في تصميم السيليكو لقاح خيمري متعدد الحلقات ضد المتفطرة السلية الجزء 2

 2.15. نظرة عامة على تصميم لقاح متعدد الحلقات

يلخص الشكل 1 المفهوم العام لتصميم اللقاح متعدد الحاتمات هذا. باختصار ، قمنا بتحليل مستضدات بروتينات M. tuberculosis التي تم الحصول عليها من IEDB واخترنا ثمانية مستضدات مرشحة لبناء لقاح متعدد الحلقات ، مع الأخذ في الاعتبار تصنيفها الوظيفي وتوطينها دون الخلوي. بعد ذلك ، توقعنا الحلقات المستضدية لهذه البروتينات الثمانية واخترنا 15 حلقة CTL ، و 16 حاتمات HTL ، و 10 حواتم خلايا B ، والتي تم ربطها أيضًا بمساعد HBHA و PADRE من خلال روابط مناسبة. علاوة على ذلك ، توقعنا أن تكون الأنتيجينيسين ، والحساسية ، والخصائص الفيزيائية والكيميائية ، والمظهر المناعي للقاح متعدد الحاتمات المصمم. وفي الوقت نفسه ، توقعنا أيضًا الهياكل الثانوية والثالثية للقاح وقمنا بتحليل تفاعله المحتمل مع مستقبل TLR4 المناعي.

المتفطرة السلية هي أحد مسببات الأمراض الشائعة التي تسبب مرض السل. يعد بروتين المتفطرة السلية أحد المكونات الرئيسية لـ Mycobacterium tuberculosis ، وهو أمر بالغ الأهمية لوظيفة الجهاز المناعي للإنسان.

يمكن لبروتين المتفطرة السلية تنشيط جهاز المناعة البشري وتعزيز مناعة الجسم. عندما يصاب الجسم بالمتفطرة السلية ، فإن الجهاز المناعي للإنسان ينتج سلسلة من الاستجابات المناعية ، بما في ذلك تنشيط وانتشار خلايا تائية وخلايا ب محددة. يمكن لهذه الخلايا أن تطلق مجموعة متنوعة من العوامل المناعية ، مثل الإنترفيرون ، والإنترلوكين ، وما إلى ذلك ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة لمساعدة الجسم على مقاومة الغزو المتفطرة السلية.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ينظم بروتين Mycobacterium tuberculosis توازن الجهاز المناعي ويتجنب الضرر المناعي الناجم عن التنشيط المفرط للاستجابة المناعية للجسم. في السنوات الأخيرة ، ركز البحث والتطوير في مجال لقاحات السل أيضًا بشكل أساسي على تطبيق بروتين المتفطرة السلية ، والذي يمكن أن يعزز مناعة جهاز المناعة البشري من خلال التطعيم ويمنع بشكل فعال حدوث وانتشار مرض السل.

لذلك ، فإن بروتين Mycobacterium tuberculosis مهم جدًا لتأثير المناعة البشرية. من خلال تقوية جهاز المناعة بشكل فعال ، من خلال التمارين المناسبة والتغذية المعقولة ، يمكنك الوقاية بشكل أفضل من مرض السل والأمراض المعدية الأخرى والحفاظ على صحة جيدة. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين مناعتنا. يمكن أن يحسن الكستانش المناعة بشكل كبير لأن السكريات الموجودة في اللحوم يمكن أن تنظم الاستجابة المناعية لجهاز المناعة البشري ، وتحسن قدرة الإجهاد للخلايا المناعية ، وتعزز مناعة الخلايا المناعية. تأثير مبيد للجراثيم.

انقر فوق الملحق cistanche deserticola

3. النتائج

3.1. استرجاع بروتينات M. tuberculosis لبناء لقاح متعدد الحاتمات

لبناء لقاح متعدد الحلقات ضد السل ، قمنا أولاً بتحليل مستضدات البروتينات في M. tuberculosis H37Rv. تم الحصول على ما مجموعه 492 بروتينًا مع خصائص مناعية مثبتة من قاعدة بيانات IEDB ، تم توقع أن تكون 402 بروتينات (81.70 بالمائة) مستضدية. من أجل التوصيف الوظيفي لهذه البروتينات البالغ عددها 492 ، تم إثراء 353 في قاعدة بيانات DAVID ، بينما لم يتم إثراء 139 منها. أظهر تحليل التوطين أن 97 من أصل 353 بروتينًا مخصبًا تم توطينهم في الحيز خارج الخلية ، الفضاء خارج سطح الخلية. تشمل البروتينات المترجمة في الحيز خارج الخلية بروتينات الغشاء الخارجي والبروتينات المفرزة.

من بين 97 بروتينًا ، هناك 49 بروتينات إفراز. كشف التخصيب الإضافي لـ 49 بروتينًا مُفرَزًا أن خمسة بروتينات تم إفرازها في الفضاء خارج الخلية وأن خمسة منها كانت مطلوبة للإمراضية (تم التحقق من صحتها تجريبياً بواسطة BioCyc) [48]. علاوة على ذلك ، عندما تم محاذاة هذه البروتينات العشرة مع إجمالي البروتينات في H. sapiens ، كان نوعان من البروتينات (Mpt83 و Mpt70) متشابهين إلى حد كبير مع بروتينات H. sapiens. لذلك ، اعتبرت البروتينات الثمانية المتبقية التي لا تشبه بروتينات H. sapiens (الجدول 1) مرشحة نهائية لبناء لقاح متعدد الحاتمات.

