تأثير تعديل مسار إشارات مستقبلات الهيدروكربون في أريل على النسخ المتماثل لفيروس جونين ، الجزء 1

خلاصة:

فيروس Junín (JUNV) ، أحد أفراد عائلة Arenaviridae ، هو العامل المسبب للحمى النزفية الأرجنتينية ، وهو مرض متوطن في المنطقة الريفية بالأرجنتين يفتقر إلى العلاج الكيميائي المحدد. يتم التعبير عن مستقبل أريل الهيدروكربوني (AHR) في العديد من أنسجة الثدييات وقد تمت الإشارة إليه كمستشعر للروابط من مصادر متغيرة ومعدِّل للاستجابة المناعية للخلية.

فيروس Junin هو فيروس نادر يؤثر على جهاز المناعة البشري ويسبب استجابة مناعية شديدة. ومع ذلك ، فإن المناعة ليست هي الإستراتيجية الوحيدة التي فشلت في محاربة فيروس جونين.

أولاً ، الحصول على قسط كافٍ من الراحة والنوم مهم للحفاظ على صحة الجهاز المناعي. أثناء النوم ، يطلق الجسم مواد تسمى السيتوكينات التي تساعد جهاز المناعة على الاستجابة بشكل أكثر فعالية للفيروسات والتهديدات الخارجية الأخرى.

ثانيًا ، عادات الأكل الصحية هي أيضًا مفتاح تحسين المناعة. يمكن أن يساعد تناول الأطعمة الغنية بالفيتامينات C و D ، مثل الحمضيات والفطر ، في تعزيز الاستجابة المناعية لجسمك.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي التمارين المعتدلة أيضًا إلى تحسين المناعة. يمكن أن يؤدي التمرين المناسب إلى زيادة عدد خلايا الدم البيضاء في الجسم ، وبالتالي تعزيز قدرة جهاز المناعة.

أخيرًا ، تعد الحالة العقلية الجيدة مهمة جدًا أيضًا لصحة جهاز المناعة. يمكن أن يؤثر التوتر والقلق على الاستجابة المناعية للجسم ، لذلك من المهم أن تظل مسترخيًا وإيجابيًا.

باختصار ، على الرغم من أن فيروس Junin له تأثير على جهاز المناعة ، فمن خلال تحسين نمط حياتنا والحفاظ على موقف إيجابي ، يمكننا تحسين مناعتنا ومنع هجمات الفيروسات والرد عليها بشكل فعال. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين مناعتنا. يمكن أن يحسن الكستانش المناعة بشكل كبير ، لأن رماد اللحوم يحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة بيولوجيًا ، مثل السكريات ، واثنين من عيش الغراب ، وهوانغ لي ، وما إلى ذلك. يمكن لهذه المكونات أن تحفز جهاز المناعة أنواعًا مختلفة من الخلايا في النظام ، وتزيد من نشاطها المناعي.

انقر فوق الملحق cistanche deserticola

ومن المثير للاهتمام أن الدراسات الحديثة قد أشارت إلى أن تنشيط أو تثبيط مسار إشارات AHR قد يلعب دورًا في نتيجة العدوى الفيروسية البشرية المتنوعة. في هذا التقرير ، تم تحليل تأثير التعديل الدوائي لـ AHR على عدوى المختبر في JUNV. أظهر فحص ميكروأري الأولي أن مسار AHR كان مفرطًا في التعبير عن الخلايا الكبدية المصابة بـ JUNV.

بالتزامن مع ذلك ، تم منع إصابة خلايا Vero و Huh -7 بسلالات JUNV IV4454 و Candid # 1 بشكل كبير بطريقة تعتمد على الجرعة عن طريق العلاج بـ CH223191 ، وهو مضاد AHR محدد ، كما تم اكتشافه بواسطة فحوصات العدوى ، وقت RT-PCR والكشف عن التألق المناعي للبروتينات الفيروسية. علاوة على ذلك ، يبدو أن الدور المؤيد للفيروسات لـ AHR في عدوى JUNV مستقل عن مسار IFN-I. تدعم النتائج التي توصلنا إليها وجهات النظر الواعدة للتعديل الدوائي لـ AHR كهدف محتمل للسيطرة على AHF.

الكلمات الدالة:

مستقبلات أريل الهيدروكربونية ؛ فيروس جونين أرينا. الحمى النزفية الأرجنتينية الهدف العلاجي المضيف.

