التقييم في المختبر لتفاعلات الدواء مع الأدوية بوساطة P ‑ gp باستخدام نموذج الخلية الكلوية البشرية RPTEC / TERT1

edmund.chen@wecistanche.com

مقدمة يعد التقييم في المختبر لإمكانية تثبيط البروتين السكري (P-gp) قضية مهمة أثناء عملية تطوير الدواء ، حيث يسمح بالتنبؤ بالتفاعلات الدوائية - الدوائية ذات الصلة سريريًا (DDIs) [1-3]. ينتمي P-gp إلى عائلة ناقل ربط ATP (ABC) الفائقة ويتم ترميزه بواسطة جين مقاومة الأدوية المتعددة MDR1 (المعروف أيضًا باسم ABCB1). ومن المعروف أن ناقل الغشاء هذا يكون مفرط التعبير في الخلايا السرطانية ويسبب مقاومة للعديد من الأدوية المضادة للسرطان [4]. يقع داخل جميع الحواجز الفسيولوجية ، بما في ذلك الأمعاء والكبد والكلى، P-gp يحمي من المواد الغريبة عن طريق الحد من امتصاص هذه الركائز من الجهاز الهضمي وتسهيل تدفقها إلى الصفراء والبول. وهكذا ، يلعب P-gp دورًا بارزًا في الحرائك الدوائية لمختلف الفئات العلاجية [5-7]. من المعروف أن عددًا كبيرًا من الأدوية مثل العوامل المضادة للسرطان ومضادات الفطريات وأدوية القلب والأوعية الدموية هي ركائز و / أو مثبطات P-gp ، ويشارك العديد منها في التفاعلات ذات الصلة سريريًا [8-10]. لذلك ، تفرض إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) تقييم إمكانية تثبيط P-gp خلال المراحل المبكرة من تطوير الدواء. عادةً ما تستند الفحوصات المخبرية التي يتم إجراؤها لهذا الغرض إلى دراسات نقل الأدوية باستخدام خطوط الخلايا المعبرة عن P-gp. بتعبير أدق ، توصي إرشادات إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بتحديد قيم التركيز المثبط نصف الأقصى في المختبر (IC50) لتقييم مخاطر DDIs السريرية الناتجة عن تثبيط P-gp. تحقيقا لهذه الغاية ، تم إجراء العديد من الاختبارات التجريبية ، وركز معظمها على التفاعلات الدوائية المتعلقة بالامتصاص المعوي باستخدام نماذج Caco -2 أو MDCK-MDR1 [11-13]

سيحسن القسطرة من أمراض الكلى / الكلى

حيثكلوييعتبر التخلص أيضًا طريقًا شائعًا للتخلص من فئات مختلفة من الأدوية ، كما أن الإفراز الأنبوبي النشط عبر ناقلات ABC قد يلعب أيضًا دورًا رئيسيًا في هذه التفاعلات [14]. ومع ذلك ، في المختبر البيانات علىكلويDDIs بوساطة P-gp محدودة. هذا يرجع جزئيًا إلى نقص تطوير وتوصيف النماذج المختبرية للتنبؤكلوينقل المخدرات. من بين خطوط الخلايا البشرية المختلفة ، يبدو أن نموذج RPTEC / TERT1 يبشر بالخير لتقييمكلويتفاعل الأدوية. يُشتق خط الخلية هذا من متبرع بشري سليم وقد تم إنشاؤه من خلايا نبيبات قريبة خالدة. علاوة على ذلك ، تم توضيح تعبير ووظيفة P-gp باستخدام هذا النموذج ، مما يفسد قدرته على التنبؤكلويefuxes الأدوية [15 ، 16]. في هذا السياق ، تم تصميم الدراسة الحالية للتحقيق في إمكانات تثبيط P-gp باستخدام نموذج RPTEC / TERT1. أولاً ، تم إجراء اختبار فحص تراكم رودامين 123 (R123) للحصول على ملف تعريف تثبيط لكل عقار تم اختباره. بناءً على هذا الفحص ، تم بعد ذلك اختيار أربعة عقاقير لتقييم التأثيرات المعتمدة على التركيز على التراكم داخل الخلايا لعقاقير ركيزة P-gp: apixaban و rivaroxaban

الكلمات الدالة:الخلايا الكلوية ، النموذج الكلوي ، الأدوية الكلوية ، القضاء الكلوي ، الكلى.

