تصميم لقاح ببتيد جديد متعدد التكافؤ متعدد الوحدات يستفيد من المناعة المتقاطعة ضد داء الليشمانيات الحشوي والجلدي البشري: نهج قائم على المعلوماتية المناعية

خلاصة

السياق داء الليشمانيات هو مجموعة من الأمراض المعدية المنقولة بالنواقل والتي يسببها أكثر من 20 نوعًا من الليشمانيا المسببة للأمراض والتي تتوطن في العديد من البلدان الاستوائية وشبه الاستوائية. إن ظهور سلالات مقاومة للأدوية، والآثار الجانبية الضارة للأدوية المضادة لليشمانيا، وغياب استراتيجية التطعيم الوقائية، يهدد السكان الحساسين. في الآونة الأخيرة، استغلت مجموعات عديدة من الباحثين مجال اللقاحات العكسية لتطوير اللقاحات، مع التركيز بشكل أساسي على تحفيز المناعة ضد داء الليشمانيات الحشوي أو الجلدي.

cistanche tubulosa - مضاد للالتهابات

طُرقيتضمن هذا العمل الحالي استرجاع اثني عشر تسلسلاً من بروتينات مستضدات الليشمانيات تم التحقق من صحتها تجريبيًا من قاعدة بيانات UniProt، متبوعة بتنميط مولدات المضادات باستخدام خوادم ANTIGENpro وVaxijen 2.0. تم التنبؤ بحلقات ربط MHC لنفسها باستخدام خوادم NetCTL 1.2 وSYFPEITHI، بينما تم حساب الحلقات للخلايا B باستخدام خوادم ABCpred وBepiPred 2.0. تم استخدام الحواتم التي تم فحصها ذات الدرجات الأعلى بشكل ملحوظ لتصميم بناء اللقاح باستخدام الروابط المناسبة والمواد المساعدة الطبيعية. تم تحديد الهياكل الثانوية والثالثية للببتيد الاصطناعي بواسطة الحقول العشوائية الشرطية والشبكات العصبية الضحلة ومحاذاة خيوط الملف الشخصي مع محاكاة تجميع البنية التكرارية، على التوالي. تم التحقق من صحة نموذج اللقاح 3-D من خلال التحسين الذي تم اختباره بواسطة CASP10- وخادم الويب MolProbity. تم إجراء الالتحام الجزيئي ومحاكاة تحليل الوضع الطبيعي متعدد النطاق لتحليل أفضل مجمع لقاح TLR. أخيرًا، كشفت نتائج المحاكاة المناعية الحسابية عن استجابات مناعية خلوية وخلطية واعدة، مما يشير إلى أن الببتيد الخيميري المُصمم هندسيًا هو لقاح محتمل واسع النطاق ضد داء الليشمانيات الحشوي والجلدي.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

الكلمات المفتاحية داء الليشمانيات · اللقاحات العكسية · TLR · لقاح متعدد الحواتم · المحاكاة الديناميكية الجزيئية · نمذجة التماثل

مقدمة

داء الليشمانيات هو مجموعة من الأمراض الطفيلية التي تسببها أعضاء مختلفة من جنس الليشمانيا، وهو كائن أولي طفيلي ثنائي الشكل داخل الخلايا [1]. يؤثر داء الليشمانيات على معظم السكان بسبب الوضع الاجتماعي والاقتصادي المنخفض في البلدان الاستوائية وشبه الاستوائية في جميع أنحاء العالم [2]. وهو مرض ينقل بالنواقل، وتنتقل الطفيليات عن طريق عض أنثى ذباب الرمل الفاصدة المصابة (منظمة الصحة العالمية، 2019). وفقًا لأحدث التقارير الصادرة عن منظمة الصحة العالمية، فإن 700، 000 إلى مليون حالة جديدة وحوالي 26، 000 إلى 65، 000 حالة وفاة تحدث سنويًا (منظمة الصحة العالمية، 2019). في شرق أفريقيا، تحدث حالات تفشي داء الليشمانيات الحشوي بشكل متكرر. يمثل إقليم شرق المتوسط ​​70% من حالات داء الليشمانيات الجلدي في جميع أنحاء العالم (منظمة الصحة العالمية، 2019). وفي عام 2017، حدثت 20,792 حالة من أصل 22,145 (94%) حالة جديدة أُبلغت بها منظمة الصحة العالمية في سبعة بلدان: البرازيل، وإثيوبيا، والهند، وكينيا، والصومال، وجنوب السودان، والسودان (منظمة الصحة العالمية، 2017). ونظرًا للسيناريو المثير للقلق، ينبغي أيضًا التأكيد على تدابير مكافحة المرض والقضاء عليه في بلدنا. لداء الليشمانيات مجموعة متنوعة من المظاهر السريرية، وهناك ثلاثة أشكال رئيسية للمرض: الحشوي (المعروف أيضًا باسم الكالازار وهو الشكل الأكثر خطورة للمرض)، والجلدي (الأكثر شيوعًا)، والجلدي المخاطي (منظمة الصحة العالمية، 2019). . تشير الأدلة على الشفاء الذاتي في حالات قليلة من داء الليشمانيات الجلدي (CL) والمناعة الناتجة عن إعادة العدوى إلى النطاق المحتمل للتطعيم كوسيلة مجدية للسيطرة على داء الليشمانيات خلال الفترة [3]. ومع ذلك، حتى الآن، لا يوجد لقاح مرخص ضد داء الليشمانيات البشري. على الرغم من أن بعض اللقاحات المرشحة المحتملة قد تقدمت إلى مرحلة التجارب السريرية، إلا أن العديد منها لا يزال في مرحلة البحث والتطوير المبكرة [4]. يعد توليد لقاحات الببتيد مجال بحث سائد وواعد في هذا المجال. على النقيض من الطفيليات الحية أو الموهنة أو لقاحاتها القائمة على الوحدات الفرعية، تتمتع الببتيدات الاصطناعية بالعديد من المزايا التي تشمل عدم وجود مواد ضارة محتملة، وانخفاض تعقيد المستضد، واستقرار جيد، وانخفاض تكلفة التوسع [1، 5]. يتطلب تطوير لقاحات جديدة رؤى أعمق في علم المناعة، والبيولوجيا الجزيئية، والهندسة الكيميائية. ولذلك، يعمل العلماء في جميع هذه المجالات جنبًا إلى جنب لتصميم وإنتاج لقاحات آمنة وفعالة [6]. يجب أن يثير اللقاح المثالي ضد داء الليشمانيات مناعة طويلة الأمد واستجابة مناعية متوازنة TH-1 وTH-2- بوساطة [4، 7]. يعد النهج القائم على المعلوماتية المناعية لتصميم مثل هذا اللقاح المرشح الجديد بمثابة استراتيجية أحدث تستخدم في المقام الأول أدوات حسابية للتنبؤ بلقاح الببتيد متعدد الوحدات المستقر هيكليًا والمناعي خلال فترة زمنية قصيرة. كانت البروتينات التي وُجد في المقام الأول أنها تتمتع بميزات مناعية ضرورية لمنح المناعة ضد المرض في الدراسات المناعية السابقة التي تتضمن نماذج حيوانية تجريبية أو غيرها من تحليلات السيليكو، هي أفضل المرشحين المحتملين للحاتمة [1، 8-10]. من بين البروتينات قيد التحقيق، يعد بروتين LACK (مستضد C-كيناز المنشط بالليشمانيا) بروتينًا محفوظًا للغاية عبر أنواع الليشمانيا، ويعتبر لقاحًا مرشحًا قابلاً للتطبيق ضد داء الليشمانيات البشري [11]. لقد ثبت أنه هدف رئيسي للاستجابة المناعية لدى الفئران الحساسة BAL b/c [12]. KMP -11 (بروتين غشاء الحركية -11) موجود في جميع الأوليات الحركية ويعتبر أيضًا مرشحًا محتملاً للقاح يظهر أنه يزيد مستويات IL-10 في نماذج الفئران، مما يشير إلى إمكاناته المناعية [13]. الليشمانوليسين، أو GP63، هو بروتيناز سطحي تم افتراضه كعامل ضراوة يشارك في التفاعل المباشر للطفيلي مع مستقبل البلاعم المضيف [14]. تم العثور على البروتينات الغشائية LCR1 وGP46 أيضًا لزيادة إنتاج الإنترفيرون جاما، وبالتالي تعتبر مفيدة في تطوير لقاح عام ضد عدوى الليشمانيا [5، 15]. بروتينات الصدمة الحرارية (HSPs) هي جزيئات محفوظة بدرجة عالية وتتمتع بدرجة عالية من المناعة لتحفيز مسارات MHC-I وMHCII للمناعة التكيفية ويُعتقد أن لها دورًا وثيق الصلة في تطوير لقاح ضد داء الليشمانيات المعدي [16]. يتم التعبير عن بروتين الليشمانيا السطحي المحب للماء-B (HASP-B) فقط في الطفيليات المعدية مما يشير إلى دور في فوعة الطفيليات، وبالتالي مرشح محتمل للقاح [17]. تعد بروتينات قضيب بارافاجيلار (PFR) الحركية أيضًا ذات أهمية علاجية ووقائية نظرًا لتوزيعها التطوري المحدود وتنظيمها عالي الترتيب ومناعتها العالية [18]. وبالمثل، تعمل بروتياز السيستين والبروتيوفوسفوجليكان أيضًا كعوامل فوعة أساسية للطفيليات في مضيفات الثدييات، كما أنها أهداف دوائية جذابة لداء الليشمانيات [19-21]. علاوة على ذلك، تم وصف بروتين بيتا توبولين سابقًا أيضًا على أنه مستضد محفز للخلايا التائية من الليشمانيا، على الرغم من أن فعاليته كمرشح لقاح لم تتم تجربته بعد [22]. يعتبر بيتا توبولين L. donovani أيضًا هدفًا دوائيًا محتملاً ضد داء الليشمانيات الحشوي [23]. وأخيرًا، تبين أن بروتين عامل الترجمة eIF5A من L. braziliensis يحفز الحماية غير المتجانسة ضد داء الليشمانيات في الحيوانات عند إعطائه كلقاح مع بروتين مؤتلف آخر. يزيد من إفراز السيتوكينات الخاصة بالطفيليات في الحيوانات المحصنة. يتم حفظ بروتين eIF5A أيضًا في جميع حقيقيات النوى [24]. في وقت سابق، خاتون وآخرون. وصف النهج القائم على المعلوماتية المناعية لتصميم لقاح الببتيد متعدد الوحدات ضد داء الليشمانيات الحشوي (VL) من خلال استكشاف البروتينات الإفرازية لـ L. donovani [6]. هنا، قمنا باختيار مستضدات الليشمانيات المختلفة عبر مختلف الأنواع المعدية من الطفيلي. وفي الوقت نفسه، تم بالفعل تحديد جميع هذه البروتينات (إما عن طريق الدراسات على الحيوانات في المختبر أو باستخدام الأدوات الحسابية) لتحفيز الاستجابة المناعية، وإثارة المناعة الوقائية. تنتمي تسلسلات البروتين المختارة إلى أي من الأنواع الخمسة المسببة للأمراض من الليشمانيا، وهي الليشمانيا الكبرى، والليشمانيا المكسيكية، والليشمانيا دونوفاني، والليشمانيا شاغاسي، والليشمانيا الأمازونية، ومن بينها الليشمانية دونوفاني هي الطفيلي الرئيسي المسبب لداء الليشمانيات الحشوي (VL)، بينما والبعض الآخر مسؤول بشكل أساسي عن التسبب في داء الليشمانيات الجلدي (CL) أو داء الليشمانيات الجلدي المخاطي (MCL). كان الأساس المنطقي وراء اختيار هذه الأنواع المتنوعة من البروتينات المحفوظة والمناعة عبر أنواع مختلفة من الليشمانيا هو تصميم لقاح ببتيد عام من شأنه أن يمنح مناعة متقاطعة واسعة النطاق ضد كل من أشكال داء الليشمانيات (VL وCL) التي تؤثر عادة على البشر .