1 المقدمة

حاليًا ، هناك أدلة متزايدة تدعم أن مستقبلات هيدروكربون أريل (AHR) هي مُعدِّل مهم للاستجابة المناعية للمضيف وتساهم هذه الميزة في النتائج السريرية التفاضلية للعدوى على مستوى الفرد والسكان [1،2]. AHR هو مستقبل حشوي يتم التعبير عنه في كل مكان في أنسجة الثدييات ، ويعمل كمستشعر لمجموعة متنوعة من الروابط الداخلية والخارجية ذات الأصول المختلفة مثل الملوثات ، والنظام الغذائي ، والميكروبيوم ، واستقلاب المضيف [3-5].

في الواقع ، لقد تم اقتراح أن AHR له تأثير كبير على التفاعل بين العوامل البيئية والالتهابات الفيروسية [1،2]. بمجرد أن يتعرف AHR على جزيء ligand ، فإنه ينتقل إلى النواة حيث يتجانس مع الناقل النووي لمستقبل الهيدروكربون aryl وينظم التعبير عن جينات التمثيل الغذائي للأجانب الحيوية (CYP1A1 ، CYP1A2 ، CYP1B1).

يمكن أن تتفاعل AHR أيضًا مع عوامل النسخ الأخرى ، مثل NF-kB ، لتعديل مجموعة واسعة من مسارات الإشارات ، بما في ذلك تلك المشاركة في الاستجابة المناعية [6-8]. يمكن لـ AHR تعديل التعبير عن الجينات المنظمة للمناعة وتغيير مسارات التمايز للخلايا التغصنية الالتهابية والخلايا التائية [9-11].

أظهرت الدراسات الحديثة التي أجرتها مجموعتنا البحثية أن تنشيط مسار إشارات AHR يلعب دورًا مؤيدًا للفيروسات خلال زيكا (ZIKV) ، وحمى الضنك (DENV) ، [12] والمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة فيروسات التاجية 2 (SARS-CoV {{ 4}}) الالتهابات [13]. ملاحظة ، تم التأكيد على أن تثبيط AHR أدى إلى تناقص التكاثر الفيروسي في هذه النماذج الفيروسية ، مما يدل على أن AHR يمثل استراتيجية واعدة مضادة للفيروسات.

فيروس Junín (JUNV) هو فيروس جينوم RNA مجزأ مغلف من عائلة Arenaviridae [14]. يشفر كل مقطع RNA لبروتينين في اتجاهين متعاكسين. من ناحية ، يشفر الجزء الكبير (L RNA) لبوليميراز RNA المعتمد على RNA (L) وبروتين المصفوفة (Z).

من ناحية أخرى ، يشفر الجزء الصغير (S RNA) للبروتين النووي (NP) ولسلائف البروتين السكري (GPC) ، والتي يتم تشققها بواسطة البروتياز لإنتاج ثلاث وحدات فرعية (GP1 ، GP2 ، إشارة الببتيد SSP) التي هي تماسك معًا لتكوين مركب البروتين السكري [14].

JUNV هو العامل المسبب للحمى النزفية الأرجنتينية (AHF) [15] ، وهو مرض متوطن يصيب السكان الريفيين في منطقة بامبا الرطبة في الأرجنتين. لاحظ أن السمة المميزة لـ AHF هي النطاق الواسع للأعراض السريرية التي يقدمها المرضى المصابون. يحدث المرض غير المصحوب بأعراض أو مرض خفيف ، مع أعراض تشبه أعراض الأنفلونزا ، في 70-80 في المائة من العدوى. ومع ذلك ، فإن الحالات الشديدة تنطوي على مضاعفات نزفية وعصبية مع معدل وفيات يتراوح من 20 إلى 30 بالمائة في المرضى في المستشفى [15].

الأهم من ذلك ، أثبت لقاح حي موهن اسمه Candid # 1 أنه فعال للغاية في الوقاية من الحالات الشديدة من AHF [15،16]. ومع ذلك ، فإن العلاج الوحيد المتاح ضد المرض هو إعطاء البلازما المناعية من مرضى النقاهة. علاج ثبت أنه يقلل من عدد الحالات المميتة فقط إذا تم إعطاؤه في غضون 8 أيام بعد ظهور الأعراض الأولى [17].

على الرغم من أنه تم في السنوات الأخيرة جمع العديد من الأدلة حول تأثير AHR أثناء العدوى ، لا يوجد حتى الآن دليل واضح على دوره أثناء عدوى فيروس arenavirus [2].