المواد والأساليب

الكواشفApixaban، [2H 71 3 C] - api xa ban، ri va r oxa ban، [13C6] -rivaroxaban، nilotinib، crizotinib، erlotinib، axitinib، idelalisib، warfarin، and dabigatran etexilate تم شراؤها من Alsachim (Alsachim) فرنسا). تم شراء Verapamil و ketoconazole و simvastatin و amiodarone و rhodamine 123 ومحلول Hank المتوازن الملح (HBSS) ومحلول HEPES من Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier ، فرنسا).

زراعة الخلايا  تم الحصول على خلايا RPTEC / TERT1 من مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC ، Molsheim ، فرنسا) وتم تربيتها في وسط منزوع الهرموني وخالي من المصل يتكون من Dulbecco's Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC) المكملة بمجموعة عوامل النمو (ATCC) و a مزيج مضاد حيوي / مضاد حيوي بنسبة 1 في المائة (بنسلين - ستربتومايسين ، أمفوتيريسين ب) عند 37 درجة و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون 2. بالنسبة لجميع التجارب ، تم بذر الخلايا في 96- أطباق جيدة بكثافة 50 ، 000 الخلايا لكل بئر واستخدمت لتنمو بعد 14 يومًا من الثقافة. تم تجديد الوسيط كل يومين وتم استخدام الخلايا من الممر 27 إلى الممر 34. كما تم شراء خلايا Caco -2 من ATCC. تم الحفاظ على الخلايا في وسط مستنبت يتكون من الوسط الأساسي الأدنى من Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) مكملًا بنسبة 10 بالمائة FBS ، و 1 بالمائة من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، ومزيج مضاد حيوي / مضاد للفطريات بنسبة 1 بالمائة (بنسلين - ستربتومايسين ، أمفوتريسين ب ) عند 37 درجة و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم زرع خلايا Caco -2 في 96- أطباق بئر بكثافة 5 × {{24} خلية لكل بئر واستخدمت للنمو بعد 14 يومًا من الثقافة. تم الحصول على الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة البشرية (HPTECs) من BIOPREDIC (رين ، فرنسا) وزُرعت في DMEM / F12 مع الهيدروكورتيزون ، EGF ، الأنسولين ، الترانسفيرين ، وسيلينيت الصوديوم. تم بذر الخلايا في 96- ألواح استنبات مُجمَّعة جيدًا بكثافة 6600 خلية لكل بئر واستخدمت للنمو بعد 11 يومًا من الثقافة.

فحص فحص تراكم رودامين 123  تم تحديد القدرة المثبطة لـ P-gp عن طريق قياس التراكم داخل الخلايا للرودامين 123 في خلايا RPTEC / TERT1 في وجود وغياب فئات مختلفة من الأدوية. من بين الأدوية الـ 14 التي تم اختبارها ، تم استخدام السيكلوسبورين A (10 ميكرومتر) والكيتوكونازول (50 ميكرومتر) وفيراباميل (100 ميكرومتر) والأميودارون (50 ميكرومتر) كمثبطات P-gp. تم استخدام Apixaban و rivaroxaban و dabigatran etexilate - ثلاثة مضادات التخثر الفموية المباشرة (DOACs) - كركائز P-gp (10 ميكرومتر). تم استخدام الوارفارين (50 ميكرومتر) كعقاقير غير مثبطة ، وتم استخدام الأدوية المضادة للسرطان بما في ذلك nilotinib و crizotinib و erlotinib و idelalisib دون معرفة ملامح تثبيطها بتركيز 10 ميكرومتر. تمت إعادة إنتاج العديد من الشروط باستخدام خلايا Caco -2 ، والتي تمت الموافقة عليها من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) لدراسات نقل الأدوية. بهذه الطريقة ، تم تحديد الاحتفاظ داخل الخلايا للرودامين 123 في خلايا Caco -2 في وجود وغياب فيراباميل (100 ميكرومتر) ، وسيكلوسبورين أ (10 ميكرومتر) ، ونيلوتينيب (10 ميكرومتر) ، ودواكس (10 ميكرومتر). ). باختصار ، بعد 14 يومًا من الثقافة في 96- ألواح الآبار ، تم تحضين الخلايا مسبقًا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مع كل عقار مذاب في HBSS بـ 10 ملي مولار HEPES (ت / ت). ثم تم تحضين الخلايا بـ 10 ميكرومتر رودامين 123 لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة. أخيرًا ، بعد ثلاث عمليات غسل في محلول HBSS / HEPES بارد ، تم تحلل الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في محلول من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) يحتوي على 1 في المائة من بورات الصوديوم. تم قياس كمية مادة رودامين 123 داخل الخلايا باستخدام مقياس الطيف النانوي Infnite M (علوم الحياة ، TECAN ، سويسرا) ، مع ضبط الأطوال الموجية على 485/535 نانومتر. تم التعبير عن البيانات كنسب مئوية لتراكم رودامين 123 في خلايا التحكم التي لم تتعرض لأي مثبطات محتملة لـ P-gp وتم ضبطها بشكل تعسفي عند تراكم 100 بالمائة.