ماذا يفعل عشب سيستانش – مضاد-التهابي

المواد والأساليب

اختيار واسترجاع تسلسل البروتين المستضد الليشمانيا

تم استرداد تسلسل الأحماض الأمينية الكاملة لاثني عشر بروتينًا مستضدًا خاصًا بالليشمانيا من قاعدة بيانات Uniprot (موارد البروتين العالمي) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) بتنسيق FASTA (تم الوصول إليه في 21.{{16} }3.2022). كما ذكرنا سابقًا، تم الإبلاغ عن جميع هذه البروتينات على أنها مرشحة للقاحات مناعية ومحفوظة للغاية ومحتملة، كما هو موجود في الدراسات المناعية السابقة التي تتضمن نماذج حيوانية أو طرق التنبؤ الحسابية بالسيليكو. تم حساب مولد الضد للبروتينات المحددة من خلال استخدام خادم ANTIGENpro (//scratch.proteomics.ics.uci.edu/) الذي يحسب مولد الضد لتسلسل بروتين الإدخال عن طريق استغلال مصنف ثنائي المرحلة قائم على SVM تم التحقق من صحته بعشرة أضعاف نهج التحقق من الصحة [25]. تم بعد ذلك إخضاع البروتينات لتحليل الببتيد للإشارة باستخدام خادم SignalP 4.1 (SignalP — 4.1 — Services — DTU Health Tech) من أجل التمييز بين البروتينات الإفرازية الكلاسيكية وغير الإفرازية (عبر الغشاء). تتضمن هذه الطريقة التنبؤ بمواقع الانقسام وتوقع الببتيد الإشارة / الببتيد غير الإشارة بناءً على مزيج من عدة شبكات عصبية اصطناعية [26]. تم إجراء تنبؤات التوطين لجميع البروتينات بعد ذلك باستخدام DeepLoc (DeepLoc—1.0—Services—DTU Health Tech)، وهي خوارزمية خالية من القوالب تستخدم شبكات عصبية عميقة للتنبؤ بالتوطين دون الخلوي للبروتين باستغلال معلومات التسلسل فقط، وتحقيق دقة جيدة [27]. تم بعد ذلك إخضاع جميع تسلسلات البروتين الوظيفية، كما تم الحصول عليها من خادم SignalP 4.1، للتنبؤ بوجود محددات المستضد (الحواتم) التي سيتم التعرف عليها بواسطة مستقبلات الخلايا B وT. تم القيام بذلك للتأكد من أن بنية اللقاح المصممة تحتوي فقط على الخلايا التائية المهيمنة مناعيًا وحواتم الخلايا البائية، وبالتالي، ستكون قادرة على تحفيز استجابة مناعية فعالة تتضمن المسارات الخلطية والمسارات الخلوية لآليات المناعة.

التنبؤ بحلقة الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL).

يعد التنبؤ بحاتمة الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) جانبًا أساسيًا في تصميم الببتيد المثالي [28]. تم استخدام خادم ويب يمكن الوصول إليه مجانًا، وهو NetCTL1.2 (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL)، للتنبؤ بحلقات CTL لجميع البروتينات المحددة. تدمج الطريقة التنبؤ بربط الببتيد MHC من الدرجة الأولى، والانقسام الطرفي البروتيزومي C، وكفاءة نقل TAP [29]، وكلها ميزات أساسية يجب أن تمتلكها سلسلة من الحاتمة المرتبطة بـ CTL. يسمح الخادم بالتنبؤ بحلقات CTL المقيدة بـ 12 نوعًا فائقًا من MHC من الفئة الأولى، ومن بينها النوع الفائق A1 فقط الذي تم استخدامه في الدراسة الحالية. يتم إجراء الربط والانقسام البروتيزومي من الدرجة الأولى باستخدام الشبكات العصبية الاصطناعية. يتم التنبؤ بكفاءة نقل TAP باستخدام مصفوفة الوزن [29]. تعتبر التسلسلات ذات درجات الارتباط الأعلى حلقات CTL قوية. بالإضافة إلى NetCTL 1.2، تم أيضًا الاستفادة من نهج آخر قائم على خادم الويب متاح للجمهور، وهو SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)، للتنبؤ بحلقات CTL من جميع بروتينات الليشمانيا المختارة. تعتمد التوقعات على العناصر المنشورة وتأخذ في الاعتبار الأحماض الأمينية الموجودة في مواقع التثبيت والمثبت المساعد والأحماض الأمينية المتكررة الأخرى [30]. من قائمة أنواع MHC المتوفرة في هذا الخادم، تم اختيار HLA-A*01 وHLA-A*02:01 وHLA-A*03 للتنبؤ. تم تحديد بحث الحلقة للتسلسلات غير الاسمية لإجراء مقارنة موحدة مع النتائج المقدمة من خادم NetCTL 1.2. تم اختيار الحواتم المشتركة فقط من كل بروتين (إن وجدت)، والتي تم التنبؤ بها بواسطة خوادم NetCTL 1.2 وSYFPEITHI ذات الدرجات الأعلى المتوافقة، لبناء اللقاح النهائي.

التنبؤ بحلقة الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة (HTL).

تعد الخلايا الليمفاوية التائية المساعدة أهم الخلايا المناعية لأنها مطلوبة في جميع أنواع الاستجابات المناعية التكيفية. وبالتالي، يصبح التنبؤ بحلقات HTL (بشكل أساسي من النوع Th-1) عنصرًا أساسيًا لتصميم لقاح الببتيد الفعال. في الدراسة الحالية، تم استخدام أداة تحليل MHC-IIbinding في خادم IEDB (قاعدة وتحليل بيانات Immuno Epitope Datan) (http://tools.iedb.org/mhcii/) للتنبؤ بـ 15-mer HTL الحواتم لمجموعة من ثلاثة أليلات بشرية، وهي HLA-DRB1*01:01، HLADRB1*01:02، وHLA-DRB1*01:03. تم اختيار أليلات HLA البشرية لإجراء تقدير أكثر واقعية لتقارب الحواتم MHC-II أثناء تصميم اللقاح ضد داء الليشمانيات البشري. يتم إعطاء الإخراج المتوقع في وحدات IC50nM للمكتبة التوافقية ومحاذاة SMM. ولذلك، يشير الرقم الأقل إلى تقارب أعلى. تم استخدام طريقة التنبؤ الموصى بها من IEDB في هذا النهج حيث يشير الترتيب المنخفض المعدل إلى وجود روابط MHC-II مناسبة، وبالتالي يمكن تعريفها على أنها حلقات HTL قوية.

تحديد واختيار حلقات HT المحفزة للسيتوكينات

للسيتوكينات أهمية كبيرة في حسن سير عمل الجهاز المناعي. يمكن لبطارية من السيتوكينات مثل IL-2، وIL-4، وIL-6، والإنترفيرون- أن تحفز الاستجابات المناعية الخلطية بوساطة CTL [31]. ومن ثم، فإن الحواتم HTL التي يمكن أن تؤدي إلى إنتاج السيتوكينات هي الأفضل لتصميم لقاح وقائي مناعي. من خلال هذا العرض، تم استخدام خادم IFNepitope (http://crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) لتحديد حلقات HTL التي تتمتع بقدرات محفزة للسيتوكينات. IFNepitope هو خادم تنبؤ عبر الإنترنت يهدف إلى التنبؤ بالببتيدات من تسلسلات البروتين التي يمكن أن تحفز IFN-gamma المنطلق من خلايا CD4+ T. تم تطوير خادم الويب على أساس مجموعة بيانات تشتمل على مجلدات من الدرجة الثانية تحفز IFN-gamma وغير محفزة لـ MHC [32]. تم توفير حلقات HTL التي تنبأ بها خادم IEDB مع ارتباطات ربط MHC-II أعلى (الرتب المعدلة الأقل) كمدخلات للتحقق من قدرتها على إنتاج السيتوكينات بواسطة خادم IFNepitope. تم بعد ذلك إخضاع الحلقات التي تم تحديدها إلى المستوى التالي من التحليل بواسطة خادم IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in) وأيضًا بواسطة خادم IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3 .php) من أجل التأكد من أن حلقات HTL المحددة ستثير أيضًا إفراز IL-4 وIL-10، على التوالي. كما أنهم يأخذون في الاعتبار أيضًا الحفاظ الموضعي لبقايا الأحماض الأمينية وتكوين الأحماض الأمينية للحمض الأميني. الببتيدات للتنبؤ أكثر دقة [33، 34]. تم اختيار حلقات HTL الملزمة لـ MHC-II والتي من المتوقع أن تكون إيجابية بواسطة جميع الخوادم الثلاثة لدمجها في البنية النهائية للقاح. تم اعتماد هذه الإستراتيجية لتحسين فعالية اللقاح لأنه يمكن أن يحفز استجابة مكثفة تتضمن مجموعة واسعة من السيتوكينات (IFN-gamma، IL-4، و IL-10)، مما يؤدي إلى مناعة سريعة وطويلة الأمد.

تحليل الحفاظ على الحاتمة

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (افتراضي).

تصميم تسلسل لقاح متعدد الحلقات

استنادًا إلى تحليل المعلومات المناعية، تم إنشاء تسلسل أولي للقاح الوحدة الفرعية من خلال دمج تسلسلات الحاتمة CTL وHTL المحددة. تم ربط هذه الحواتم معًا بواسطة روابط AAY وGPGPG، على التوالي [28، 31]. يتم إدخال الروابط للفصل الصحيح بين الحواتم الفردية المطلوبة للعمل الفعال لبنية اللقاح [28، 36]. ثانيًا، تعد إضافة مادة مساعدة مناسبة أمرًا بالغ الأهمية في لقاح الوحدة الفرعية لتعزيز الاستجابة المناعية [31]. يعد اختيار المادة المساعدة المناسبة أمرًا أساسيًا في تصميم اللقاحات للتجارب البشرية. يعد IL-12 الذي تنتجه الخلايا المناعية المختلفة ضروريًا لتطوير مناعة خلوية ضد داء الليشمانيات، وقد تم الإبلاغ عن إمكانات IL-12 كمساعد في اللقاحات ضد داء الليشمانيات في نماذج الفئران [3، 37، 38]. تم اختيار IL-12 هذا كمساعد لتصميم اللقاح، وتم تضمين تسلسله في الطرف N الخاص ببناء اللقاح باستخدام رابط EAAK [28، 31]. تم استرداد تسلسل سلسلة ألفا IL-12 البشرية من قاعدة بيانات Uniprot (www.uniprot.org؛ رقم الوصول P29459). أخيرًا، تم الحصول على تركيبة لقاح الببتيد التي تحتوي على حلقات مساعدة، ورابط، وحلقات CTL، وحلقات HTL (مع روابط AAY وGPGPG داخل الحلقة) في تسلسل ينتقل من الطرف N إلى الطرف C.