3.2 التنبؤ بحلقات الخلايا التائية والخلايا البائية للبروتينات المرشحة

قبل التنبؤ الحاتمة ، تم تحديد الببتيدات الإشارة وحذفها من البروتينات المرشحة. تم توقع إجمالي 623 حاتمة CTL من ثمانية بروتينات مرشحة مع 135 رابطًا قويًا (16 من A1 ، و 40 من A2 ، و 22 من A3 ، و 19 من A24 ، و 38 من الأنواع الفائقة B7 من MHC من الدرجة الأولى) بواسطة NetMHCpan {{12} } .1 الخادم (الشكل 2 أ ، ب). من بين 135 ملفًا قويًا ، كان 36 منها مستضديًا وموليًا للمناعة. أخيرًا ، اخترنا 15 من أصل 36 حاتمة CTL وفقًا للمعايير التالية: ثلاثة حاتمات لكل نوع فائق وواحد على الأقل لكل بروتين مرشح (ملاحظة: لم يكن لدى EsxA رابط قوي كان مستضديًا ومولعًا للمناعة) (الجدول 2).

علاوة على ذلك ، توقعنا حواتم HTL الخاصة بهم (معقدات التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية). {0} حلقات Mer من أربعة أليلات (HLA _ DRB و HLA _ DP و HLA _ DQ و H -2- I) مع ترتيب النسبة المئوية أقل من أو يساوي 2. تم اعتبار 0 روابط قوية وتم تصنيفها من أدنى درجة إلى أعلى درجة. كان لأليلات HLA-DR أكبر عدد من روابط MHC II (2990) ، بينما كان لدى HLA-DP أقل عدد (601) (الشكل 2C ، D). وتجدر الإشارة إلى أن الاستجابة المناعية للاضطرابات الورمية الحبيبية مثل السل والجذام والساركويد تهيمن عليها خلايا T-helper المنتجة لـ IFN -1 (Th1) [97]. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت التقارير السابقة أن التعبير عن السيتوكينات Th1 (IFN- و IL2) انخفض في مرضى السل [98]. لذلك ، لتحفيز خلايا Th1 ، توقعنا أن تحفز 15- mer IFN - - ببتيدات هذه البروتينات. تم توقع إجمالي 534 حاتمة ذات نشاط تحفيز IFN باستخدام NetMHCIIpan 4.0 ، منها 315 حاتمة مستضدية. من بين 315 حاتمة ، أظهر 103 نشاطًا قويًا للربط مع أليل HLA واحد على الأقل.

أيضًا ، ينتج عن تعدد الأشكال في أليلات HLA تباين الأليلات ، مما يؤدي إلى خصائص ارتباط ببتيد متميزة على نطاق واسع [55]. نتيجة لذلك ، اخترنا حاتمة واحدة مع أقوى نشاط ربط (الحاتمة الأكثر اختلاطًا) من كل من البروتينات الثمانية المرشحة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف الـ 95 حاتمة المتبقية بناءً على قوة الارتباط ، ثم تم اختيار ثمانية حواتم إضافية ، بحد أقصى حلقتين لكل بروتين مرشح. أخيرًا ، اخترنا 16 من أصل 103 حاتمة HTL وفقًا للمعايير التالية: حاتمة واحدة على الأقل وثلاثة حواتم كحد أقصى لكل بروتين مرشح ، وأقوى نشاط ارتباط لكل بروتين مرشح ، ومعظم المستضدات وتحريض IFN. ثم استخدمناها لبناء هذا اللقاح متعدد الحاتمة (الجدول 2).

أما بالنسبة للتنبؤ الخطي للخلايا الحاتمة ، فقد تم استخدام خادمين (BepiPred2. 0 و ABCpred) وتم الحصول على 166 حلقة. لقد توقعنا مولد الضد في الحلقات الخمسة الأولى لكل بروتين ثم اخترنا عشرة حواتم مستضدية (16- مير ، واحدة على الأقل من كل بروتين مرشح) (الجدول 2).

3.3 بناء لقاح متعدد الحلقات

لبناء لقاح متعدد الحلقات ، تم توصيل حلقات HBHA ، و PADRE ، و 16 HTL (15- mer) ، و 15 CTL ، و 10 حلقات خطية من الخلايا B (16- mer) عبر روابط مناسبة وتم ربطها بواسطة × 6 علامة (الشكل 3). المواد المساعدة هي مكونات مهمة للقاحات يمكن أن تعزز الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية [99]. العديد من البروتينات من المتفطرة السلية لها خصائص مساعدة وقد استخدمت لتصميم اللقاحات [17،27،87،100-105]. أحد أكثرها استخدامًا هو HBHA [100-105] ، وهو محفز مناعي قوي يحفز نضوج الخلايا المتغصنة (DCs) من خلال معالجة TLR4 [105106]. تم العثور على DCs المعالجة بـ HBHA لتنشيط الخلايا التائية الساذجة ، واستقطاب CD4 plus و CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية لإفراز IFN- والحث على السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية [47].

في هذه الدراسة ، وضعنا HBHA كمساعد بروتين في الطرف N لأنه مناسب لبدء تخليق بناء اللقاح من HBHA ، وهو بروتين يحدث بشكل طبيعي. تم وضع HBHA سابقًا في الطرف N لبعض اللقاحات متعددة الرؤوس كمساعد [105،107]. بالإضافة إلى المواد المساعدة ، يمكن لـ PADRE ، وهو آمن للبشر ، أن يعزز بشكل كبير مناعة اللقاح لأنه يرتبط بدرجة عالية من التقارب مع الفئران المتعددة وأليلات MHC-II البشرية ذات التقارب العالي للحث على الاستجابات التي تتوسطها الخلايا [47،62]. تم توصيل HBHA و PADRE بواسطة رابط حلزوني PEAK ، والذي يوفر الصلابة أثناء فصل مكوني البروتين لتعزيز الكفاءة وتقليل التداخل. علاوة على ذلك ، تم تشكيل جسر ملح Glu-Lys داخل الأجزاء مما أدى إلى استقرار الرابط.