نظرًا لأن سكان الريف يتعرضون باستمرار لروابط AHR ، مثل الملوثات من الصناعة الزراعية مثل الكيماويات الزراعية ، ومبيدات الآفات ، والمنتجات الثانوية لاحتراق الوقود الأحفوري [18] ، قمنا في هذا العمل بتقييم تأثير التعديل الدوائي AHR في المختبر على الاستجابة الخلوية لعدوى JUNV والاستخدام المحتمل لـ AHR كهدف مرشح للتدخل العلاجي في مرض AHF.

2. المواد والأساليب

2.1. خطوط الخلية

تم استخدام خطوط الخلايا التالية: Huh -7 (JCRB Cell Bank # 0403) و HepG -2 ATCC HB8065 ، سطرين من الخلايا السرطانية المشتقة من خلايا الكبد البشرية ؛ Vero ATCC CCL -81 ، خط خلية طلائية للكلى مشتق من القرد. تمت زراعة كل خط خلية في الوسيط الأساسي الأدنى من Eagle (MEM) (Gibco ، ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مكملًا بنسبة 5 في المائة من مصل العجل حديثي الولادة (NBCS) (Gibco ، ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) واستكمل مع 50 ميكروغرام / مل جنتامايسين (سيغما الدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 1 ملي بيروفات الصوديوم (سيغما الدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 2 ملي L- الجلوتامين (جيبكو ، ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ومخزنة مع HCl / NaHCO3. تمت زراعة خطوط الخلايا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 في المائة.

2.2. السلالات الفيروسية

تم استخدام السلالات الفيروسية التالية: سلالة IV4454 الموهنة طبيعياً التي تم الحصول عليها من حالة بشرية خفيفة من AHF [19] وسلالة Candid # 1 المضعفة باللقاح [20]. تم استخدام خلايا فيرو على حد سواء لتوليد مخزون الفيروس ومعايرة الفيروس من خلال مقايسة البلاك القياسية.

تم إجراء جميع الأعمال المتعلقة بالعوامل المعدية في مرافق السلامة الحيوية من المستوى 2 وتمت الموافقة عليها من قبل مكتب الصحة والسلامة البيئية في كلية العلوم ، جامعة بوينس آيرس. تم تطعيم جميع الأفراد المشاركين في إجراءات العدوى باستخدام Candid -1 المقدم من Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr.JI Maiztegui (Pergamino ، بوينس آيرس ، الأرجنتين).

2.3 تحليل ميكروأري

تم زرع ما مجموعه 5 × 1 0 5 خلايا HepG2 في قوارير استزراع 25 سم 2 وإصابتها بـ JUNV IV4454 بتعددية عدوى (MOI) 1 أو مصابة بالعدوى الوهمية. تم استخراج الحمض النووي الريبي وتنقيته باستخدام RNAeasy (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) في 24 و 48 ساعة بعد الإصابة (pi). تم قياس تركيزات الحمض النووي الريبي باستخدام Nanodrop. تم وصف ملامح التعبير الجيني لخلايا HepG2 باستخدام تحليل ميكروأري (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips) لتحديد جينات المضيف التي تنظم نسبيًا عن طريق العدوى.

تم حساب العدد الإجمالي للجينات المضيفة التي تم تنظيمها بشكل كبير عن طريق العدوى لكل نقطة زمنية عن طريق تحديد الجينات التي أظهرت ، على الأقل ، 1. 6- أضعاف التغيير في التعبير واحتمال 95 في المائة للتعبير عنها بشكل تفاضلي (p {{ 3}} 05).

تم استخدام برنامج WebGestalt (http://www.webgestalt.org ، الذي تم الوصول إليه في 3 يوليو 2020) ، والذي يستخدم قاعدة بيانات Wikipathways لتحليلات التمثيل الزائد للمسار. تم إجراء تجارب مكررة في أيام مختلفة (عدد=3 تجارب مستقلة لكل حالة).

2.4 مركبات الجزيئات الصغيرة

المضاد التنافسي التركيبي الخاص بـ AHR CH223191 ، 1- Methyl-N - [2- methyl 4- [2- (2- methyl phenyl) diazenyl] phenyl] { تم إذابة {9}} H-pyrazole -5- carboxamide (Tocris Bioscience ، Bristol ، المملكة المتحدة) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) واستخدامه بتركيز 1.25 و 2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 و 80 ميكرومتر.