التنبؤ بحلقة الخلية B المطابق والخطي

تتضمن المناعة الخلطية تخليق وإفراز أجسام مضادة محددة بواسطة الخلايا البائية المنشطة، الأمر الذي يتطلب وجود محددات مستضدية تتعرف عليها مستقبلات الخلايا البائية الموجودة على سطح الخلايا الليمفاوية البائية. يجب أن يحتوي لقاح الببتيد المثالي للوقاية من المناعة على مثل هذه المكونات من أجل التفاعل مع الخلايا البائية وبالتالي تحفيزها. لذلك، تم تطبيق خادمين، وهما ABCpred وBepiPred 2.0، للتنبؤ الدقيق بحلقات الخلية B في التسلسل الأولي للقاح المصمم. خادم ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) هو أسلوب قائم على الشبكة العصبية الاصطناعية (ANN) يتنبأ بحلقات الخلايا البائية في تسلسل مستضد معين باستخدام معلمات الطول الثابت. تحتوي مجموعة بيانات التدريب المستخدمة في هذه الطريقة على حلقات الخلية B من قاعدة بيانات حلقة الخلية B (BCIPEP). الخادم قادر على التنبؤ بالحواتم بدقة 65.93% باستخدام شبكة عصبية متكررة [39]. تم توفير التسلسل الأولي لبناء اللقاح النهائي كمدخل بتنسيق عادي، وتم استخدام المعلمات الافتراضية لخادم ABCpred، بما في ذلك قيمة عتبة 0.51 مع طول نافذة يبلغ 16 بقايا حمض أميني، من أجل التنبؤ. من ناحية أخرى، يتنبأ خادم BepiPred 2.0 (BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech) بحلقات الخلية B المتسلسلة من تسلسل إدخال بواسطة خوارزمية غابة عشوائية مدربة على الحلقات و الأحماض الأمينية غير الحاتمية التي يتم تحديدها من الهياكل البلورية متبوعة بتنعيم التنبؤ المتسلسل [40]. تم توفير التسلسل الأولي للقاح بتنسيق FASTA كمدخل. إن تطبيق خادمين مختلفين يتنبأان بحلقات الخلية B بناءً على خوارزميتين مختلفتين يجعل التنبؤ أكثر واقعية. معظم محددات المستضدات التي يتعرف عليها مستقبل الخلية البائية والأجسام المضادة متقطعة، مما يعني أنها تحتوي على بقايا أحماض أمينية تقع بعيدًا في البنية الأولية للمستمنع ولكنها تجاور بعضها البعض أثناء طي البروتين [41]. تم التنبؤ بحلقات الخلايا البائية المتقطعة هذه في البنية الثلاثية المعتمدة للقاح من خلال استخدام خادم ElliPro (http://tools.iedb.org/ellip ro/) المدمج في بوابة IEDB. ElliPro هي أداة ويب يمكن الوصول إليها مجانًا وتطبق طريقة Thronton المعدلة وتأخذ في الاعتبار مركز كتلة كل بقايا بدلاً من ذرات C. يؤدي القيام بذلك إلى ربط كل من الحواتم بدرجة معينة محددة على أنها PI (مؤشر النتوء) متوسطًا على بقايا الحاتمة. يتم تحديد الحواتم المتقطعة بناءً على قيم PI الخاصة بها ويتم تجميعها بناءً على المسافة بين مراكز كتلة البقايا (R). ترتبط القيم الأكبر لـ R بالحواتم المتقطعة الأكثر أهمية التي يتم التنبؤ بها [42]. وفي الوقت نفسه، يمكن أيضًا التنبؤ بحلقات الخلية B الخطية في نموذج بروتين الإدخال وتصورها باستخدام ElliPro. يضمن اكتشاف حلقات الخلايا البائية الخطية والمتقطعة في النموذج ثلاثي الأبعاد المكرر للقاح استراتيجية ناجحة لتصميم اللقاح.

تحديد خصائص المستضادة والحساسية والسمية في بناء اللقاح

تعد المستضدات معيارًا أساسيًا للقاح الوقائي المناعي. للتأكد من أن بنية اللقاح المصممة ستثير استجابة مناعية طويلة الأمد من خلال التفاعل مع مستقبلات الخلايا B وT، تم تقييم مولد الضد باستخدام خوادم ANTIGENpro وVaxiJen 2.0. يقوم خادم ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) بتصنيف 82% من المستضدات الوقائية المعروفة بشكل صحيح عند تدريبه باستخدام مجموعات بيانات ميكروأري البروتين فقط. تُقدر دقة مجموعة البيانات المجمعة بنسبة 76% من خلال تجارب التحقق المتبادل بعشرة أضعاف والتي تتيح التعرف بشكل أفضل على الببتيدات المستضدية. إنه يعمل على بنية ذات مرحلتين، بما في ذلك مصنف المرحلة الثانية القائم على SVM. بالنسبة لتسلسل بروتين الإدخال الجديد، فإن الاحتمالية المحسوبة بواسطة توقع المرحلة الثانية SVM هي النتيجة النهائية للتنبؤ بـ ANTIGENpro [25]. VaxiJen2.0 (http://www.dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) هو خادم ويب آخر يمكن الوصول إليه بشكل عام ويقوم بتقييم مولد الضد لتسلسل البروتين من خلال منهج خالٍ من المحاذاة يعتمد على على تحويل التباين المتبادل التلقائي (ACC) لتسلسلات البروتين إلى نواقل موحدة لخصائص الأحماض الأمينية الرئيسية ويسمح بتصنيف المستضد فقط بناءً على الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة للبروتين دون الإشارة إلى محاذاة التسلسل [43]. ثانيًا، من أجل استبعاد أي احتمال بأن يؤدي بناء اللقاح إلى استجابة حساسية لدى الفرد، تم استخدام خادم AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) لـ تحديد مدى حساسيته. توفر أداة الخادم مجموعة متنوعة من الأساليب، بما في ذلك رسم خرائط حلقات IgE، ونموذج MEME/MAST، وطريقة SVM المستندة إلى تكوين ثنائي الببتيد، وBLAST ARPs، والتي يتم استغلالها جميعًا للتنبؤ الدقيق. تم تعيين العتبة عند 0.4 (افتراضي) للحصول على دقة تنبؤ أعلى. بالإضافة إلى ذلك، تم أيضًا تطبيق AllerTop v.2.{{20}} (https://www.dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html)، وهي أداة قائمة على خادم الويب يمكن الوصول إليها مجانًا للتأكد من الطبيعة غير المسببة للحساسية لتركيبة اللقاح. تعتمد هذه الطريقة على تحويل التباين التلقائي (ACC) لتسلسلات البروتين إلى نواقل موحدة متساوية الطول. وقد تم تطبيقه على دراسات العلاقات الكمية بين البنية والنشاط (QSAR) للببتيدات ذات الأطوال المختلفة، ويتم تصنيف البروتينات بواسطة خوارزمية جار أقرب k [44]. تم التنبؤ بالسمية، إن وجدت، من خلال استخدام خادم ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). تعمل أداة التنبؤ هذه بناءً على كل من تقنية التعلم الآلي والطريقة الكمية التي يتم تدريبها على مجموعة بيانات من الببتيدات السامة وغير السامة المختلفة التي تم الحصول عليها من SwissProt وTrEMBL [45]. يعد تحديد سمية أمرًا بالغ الأهمية لتقييم سلامة اللقاح وغيره من الببتيدات العلاجية المناعية المخصصة للتجارب البشرية. تم إجراء التحليل عن طريق اختيار النهج المستند إلى الحافز SVM (TrEMBL) + عند عتبة قيمة E البالغة 1 0.0 للطريقة القائمة على الحافز وعتبة SVM البالغة 0.1.

تقييم الخواص الفيزيائية والكيميائية

يصبح وصف الخصائص الفيزيائية والكيميائية للببتيد الخيميري أمرًا حيويًا، لأنه عند تناوله كلقاح، يجب أن يكون قادرًا على تحفيز الاستجابة المناعية المناسبة. تم استخدام خادم ProtParam المتوفر مع بوابة ExPASY (نظام تحليل البروتين الخبير) (https://web.expasy.org/program/) لحساب المعلمات الفيزيائية والكيميائية المختلفة لبناء اللقاح الأساسي الذي يتضمن ميزات مثل الوزن الجزيئي، ومؤشر pI النظري، مؤشر عدم الاستقرار، المؤشر الأليفاتي، نصف العمر في الجسم الحي وفي المختبر، المتوسط ​​الكبير للكارهة للماء (GRAVY)، وغيرها.

التنبؤ بالبنية الثانوية للقاح الببتيد

تم التنبؤ بالعناصر الهيكلية الثانوية لبناء اللقاح المصمم من خلال تطبيق خادم PSIPRED (//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) وخادم خاصية RaptorX (//raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ توقع/) وكلاهما يمكن الوصول إليه مجانًا عبر الإنترنت من خلال خوادم تحليل بنية البروتين. تم توفير التسلسل الأولي لببتيد اللقاح كمدخل. يتنبأ PSIPRED بالبنية الثانوية لتسلسل بروتين الإدخال من خلال استغلال شبكتين عصبيتين للتغذية الأمامية تعملان بناءً على مصفوفات التسجيل الخاصة بالموضع (PSSM) الناتجة عن PSI-BLAST [46]. وهو يشتمل على تحديد التسلسلات المتماثلة لبناء اللقاح الخاص بنا بواسطة PSI-BLAST، متبوعًا بتوليد PSSM. تم العثور على PSIPRED 3.2 والإصدارات الأعلى لتحقيق متوسط ​​​​درجة الربع الثالث بنسبة 81.6٪ كما تم تقييمها من خلال طريقة صارمة للتحقق من الصحة ثلاثية الأبعاد مما يجعل هذا النهج دقيقًا ودقيقًا بشكل كبير. يستخدم خادم الويب الخاص بـ RaptorX تقنية حديثة جدًا للتعلم الآلي تسمى DeepCNF (المجالات العصبية التلافيفية العميقة) للتنبؤ بميزات مختلفة مثل البنية الثانوية وإمكانية الوصول إلى المذيبات والمناطق المضطربة في وقت واحد. DeepCNF هو نهج متكامل يجمع بين كل من الحقول العشوائية الشرطية (CRFs) والشبكات العصبية الضحلة التي تصمم علاقات بنية تسلسلية معقدة من خلال بنية هرمية عميقة ويمكنها الحصول على دقة Q3 تبلغ 84٪ تقريبًا لبنية ثانوية من الفئة 3- [47] .

التنبؤ بالهيكل الثالث

تم التنبؤ بالبنية الثلاثية لببتيد اللقاح النهائي باستخدام خادم الويب عبر الإنترنت I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER هو أسلوب نمذجة هيكل البروتين الهرمي يعتمد على محاذاة خيوط الملف الشخصي (PPA) ومحاكاة تجميع البنية التكرارية متبوعة بتحسين البنية على المستوى الذري. وهو يعمل على ثلاث مراحل: تحديد القالب الهيكلي، وتجميع الهيكل التكراري، والتعليق التوضيحي للوظيفة القائمة على الهيكل. يتم إرجاع نماذج البنية الأعلى تصنيفًا مع تقديرات الدقة العالمية والمحلية مع درجات C ودرجات TM التمثيلية، والتي ترتبط بجودة النموذج المتوقع. يمثل برنامج I-TASSER أحد أكثر الطرق نجاحًا الموضحة في CASP للتنبؤات الآلية لبنية البروتين ووظيفته [48، 49].

صقل هيكل اللقاح الثالث

لا تضمن النمذجة الحسابية التقليدية لبنية البروتين وحدها صحة ودقة النموذج المتوقع نظرًا لأن استراتيجيات النمذجة هذه تعتمد إلى حد كبير على درجة تشابه المدخلات (الهدف) مع هياكل القالب المتاحة. لذلك، يُعتقد أن تحسين جودة النموذج القائم على القالب بما يتجاوز الدقة أمر ضروري، ويمكن تحقيق ذلك من خلال تحسين بنية البروتين بأكملها. من هذا المنظور، تم إخضاع مخرجات النموذج ثلاثي الأبعاد من خادم I-TASSER الحاصل على أفضل درجة C لمزيد من التحسين بواسطة خادم GalaxyRefne (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} تحسين). إنه أسلوب تحسين تم اختباره بواسطة CASP10- حيث يتم إعادة بناء السلاسل الجانبية للبروتين أولاً، ثم يتم إعادة تعبئة السلسلة الجانبية واسترخاء البنية الشاملة عن طريق محاكاة الديناميكيات الجزيئية. وهذا يؤدي إلى تحسين دقيق لكل من الهياكل الثلاثية المحلية والعالمية للبروتينات المستهدفة [50].

فوائد ملحق سيستانش — مكافحةالتهابات

التحقق من صحة البنية الثلاثية للقاح

يجب التحقق من صحة البنية الثلاثية المنقحة للقاح لاكتشاف الأخطاء المحتملة التي قد تحدث في النموذج ثلاثي الأبعاد المتوقع. تم توفير النموذج المكرر الذي تم الحصول عليه من خادم GalaxyRefne كهيكل إدخال بتنسيق a.pdb. علاوة على ذلك، فإن مؤامرة راماشاندران هي طريقة أخرى مفيدة للغاية لتصور المناطق المسموح بها وغير المسموح بها من زوايا phi (ϕ) وpsi (ψ) ثنائية السطوح للسلاسل الجانبية للأحماض الأمينية التي تعتبر مكونات حاسمة للتحقق من صحة بنية البروتين. ومن ثم، تم استخدام خادم MolProbity [الصفحة الرئيسية - MolProbity (duke.edu)] لإنشاء مخطط Ramachandran للنموذج المحدد للقاح استنادًا إلى التحقق من صحة أسلوب MolProbity المستند إلى Python [51]. استخدمنا أيضًا خادم ERRAT [SAVESv6.0 — خادم التحقق من صحة الهيكل (UCLA.edu)] الذي يحلل إحصائيات التفاعلات غير المرتبطة بين الذرات المختلفة في النموذج ويرسم قيمة دالة الخطأ مقابل {{ 6}}بقايا انزلاق [52]. تم استخدام خادم الويب ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)، وهو نظام أساسي تفاعلي قائم على الويب يعتمد على برنامج ProSA القياسي، لهذا الغرض [53]. تم تنفيذ هذه الخطوة للحصول على تحقق أكثر تعقيدًا ودقة للبنية النموذجية.