نظرًا لأن PADRE يمكن أن يعزز نشاط حواتم لقاح HTL [54] ، فقد وضعنا 16 حاتمات HTL بعد PADRE. تم استخدام رابط GPGPG لربط حواتم HTL ببعضها البعض وبادري لأنه يسهل تقدم الخلايا المناعية وعرض الحاتمة [108،109]. علاوة على ذلك ، يحفز GPGPG استجابة مناعية HTL ، والتي يمكن أن تعطل الاستمناع الوصلي واستعادة مناعة الحواتم الفردية بعد المعالجة [108].

بالنسبة إلى 15 حلقة CTL ، تم ضم الحاتمة الفردية بواسطة رابط AAY ، مما يساعد الحاتمة على إنتاج مواقع مناسبة للارتباط بناقل TAP وتعزيز عرض الحاتمة [47]. علاوة على ذلك ، تم ربط الوحدة الفرعية للحلقة CTL بأكملها بحلقات HTL المنبع عبر رابط HEYGAEALERAG الذي يمتلك خمسة مواقع انقسام مناسبة (A 7- L8 ، A 5- E6 ، Y 3- G4 ، R 10- A11 ، و L 8- E9) ضروريان لأنظمة التحلل البدائية والليزوزومية حقيقية النواة. في حقيقيات النوى ، تعتبر البروتيازومات والليزوزومات أهم آلية لتحلل البروتين ، والتي تستخدم نظام يوبيكويتين-بروتوزوم (UPS) ومسار الالتهام الذاتي ، على التوالي [110].

تم استخدام رابط HEYGAEALERAG أيضًا لربط الوحدة الفرعية الحلقية CTL بحلقات الخلية B الخطية العشرة المرتبطة ببعضها البعض بواسطة روابط KK. وفقًا للدراسات السابقة ، يمنع رابط KK تحريض الأجسام المضادة في تسلسل الأحماض الأمينية الناتج عن الجمع بين الببتيدات ، مما يسهل العرض المحدد لكل ببتيد على الجسم المضاد [111]. أخيرًا ، تم إرفاق علامة His × 6 بالطرف C لآخر حاتمة الخلية B الخطية للتنقية اللاحقة وتوصيف اللقاح (الشكل 3).

يتكون البروتين الكيميري النهائي من 933 بقايا من الأحماض الأمينية ، بدءًا من المادة المساعدة HBHA ، تليها 41 حاتمة ، وتنتهي بعلامة His × 6 (الشكل 3). نظرًا لأن هذا البروتين الخيمري يتكون من مستضدات حلقية متعددة من ثمانية بروتينات ، فقد أطلقنا عليه اسم MTBV8 ، لقاح السل متعدد الحلقات المشتق من 8 بروتينات مرشحة.

3.4. تحليل بارامترات الأنتيجينسيتي ، الحساسية ، الفيزيوكيميائية لـ MTBV8

أثبتت الدراسات السابقة أن المستضدات مطلوبة للقاحات البشرية لاستنباط استجابات مناعية خلطية ، مما يؤدي إلى توليد خلايا ذاكرة موجهة ضد حواتم العوامل المعدية [112]. لذلك ، توقعنا مولد الضد للقاح متعدد الحاتمات MTBV8 باستخدام خادم VaxiJen 2. 0 وحصلنا على مولد الضد 0. 97 ، وهو أعلى بكثير من قيمة العتبة ({{7} } .4) [45،46] يعتبر البروتين البكتيري مستضديًا. والجدير بالذكر أن MTBV8 كان مستضديًا أكثر من جميع البروتينات المكونة (الشكل 4) ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يحفز بشكل فعال الاستجابات المناعية للمضيف

علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن العديد من الجزيئات الميكروبية لديها القدرة على إحداث تفاعلات فرط الحساسية لدى البشر [113]. لتحليل قضية فرط الحساسية لـ MTBV8 والبروتينات المكونة الثمانية ، توقعنا الحساسية لها باستخدام خادم AllerTOP 2. 0. تم توقع أن يكون اثنان من البروتينات المكونة الثمانية (LprA و EspC) من مسببات الحساسية (الجدول 1). وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن اللقاح متعدد الحاتمات المصمم (MTBV8) يحتوي على عشرة حواتم تم الحصول عليها من هذين البروتينين ، إلا أنه من المتوقع أن يكون غير مسبب للحساسية ، مما يشير إلى أن هذا اللقاح آمن.

لتوصيف MTBV8 بشكل أكبر ، قمنا بتحليل خصائصه الفيزيائية والكيميائية من خلال خادم ExPASy ProtParam. يبلغ الوزن الجزيئي للبروتين المؤتلف 94.84 كيلو دالتون ونقطة تساوي الكهرباء 8.91. علاوة على ذلك ، تم اعتبار البروتين مستقرًا بمؤشر عدم استقرار محسوب (II) يبلغ 26.44 (البروتينات ذات مؤشر عدم الاستقرار> 4 0 اعتبرت غير مستقرة) [64]. العمر النصفي المقدر في المختبر هو 3 0 ساعات في الخلايا الشبكية للثدييات ، أطول من الجسم الحي 2 0 ساعة في الخميرة ، وفي الجسم الحي 10 ساعات في الإشريكية القولونية. بالإضافة إلى ذلك ، كان المؤشر الأليفاتي لـ MTBV8 71.91 ، وكان متوسط ​​القيمة الإجمالية للحنان للماء (GRAVY) - 0.32 ، مما يشير إلى أن البروتين المؤتلف كان محبًا للماء. أخيرًا ، كانت قيمة الذوبان النسبي لـ MTBV8 (0.54) أكبر من المتوسط ​​لمجموعة البيانات السكانية (0.45) ، مما يشير إلى أن مرشح اللقاح كان أكثر قابلية للذوبان من نصف بروتينات الإشريكية القولونية [114]. أشارت النتائج أعلاه إلى أن MTBV8 لها خصائص فيزيائية وكيميائية جيدة ومناسبة للاستخدام كلقاح.