فحص التراكم داخل الخلايا DOAC وتحديد IC50 من اختبار فحص الرودامين 123 السابق ، تم اختيار أربعة عقاقير للتحقيق في تأثيراتها المعتمدة على التركيز على التراكم داخل الخلايا لأبيكسابان وريفاروكسابان (1 0 ميكرومتر) في خلايا RPTEC / TERT1. تم اختيار الكيتوكونازول ، والكريزوتينيب ، والنيلوتينيب كمثبطات P-gp ، وتم اختيار الوارفارين على أنه غير مثبط. تم استخدام السيكلوسبورين أ (1 0 ميكرومتر) كمثبط واسع الطيف للناقلات. تم إعادة إنتاج دراسات التفاعلات بين DOACs و nilotinib لتحديد قيم IC5 0 في خلايا Caco -2 من أجل مقارنة النموذجين الخلويين. تم تخفيف جميع المركبات إما بمفردها أو بالمثبط المرتبط في نقل HBSS المضاف إليه 1 بالمائة HEPES (v / v) و 1 بالمائة DMSO (v / v). قبل الحضانة ، تم تسخين جميع المحاليل مسبقًا إلى 37 درجة وتم تعديل الأس الهيدروجيني إلى 7.4. بالنسبة للعقاقير المضادة للسرطان كريزوتينيب ونيلوتينيب ، بسبب ضعف قابليتها للذوبان والقدرة على تسمم الخلايا ، تراوحت التركيزات من 0.1 إلى 25 ميكرومتر. بالنسبة للكيتوكونازول والوارفارين ، تراوحت نسب تركيز كونسين من 0.1 إلى 100 ميكرومتر. باختصار ، بعد 14 يومًا من الاستنبات ، تم تحضين جميع الأدوية في HBSS بنسبة 1 بالمائة HEPES (حجم / حجم) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة. بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا بـ 10 ميكرومتر من أبيكسابان أو ريفاروكسابان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة. أخيرًا ، بعد ثلاث غسلات في محلول HBSS / HEPES بارد ، تم تحلل الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في محلول 0.2 بالمائة من Triton X -100. ثم تم قياس كمية DOAC داخل الخلايا بواسطة كروماتوجرافيا سائلة - مطياف الكتلة (LC-MS). تم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الزيادات في تراكم DOAC ، وتم تعيين تراكم اللولار داخل DOAC بشكل تعسفي بنسبة 100 في المائة في خلايا التحكم. تم تحديد قيم IC لتثبيط نشاط P-gp ، والتي تتوافق مع قيم التركيز الفعال نصف القصوى (EC50) لزيادة تراكم DOAC ، من نمذجة انحدار المربعات الصغرى غير الموزونة للتراكم المتزايد مع وظيفة 'nls ()' في R برمجيًا وفقًا للمعادلة التالية (مكافئ 1):