هندسة ثنائي كبريتيد الببتيد اللقاح

تساهم روابط ثاني كبريتيد في استقرار البروتين عن طريق خفض الإنتروبيا التوافقية وأيضًا عن طريق زيادة الطاقة الحرة للحالة المشوهة. يعتبر إدخال روابط ثاني كبريتيد جديدة أداة تكنولوجية حيوية مهمة لتحسين الثبات الحراري للبروتينات الأصلية المطوية. تم استخدام خادم ثاني كبريتيد حسب التصميم 2 (DbD 2) v 2.12 لتعزيز الاستقرار الهيكلي العام للقاح المصمم عن طريق إدخال روابط ثاني كبريتيد. تستخدم هذه الطريقة الهندسة الأصلية وتحسب قيمة الطاقة لكل ثاني كبريتيد محتمل، وبالتالي توفر وسيلة لتصنيف روابط ثاني كبريتيد المرشحة. كانت روابط ثاني كبريتيد التي تمنح أقصى قدر من الاستقرار هي المرشحين ذوي قيمة chi3 العالية وطاقة الرابطة والعامل B [54]. تم اختيار المناطق المرنة من الببتيد بناءً على المعلمات المذكورة سابقًا، وتم إنشاء طفرات التثبيت المقابلة عن طريق تكوين روابط ثاني كبريتيد بين أزواج البقايا المختارة.

الالتحام الجزيئي لبناء اللقاح مع المستقبلات المناعية (TLRs البشرية 2، 4، 5، 8، والمستقبلات TLR ‑ 9)

تعد مستقبلات Toll-like (TLR) من السمات الرئيسية للاستجابات المناعية الخلوية التي تتعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) وتثير استجابات مناعية فطرية ضد العدوى. تم الإبلاغ لاحقًا عن التنشيط المباشر لـ TLR -2 مع مكونات الليشمانيا [55]. في الدراسات التجريبية الأخرى ذات الصلة، أدى نقص TLR-4 إلى زيادة نمو الطفيليات وتأخر شفاء الآفات الجلدية الناجمة عن العدوى الكبيرة بالليشمانيا مما يشير إلى الدور المعقول لـ TLR-4 في تحفيز المناعة ضد الليشمانيا [56 ]. من ناحية أخرى، تم العثور على TLR -2 و4 و9 متورطين في طيف مرضي مناعي لـ CL الناجم عن L. braziliensis وL. amazonensis [57]. تم تقييم TLR -9 أيضًا باعتباره لاعبًا رئيسيًا في تنشيط الخلايا الجذعية في التسبب في VL عند البشر [58]. لقد ثبت أن بعض المكونات المشتقة من الليشمانيا تنشط TLR-2 و4 و9 في غالبية الدراسات التي أجريت في هذا المجال. تؤكد هذه الملاحظات على حقيقة أن TLRs المختلفة تشارك في تحفيز المناعة الوقائية ضد الليشمانيا. لذلك، اعتبر التفاعل بين مستقبلات TLRs وبنية اللقاح المصممة ضروريًا للحصول على مناعة فعالة ضد عدوى الليشمانيا. تم التحقق من ذلك عن طريق إجراء الالتحام الجزيئي لببتيد اللقاح متعدد الحلقات مع TLRs البشرية -2، 4، 5، 8، والماوس TLR -9 باستخدام خادم PatchDock [PatchDock Server (tau.ac.il )]. تتكون خوارزمية PatchDock من ثلاث مراحل رئيسية، وهي تمثيل الشكل الجزيئي، ومطابقة التصحيح السطحي، والتصفية والتسجيل. إنها خوارزمية إرساء جزيئية قائمة على الهندسة وتعمل بشكل أساسي على تكامل الشكل الجزيئي بين المستقبل والرابط. تتم مطابقة التصحيحات التكميلية، ويتم إنشاء التحولات المرشحة. يتم تصنيف كل من هذه التحولات بشكل أكبر من خلال تعيين وظيفة تسجيل تأخذ في الاعتبار كلاً من طاقة الخراب الذري والقدم الهندسي [59، 60]. في دراستنا، TLR -2 البشري (معرف PDB: 6NIG)، TLR -4 (معرف PDB: 4G8A)، TLR -5 (معرف PDB: 3J 0 A)، تم اختيار TLR -8 (معرف PDB: 4QC 0)، والماوس TLR -9 (معرف PDB: 3WPF) كمستقبلات، وتم استرداد ملفات PDB المنفصلة الخاصة بها من Protein DataBank (www) .rcsb.org). تم استخدام النموذج ثلاثي الأبعاد المكرر لببتيد اللقاح باعتباره الرابط لجميع عمليات محاكاة الالتحام. تم تعيين خادم PatchDock على المعلمات الافتراضية (تجميع RMSD: 4.0). قمنا أيضًا بتحليل أفضل نموذج لرسو السفن باستخدام خادم Cluspro استنادًا إلى خوارزمية دوران السندات المحتملة، وتم تقييم الروابط باستخدام برنامج PyMOL [61].

تحسين الكودون، والتنبؤ ببنية الرنا المرسال، واستنساخ السيليكو للتعبير عن بروتين اللقاح

مطلوب تحسين الكودون لتحقيق الحد الأقصى من التعبير عن الجينات الأجنبية في الكائن المضيف عندما يختلف استخدام الكودون من قبل المضيف بشكل كبير عن استخدام المضيف الأصلي الذي تم التخلص من التسلسلات الأصلية لبناء اللقاح النهائي منه. تم استخدام JCat (أداة تكيف Java Codon)، المتاحة للجمهور على (http://www.jcat.de/)، للترجمة العكسية وتحسين الكودون من خلال توفير تسلسل أولي لبناء اللقاح النهائي كمدخل. تم تحسين استخدام الكودون للكائنات بدائية النواة الأكثر تسلسلاً، E. coli K12 [6]. تم اختيار ثلاثة خيارات إضافية توفرها الأداة لتجنب أدوات إنهاء النسخ المستقلة عن rho، ومواقع ربط الريبوسوم بدائية النواة، ومواقع انقسام التقييد غير المرغوب فيها. يشير مؤشر تكيف الكودون (CAI) ومحتوى GC، كما تم حسابه بواسطة أداة JCat، إلى مدى جودة التحسين. يضمن التحسين الأفضل تعبيرًا أعلى عن بروتين اللقاح. علاوة على ذلك، تم دمج مواقع التقييد للإنزيمات XhoI وNdeI في تسلسل cDNA الأمثل الذي توفره أداة JCat لتسهيل الاستنساخ. تم بعد ذلك إدراج التسلسل المعدل (مع مواقع التقييد) في ناقل البلازميد E. coli pET 28-a(+) باستخدام وحدة استنساخ التقييد في أداة SnapGene [6، 31، 62، 63]. يتوفر برنامج SnapGene على الويب على (https://www.snapgene.com/). علاوة على ذلك، استخدمنا أيضًا خادم الويب mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) للتنبؤ بالبنية الثانوية للmRNA المشفر بواسطة جينات الببتيد الخيميري. تم توفير التسلسل الأمثل المترجم عكسيًا والذي تم الحصول عليه من أداة JCat كمدخل. يعتمد برنامج mfold على خوارزمية أساسية تتنبأ بالحد الأدنى من الطاقة الحرة، ∆ G، والحد الأدنى من الطاقات الحرة للطيات التي تحتوي على أي زوج أساسي معين. يتم أيضًا تطبيق قيود قابلة للطي المختلفة للتنبؤ الدقيق للطاقات القابلة للطي. طاقة الطي لطي الحمض النووي الريبي (RNA) ثابتة عند 37 درجة، بينما تكون الظروف الأيونية ثابتة عند [Na+]=1 M و [Mg++]=0 [64].

محاكاة مناعية تعتمد على C-imsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index.php?page=1) هي أداة للتنبؤ بالاستجابة المناعية تعتمد على الخادم وتستخدم الفئة القائمة على الوكيل، و ويعتمد توقعها على الشبكات العصبية. ويمكنه التنبؤ بكل من الاستجابات المناعية الخلطية والخلوية. يستخدم C-immsim نموذج Celda Seiden، ونموذج الشبكة متعددة النسيلة ذات سلسلة البت، ومؤشر Simpson لتوصيف التنبؤ بالخلايا النشطة، والخلايا الخاملة، وخلايا الذاكرة وطول عمرها. فهو يساعد على التنبؤ بملف السيتوكين لتفاعل معين لتقييم الاستجابات الالتهابية [65].

مسحوق استخراج سيستانش

المحاكاة الديناميكية الجزيئية

تم إجراء المحاكاة الديناميكية الجزيئية لتقييم استقرار أفضل مركب لدينا، أي TLR، مع اللقاح المقترح باستخدام خادم iMOD (خادم الصفحة الرئيسية لخادم iMod (csic.es). يستخدم هذا الخادم القائم على الويب تحليل الوضع العادي المحسن (NMA) لتوصيف الخصائص الديناميكية المختلفة للجزيئات الحيوية، مثل مرونة البروتين واستقراره، عن طريق مجال القوة داخل الذرة. في هذه الدراسة الحالية، قمنا بتحليل تشوهات السلسلة الرئيسية، والعامل B، والقيم الذاتية، وعامل التغاير، ونموذج الشبكة المرنة كمعلمات NMA قياسية لتقييم مجمعات البروتين البروتين التي تم الحصول عليها عن طريق أساليب السيليكو [66-69].

نتائج

اختيار واسترجاع تسلسل البروتين المستضد الليشمانيا

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51)، مما يعكس فعاليتها العالية في تصميم اللقاح (الجدول 1). تم تمييز البروتينات على أنها إفرازية وغير إفرازية بناءً على التنبؤ بمواقع انقسام الببتيد للإشارة بواسطة خادم SignalP 1.4. اثنان من بروتينات الليشمانيا المختارة. تم العثور على بروتيناز L. mexicana Cysteine ​​A (Uniprot id: P25775) وL. amazoensis surface glycoprotein GP-46/M2 (معرف Uniprot: P21978) يحتويان على ببتيدات الإشارة، وبالتالي، تم التنبؤ بها كبروتينات إفرازية. لم يتم العثور على بقية مستضدات الليشمانيا العشرة التي تحتوي على أي إشارة ببتيد تشير إلى طبيعتها غير الإفرازية. توقع تحليل التوطين أن يتم توطين بروتين السيستين بروتيناز A من L. mexicana (معرف Uniprot: P25775) في الليزوزوم/الفجوة، والبروتينات الليشمانوليسين C1 والبروتيوفوسفوجليكان من L. mexicana (معرفات Uniprot: P43150 وQ9TW13، على التوالي) لتكون بروتينات غشائية. ، لا يوجد مستضد وقائي لـ L. donovani (معرف Uniprot: Q9BIJ5) ليكون في النواة والصدمة الحرارية 70 البروتين المرتبط 1 من L. الكبرى (معرف Uniprot: P12076) ليتم توطينه في الميتوكوندريا. تم التنبؤ بجميع البروتينات الأخرى على أنها السيتوبلازم (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، تم أيضًا الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية لسلسلة ألفا لـ IL-12 البشري من قاعدة بيانات Uniprot (معرف Uniprot: P29459) لاستخدامه كمساعد في بناء اللقاح النهائي.