3.5 الملف المناعي من MTBV8

لتقييم ملف المناعة المناعي لـ MTBV8 ، قمنا بتحليل الاستجابات المناعية في السيليكو عبر خادم المناعة C-IMMSIM. كما هو مبين في الشكل 5 أ ، تمت زيادة عيار IgM و IgG1 بشكل كبير بعد التحفيز المناعي الثانوي بواسطة MTBV8. علاوة على ذلك ، زاد مستوى الخلايا البائية النشطة وظل عند مستوى مرتفع بعد كل تمنيع (الشكل 5 ب). حتى بالنسبة للخلايا B في البلازما ، بقيت النظائر B IgM و IgG1 مرتفعة بعد التحصين (الشكل التكميلي 1 أ ، ب). بالنسبة للتأثير على الخلايا التائية ، زادت مستويات خلايا الذاكرة Th (y2) (الشكل التكميلي 1C) والخلايا Th النشطة (الشكل 5C) بسرعة بعد التحصين الأولي وتعززت بشكل ملحوظ بعد التحصين الثانوي. تم تحفيز الخلايا التائية التنظيمية (الخلايا النشطة بشكل أساسي) عند التحصين الأولي ثم انخفضت بسرعة (الشكل التكميلي 1 د). ومن المثير للاهتمام أن مستوى الخلايا T (Tc) النشطة السامة للخلايا زاد بسرعة بعد التحصين الأولي ، وظل مرتفعًا في التحصين الثاني ، ثم انخفض بشكل مطرد ، بينما أظهرت الخلايا التائية المريحة الاتجاه العكسي للخلايا Tc النشطة (الشكل 5 د). في المقابل ، ظلت مستويات الخلايا Tc (الشكل 5 د) وخلايا الذاكرة التكميلية (الشكل التكميلي 1E) دون تغيير عند التحصين. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن مستويات العوامل المناعية IFN- و IL -2 التي تفرزها الخلايا التائية الحاسمة للاستجابة المناعية ضد المتفطرة السلية [115] زادت أيضًا بشكل ملحوظ بعد تحصين MTBV8 (الشكل 1). 5E).

علاوة على ذلك ، توقعنا تأثير لقاح MTBV8 على مجموعات الخلايا المناعية الفطرية (الشكل 5F والشكل التكميلي 1FH). زاد تقديم الخلايا -2 في البلدان النامية والضامة بسرعة عند التحصين الأول ، بينما لوحظ زيادة طفيفة فقط بعد التحصين الثاني (الشكل 5F والشكل التكميلي 1G). بالإضافة إلى ذلك ، في البلاعم ، أدى التحصين الأول إلى زيادة أو نقصان في وقت واحد في الضامة النشطة والراحة. بعد أسابيع قليلة من التحصين الثاني ، تناقصت البلاعم النشطة بسرعة بينما زادت الضامة في حالة الراحة بسرعة. (الشكل التكميلي 1G). والجدير بالذكر أن الخلايا القاتلة الطبيعية ومجموعات الخلايا الظهارية النشطة أظهرت نمطًا ثابتًا إلى حد ما عند التحصين. (الشكل التكميلي 1F ، H). مجتمعة ، اقترحت هذه التوقعات أن MTBV8 يمكن أن تحفز بشكل فعال كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية ، مما يجعلها لقاح مرشح فعال محتمل.

3.6 الهياكل الثانوية والثالثية المتوقعة من MTBV8

لتوصيف MTBV8 بشكل أفضل ، توقعنا هياكلها الثانوية والثالثية ، متبوعة بتحسين هيكلها العالي. يتكون الهيكل الثانوي لـ MTBV8 من 42.12 بالمائة من الحلزونات و 11.79 بالمائة من السلاسل و 46.09 بالمائة من الملفات (الشكل التكميلي 2). وفقًا لتوقعات DISOPRED3 ، كان 27.11 بالمائة من بقايا الأحماض الأمينية مضطربة.

تم التنبؤ بالبنية الثلاثية لـ MTBV8 بواسطة خادم I-TASSER ، وتم الحصول على 5 نماذج مع درجات C جيدة. تتراوح الدرجة C بين 5. 0 و 2. 0 وتتناسب مع موثوقية التوقع. خضعت هذه النماذج لتحليل الويب ProSA وتم اختيار النموذج 4 بسبب الخصائص التالية ؛ درجة C=−3.8 ، درجة Z=−4.4. أظهر تحليل مخطط راماشاندران لهذا الهيكل الثلاثي أن أقل من 7. 0 0 في المائة من المخلفات كانت في مناطق مفضلة ، وبالتالي ، يلزم مزيد من التحسين للبنية الثلاثية.