اللوني السائل - تحليل مطياف الكتلةتم إجراء القياس الكمي لـ apixaban (m / z 46 0. 19793) و rivaroxaban (m / z 436. 0 7285) باستخدام Ultimate U3 0 0 {{18 }} نظام الكروماتوغرافيا السائلة (Dionex ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مقترنًا بمطياف الكتلة Q-Exactive Plus (ThermoFisher ، بريمن ، ألمانيا). تم تحقيق عمليات فصل LC باستخدام عمود تحليلي Hypersil Gold C18 (3 ميكرومتر ، 5 0 × 2.1 مم) (ThermoFisher Scientifc ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومعدل تدفق يبلغ 0. 6 مل / دقيقة . الطور المتحرك أ عبارة عن ماء يحتوي على 0. 1٪ حمض الفورميك (FA) والطور المتحرك ب كان أسيتونيتريل مع 0. 1٪ FA. بالنسبة إلى rivaroxaban ، كان التدرج: 0 - 0. 3 دقائق ، 10 بالمائة ب ؛ 0.3-1 دقيقة ، خطي من 10 في المائة إلى 70 في المائة ب ؛ 1 - 1.5 دقيقة ، 70 بالمائة ب ؛ 1.51 دقيقة ، العودة إلى ظروف البداية حتى 3 دقائق. بالنسبة لأبيكسابان ، كان التدرج اللوني: 0-0.3 دقيقة ، 10 بالمائة ب ؛ 0.3-0.7 دقيقة ، خطي من 10 إلى 90 في المائة ب ؛ 0.7-1.5 ، 90 بالمائة ب ؛ 1.51 دقيقة ، العودة إلى ظروف البداية حتى 3 دقائق. تم إجراء الكشف في وضع مراقبة التفاعل المتوازي الموجب بالرش الكهربائي (PRM) بدقة 35 ، 000 (عند m / z 200). كانت المعايير الداخلية (ISs) هي [13C، 2H7] -apixaban (m / z 468.2452) لأبيكسابان و [13C6] -rivaroxaban (m / z 442.09297) للريفاروكسابان. لكل عقار و IS الخاص به ، تم رصد أيون مستهدف (من أجل القياس الكمي) وأيون confrming. بالنسبة إلى rivaroxaban و IS الخاص به ، كان أيون الهدف هو m / z 144.95125 وكانت الأيونات المتجمعة m / z 231.11280 و m / z 237.13298 ، على التوالي. بالنسبة إلى apixaban و IS الخاص به ، كان أيون الهدف هو m / z 199.08656 وكانت الأيونات المتجمعة m / z 282.12387 و m / z 241.06062 على التوالي.

نتائج

فحص فحص تراكم رودامين 123تم إجراء فحص فحص تراكم الرودامين 123 في خلايا RPTEC / TERT1 مع 14 عقارًا مع أنماط تثبيط مختلفة (الشكل 1). كما هو متوقع ، كان التراكم داخل الخلايا للرودامين 123 في وجود السيكلوسبورين أ ، مثبط واسع الطيف ، من بين أعلى المستويات ، مع زيادة في التراكم بنسبة 75 في المائة مقارنة بخلايا التحكم. أدى وجود فيراباميل ، وهو مثبط محدد لـ P-gp ، إلى زيادة تراكم رودامين 123 بنسبة 57 بالمائة ، مما يدل على تورط P-gp. وبنفس الطريقة ، فإن الكيتوكونازول ، الموصوف بأنه مثبط قوي لـ P-gp ، أدى إلى زيادة أكبر (66 في المائة) في التراكم داخل الخلايا للرودامين 123 مقارنة بالفيراباميل ، مما أدى إلى تثبيطه. على العكس من ذلك ، فإن إضافة الأميودارون ، الذي يتميز بأنه مثبط معتدل لـ P-gp ، تسبب في زيادة التراكم بنسبة 59 في المائة ، وهو ما يشبه ذلك الذي يسببه فيراباميل. لوحظت مظاهر تثبيط مختلفة للعوامل المضادة للسرطان مثل nilotinib و axitinib و crizotinib و erlotinib و idelalisib. أدت إضافة nilotinib إلى زيادة قوية في تراكم رودامين 123 (71 بالمائة) ، مما يشير إلى إمكانية تثبيط كبيرة ، يليه أكسيتينيب ، مما تسبب في زيادة في الاحتفاظ بنسبة 57 في المائة. من ناحية أخرى ، أظهر crizotinib و erlotinib إمكانات مثبطة معتدلة إلى منخفضة ، مع زيادة في تراكم رودامين 123 بنسبة 23 في المائة و 16 في المائة على التوالي. لم يؤثر إديلاليسيب على تراكم رودامين 123 ؛ كان الشيء نفسه ينطبق على الوارفارين ، والذي كان