التنبؤ بحلقات CTL و HTL

من بين جميع البروتينات التي يتم فحصها، تم تحديد إجمالي عدد 59 حلقة CTL غير اسمية شائعة بشكل مشترك بواسطة خوادم NetCTL 1.2 وSYFPEITHI. تم تعيين درجة معينة محسوبة بواسطة الخوادم المعنية لكل من حلقات CTL المتوقعة. تم اختيار 26 فقط من نماذج CTL 9- الشائعة هذه نظرًا لدرجاتها الأعلى (مما يشير إلى تقارب ربط MHC I الأعلى). تم تضمين حلقات CTL الستة والعشرون التي تم تحديدها بشكل شائع بواسطة كلا الخادمين ذوي الدرجات الأعلى المتوافقة في البنية النهائية للقاح (الجدول التكميلي S1). وبالمثل، تنبأت أداة تحليل ربط IEDB MHCII بحلقات HTL 15- من جميع البروتينات المحددة ضد مجموعة من ثلاثة أليلات HLA بشرية (HLA- DRB1*01:01، HLA- DRB1*01:02 وHLADRB1* 01:03). تم توثيق حلقات HTL المتوقعة ذات أدنى رتبة معدلة لكل واحدة من هذه الأليلات كما في الجدول التكميلي S2. من هذا التجمع، تم اختيار إجمالي تسعة تسلسلات على أساس رتبها المعدلة المنخفضة (الجدول 2) والتي تجعل من حلقات HTL هذه أقوى روابط MHC-II لأي من أليلات HLA الثلاثة. تم بعد ذلك إخضاع حلقات HTL المختارة لمزيد من التحليل الحسابي من أجل التنبؤ بقدراتها على إنتاج السيتوكينات.

الجدول 1. تم استغلال اثني عشر ببتيدًا مستضديًا محتملاً من أنواع مختلفة من الليشمانيا لبناء اللقاح وتم اختيارها بناءً على درجة المستضد العالية كما تنبأ خادم ANTIGENpro

الكشف عن حلقات HTL ذات القدرات المحفزة للسيتوكينات

تم تقييم جميع حلقات HTL التسعة المختارة (الجدول 2) لقدرتها على إنتاج الإنترفيرون من خلال استخدام خادم IFNepitope. تنبأ الخادم (IFN- مقابل NonIFN، باستخدام SVM والتحليل الهجين القائم على الحافز) بثلاثة ببتيدات فقط مثل FRRLYKTLGQLVYKK من بروتين قضيب بارافاجيلار 2C من L. الكبرى، DNGAYLGMEPSSVAA من بروتيوفوسفوجليكان من L. mexicana، وRLHFFMMGFAPLTSR من سلسلة بيتا التيوبيولين. L. mexicana باعتبارها "إيجابية" بدرجات أقل من 1.0 (الجدول 3). تم فحص هذه الببتيدات الثلاثة أيضًا للتأكد من قدراتها الإنتاجية IL-4 وIL-10- باستخدام خادم IL4pred وخادم IL10pred، على التوالي. يستخدم كلا الخادمين مصنف SVM ويأخذان في الاعتبار معلمات إدخال SVM المختلفة مثل تكوين الأحماض الأمينية، وتكوين ثنائي الببتيد، وميل الأحماض الأمينية، والخصائص الفيزيائية والكيميائية للتنبؤ [32، 33]. توقعت الخوادم المعنية أن هذه الحلقات الثلاث المنتجة لـ 15-mer IFN- - كانت محفزات لـ IL-4 و IL-10 أيضًا (الجدول التكميلي S3). وبالتالي، تم أخيرًا اختيار حلقات HTL الثلاثة المرتبطة بـ MHC-II 15- لبناء اللقاح مع الأخذ في الاعتبار قدرتها على تحفيز إنتاج السيتوكينات IFN- وIL-4 وIL{{24 }} وبالتالي التوسط في الاستجابة المناعية المتزايدة.

تحليل الحفاظ على الحاتمة

تم الاستفادة من وحدة IEDB "الحفظ عبر المستضد" المتوفرة داخل خادم IEDB للعثور على درجة الحفاظ على حلقات CTL وHTL المحددة التي سيتم دمجها في بناء اللقاح النهائي. تم فحص كل حلقة من حلقات CTL الستة والعشرين وثلاث حلقات HTL بشكل فردي مقابل مجموعة محددة من تسلسلات البروتين المتماثلة التي تم الحصول عليها بواسطة Uniprot BLAST. أظهرت نتائج بلاست درجة عالية من الحفاظ على البروتينات المختارة في أنواع مختلفة من الليشمانيا وكذلك في الكائنات الأولية الطفيلية الأخرى ذات الصلة، ومعظمها من المثقبيات. تم العثور على جميع حلقات HTL محفوظة بدرجة عالية (100%) عبر مجموعة بروتينات الليشمانيا ذات الصلة المستخدمة في التحليل، في حين تراوح نطاق الحفاظ على حلقات CTL المحددة من 0 إلى 100% (جدول إضافي) 4 س). إن دمج حلقات CTL و HTL المحفوظة في البنية النهائية للقاح من شأنه أن يضمن مناعة متقاطعة واسعة النطاق ضد أنواع متعددة من الليشمانيا المسببة للأمراض التي تصيب البشر عادة.

الجدول بالحجم الكامل

الجدول 3: تنبأ خادم IFNepitope بالحواتم المحفزة لـ MHC II والقادرة على إنتاج الإنترفيرون

بناء تسلسل لقاح متعدد الحلقات

تم إنشاء التسلسل الأولي للقاح الببتيد متعدد الوحدات من خلال دمج تسلسل ستة وعشرين حلقة من حلقات CTL وثلاث حلقات من HTL تم اختيارها على أساس مولدها المضاد، وتقارب ربط MHC، والقدرة على تحفيز السيتوكين. تم دمج حواتم CTL وHTL الفردية باستخدام روابط AAY وGPGPG، على التوالي، وكان الطول الإجمالي لببتيد اللقاح الناتج 369 حمضًا أمينيًا. تمت إضافة المادة المساعدة، 219 من الأحماض الأمينية سلسلة ألفا طويلة من IL -12 البشري (معرف Uniprot: P29459)، إلى الطرف N من الببتيد المصمم بواسطة رابط EAAK. كان من المفترض أن تؤدي إضافة IL-12 كمساعد طبيعي إلى تعزيز فعالية اللقاح عن طريق تسريع الاستجابة المناعية، كما تم التحقق من صحته بالفعل في الدراسات على الحيوانات [3، 37]. بالإضافة إلى ذلك، تمت إضافة علامة 6XHis أيضًا إلى الطرف C للببتيد لتسهيل التعرف على البروتين وتنقيته بعد إنتاجه بواسطة تقنية الحمض النووي المؤتلف. بعد إضافة الروابط والمواد المساعدة وعلامة الهيستيدين، وجد أن طول ببتيد اللقاح النهائي يبلغ 598 بقايا حمض أميني (الشكل 1).

التنبؤ بحلقة الخلية B الخطية والمستمرة والمتقطعة

تم التعرف على وجود المحددات المستضدية في التسلسل الأولي للقاح المصمم من خلال استخدام خادمين مختلفين، وهما ABCpred وBepiPred 2.0، للحصول على تنبؤ أكثر فعالية. يتنبأ خادم ABCpred بحلقات الخلية B باستخدام شبكة عصبية متكررة مدربة ويمثل التسلسلات المرشحة على أنها 16- ببتيدات مرتبة وفقًا لدرجات الارتباط الخاصة بها (الجدول التكميلي S5). الدرجة الأعلى من الببتيد تعني احتمالية أكبر لكونها حاتمة. تم العثور على ببتيد اللقاح المصمم يحتوي على سبعة ببتيدات غير متداخلة 16- مع درجات متوقعة تبلغ 0.90 وما فوق عند قيمة عتبة افتراضية تبلغ 0.51 مما يعكس فعاليتها العالية جدًا في ربط الخلايا البائية وتحفيزها. الخادم الآخر، BepiPred 2.0، يتنبأ باحتمالية أن تكون كل بقايا حمض أميني في تسلسل الإدخال جزءًا من حلقة الخلية B ويصور المخرجات كرسم توضيحي بتدرج لون برتقالي يشير إلى درجة احتمالا. يتم وضع علامة على البقايا المتوقعة التي تنتمي إلى حواتم الخلايا البائية بالحرف "E". حدد الخادم عددًا كبيرًا من الوحدات البنائية لتكون حلقات خلية B خطية ذات احتمالية عالية ضمن امتداد بقايا قدره 380–53{{20}} من موضع الببتيد (الشكل 2) عندما تم تعيين عتبة الحاتمة عند 0.5 (افتراضي). وهكذا، فإن تحديد المحددات المستضدية لمستقبلات الخلايا البائية بواسطة خادمين مستقلين أثبت حقيقة أن الببتيد، عند إعطائه كلقاح، سيكون قادرًا على تحفيز إنتاج الأجسام المضادة بواسطة الخلايا البائية لحماية الأفراد من عدوى الليشمانيا. تنبأت بدلة Ellipro (المتوفرة على بوابة IEDB) بوجود إجمالي 323 من بقايا الأحماض الأمينية الموجودة في ثماني حلقات متقطعة من الخلايا البائية في البنية الثلاثية المكررة للقاح الببتيد، مع درجات تتراوح من 0.509 إلى 0.802. من بينها، تحتوي أكبر الحاتمة التوافقية على 107 بقايا من الأحماض الأمينية بدرجة متوقعة قدرها 0.772. تم استخدام المعلمات الافتراضية للخادم للتحليل. تنبأ Ellipro أيضًا باثني عشر حلقة خطية من الخلايا B مع إجمالي عدد 324 وحدة بنائية ضمن نطاق درجات يتراوح بين 0.535-0.885 (الجدول التكميلي S6 والصورة التكميلية M1).

مولد الضد والحساسية والسمية في بناء اللقاح

تم تقييم مولد الضد لتسلسل اللقاح النهائي (مع المادة المساعدة) بواسطة خوادم ANTIGENpro وVaxiJen 2.0. توقع خادم ANTIGENpro أن يكون مستضدًا محتملاً مع درجة مولد مضاد تبلغ 0.745396. قام خادم VaxiJen 2.0 بتقييم ببتيد اللقاح باعتباره مضادًا محتملاً بدرجة 0.5325 عند عتبة {{10}}.5 عندما يكون الكائن المستهدف تم اختياره ليكون طفيليًا (الجدول 4). ومع ذلك، عندما تم تحليل تسلسل اللقاح الأصلي بدون المادة المساعدة بواسطة VaxiJen 2.0، تم التنبؤ به أيضًا باعتباره مستضدًا محتملاً بدرجة 0.5768 في نماذج الطفيليات. كانت نتيجة تنبؤ ANTIGENpro للتسلسل الأصلي هي 0.714582. وبالتالي، تم العثور على كل من تسلسل اللقاح المبني (مع وبدون مادة مساعدة) ليكون مستضديًا بطبيعته، مما يدعم حقيقة أن مكونات الببتيد في اللقاح كانت مستضدية في حد ذاتها، حتى في حالة عدم وجود المادة المساعدة المضافة (الجدول 4). بقدر ما يتعلق الأمر بالحساسية، فقد وجد AlgPred أن تسلسل اللقاح النهائي غير مسبب للحساسية مع درجة متوقعة تبلغ 0.4018 عند عتبة 0.4. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم العثور على أن تسلسل البروتين يحتوي على أي حلقة IgE مثبتة تجريبيًا، ولم يتم العثور على نتائج لنتائج BLAST للببتيدات الممثلة للحساسية (ARPs)، مما يشير إلى طبيعة اللقاح غير المسببة للحساسية. قام خادم AllerTOP v.2.0 أيضًا بتعريف البروتين على أنه مادة غير مسببة للحساسية. توقع تحليل السمية بواسطة خادم ToxinPred أن يكون الببتيد غير سام عندما تم اعتماد النهج القائم على SVM (TrEMBL) + عند عتبة SVM تبلغ 0.1، وتم تعيين الحد الفاصل لقيمة E للحافز عند 10.0. ومن ثم، تم التنبؤ بتسلسل اللقاح الناتج كمستضد محتمل، وغير مسبب للحساسية، وغير سام، وكلها معايير مهمة للقاح الببتيد المثالي متعدد الوحدات.