تم تحسين البنية الثلاثية التي حصلت عليها I-TASSER بواسطة خادم ModRefiner ، متبوعًا بخادم GalaxyRefine لإنشاء خمسة نماذج. من بين النماذج الخمسة المحسّنة ، كان للنموذج 2 أفضل بنية عند النظر في المعلمات التالية: اختبار المسافة العالمية دقة عالية (0. 89) ، RMSD (0. 58) ، MolProbity (2.31) ، صراع النتيجة (14.8) ، درجة rotamer ضعيفة ({{1 0}}. 80) ودرجة مؤامرة Ramachandran (86. 5٪) (الشكل 6 أ). كشف تحليل مؤامرة راماشاندران لهذا الهيكل باستخدام PROCHECK أنه من بين 753 من المخلفات غير الجليسينية وغير البرولين وغير النهائية ، كان 78.9 في المائة منها في المنطقة الأكثر ملاءمة [A ، B ، L] ، 17.3 في المائة كانت في بالإضافة إلى المنطقة المسموح بها [a ، b ، l ، p] ، و 1.5 بالمائة في المنطقة المسموح بها عمومًا [a ، b ، ∼l ، p] ، مع 2.4 بالمائة فقط في المنطقة غير المسموح بها (الشكل 6 ب). عند تحليل مخطط Ramachandran للهيكل المكرر باستخدام Molprobity ، وجدنا أن 86. 5 في المائة من بقايا الأحماض الأمينية كانت موجودة في المنطقة المفضلة ، والتي كانت هي نفسها التي حصل عليها خادم GalaxyRefine (الشكل 6 ج) . علاوة على ذلك ، كانت 98.0 بالمائة من المخلفات في المنطقة المسموح بها ، بينما كانت 19 من البقايا ذات القيم المتطرفة (phi ، psi) (الشكل 6C). على الرغم من أن النموذج المكرر يحتوي على المزيد من المخلفات في المنطقة المفضلة مقارنة بالنموذج الذي تم إنشاؤه بواسطة I-TASSER ، إلا أنه يحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة.

يعد التحقق من صحة النموذج خطوة أساسية في عملية بناء النموذج حيث يمكنه تحديد الأخطاء المحتملة في النماذج ثلاثية الأبعاد المتوقعة [116]. للتحقق من صحة النموذج المكرر من MTBV8 ، تم إجراء تحليلات ProSA-web ، و ERRAT. أظهر تحليل الويب ProSA درجة Z-5.76 لـ MTBV8 (الشكل 6D) ، والتي كانت خارج نطاق الدرجات المحدد تجريبياً للبروتينات ذات الحجم المماثل. ومع ذلك ، أظهر تحليل ERRAT عامل جودة إجمالي قدره 70.94 لـ MTBV8 المكرر. نظرًا لأن درجة ERRAT التي تزيد عن 50 تمثل نموذجًا جيدًا للجودة [117] ، فإن النتيجة 70.94 تشير إلى أننا نتمتع بثقة عالية في البنية النموذجية للتحليل اللاحق.

3.7 الالتحام الجزيئي لـ MTBV8 مع مستقبلات الخلايا المناعية

ينتج التقارب القوي للقاحات لمستقبلات الخلايا المناعية استجابة مناعية مستقرة [118]. لاكتساب نظرة ثاقبة على التفاعلات المحتملة بين MTBV8 ومستقبلات الخلايا المناعية ، أجرينا الالتحام الجزيئي بين MTBV8 والمستقبل المناعي TLR4 (الشكل 7 أ و ب). أظهرت الدراسات السابقة أن روابط TLR4 يمكنها تنشيط DCs ، والتي بدورها تنشط الخلايا التائية الساذجة ، وتستقطب الخلايا التائية بشكل فعال (خلايا CD4 plus و CD8 plus) لإفراز IFN- وتحفيز السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية [106]. ستؤدي هذه العمليات إلى زيادة مجموعة خلايا ذاكرة المستجيب [119]. نظرًا لأن تفاعل TLR4 مع الببتيدات المستضدية يؤدي إلى استجابات ضد عدوى السل ، فقد ركزنا على التفاعلات بين MTBV8 و TLR4 (الشكل 7 أ). أظهرت نتائج الالتحام الجزيئي من Firedock أن النموذج المكرر المفضل لديه طاقة عالمية تبلغ - 40.28 ، طاقة فان دير فالس جذابة (aVdW) تبلغ - 19. 86 ، طاقة طاردة (حمراء) تبلغ 2.19 ، طاقة ملامسة ذرية 4.70 ومساهمة رابطة الهيدروجين (HB) - 1.03 (الشكل 7 ب). بالإضافة إلى ذلك ، توقع Prodigy طاقة ربط بين TLR4 و MTBV8 تبلغ 8.6 كيلو كالوري / مول. أشارت النتائج أعلاه إلى أن MTBV8 له صلة قوية بـ TLR4 ، مما يمكنه من توليد استجابة مناعية مستقرة.

3.8 محاكاة الديناميات الجزيئية

تم استخدام المحاكاة الديناميكية الجزيئية لتحليل حركة الذرات في اللقاح [120]. يكشف تشوه السلسلة الرئيسية إلى أي مدى يمكن للجزيء أن يتشوه عند كل بقايا مكونة. أشارت المناطق ذات التشوه العالي إلى موضع سلسلة "المفصلة" (الشكل 7C) ، وتم الحصول على العامل B التجريبي من بنك بيانات PDB المقابل بينما تم إجراء الحساب بضرب تنقل NMA بمقدار 8 نقطة في البوصة ^ 2 (الشكل 7 د) ). قيمة eigenvalue المخصصة لكل وضع عادي هي مقياس لتصلب الحركة ، والذي يرتبط ارتباطًا مباشرًا بطاقة التشوه للهيكل بأكمله. تتناسب قيمة eigenvalue طرديًا مع سهولة التشوه (الشكل 7E). يتناسب التباين في كل وضع عادي عكسياً مع القيمة الذاتية. الفروق الفردية ملونة باللون البني بينما الفروق التراكمية ملونة باللون الأخضر) (الشكل 7F). في مصفوفة التغاير ، يوجد اقتران بين أزواج من البقايا ، وتم عرض حركات مترابطة (حمراء) وغير مرتبطة (بيضاء) ومضادة (زرقاء) (الشكل 7G). تمثل شبكة المرونة أزواجًا من الذرات متصلة بواسطة زنبركات ، وتمثل كل نقطة زنبركًا بين أزواج متقابلة من الذرات. يدل لون النقاط على صلابتها. توضح النقاط الرمادية الداكنة الينابيع الأكثر صلابة والعكس صحيح (الشكل 7H). اقترحت محاكاة الديناميكيات الجزيئية باستخدام خادم iMODS أن مجمع الالتحام بين MTBV8 و TLR4 كان مستقرًا.