تم اختياره على أنه غير مثبط. من بين ثلاثة DOACs ، تسبب apixaban و rivaroxaban في زيادات طفيفة في الاحتفاظ بالرودامين 123: 33 في المائة و 12 في المائة على التوالي. ومن المثير للاهتمام ، أن dabigatran etexilate ، وهو عقار أولي من dabigatran وركيزة معروفة من P-gp ، تسبب في زيادة الاحتفاظ بالرودامين 123 بحوالي 50 بالمائة ، على الرغم من أنه لا يوصف بأنه مثبط محتمل لـ P-gp. أخيرًا ، أدت إضافة سيمفاستاتين إلى زيادة طفيفة فقط في تراكم الركيزة fuorescent (32 بالمائة). بناءً على هذا الفحص ، تم اختيار أربعة عقاقير لتقييم آثارها المعتمدة على التركيز على التراكم داخل الخلايا لـ apixaban و rivaroxaban ضمن نموذج RPTEC / TERT1. تم اختيار الكيتوكونازول كشرط تحكم إيجابي لتثبيط P-gp ، وتم اختيار الوارفارين كمثبط لـ P-gp لحالة التحكم السلبية. تم اختيار Nilotinib و crizotinib كمثبطات P-gp قوية ومتوسطة على التوالي. تمت إعادة إنتاج العديد من الشروط مع النموذج المرجعي ، Caco -2. تم تحديد التراكم داخل الخلايا لـ R123 في الخلايا بعد الدمج (أو لا) مع أبيكسابان وريفاروكسابان (10 ميكرومتر) ونيلوتينيب (10 ميكرومتر) وسيكلوسبورين أ (10 ميكرومتر) وفيراباميل (100 ميكرومتر) لظروف التحكم للتثبيط (الشكل 2 أ). كما هو متوقع ، تسبب فيراباميل وسيكلوسبورين أ في زيادة احتباس R123 بنسبة 297 في المائة و 275 في المائة على التوالي. وبنفس الطريقة ، تسبب nilotinib في زيادة عالية في التراكم داخل الخلايا لـ R123 (229 بالمائة) ، مما يخلط بين قدرته التثبيطية. أدى الجمع بين R123 و DOACs إلى زيادات طفيفة في تراكم R123 (40-44 بالمائة) مقارنة بالعقاقير الأخرى. علاوة على ذلك ، فإن التراكم داخل الخلايا للرودامين 123 في غياب ووجود السيكلوسبورين أ فيكلويتم فحص الخلايا البشرية الأولية أيضًا في هذه الدراسة للتحقق من موثوقية النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خلايا RPTEC / TERT1 (الشكل 2 ب). أظهرت هذه التحليلات أن وجود السيكلوسبورين أ زاد من احتباس R123 بنسبة 71 بالمائة. كانت هذه القيمة قريبة من تلك التي تم الحصول عليها في ظل نفس الظروف مع خلايا RPTEC / TERT1 (زيادة بنسبة 75 في المائة باستخدام السيكلوسبورين أ). لذلك ، كان نشاط P-glycoprotein مشابهًا في نموذج RPTEC / TERT1 والخلايا البشرية الأولية.