الشكل 1. رسم تخطيطي للقاح الببتيد متعدد الحواتم المصمم الذي يحتوي على إجمالي 598 تسلسلًا من الأحماض الأمينية تمثل بناء لقاح محتمل مع مساعد طبيعي طرفي N (أخضر) مرتبط بـ EAAK (أرجواني) مع 26 CTL (برتقالي) باستخدام رابط AAY (أزرق) و3HTL (أصفر) متصلان برابط GPGPG (أحمر). وينتهي بـ 6-علامته في محطة C لأغراض التنقية

الشكل 2: حلقة الخلية B التي تنبأ بها خادم Bepipred 2.0. تم التنبؤ بالامتدادات في نقاط مختلفة من 1 إلى 590 تسلسلًا من الأحماض الأمينية مع وجود حلقة محتملة أعلى من مستوى العتبة الافتراضية. يُظهر السطر الأول الذي يحمل علامة E موقع الحاتمة المتوقعة

تقييم المعلمات الفيزيائية والكيميائية

تم حساب المعلمات الفيزيائية والكيميائية لبناء اللقاح النهائي بواسطة خادم Protparam على أساس بقايا الأحماض الأمينية الموجودة في التسلسل المحدد. تم حساب الوزن الجزيئي (MW) للببتيد المصمم ليكون 65.68 كيلو دالتون مما يجعله مناسبًا لإحداث استجابة مناعية. تم حساب pI النظري (نقطة تساوي الجهد الكهربي) على أنه 5.98، مما يشير إلى أن الببتيد حمضي قليلاً بطبيعته. كان إجمالي عدد المخلفات الموجبة والسالبة الشحنة في الببتيد 48 و 55 على التوالي. تم حساب نصف العمر على أنه 30 ساعة في الخلايا الشبكية للثدييات في المختبر، وأكثر من 20 ساعة في الخميرة، وأكثر من 10 ساعات في الإشريكية القولونية في الجسم الحي. كان ثبات البروتين لمدة 30 ساعة في خلايا الثدييات (بما في ذلك البشر) كافياً لإثارة استجابة مناعية مرغوبة لأن الآلية تتطلب معالجة البروتين وعرضه بواسطة الخلايا المناعية. كان من المتوقع أن يكون المؤشر الأليفاتي (الحجم النسبي الذي تشغله السلاسل الجانبية الأليفاتية) 78.34، مما يشير إلى أن البروتين قابل للحرارة بطبيعته حيث يمكن اعتبار المؤشر الأليفاتي عاملاً إيجابيًا يساهم في زيادة الثبات الحراري للبروتينات الكروية. تم حساب مؤشر عدم الاستقرار إلى 47.10. كان من المتوقع أن يكون المتوسط ​​الكبير المتوقع لقيمة المعالجة المائية (GRAVY) لبناء اللقاح −0.140؛ تحدده القيمة السلبية على أنه محب للماء بطبيعته وسيتفاعل مع جزيئات الماء [28، 70–72]. في الختام، تنبأ تحليل المعلومات المناعية ببناء الببتيد المصمم على أنه مستضدي، وثابت للحرارة، ومستمر في خلايا الثدييات، ومحب للماء. كل هذه العوامل تؤثر على فعالية البناء كمرشح محتمل للقاح.

التنبؤ بالهيكل الثانوي

يكشف التنبؤ بالهيكل الثانوي للببتيد الخيميري الطويل البالغ عدده 592 بقايا بواسطة خادم PSIPRED عن وجود 45.77% حلزون ألفا، و4.89% ورقة بيتا، وملفات 49.32%، كما هو موضح في الشكل 3 التالي. بالإضافة إلى ذلك، هيكل RaptorX قام خادم التنبؤ بتحليل إمكانية الوصول إلى المذيبات ذات الصلة للببتيد حيث كان من المتوقع أن يتم كشف 36% من البقايا، و28% تم التنبؤ بها كوسط مدفون، و35% من البقايا تم دفنها، مما يشير إلى أن البروتين سيكون له اتصال عادل بشكل عام مع الماء (المذيب). تم التنبؤ بوجود 32 وحدة بنائية فقط (5٪ من الببتيد) في المجال المضطرب للبروتين بواسطة خادم RaptorX.

التنبؤ بالهيكل الثالث

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 يشير إلى نموذج ذو الطية الصحيحة. درجة TM هي معلمة مستقلة بطول التسلسل لقياس التشابه الهيكلي للنموذج المتوقع مع بروتينات أخرى مماثلة في نفس عائلة طيات SCOP / CATH [47].

الجدول 4: نتائج مولد المضاد المحسوبة من خادم ANTIGENpro وخادم Vaxijen2.0 مع مولد المضاد وبدونه

الشكل 3: التنبؤ بالبنية الثانوية لتسلسل اللقاح الخطي بواسطة خادم PSIPRED

الشكل 4 التنبؤ بالبنية الثلاثية وتحسينها 3-النمذجة ثلاثية الأبعاد لبنية اللقاح كما تنبأ بها خادم I-TASSER. ب تحسين النموذج الخام 3-D بواسطة خادم GalaxyRefne

تحسين والتحقق من صحة نموذج اللقاح ثلاثي الأبعاد

تم تحسين النموذج الثلاثي "الخام" للقاح الببتيد بشكل فرعي من خلال معالجته من خلال خادم GalaxyReone. أنتجت GalaxyRefne خمسة نماذج، تم العثور على النموذج 1 منها ليكون الأفضل بعد تقييم ومقارنة المعلمات المرتبطة مثل GDT-HA (0.8826)؛ RMSD ({{5}).608); مولبروبيتي (2.398)؛ نتيجة الصدام (21.1)؛ الدوارات الفقيرة (0.6); والمنطقة المفضلة لراما (88.8) مع بقية النماذج (الشكل 4 ب). أظهرت مخططات Ramachandran التي تم إنشاؤها بواسطة خادم MolProbity أن نموذج 3-D المكرر يحتوي على 88.8% من البقايا في المنطقة المفضلة، و98.6% من البقايا في المنطقة المسموح بها، وفقط 0.013% من القيم المتطرفة. في المقابل، وجد أن النموذج الخام الأولي يحتوي على 77.1%، 94.2%، و0.057% من المخلفات في المناطق المفضلة والمسموح بها والخارجية، على التوالي. تستنتج هذه النتائج بوضوح أن جودة نموذج التعليم العالي المكرر قد تحسنت بشكل ملحوظ. تم أيضًا استغلال خادم ERRATA للتحقق الإضافي من صحة النموذج المكرر. قام خادم ERRATA بتحليل النموذج بعامل جودة إجمالي قدره 43.542، وهو ما يمثل في الواقع النسبة المئوية لنموذج بروتين الإدخال الذي يقل عن حد الرفض البالغ 95%. وهكذا، نجحنا في الحصول على بنية ثالثية مصقولة ومثبتة بشكل ملحوظ لبناء اللقاح. يتم تمثيل الهيكل الثالث المكرر للقاح، إلى جانب المخططات التي تم الحصول عليها من خادم MolProbity وخادم ERRAT، في الشكل 5. وقد أظهر خادم الويب ProSA درجة Z تبلغ −1.08 (الصورة التكميلية M2)، حيث كانت النتيجة السلبية تشير القيمة إلى أن النموذج يقع خارج نطاق درجات البروتينات المماثلة ذات الأحجام المماثلة والتي تم تحديد بنيتها بواسطة حيود الأشعة السينية أو الرنين المغناطيسي النووي [51].

هندسة ثنائي كبريتيد الببتيد اللقاح

أعاد خادم Disulfide by Design 2.12 45 زوجًا من بقايا الأحماض الأمينية التي تعد مواقع محتملة لتكوين رابطة ثاني كبريتيد. لقد حددنا أزواج البقايا المرشحة الأربعة الأكثر أهمية والتي قد تكون موجودة في منطقة الحلقة المرنة لبروتين اللقاح بناءً على طاقة الرابطة العالية وقيم Chi3 (الجدول التكميلي S7). هذه البقايا، THR58-PHE61 (chi3:+126.18)، LEU216-ALA234 (chi3:+125.92)، THR323-GLU359 (chi3) :+121.54)، وTYR472-ARG504 (chi3: + 125.75)، تم استبدالهما بالسيستين في النموذج الثالثي المكرر لبروتين اللقاح النهائي، وبالتالي تحسين الاستقرار الحراري من الببتيد (الشكل 6). ومع ذلك، فإن دقة العامل B تقتصر على تخفيف تشتت النيوترونات أو الأشعة السينية عن طريق الحركة الحرارية للجزيئات في علم البلورات البروتينية. وهكذا، قمنا باختيار طاقة الرابطة العالية وقيم Chi3 بشكل صارم على العامل B لنموذج اللقاح المكرر بمساعدة الكمبيوتر [73، 74].

تحليل تفاعلات الالتحام بين ببتيد اللقاح مع TLRs

تمت دراسة تفاعلات الببتيد الخيميري مع المستقبلات المناعية (TLRs البشرية {{0}}، 4، 5، 8 والماوس TLR -9) من خلال إجراء تحليل الإرساء باستخدام خادم PatchDock حيث يتم الربط تم تقييم تقارب اللقاح (يجند) مع TLRs (المستقبلات) المختلفة. تم النظر في النماذج العشرة الأولى التي تم إنشاؤها بواسطة PatchDock لكل إرساء، ومن بينها تم اختيار النماذج الأفضل تصنيفًا والتي حصلت على أعلى درجات الإرساء لكل حالة. تمثل الدرجات الشكل والجمعيات الخيرية المكملة للكهرباء الساكنة بين المستقبلات والروابط. تم العثور على أفضل تكامل في حالة TLR -2 البشري (معرف PDB: 6NIG) بنتيجة 18714، ومساحة السطح 3963.10، وطاقة التلامس الذرية (ACE) 217.99 (الشكل 7 أ) . أظهر اللقاح أيضًا ارتباطًا فعالاً مع TLR-5 (معرف PDB: 3J0A) وTLR -9 (معرف PDB: 3WPF) بدرجة إرساء قدرها 18,258؛ مساحة السطح 2879.80 و ACE of −666.94 ودرجة الالتحام 18,164؛ ومساحة السطح 4090.70 و ACE 495.74 على التوالي. أظهر الالتحام مع TLRs الأخرى ارتباطات ربط أضعف كما ينعكس في درجات الالتحام المنخفضة الناتجة عن PatchDock، و16,708 لـ TLR-4 (معرف PDB: 4G8A)، و17,800 لـ TLR-8 (معرف PDB: 4QC0). وهكذا، كان بناء اللقاح الخاص بنا قادرًا على الارتباط بمستقبلات مناعية مختلفة ذات ارتباطات ارتباط متفاوتة. سيكون هذا أمرًا مرغوبًا للغاية للحصول على لقاح فعال من حيث إحداث مناعة مناسبة ومعززة للوقاية من عدوى الليشمانيا. علاوة على ذلك، تم استخدام أداة الويب FireDock لتحسين وتسجيل أفضل مجمع (مجمع لقاح TLR -2)، والذي قام بتحسينه مع الحد الأدنى من الطاقة العالمية البالغة −19.01، وارتباطات Van Der Waals (−25.74)، والاتصال الذري الطاقة (.030.03) والطاقة الحرة الملزمة (.24.26). تؤكد هذه النتائج حقيقة أن ببتيد اللقاح يتفاعل بكفاءة أكبر مع TLR -2 البشري، وبالتالي يشكل مركبًا مستقرًا إلى حد معقول قد يؤدي إلى استجابة مناعية ملحوظة ضد طفيليات الليشمانيا. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نجري مزيدًا من التحقيق في الالتحام بين TLR-2 واللقاح؛ باستخدام خادم الويب Cluspro، يتم تحديد النموذج العلوي (الشكل 7 ب) بناءً على FFT التناوبي 5D وCAPRI (التقييم النقدي للتفاعلات المتوقعة) مع النتيجة المرجحة المتوازنة −1192.5 التي تحتوي على أكبر حجم كتلة يبلغ 42 عضوًا. يحتوي الجدول 5 على قائمة مكونة من 10 بقايا من الأحماض الأمينية المتفاعلة من الشكل 7 ب والتي تشكل مركب يجند مستقبلات مستقر.