3.9 في silico الأمثل واستنساخ MTBV8

تخليق البروتين شرط أساسي لنشاطه [121]. تمشيا مع هذا ، فإن زيادة كفاءة النسخ والترجمة للقاح ضرورية لإفراط في التعبير في خلايا الإشريكية القولونية عبر البلازميد pET28a المتكاثر ذاتيًا (زائد) [1 0 3]. تم تحقيق التحسين من خلال مؤشر Codon Adaptation Index (CAI) البالغ 0.99 ، ومحتوى GC (54.81 بالمائة) بين 30 بالمائة و 70 بالمائة ، والتي تعتبر بشكل عام مواتية للتعبير عن البروتين في المضيف. يمكن استنساخ جزء الحمض النووي لـ mtbv8 في ناقل pET -28 (زائد) بين مواقع تقييد NcoI و XhoI باستخدام SnapGene لتوليد pET -28 a (plus) -mtbv8 مؤتلف بلازميد (الشكل التكميلي S1) .3).

4. مناقشة

4.1 ظهور لقاحات متعددة الحاتمة ضد السل

التطعيم هو الطريقة الأكثر موثوقية لمكافحة عدوى السل. لسنوات عديدة ، حدد العلماء العديد من اللقاحات المرشحة الواعدة التي يمكن أن تحل محل BCG ، لقاح السل الوحيد المعتمد [8100122-125]. في الآونة الأخيرة ، حظيت لقاحات السل المؤتلفة باهتمام متزايد. أثبتت العديد من اللقاحات المؤتلفة فعاليتها في التجارب قبل السريرية والسريرية ، بما في ذلك ID93 / GLA-SE الذي يتكون من أربعة لقاحات مرشحة Rv2608 (عائلة PE / PPE) ، Rv1813 (معبرًا عنها تحت الضغط / نقص الأكسجة) ، ESXV ، و ESXW ، والتي تعد واعدة في تجارب الفئران قبل السريرية [122]. بالنسبة للتجارب السريرية ، كان GamTBvac ، الذي تم الحصول عليه بدمج Ag85a و ESAT 6- CFP10 ، ناجحًا في تجارب المرحلة الأولى [125] ، في حين أن M72 ، الذي يتكون من اثنين من المرشحين [Mtb39A (PPE18) و Mtb32A] ، حقق فاعلية كبيرة في المرحلة الثاني المحاكمات [123].

تشير التجارب الناجحة لهذه اللقاحات المؤتلفة إلى الفاعلية الأكبر للقاحات المرتكزة على الحاتمة التي تدمج ببساطة الخصائص المناعية لبروتينات مرشحة مختلفة في بروتين اصطناعي [124]. والجدير بالذكر أن العديد من لقاحات الوحيدات الفرعية لمرض السل قد تم اشتقاقها من عدد كبير من اللقاحات المرشحة ، وقد ظهرت كمرشحين يحتمل أن يكونوا جذابين في دراسات النماذج الحيوانية [100]. على سبيل المثال ، تسبب MP3RT ، وهو مرشح لقاح السل متعدد الببتيد المكون من ستة ببتيدات HTL المناعية ، في إحداث مستويات أعلى بكثير من IFN- و CD3 بالإضافة إلى IFN- بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية التائية ووحدات تشكيل مستعمرة أقل (CFUs) في الرئة والطحال من الفئران المتوافقة مع البشر. الفئران البرية [8]. من الآن فصاعدًا ، أدى البحث من أجل فعالية أكبر في هذه اللقاحات إلى إثراء البروتينات المرشحة المحتملة.

علاوة على ذلك ، البروتينات التي تفرزها المتفطرة السلية تم أخذها بعين الاعتبار في تصميم MTBV8 (الجدول 1) ، لأنها مهمة لتسبب مرض السل وفوعة [126]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لبعض البروتينات المفرزة من الطبقات الخارجية لخلايا المتفطرة السلية أن تعمل كمستضدات مفيدة. على سبيل المثال ، تم تنقية EsxA و EsxB من كبسولة M. tuberculosis [127] وقد تورط الاحتفاظ بـ EsxA في الكبسولة في السمية الخلوية [128]. بالإضافة إلى ذلك ، مطلوب EsxA لسلامة جدار الخلية البكتيرية [129]. بشكل عام ، تحتوي البروتينات المفرزة على أسطح مكشوفة بشكل كافٍ بحيث تكون أهدافًا للاستجابات المناعية للمضيف [130131].

4.2 التحفيز المحتمل لجهاز المناعة الفطري بواسطة MTBV8

يتضمن الفحص بحثًا عن حاتمة في البروتينات المرشحة تنشيط الجهاز المناعي الفطري متبوعًا بالتعرف على المستضد بواسطة الخلايا الليمفاوية لأن كلا العاملين مطلوبان للتنشيط اللاحق لجهاز المناعة التكيفي [50]. للاستجابة الفطرية ، يعد تكوين مركب مستقر بين MTBV8 (بمساعدة محفز TLR4 HBHA كمساعد) و TLR4 من DC (الشكل 5F) مهمًا لأن روابط TLR4 يمكنها تنشيط DCs ويمكن تنشيط DCs بدوره تستقطب الخلايا التائية الساذجة خلايا CD4 plus و CD8 plus T بشكل فعال لإفراز IFN- ، وتحفز السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية [106] وبالتالي زيادة مجموعة خلايا الذاكرة المستجيبة [119].

