرر ثلاثي الأبعاد استنادًا إلى طاقة الربط [83]. اخترنا النموذج الأول من Firedock على أساس الطاقة العالمية كمجمع لرسو السفن. أخيرًا ، تم التنبؤ بمحتوى طاقة الربط والتفكك داخل مجمع الإرساء باستخدام خادم PRODIGY [84].

2.13. محاكاة الديناميات الجزيئية

تم إجراء عمليات المحاكاة الديناميكية الجزيئية على البروتينات باستخدام خادم الويب السريع والذي يمكن الوصول إليه مجانًا ، وخادم تحليل الوضع العادي للإحداثيات الداخلية (iMODS) [85] ، وتم الحصول على نتائج إرساء متسقة ومثالية من خادم PatchDock-FireDock. في الإحداثيات الداخلية ، يولد تحليل الوضع العادي (NMA) حركات جماعية حاسمة لوظيفة الجزيئات الكبيرة. يقدم iMODS آليات لاستكشاف هذه الأنماط مثل تحليل الاهتزاز ، والرسوم المتحركة المتحركة ، ومسارات التحويل التي تم تنفيذها بشكل تفاعلي تقريبًا بدقة مختلفة [85].

2.14. الترجمة العكسية ، وتحسين الكودون ، واستنساخ اللقاح في السيليكو

للتعبير الفعال عن اللقاح المرشح في خلايا الإشريكية القولونية ، تم إنشاء (كدنا) في السيليكو من خلال تحسين الكودون والترجمة العكسية باستخدام أداة تكييف كودون جافا (JCAT) [86].

تضمن التحسين (1) تجنب عوامل إنهاء النسخ المستقلة عن rho ، 2) تجنب مواقع ربط الريبوسوم بدائية النواة ، (3) تجنب موقع الانقسام لأنزيمات التقييد NcoI و XhoI ، والتي تعمل كمواقع تقييد N-terminal و C- لإدخال cDNA قالب اللقاح ، و (4) التحسين الجزئي فقط لتطبيق الطفرات الموجهة بالموقع. توقع مؤشر تكييف Codon (CAI) ومحتوى GC جودة cDNA مع كودون إيقاف أوبال (TGA) تم إدخاله بعد علامة His × 6. بعد ذلك ، تم دمج جزء الحمض النووي المُحسَّن من اللقاح الوهمي المُرشح في الشريط العكسي لـ pET -28 a (زائد) باستخدام أداة SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com