الشكل 5: مؤامرة راماشاندران لنموذج GalaxyRefne. ب خادم ERRAT توقع تقييم جودة بنية البروتين

الشكل 6 ثاني كبريتيد حسب التصميم 2. تنبأ 0 بأربعة تكوينات محتملة لرابطة ثاني كبريتيد (يشار إليها بالسهم) لتحسين الاستقرار الحراري لبناء اللقاح النهائي

تحسين الكودون واستنساخ السيليكو للتعبير عن بروتين اللقاح

في محاولة للتغلب على مشكلة انحياز الكودون، تم استخدام أداة JCat لتحسين الكودون الذي أعاد تسلسل الأحماض الأمينية المدخلة لببتيد اللقاح في شكل تسلسل [كدنا] مترجم عكسيًا بقيمة CAI محسنة تبلغ 1. تكمن هذه القيمة ضمن نطاق قيمة CAI المقبول وهو 0.8–1.0 [28]، مما يضمن معدلًا عاليًا للتعبير عن الجين في الكائن الحي المضيف، E. coli K12. كلما ارتفعت قيمة CAI، كلما كان معدل التعبير عن الجين الأجنبي أفضل. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على محتوى GC للتسلسل المحسن بنسبة 51.85%، مما يشير إلى تحسين جيد للكودون. للحصول على تعبير جيني أفضل، مطلوب محتوى GC بنسبة 35-70% [63]. تم إنشاء مواقع التقييد للإنزيمات XhoI وNdeI عند طرفي 5/ و3/ من التسلسل، متبوعًا بإدخال التسلسل المعدل في ناقل pET28 a(+). يقع الإدخال المستنسخ، الممثل باللون الأحمر، بين مواقع التقييد المحددة في المتجه. يوجد أيضًا امتداد لستة بقايا هيستيدين على طرفي التسلسل المستنسخ لتسهيل عملية التنقية بعد إنتاج بروتين اللقاح المؤتلف [6، 31]. كان حجم بنية ناقل البلازميد النهائي مع جزء الجين المدرج حوالي 7 كيلو بايت (الشكل 8). توقع خادم الويب mfold عددًا إجماليًا يبلغ خمسين مطابقة قابلة للطي لـ mRNA، من بينها تم اختيار الهيكل العلوي نظرًا لأدنى درجة طاقة له (ΔG= −492.50). كان من المتوقع أن يحتوي هذا التشكل المطوي على حلقة خارجية واحدة وأربعة مداخن مع الحد الأدنى من الطاقات الحرة مما يشير إلى استقرار التشكل. تم تشكيل الحلقة من 21 قاعدة مفردة وحلزونين إغلاق. حسبت مخطط نقطة الطاقة الطاقة المثلى (δG) لتكون 494.4 سعرة حرارية / مول. تشير النقاط الملونة المختلفة في الحقل إلى درجات الطاقة المختلفة لزوج أساسي معين موجود في الرنا المرسال مع الأخذ في الاعتبار δG المحسوب بواسطة الخادم [64]. وفقًا للمؤامرة، فإن الطاقات الحرة لمعظم الأزواج الأساسية تقع ضمن −487.5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

الجدول 5: أنشأ PyMOL عشرة بقايا من الأحماض الأمينية المتفاعلة للمستقبل والليكاند من الشكل 7 ب، ويشير الرقم الموجود في () إلى موضع الأحماض الأمينية في المستقبل والليكاند.

محاكاة المناعة

في محاكاة مناعية سيليكو باستخدام خادم الويب C-immsim، توقع وصول عدد المستضدات إلى 6.9 × 105 / مل خلال يومين من الجرعة الأولية للحقن، وانخفض مستوى المستضد إلى 0 في اليوم الرابع فصاعدًا. ترتبط هذه الزيادة في عدد المستضدات بزيادة ملحوظة في تركيز كل من مستوى IgM IgG ومستوى IgM وحده خلال فترة الإصابة المبكرة والوصول إلى مستوى الذروة تقريبًا خلال 12 يومًا من دورة العدوى على نطاق عشوائي. تزيد الأنواع الفرعية الأخرى من مستوى IgG1+ IgG2 وIgG1 بشكل ملحوظ نتيجة للاستجابة المناعية الثانوية (الشكل 9 أ). تُظهر ملفات تعريف السيتوكينات وسطاء التهابيين مثل مستويات INF التي تصل إلى 4 × 106 نانوغرام / مل في اليوم الثاني عشر، بينما تظل مستويات السيتوكينات الأخرى منخفضة جدًا (الشكل 9 ب). تزداد الاستجابات المناعية الخلوية التي يقترحها وجود الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا النشطة والمستقرة بعد 2-3 أيام بعد الحقن الأولي ، وكان وجود الخلايا التائية المساعدة للذاكرة التكاثرية بارزًا أيضًا (الشكل 9 ج و د). يزداد إجمالي عدد الخلايا البائية أيضًا خلال 2-3 أيام، جنبًا إلى جنب مع توليد خلايا الذاكرة البائية بعد أسبوع واحد من تناول الجرعة الأولية (الشكل 9 هـ).

الشكل 8: نظام التعبير عن لقاح الليشمانيا باستخدام ناقل pET28 a(+)، تشير المنطقة الحمراء إلى تسلسل الحمض النووي المدرج للقاح محاط بمواقع تقييد NdeI وXhoI

تفسير المحاكاة الديناميكية الجزيئية

تم تحليل أفضل نتيجة إرساء تم تحقيقها بواسطة مجمع لقاح TLR2-بشكل أكبر من خلال المحاكاة الديناميكية الجزيئية بمساعدة NMA. يتم تمثيل قابلية تشوه السلسلة الرئيسية بمفصلات عالية (الشكل 10 أ)، مما يعني قابلية تشوه عالية. تم حساب العامل B (الشكل 10 ب) بواسطة NMA، مما يدل على مرونة البروتين بناءً على معلمات الإزاحة الذرية [73]. تحدد القيمة الذاتية (الشكل 10 ج) الطاقة المطلوبة لتشويه الهيكل. يظهر مجمع لقاح TLR-2 قيمة ذاتية تبلغ حوالي 7.778×10−7. يرتبط التباين (الشكل 10 د) عكسيا بالقيمة الذاتية. توضح مصفوفة التغاير (الشكل 10 هـ) ما إذا كانت أزواج المخلفات مرتبطة (أحمر) أو غير مرتبطة (أبيض) أو غير مرتبطة (أزرق). يحسب نموذج الشبكة المرنة (الشكل 10f) الزنبركات بين أزواج الذرات المتناظرة، والنقاط في الرسم البياني ممثلة بتدرج لوني يشير إلى صلابة أو مرونة الزنبرك، ويعكس اللون الغامق زنبركًا أكثر صلابة. وهكذا، فإن نتائج المحاكاة الديناميكية الجزيئية تشير إلى أن لقاح الببتيد المقترح لدينا مستقر.

مناقشة

يعتبر داء الليشمانيات من أكثر الأمراض الاستوائية المهملة، ويؤثر في المقام الأول على الأشخاص الذين يعيشون في المناطق الفقيرة في البلدان النامية، بما في ذلك الهند [2]. وفقا لتقارير منظمة الصحة العالمية، تعتبر الهند موطنا لكلا شكلي المرض، CL وVL. يحدث داء الليشمانيات الليشمانية الناجم عن الليشمانية المدارية والليشمانية الكبرى في الولايات الشمالية الغربية من الهند والبنجاب وراجستان باعتبارها البؤر (https://www.who.int/leishmaniasis/ عبء/داء الليشمانيات_India/en/ ). علاوة على ذلك، مع تزايد انتشار وباء فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) في جميع أنحاء العالم، ظهر داء الليشمانيات كعامل ممرض انتهازي يعاود الظهور لدى مرضى الإيدز، مما يجعل الوضع أكثر فظاعة [22، 38]. في الدراسة الحالية، كنا نهدف إلى تصميم لقاح عام متعدد التكافؤ جديد لداء الليشمانيات الذي قد يوفر حماية غير متجانسة من أنواع الطفيليات المسببة للأمراض الشائعة. لقد اخترنا اثني عشر بروتينًا خاصًا بالليشمانيا تشمل خمس سلالات مسببة للأمراض من الطفيلي الذي يسبب عدوى VL وCL في البشر. تم بالفعل تقييم هذه البروتينات لدورها في الفوعة والمناعة وإمكاناتها كمرشحين للقاحات في العديد من الدراسات المناعية [1، 8–1 0، 75). ولذلك، فإن بناء اللقاح المصمم في السيليكو من خلال دمج مثل هذه البروتينات المناعية المميزة والمحفوظة للغاية من مختلف الأنواع المسببة للأمراض من الليشمانيا قد يوفر مناعة متقاطعة ضد جميع أشكال داء الليشمانيات البشري (أساسًا VL وCL)، وبالتالي، يمكن استخدامه لعلاج برنامج تطعيم عام للوقاية من عدوى الليشمانيا لدى البشر. تم فحص البروتينات المختارة بشكل أساسي بحثًا عن وجود حلقات CTL وHTL المحتملة. يعد اكتشاف حواتم الخلايا التائية أمرًا مهمًا نظرًا لأن الخلايا التائية لا يمكنها التعرف على المستضدات إلا عند معالجتها إما عن طريق مسار داخلي أو خارجي، معقد مع جزيئات MHC من الصنف الأول أو MHC من الصنف II، ويتم تقديمها لاحقًا إلى مستقبلات الخلايا التائية بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد ( ناقلات الجنود المدرعة). MHC-I خاص بمستقبلات CD8+CTL، بينما يرتبط MHC-II بشكل خاص بمستقبلات CD4+HTL. تم تحديد هوية حلقات CTL بشكل صارم من خلال استخدام خادمين مستقلين في وقت واحد. فقط تلك الحواتم التي تنبأ بها كلا الخادمين ذات ارتباطات ربط MHC أعلى بكثير تم تضمينها أخيرًا في ببتيد اللقاح. تم تقييم حلقات HTL التي تم تحديدها أيضًا لقدراتها على تحفيز السيتوكينات من خلال استغلال ثلاثة خوادم ويب. تم اختيار تلك التي يمكن أن تحفز إنتاج مجموعة واسعة من السيتوكينات، وهي IFN- وIL{{20}} وIL-10، لتصميم لقاح الببتيد الخيميري لضمان ذلك فإنه يحرض على إنتاج كل هذه السيتوكينات الخاصة بالطفيليات في المضيف. يعد هذا أمرًا في غاية الأهمية نظرًا لأن Kedzierski وزملاؤه اقترحوا أن إفراز IL-10 لا يقل أهمية عن إفراز IFN- لتحديد ما إذا كان اللقاح يمكن أن يثير استجابة مناعية وقائية وأنه لا يتم تحفيز المناعة المناسبة إذا كان IL -10 مستويات ليست مرتفعة بشكل متناسب [8، 75]. تم بعد ذلك دمج حلقات CTL وHTL الحصرية باستخدام روابط AAY وGPGPG لبناء الببتيد الخيميري. تم الإبلاغ سابقًا عن أن روابط AAY وGPGPG مفيدة لتصميم لقاح متعدد الحواتم لأنها تسمح بالحد الأدنى من المناعة الوصلية وتسهل معالجة وعرض الحواتم المختارة بواسطة MHC-II [6، 28، 71]. تم ربط سلسلة ألفا المساعدة لـ IL-12 البشري بالطرف N للببتيد الناتج عبر رابط EAAK. تم اختيار IL-12 كمساعد لأنه أحد أكثر المواد المساعدة فعالية للقاح الليشمانيا في النماذج الحيوانية، كما هو موثق في الدراسات المناعية السابقة [3، 37، 71]. نظرًا لأن اللقاح مخصص للاستخدام البشري، فمن المتوقع أن يؤدي دمج IL{38}} البشري كمساعد طبيعي بدلاً من أي ناهض TLR اصطناعي إلى تعزيز المناعة دون التسبب في آثار جانبية ضارة. يتم أيضًا التأكيد على دور IL-12 كمساعد عام للقاحات نظرًا لفعاليته في تعزيز استجابات الأجسام المضادة للقاح البروتين والسكاريد وإحداث التهاب موضعي مناسب يسمح بإفراز IgG مما يؤدي إلى استجابة مناعية متزايدة [72]. تمت إضافة رابط EAAK لتحقيق معدل أعلى من التعبير وتعزيز الوظيفة البيولوجية للببتيد الاندماجي عن طريق تقييد التفاعل بين مجالات اللقاح [76، 77]. أظهر تحليل المعلومات المناعية أن بناء اللقاح الخاص بنا يحتوي على العديد من الحواتم الخطية للخلايا البائية المرغوبة للغاية للقاح المصنوع للاستخدام الوقائي المناعي. مرة أخرى، استخدمنا أداتين مختلفتين للحصول على تنبؤات أكثر دقة. توقع كلا الخادمين وجود حلقات كافية من الخلايا البائية في تسلسل اللقاح. كان من المتوقع أن يكون اللقاح المصمم غير مسبب للحساسية، وغير سام، وذو مناعة كافية لإثارة رد فعل مناعي مناسب. كشف التحليل الفيزيائي الكيميائي اللاحق أن ببتيد اللقاح حمضي قليلاً (pI 5.98) مع مؤشر أليفاتي أعلى بكثير (78.34)، مما يشير إلى طبيعته القابلة للحرارة. تشير قيمة GRAVY السلبية (.140.14) إلى أن الببتيد محب للماء، مما يساهم بشكل أكبر في فعاليته كلقاح. تم تحديد العناصر الهيكلية الثانوية للقاح بواسطة خادم PSIPRED v 4.0، والذي يعد أحد أكثر الطرق الحسابية دقة واستخدامًا على نطاق واسع للتنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين. علاوة على ذلك، تم التنبؤ أيضًا بالبنية ثلاثية الأبعاد للببتيد المصمم باستخدام خادم I-TASSER الذي قدم معلومات تفصيلية حول إحداثيات المخلفات المهمة للبروتين، والتي لها أهمية قصوى لدراسة ديناميكيات اللقاح ونشاطه الحيوي وتفاعله. مع بروابط أخرى. تم تحسين البنية الثلاثية الأولية والتحقق من صحتها من خلال استخدام أدوات التحقق من صحة بنية البروتين لتحديد وتصحيح الأخطاء المحتملة في السلسلة الجانبية أو العمود الفقري للنموذج المتوقع. أظهر تحليل مخطط راماشاندران أن أكثر من 90% من بقايا النموذج المكرر تقع ضمن المنطقة المسموح بها مع نسبة صغيرة من القيم المتطرفة، في حين أظهر خادم ERRAT عامل جودة قدره 43.542 والتي تشير جميعها إلى جودة مرضية للنموذج. تم العثور على النموذج ثلاثي الأبعاد الذي تم التحقق من صحته يحتوي على عدد مناسب من حلقات الخلية البائية المطابقة بواسطة خادم ElliPro، مما يشير إلى أنه قد يولد استجابة خلية B مرغوبة ويحفز إنتاج أجسام مضادة محددة في المضيف. يعد تنشيط الخلايا البائية أمرًا بالغ الأهمية أيضًا في الذاكرة المناعية ومسؤولًا عن مناعة طويلة الأمد لدى الأفراد الملقحين. تم أيضًا تقييم تفاعل اللقاح مع المستقبلات المناعية (TLRs) من خلال إجراء تحليل الالتحام. وجد أن ببتيد اللقاح يتمتع بأعلى درجة تقارب لـ TLR-2، يليه TLR-5، على الرغم من أنه كان قادرًا على الارتباط مع TLRs الأخرى بدرجة أقل. يعد التفاعل مع TLRs ضروريًا للحصول على مناعة وقائية منذ أن وثقت الدراسات السابقة التي تتضمن نماذج حيوانية أن أنواعًا مختلفة من الليشمانيا أو مكوناتها المستضدية تتفاعل مع TLRs المختلفة مما يؤدي إلى استجابة مناعية مكثفة في العوائل المتحدية. لتلبية متطلبات التعبير المرضي عن بروتين اللقاح المؤتلف في النظام المضيف لـ E. coli (K12)، تم إجراء تحسين الكودون من خلال تطبيق أداة JCat التي قامت بتعديل محتويات CAI وGC للتسلسل، مما يجعلها مناسبة للتعبير في بكتريا قولونية. تم أيضًا إجراء استنساخ السيليكو باستخدام ناقل التعبير القائم على البلازميد pET28a(+) لإظهار جدوى تسلسل الاستنساخ والإفراط في التعبير لتحقيق إنتاج معزز لبروتين اللقاح المؤتلف. تم التنبؤ بالبنية الثانوية للرنا المرسال المشفر بواسطة تسلسل الجينات الخيمرية لإظهار ثبات التشكل المطوي للرنا المرسال الذي سيؤثر على عملية الترجمة الفعالة في المضيف البكتيري. تم إنشاء طفرات التثبيت عن طريق إضافة روابط ثاني كبريتيد جديدة في بروتين اللقاح لأنها ستساهم في قوة البروتين الأصلي، مما يجعله قابلاً للاستكشافات الكيميائية الحيوية والمناعية والتكنولوجية الحيوية الإضافية.