مقايسة التراكم داخل الخلايا DOACs: تحديد نسبة IC50 و I1 / IC50 تم إجراء دراسات التراكم داخل الخلايا لتقييم النقل بوساطة P-gp لأبيكسابان وريفاروكسابان بتركيز ثابت قدره 1 0 ميكرومتر في خلايا RPTEC / TERT1 في المختبر وفي وجود تركيزات متزايدة من nilotinib و crizotinib و ketoconazole ، والوارفارين (الأشكال 2 ، 3). تم تقييم نمذجة زيادة reten apixaban و rivaroxaban لتحديد قيم IC. أدى الجمع بين DOACs والنيلوتينيب إلى أدنى قيم IC50: 0.85 ميكرومتر و 1.37 ميكرومتر للريفاروكسابان وأبيكسابان ، على التوالي (الأشكال 4 ، 5). أسفر الجمع مع crizotinib عن قيم IC50 تبلغ 10.1 ميكرومتر و 12.2 ميكرومتر للريفاروكسابان وأبيكسابان ، على التوالي. من المثير للدهشة أن الجمع بين DOACs مع كيتو كونازول لم ينتج عنه أدنى قيم IC50 (16.5 ميكرومتر و 16.9 ميكرومتر لـ rivaroxaban و apixaban ، على التوالي). أخيرًا ، كما هو متوقع ، تم الجمع بينه وبين الوارفارين ، والذي كان

تم اختياره على أنه غير مثبط ، ولم يؤثر على عمليات الاحتفاظ داخل الخلايا لاثنين من DOACs. لذلك تم فحص التراكم داخل الخلايا لكل من apixaban و rivaroxaban داخل خلايا Caco -2 في وجود تركيزات متزايدة من nilotinib للمقارنة مع النماذج الخلوية. ومن المثير للاهتمام ، كما لوحظ في نموذج RPTEC / TERT1 ، أن قيمة IC5 0 للريفاروكسابان (4.16 ميكرومتر) كانت أقل من تلك التي تم الحصول عليها لأبيكسابان (9.35 ميكرومتر). من المثير للاهتمام أيضًا ملاحظة أن قيم IC5 0 التي لوحظت في خلايا Caco -2 كانت أعلى من تلك التي تم الحصول عليها في خلايا RPTEC / TERT1 لنفس المانع. يمكن التنبؤ بالأهمية السريرية لـ DDIs من البيانات المختبرية. وفقًا لإرشادات إدارة الغذاء والدواء ، تم حساب نسب [I1] / IC5 0 لكل مجموعة من الأدوية. تسمح هذه النسبة بمقارنة التركيزات في الجسم الحي بتلك المعروفة لإنتاج تأثير ذي صلة في المختبر. بالنسبة لأبيكسابان في خلايا RPTEC / TERT1 ، كانت النسب 3.1 و 0.06 و 17.4 مع nilotinib و crizotinib و ketoconazole ، على التوالي (الجدول 1). في خلايا Caco -2 ، كانت نسبة [I1] / IC50 هي 0.46 للتفاعل بين apixaban و nilotinib (الجدول 1). بالنسبة للريفاروكسابان ، كانت النسب أعلى قليلاً من تلك التي تم الحصول عليها لأبيكسابان في خلايا RPTEC / TERT1: 5.1 و 0.08 و 17.7 ، على التوالي ، للنيلوتينيب ، والكريزوتينيب ، والكيتوكونازول (الجدول 2). بالطريقة نفسها ، كانت نسبة [I1] / IC50 التي لوحظت للتفاعل بين rivaroxaban و nilotinib في خلايا Caco -2 1.03 ، والتي كانت أعلى من تلك التي تم الحصول عليها لأبيكسابان (الجدول 2).

مناقشة

أشارت العديد من الدراسات التي أجريت في العقود الأخيرة إلى الدور الملحوظ لـ P-gp في الحرائك الدوائية للأدوية [17-19]. في ضوء الاهتمام التنظيمي المتزايد بالتفاعلات الدوائية التي تتوسطها P-gp ، فإن الاختبارات في المختبر للتحقيق في الإمكانات المثبطة للأدوية تعد جانبًا مهمًا من تطوير الأدوية والممارسة السريرية. تحقيقا لهذه الغاية ، تم إجراء العديد من الفحوصات المخبرية ، وتم إنشاء معظم البيانات المرتبطة بالامتصاص المعوي المتوقع من سلالات خلايا Caco -2 و MDCK-MDR1 [20-22]. ومع ذلك ، تتوفر القليل من البيانات حول الإفراز الأنبوبي النشط للأدوية ، والذي يلعب أيضًا دورًا رئيسيًا في التخلص من الأدوية ويعتمد على وجود ناقلات ABC. هذه الملاحظة مرتبطة بشكل واضح بنقص التوصيفكلويخطوط الخلايا للتنبؤ بالمخدراتكلويefux. هذا الهدف يتطلب إجراء عملية جراحية في المختبركلوينموذج يحاكي بشكل وثيق الحاجز الفسيولوجي. يبدو أن خط الخلايا البشرية RPTEC / TERT1 ، الذي يعبر عن العديد من ناقلات ABC (خاصة P-gp) ، بديل جيد ، كما هو موضح في دراسة سابقة [16]. في هذا السياق ، حقق العمل الحالي في تطبيق نموذج RPTEC / TERT1 لتقييم إمكانات تثبيط P-gp. على حد علمنا ، فإن هذا العمل هو الأول لتوفير البيانات من دراسات تثبيط P-gp باستخدام الإنسانكلويالخلايا.