من المحتمل أن يكون هذا المركب قد ساهم في زيادة عدد خلايا الذاكرة (y2) في الخلايا الليمفاوية B (الشكل التكميلي 1A) والخلايا الليمفاوية (الشكل التكميلي 1C) مقارنة بالخلايا غير الذاكرة. التحفيز المناعي بواسطة MTBV8 يمكن مقارنته بالتحفيز الذي تم الحصول عليه مع اللقاحات الأخرى ضد السل [33،37،39] والأمراض الأخرى [27،62،107،124،132]. وألمح هذا إلى اتساق آلية لقاح الحاتمة المتعددة.

4.3 التحفيز المحتمل لجهاز المناعة التكيفي بواسطة MTBV8

الخلايا الليمفاوية B و T هي الخلايا المستجيبة الأولية التي تنسق الاستجابات المناعية التكيفية من خلال المناعة الخلطية أو الخلطية عن طريق التعرف على أجزاء من مسببات الأمراض الغازية ، والتي يشار إليها باسم المستضدات [50]. للحث على استجابة مناعية تكيفية خلطية ، قمنا بدمج حواتم الخلايا البائية عالية الدرجات (الجدول 2) للتعرف عليها وتدميرها بواسطة الأجسام المضادة التي يتم التعبير عنها وإفرازها بواسطة الخلايا الليمفاوية البائية [50،133]. قد يؤدي تحفيز الخلايا اللمفاوية البائية النشطة (الشكل 5 ب) ، ومعظمها إفراز الخلايا البائية IgM- و IgG 1- (الشكل التكميلي 1 أ) ، إلى إفراز مفرط لـ IgM و IgG1 (الشكل 5 أ).

قد يكون لارتفاع مستضد اللقاح (الشكل 4) آثار مهمة لتعزيز استجابات الجسم المضاد (الشكل 5 أ). في الواقع ، تعتمد الاستجابات المناعية الخلوية اعتمادًا كبيرًا على قدرة الخلايا التائية على التعرف على المستضدات [134]. لتحقيق ذلك ، اخترنا حواتم CTL و HTL القوية والمستضدية القوية المرتبطة بـ MHC (الجدول 2) ، والتي عززت استقرار الببتيد: مجمع MHC (pMHC) ، وهو العامل الرئيسي الذي يتحكم في مناعة الببتيد MHC [135] ويلعب دورًا في تحضير خلايا CD8 plus و CD4 plus T بواسطة DC ، مما يؤدي إلى استجابات الخلايا اللمفاوية التائية (الشكل 5C ، الشكل التكميلي 1C) [136].

إن دمج الوصلات المناسبة وأوليجوببتيدات اصطناعية (PADRE و HEYGAEALERAG) وتحديد الموضع الدقيق لكل مكون يمكن أن يسهل عملية الحاتمة وعرضها (الشكل 3). نظرًا لاختلاف الأليل بين البشر ، اخترنا حواتم CTL بناءً على التعرف على أليلات MHC-I لأعراق بشرية رئيسية الجدول التكميلي 1 (الجدول 2) ، وتم اختيار حواتم HTL المختلطة بعد فحص خصائص تحفيز IFN واستضداد.

4.4. آفاق تطوير MTBV8

هذا في تصميم لقاح السيليكو هو مؤشر مناسب في مراحل الفرز من حيث تخليق وفعالية اللقاحات المرشحة. للتوليف ، كشفت تنبؤاتنا أنه يمكن تصنيعه في نظام الإشريكية القولونية ، ومع ذلك ، يمكن أيضًا النظر في أنظمة أخرى مثل خلايا الحشرات والثدييات إذا واجهت الأنظمة القائمة على الإشريكية القولونية صعوبات. التحقق المخبري الرطب هو المرحلة التالية في تأكيد اللقاحات المرشحة بعد دراسات السيليكو. تم استخدام هذه الطريقة بشكل فعال في بعض اللقاحات المرشحة ، والتي تم تصميمها أيضًا أولاً في السيليكو وثبت لاحقًا فعاليتها في المرحلة التجريبية [137].

5. الخلاصة

يتمثل أحد الدعم الرئيسي لهدف التنمية المستدامة لمنظمة الصحة العالمية من أجل القضاء التام على السل في الحصول على لقاح فعال للوقاية من عدوى السل المتفطرة. أظهرت الدراسات السابقة أن اللقاحات الخيمرية متعددة الحاتمات يمكن أن تستغل الخصائص المناعية / المستضدية لبروتينات معينة لتعزيز الفعالية المناعية. في هذه الدراسة ، استخدمنا نهجًا في السيليكو لتصميم لقاح كيميري (MTBV8) من خلال دمج 41 حاتمة مختلطة مشتقة من ثمانية بروتينات مستضدية يفرزها M. tuberculosis H37Rv. تم توقع أن تكون MTBV8 مستقرة وقابلة للذوبان وآمنة ومستضدية عالية ومناعة.

أظهر تحليل المعلوماتية المناعية أن MTBV8 أظهر تقاربًا جيدًا لمستقبل الخلايا المناعية الرئيسية TLR4. الأهم من ذلك ، أن تحفيز التطعيم ضد MTBV8 يمكن أن يزيد بشكل كبير من مستويات الخلايا البائية والخلايا التائية ومجموعات الخلايا المناعية الفطرية ويحفز إنتاج الغلوبولين المناعي (IgG1 و IgM وما إلى ذلك) بالإضافة إلى عوامل المناعة (IFN- و IL {{6) }}، إلخ). يعتبر اللقاح متعدد الحاتمات MTBV8 معًا مؤشرًا ذا صلة في مرحلة تصميم اللقاحات المضادة للسل وقد يصبح حجر الزاوية المحتمل في تحقيق "استراتيجية القضاء على السل".