الشكل 9: المحاكاة المناعية القائمة على خادم C-immsim. (أ) توليد المستضد الكلي والأجسام المضادة المعنية، وملف إنتاج السيتوكينات (ب)، وتوليد الخلايا التائية المساعدة (ج) و (د) وإجمالي عدد الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (النشيطة والمستقرة)، واستجابة الخلايا البائية بعد إعطاء اللقاح

الشكل 10: المحاكاة الديناميكية الجزيئية. a تشوه السلسلة الرئيسية المشار إليه بواسطة المفصلات ، b عامل B الذي تم إنشاؤه بواسطة NMA يُظهر ثبات البروتين ، c القيمة الذاتية لتشوه بنية مجمع الإرساء ، d فردي (أرجواني)٪ من التباين والتراكمي (الأخضر) للهيكل ، مصفوفة التغاير e مرتبطة (أحمر) أو غير مرتبط (أبيض) أو غير مرتبط (أزرق) بين أزواج الذرات، ونموذج شبكة مرن يوضح نوابض متصلة بين أزواج الذرة، ويشير اللون الرمادي الداكن إلى نوابض صلبة والعكس صحيح

فوائد مكملات cistanche - زيادة المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

خاتمة

في العمل الحالي، استغلنا نهج اللقاحات العكسية للتصميم السيليكو للقاح الببتيد متعدد التكافؤ متعدد الوحدات ضد داء الليشمانيات البشري (سواء الحشوي أو الجلدي) والذي قد يكون قادرًا على منح حماية غير متجانسة من طفيليات الليشمانيا الشائعة التي تصيب البشر، وبالتالي، يمكن اعتبارها واسعة النطاق بطبيعتها. ويمكن استخدام نفس الشيء في برنامج التطعيم العام للسيطرة على المرض والقضاء عليه كاستراتيجية تكميلية إلى جانب عوامل العلاج الكيميائي المتاحة حاليًا. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا IL-12 كمساعد طبيعي بدلاً من أي ببتيد صناعي غير بشري. سيؤدي استخدام IL-12 كمادة مساعدة إلى زيادة مناعة اللقاح دون التسبب في أي آثار جانبية ضارة في الجسم المضيف. شريطة أن يتكون الببتيد اللقاحي من مجموعة متنوعة من الببتيدات المحفوظة بدرجة عالية والتي يحتمل أن تكون مناعية تم الحصول عليها من خمسة أنواع من الليشمانيا المسببة للأمراض، فمن المفيد الحصول على مناعة متقاطعة لدى الأفراد الملقحين، وبالتالي الحصول أيضًا على مزايا علاجية ووقائية. لقد وجدت العديد من التحليلات المعلوماتية المناعية الصارمة باستخدام العديد من الأدوات الحسابية أن اللقاح المقترح مناعي ومستقر وقابل للتكاثر كبروتين مؤتلف وآمن للتجارب البشرية. ومع ذلك، لا يزال يتعين إجراء التحقق التجريبي لضمان الاستنباط المناسب لمناعة وقائية وطويلة الأمد واستبعاد السمية.

مراجع

1. دي بريتو RCF، كاردوسو جمو، ريس ليه، فييرا جي إف، ماتياس فاس، روات بي إم، أجيوار سواريس آر دي دي أو، رويز جي سي، ريسندي دي إم وآخرون. (2018) لقاحات الببتيد لداء الليشمانيات. الجبهة المناعيول 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) العبء الاجتماعي والاقتصادي لداء الليشمانيات البشري. آم جي تروب ميد هيج 94(3):489-493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. موتيسو جي إم، ماشاريا جي سي، جيشيرو إم إم جي (2010) بيوميد ريس 24(1):16-25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM، Beaumier CM، Strych U، Hayward T، Hotez PJ، Bottazzi ME (2016) حالة أبحاث اللقاحات وتطوير لقاحات لداء الليشمانيات. اللقاح 34(26):2992-2995. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. جوشي إس، روات كيه، ياداف إن كيه، كومار في (2014) صديقي مي أند ودوبي أ (2014) داء الليشمانيات الحشوي: التقدم في تطوير اللقاحات عبر الأساليب الكلاسيكية والجزيئية. الجبهة المناعيول 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) استكشاف البروتينات الإفرازية لليشمانيا لتصميم لقاح متعدد الوحدات الفرعية للخلايا B وT باستخدام نهج المعلوماتية المناعية. مندوب العلوم 7: 8285

7. Goto Y، Bhatia A، Raman VS، Liang H، Ahmad R، Picone AF، Vidal SEZ، Vedvick TS et al (2011) KSAC، أول لقاح متعدد البروتينات محدد مرشح لداء الليشمانيات الحشوي. لقاح كلين إيمونول 18(7):1118-1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. كيدزيرسكي إل (2010) لقاح داء الليشمانيات: أين نحن اليوم؟ جي جلوب إنفيكت ديس 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) اللقاحات المرشحة لداء الليشمانيات: مراجعة. إنت إمونوفارماكول 11(10):1464-1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. كولر آر إن، ريد إس جي (2005) لقاحات الجيل الثاني ضد داء الليشمانيات. الاتجاهات الطفيلي 21 (5): 244-249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M et al (2018) مستضد مستضد c-kinase المنشط بالليشمانيا (LACK) في أحاديات الدم المحيطية البشرية الخلايا والتأثير الوقائي للتطعيم المعزز الأولي باستخدام pCI-neo-LACK بالإضافة إلى فيروسات اللقاح الموهنة التي تعبر عن LACK في الهامستر. الجبهة المناعيول 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. كيلي BL، Stetson DB، Locksley RM (2003) مطلوب مستضد الليشمانيا الرئيسي LACK لتطفل الفقاريات بكفاءة. J إكسب ميد 198(11):1689-1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) بروتين غشاء الحركية -11 كمرشح لقاح وعامل فوعة في الليشمانيا. الجبهة المناعيول 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14. جوشي PB، كيلي BL، Kamhawi S، Sacks DL، McMaster WR (2002) حذف الجينات المستهدفة في الليشمانيا الكبرى يحدد الليشمانوليسين (GP63) كعامل فوعة. مول بيوكيم باراسيتول 120 (1): 33-40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D، Rodriguez D، Rodriguez JR، Zhang Y، Manson K، Bergman C، Rivas L، Rodriguez JL et al (1993) فيروسات اللقاح المؤتلف التي تعبر عن GP46/M-2 تحمي من عدوى الليشمانيا. تصيب المناعة 61(8):3351-3359

16. Holakuyee M، Mahdavi M، Zuhair MH، Abolhasani M (2012) بروتين الصدمة الحرارية المخصب من الليشمانيا الكبرى الذي يحفز الاستجابة المناعية Th2 في الفئران BALB / c. إيران بيوميد J 16(4):209-217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) استكشاف مسار تصدير بروتين الليشمانيا السطحي المحب للماء (HASPB) عن طريق طرق تصوير الخلايا الحية. طرق مول بيول 1459: 191-203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR، Tewari AK، Singh V (2015) نظرة عامة على قضيب parafagellar الحركية. J Parasit Dis 39(4):589-595. https://doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. محمودزاده NH، ماكيرو JH (2004) الليشمانيا الاستوائية: البروتياز السيستين ضرورية للنمو والتسبب في الأمراض. إكسب باراسيتول 106(3-4):158-163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V، Kucknoor AS، Gedamu L (2005) دور الليشمانيا (الليشمانيا) تشاجاسي أماستيجوت سيستين بروتياز في بقاء الطفيليات السفرية: دراسات عن طريق تعطيل الجينات وتثبيط مرنا المضاد للفيروسات. بي إم سي مول بيول 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. روجرز ME (2012) دور الليشمانيا بروتيو فوسفوجليكان في انتقال ذبابة الرمل وإصابة مضيف الثدييات. الجبهة ميكروبيول 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) تحديد مستضدات الليشمانيا الدونوفانية الجديدة التي تساعد في تحديد ارتباطات الحماية التي يتوسطها اللقاح في داء الليشمانيات الحشوي. بلوس واحد 4(6):e5820. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM، Mancini DT، Ramalho TC، da Cunha EFF (2014) في دراسة سيليكو لليشمانيا دونوفاني - التوبولين والمثبطات. ي كيم. https://doi.org/10.1155/2014/492579