عادة ما تستند الاختبارات في المختبر لتحديد إمكانات مثبطة P-gp على استخدام ركيزة P-gp مرجعية محددة ، مثل الديجوكسين أو الرودامين 123 [23-25]. نظرًا لسهولة استخدامها ، تعد مجسات الفلورسنت مفيدة للمقايسات عالية الإنتاجية. علاوة على ذلك ، تم تطبيق رودامين 123 على نطاق واسع للكشف عن نشاط P-gp في مجموعة واسعة من الدراسات [26-28]. بهذه الطريقة ، تم إجراء فحوصات لتراكم رودامين 123 في خلايا RPTEC / TERT1 في هذه الدراسة لتحديد سمات تثبيط 14 دواء. من بين هذه الأدوية ، تم اختيار السيكلوسبورين A ، والكيتوكونازول ، والفيراباميل كمثبطات قوية لـ P-gp. تم وصف هذه المثبطات على نطاق واسع لقدرتها التثبيطية الكبيرة P-gp ، مما يؤدي إلى تعديل كل من نقل الديجوكسين والرودامين 123 [27 ، 29 ، 30]. كما هو متوقع ، تسببت هذه الأدوية في أعلى معدل احتفاظ بالرودامين 123 في خلايا RPTEC / TERT1. في المقابل ، لم يلاحظ أي زيادة في الاحتفاظ بـ R123 مع الوارفارين ، والذي تم استخدامه كعنصر تحكم سلبي ، مما أدى إلى موثوقية نموذج RPTEC / TERT1. ومن المثير للاهتمام ، أنه من بين جميع الأدوية المختبرة ، تسببت DOACs - بما في ذلك dabigatran etexilate و apixaban و rivaroxaban - في زيادات واضحة في الاحتفاظ بـ R123 ، على الرغم من أنها لم يتم وصفها سابقًا كمثبطات ، فقط ركائز P-gp [31 ، 32]. قد تكون هذه الملاحظة ناتجة عن وجود ما يسمى بالتثبيط "التنافسي" ، حيث يمكن للعقاقير أن تتفاعل مع نفس مواقع الارتباط على P-gp. أكثر المواقع تميزًا لـ P-gp هي موقع H (لربط Hoechst 33342) وموقع R (لربط رودامين 123). ومع ذلك ، يمكن أن تلعب عدة مواقع أخرى غير معروفة مرتبطة بالعقاقير دورًا في هذه التفاعلات ، مما قد يفسر التأثيرات المختلفة لـ DOACs على تراكم R123 [33 ، 34]. وبالتالي ، فإن تثبيط P-gp الذي لوحظ لعقار معين يعتمد على الركيزة المستخدمة أثناء الدراسات المختبرية [28 ، 35]. لذلك يجب النظر في استخدام ركائز P-gp المختلفة التي تتفاعل مع مواقع ربط الأدوية المختلفة لوصف القدرات المثبطة المفترضة للأدوية بدقة. من المثير للاهتمام أيضًا ملاحظة أنه تم أيضًا إجراء العديد من الشروط من فحص رودامين 123 في خلايا Caco -2 من أجل مقارنة خلايا RPTEC / TERT1 بنموذج مرجعي في دراسات نقل الأدوية. كما هو متوقع ، تسبب السيكلوسبورين أ ، فيراباميل ، ونيلوتينيب في أعلى زيادة في احتباس رودامين. لوحظت نفس ملامح التثبيط مع كل من خلايا Caco -2 و RPTEC / TERT1. ومع ذلك ، فإن الزيادات في احتباس رودامين 123 الناتج عن التفاعلات في نموذج Caco -2 كانت أكبر من تلك التي لوحظت في خلايا RPTEC / TERT1 ، مما يشير إلى اختلاف محتمل في التعبير عن البروتين السكري بين النماذج لذلك ، في الوقت الحاضر في الدراسة ، تم استخدام طريقة ثانية لتقييم وإثبات التثبيط المحتمل لـ P-gp بواسطة الأدوية.