بيان مساهمة التأليف الائتماني

Binda T. Andongma: التصور ، المنهجية ، البرمجيات ، الكتابة - المسودة الأصلية. Yazheng Huang: تنظيم البيانات ، البرمجيات. فانغ تشن: البرمجيات والتصور. تشينغ تانغ: معالجة البيانات ، التحليل الرسمي. مين يانغ: البرمجيات والتصور. شان هو تشو: الكتابة - مراجعة وتحرير. Xinfeng Li: التصور ، المنهجية ، البرمجيات ، اقتناء التمويل. جين هي: الإشراف ، الكتابة - المراجعة والتحرير ، الاستحواذ على التمويل.

إعلان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل الوارد في هذه الورقة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32200026 ، 31900057) ، والصناديق المفتوحة لمختبر الدولة الرئيسي لعلم الأحياء الدقيقة الزراعية (AMLKF202108) ، ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (2019M662654).

الملحق أ. المعلومات الداعمة

يمكن العثور على البيانات التكميلية المرتبطة بهذه المقالة في الإصدار عبر الإنترنت على doi: 10.1016 / j.csbj.2023.01.019.

مراجع

[1] Boineau R و Domanski M و Troutman C و Anderson J و Johnson G و Mcnulty SE و Clappchanning N و Davidson-ray LD و Fraulo ES و Fishbein DP وآخرون. الأميودارون أو مقوم نظم القلب ومزيل الرجفان القابل للزرع لفشل القلب الاحتقاني. نيو إنجل J ميد 200 ؛ 352 (3): 225-37.

[2] Khoshnood S، Heidary M، Haeili M، Drancourt M، Darban-sarokhalil D، Nasiri MJ، Lohrasbi V. لقاح جديد مرشح ضد Mycobacterium tuberculosis. إنت J بيول ماكرومول 2018 ؛ 120 (نقطة أ): 180-8.

[3] Kyu HH و Maddison ER و Henry NJ و Ledesma JR و Wiens KE و Reiner R et al. العبء العالمي والإقليمي والوطني لمرض السل ، 1990-2016: نتائج دراسة العبء العالمي للأمراض والإصابات وعوامل الخطر لعام 2016. لانسيت إنفيكت ديس 2018 ؛ 18 (12): 1329–49.

[4] منظمة الصحة العالمية (2022). تقرير السل العالمي. 〈https: // www. من. int / منشورات / i / item / 9789240061729〉.

[5] Mirzayev F، Viney K، Linh NN، Gonzalez-Angulo L، Gegia M، Jaramillo E، Zignol M، Kasaeva T. توصيات منظمة الصحة العالمية بشأن علاج السل المقاوم للأدوية ، تحديث 2020. يور ريسبير J 2021 ؛ 57 (6): 2003300.

[6] أحمد خان ف ، فوكس جي ، مينزيس د. السل المقاوم للأدوية. نيويورك: دليل Springer المقاومة لمضادات الميكروبات ؛ 2017. ص. 263 - 86.

[7] ميتشيسون د ، ديفيس ج. العلاج الكيميائي لمرض السل: الماضي والحاضر والمستقبل. إنت J تيوب لونج ديس 201 ؛ 16 (6): 724-32.

[8] Gong W و Liang Y و Mi J و Jia Z و Xue Y و Wang J و Wang L و Zhou Y و Sun S و Wu X. لقاح قائم على الببتيدات يحفزه MP3RT ضد عدوى السل المتفطرة في نموذج فأر متوافق مع البشر . الجبهة إمونول 2021 ؛ 12: 1-19.

[9] Lange C، Aaby P، Behr MA، Donald PR، Kaufmann SHE، Netea MG، Mandalakas AM. 100 عام من بكتيريا Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin. لانسيت إنفيكت ديس 2022 ؛ 22 (1): e2-12.

[10] Glaziou P ، Floyd K ، Raviglione MC. وبائيات السل العالمية. سيمين ريسبير كريت كير ميد 2018 ؛ 39 (3): 271-85.

[11] إرنست دينار. آليات التهرب المناعي لمرض السل كتحديات لتصميم لقاح السل. ميكروب مضيف الخلية 2018 ؛ 24 (1): 34-42.

[12] ينظم كل من Li X و Chen F و Liu X و Xiao J و Andongma BT و Tang Q و Cao X و Chou SH و Galperin MY و He J. Clp البروتياز والحمض النووي الريبي المضاد للحساسية المنظم العالمي CarD للتوسط في استجابة الجوع الفطري. eLife 2022 ؛ 11: 1–22.

[13] Liu CH ، Liu H ، Ge B. المناعة الفطرية في مرض السل: دفاع المضيف مقابل تجنب العوامل الممرضة. خلية مول إمونول 2017 ؛ 14 (12): 963-75.

[14] استجابات خلايا Elvang T و Christensen JP و Billeskov R و Hoang TTKT و Holst P و Thomsen AR و Andersen P و Dietrich J. CD4 و CD8 T لمرض السل Ag85B-TB10.4 الذي تم الترويج له بواسطة الوحدة الفرعية المساعدة ، adenovector أو التطعيم غير المتجانسة الأولية. بلوس وان 200 ؛ 4 (4): e5139.

[15] Rossjohn J ، Gras S ، Miles JJ ، Turner SJ ، Godfrey DI ، مكلوسكي J. T التعرف على مستقبلات مستضد الخلايا التائية من جزيئات تقديم المستضد. Annu Rev Immunol 2015 ؛ 33: 169-200.

For more information:1950477648nn@gmail.com