كان مستقلب التربتوفان L-kynurenine (2S) -2- Amino -4- (2- aminophenyl) -4- oxobutanoic acid (Sigma-Aldrich، St. يذوب في DMSO ويستخدم بتركيز 2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 و 80 و 160 و 320 ميكرومتر.

تم إجراء جميع المعالجات في غياب الضوء ، بالنظر إلى أن المركبات تحتوي على حساسية للضوء.

2.5 فحوصات جدوى الخلية

لتحديد صلاحية الخلية ، تمت زراعة الطبقات الأحادية لخلايا Vero و Huh -7 في 96 طبقًا جيدًا لمدة 24 ساعة في MEM 5 بالمائة NBCS. تمت معالجة الطبقات الأحادية الخلية عند التقاء 90 بالمائة بتركيزات مختلفة من CH223191 (1.25 ميكرومتر إلى 80 ميكرومتر) والكينورينين (5 ميكرومتر إلى 320 ميكرومتر) لمدة 72 ساعة. تم التعامل مع Mock بنفس تركيز DMSO كأكبر جرعة من علاج الترابط واعتبرت 100٪ من حيوية الخلية.

تم إجراء جميع العلاجات في أربع مرات. تم تقييم صلاحية الخلية من خلال 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- yl) -2 ، 5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) (Sigma-Aldrich، St لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم قياس الامتصاصية عند 570 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة FLUOstar OPTIMA. تم تحديد نسبة بقاء الخلية من خلال جعل نتائج امتصاص العلاج نسبية باستخدام قيم الامتصاصية الوهمية.

بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة قدرة النمو والتشكل للخلايا المعالجة تحت المجهر الضوئي. تم التقاط الصور في 72 ساعة باستخدام مجهر Nikon Eclipse TS1 0 0 ؛ التكبير: 100 × ؛ غير متوفر: 0.25.

2.6. العلاجات والالتهابات الفيروسية

تمت معالجة الطبقات الأحادية للخلية فيرو وهوه {0}} مسبقًا باستخدام CH223191 والكينورينين المخفف في MEM بنسبة 1.5 في المائة من NBCS لمدة ساعة أو 24 ساعة على التوالي عند 37 درجة مئوية. تم استخدام CH223191 بتركيزات تتراوح بين 1.25 و 20 ميكرومتر ، بينما تم استخدام كينورينين بتركيزات تتراوح بين 5 و 80 ميكرومتر. بعد ذلك ، تم إجراء عدوى فيروسية إما بسلالة IV4454 أو Candid # 1 في وزارة الداخلية بمقدار 0.5. بعد ساعة واحدة ، تمت إزالة اللقاح وتعريض الخلايا لكلا المركبين لمدة 48 ساعة بالتركيزات المذكورة. في 48 ساعة ، تم جمع المواد الطافية لفحص البلاك وتمت معالجة الطبقات الأحادية الخلية إما من أجل التألق المناعي غير المباشر أو RT-qPCR.

2.7. التألق المناعي غير المباشر

تم إصلاح -7 الطبقات الأحادية المعالجة بـ CH223191 أو kynurenine والمصابة بـ JUNV كما هو مذكور أعلاه عند 48 ساعة من الميثانول لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية ، وغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتخزينها في برنامج تلفزيوني طازج عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة.

تم استخدام الأجسام المضادة التالية: الأجسام المضادة الأولية وحيدة النسيلة للفأر المضادة لـ NP (1: 200) (NA 05- AG12) [21] والأجسام المضادة الثانوية المقترنة من Alexa Fluor 488 (1: 200) (A {{ 10}}) (ThermoFisher Scientific، Waltham، MA، USA). كانت نوى الخلية ملطخة بـ 40 ، 6- ديميدينو -2- فينيليندول (DAPI) (1: 1000) (سيغما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على بيانات الفحص المجهري والتصوير الفوتوغرافي باستخدام مجهر أوليمبوس IX71 الفلوري مع كاميرا QImaging Exi-Aqua مرفقة (حجم البكسل: 6.45 ميكرومتر ؛ منطقة جهاز الكشف الضوئي: 1392 × 1040 بكسل 2).

تم إجراء القياس الكمي لبيانات التألق باستخدام برنامج Fiji (الإصدار 1.53v) (المعاهد الوطنية للصحة ، Bethesda ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء عمليات القياس الكمي اليدوية للنواة الملطخة بـ DAPI والخلايا الإيجابية NP يدويًا من خلال المكون الإضافي لعداد الخلايا المتضمن في برنامج Fiji (الإصدار 1.53v). اعتبرت الخلايا إيجابية إذا أمكن اكتشاف تلطيخ مستضد فيروسي NP. تم التعبير عن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية NP كنسبة بين الخلايا الإيجابية NP والخلايا الإجمالية في كل حقل ثم تم تحديد النسبة المئوية المتوسطة وعرضها.

تم الحصول على شدة التألق للخلايا الإيجابية NP عن طريق قياس متوسط ​​القيمة الرمادية للخلايا الفردية وطرح مضان الخلفية. تم تحديد البؤر الفيروسية من خلال النظر في مجموعات الخلايا الإيجابية NP المحاطة بخلايا NP سلبية. تم عد البؤر الفيروسية على 3 صور مختلفة من 3 حقول مختلفة تم اختيارها عشوائيًا وتم تحديد متوسط ​​حجم البؤر بعدد الخلايا التي تكونها.

2.8 كشف الحمض النووي الفيروسي

تم إجراء استخلاص الحمض النووي من طبقات أحادية الخلية المصابة باستخدام مجموعة Highway ADN / ARN PuriPrep-VIRUS K1501 (Inbio Highway ، Buenos Aires ، Argentina) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء الحمل الفيروسي لـ JUNV RNA وتقدير النصوص الخلوية بواسطة RT-qPCR. تم إجراء النسخ العكسي باستخدام الاشعال العشوائي ونسخة عكسية لفيروس سرطان الدم Moloney Murine (M-MLV RT).

لتضخيم الأجزاء ، تم استخدام البادئات التالية: JUNV-np (إلى الأمام: 5 0 - GGC ATC CTT CAG AAC ATC -30 ، عكسي: 50 - CGC ACA GTG GAT CCT AGGC {{4} }) ، ahr (إعادة توجيه: 50 - ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC -30 ؛ عكسي: 50 - CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG -30) ​​، cyp1a1 ( أمامي: 50 - TTCCGACACTCTTCCTTCGT -30 ؛ عكسي: 50 - ATGGTTAGCCCATAGATGGG -30) ، -اكتين (إعادة توجيه: 50 - TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG {{17 }} ؛ عكسي: 50 - TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT -30). كانت تفاصيل دورة PCR على النحو التالي: التجريد الأولي 2 دقيقة عند 95 درجة مئوية ؛ 45 دورة تضخيم تتكون من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 58 درجة مئوية ، ودقيقة عند 72 درجة مئوية ؛ دورة نهائية مدتها 5 دقائق عند 72 درجة مئوية ؛ أخيرًا ، تم إجراء منحنيات الانصهار. تم إجراء الكشف باستخدام معدات MyiQ2 (مختبرات Bio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الإبلاغ عن النتائج على أنها 2 − Ct (تغيير طية) وتم تطبيعها باستخدام -actin كجين التدبير المنزلي.

2.9 فحص البلاك

تم تحديد الغلة الفيروسية بواسطة مقايسة اللويحة القياسية. تم جمع المواد الطافية للخلايا وتم تحضير التخفيفات التسلسلية لإصابة طبقات خلية Vero الأحادية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الامتزاز الفيروسي ، تمت إزالة اللقاح ، MEM 5 في المائة من NBCS مكمل بـ 0. تمت إضافة 7 في المائة ميثيل سلولوز وحضنت الخلايا لمدة أسبوع واحد عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، تم إصلاح الطبقات الأحادية الخلوية بنسبة 10 في المائة من الفورمالديهايد ، وغسلها وصبغها بالبنفسجي الكريستالي. تم حساب العيار الفيروسي بعد تقدير وحدة تشكيل البلاك (PFU).

2.10. تحليل احصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي للميكروأري باستخدام برنامج WebGestalt (http: // www. webgestalt.org/ ، تم الوصول إليه في 3 تموز (يوليو) 2 0 2 0). تم وصف البيانات على أنها تعني ± SD أحادية الاتجاه ANOVA مع اختبار Dunnett اللاحق بواسطة GraphPad Prism 8 (الإصدار 8.0.1) لنظام التشغيل Windows 11 (برنامج GraphPad ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) تم إجراؤه لتقييم الأهمية الإحصائية. ص أقل من أو يساوي 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية.

For more information:1950477648nn@gmail.com