سيحسن الكستانش الكلى / الكلى

بناءً على مقايسة تراكم رودامين 123 ، تم اختيار أربعة عقاقير لتحديد التأثيرات المعتمدة على تركيزها على التراكم داخل الخلايا لأبيكسابان وريفاروكسابان. لقد ثبت أن P-gp يلعب دورًا رئيسيًا في تدفق أبيكسابان وريفاروكسابان [32 ، 36]. لذلك تم تقييم قيم IC50 للنيلوتينيب ، والكريزوتينيب ، والكيتوكونازول ، مع اختيار DOACs كأدوية "الضحية". على حد علمنا ، هذه الدراسة هي الأولى لإجراء دراسات التراكم داخل الخلايا مع DOACs في الإنسانكلويالخلايا. كانت قيم IC50 التي تم الحصول عليها لنيلوتينيب وكريزوتينيب متوافقة مع ملفات التثبيط التي تم الحصول عليها من مقايسة تراكم رودامين 123. قدم Nilotinib ، الذي تسبب في زيادة قوية في الاحتفاظ بـ R123 ، أقل قيمة IC50 لاثنين من DOACs ، مما أدى إلى إمكانات تثبيط عالية. تتوافق هذه النتيجة أيضًا مع دراسة سابقة أظهرت زيادة تعتمد على التركيز في التراكم داخل الخلايا لـ [3 H] -paclitaxel في MDR 1- من الخلايا المنقولة ، مما يشير إلى أنها تحتوي على مثبط جانبي [37]. بالنسبة إلى crizotinib ، أظهر اختبار R123 إمكانية تثبيط معتدلة ، مع زيادة أقل في احتباس R123 من تلك التي يسببها nilotinib. تم دعم هذه الملاحظة من خلال دراسة سابقة حيث زاد crizotinib من التراكم داخل الخلايا لـ R123 و doxorubicin في MDR 1- الخلايا المنقولة [38]. تتوافق هذه النتيجة أيضًا مع قيم IC 50 المحددة مع DOACs ، والتي كانت أعلى من القيم المقابلة لـ nilotinib ، مما يفسد المظهر الجانبي للتثبيط المعتدل. ومع ذلك ، من المثير للاهتمام ملاحظة أن تركيز 10 ميكرومتر من nilotinib أو crizotinib لم يسبب نفس الزيادات في الاحتفاظ بالرودامين 123 و DOACs. في فحص الرودامين ، زاد nilotinib من احتباس الركيزة بحوالي 71 بالمائة ، بينما كان حوالي 40 بالمائة في DOACs. في المقابل ، تسبب crizotinib في زيادة طفيفة في الاحتفاظ بالرودامين (23 بالمائة) ولكن زيادات أكبر في الاحتفاظ بـ DOACs (حوالي 50 بالمائة) بنفس التركيز. كما نوقش سابقًا ، يمكن تفسير هذه الملاحظة بالاختلافات في مواقع الربط على P-gp. من المعروف أن العديد من الأدوية تتفاعل وتتنافس مع موقع الربط H بدلاً من موقع الربط R (حيث يرتبط رودامين 123) والعكس بالعكس [39]. ومن المثير للاهتمام ، أن الكيتوكونازول ، المعروف بأنه مثبط قوي لـ P-gp ، تسبب في زيادة أقل قليلاً في الاحتفاظ بالرودامين 123 مقارنة بالنيلوتينيب (66 بالمائة مقابل 71 بالمائة ، على التوالي). ومع ذلك ، لوحظت قيمة مماثلة في خلايا Caco -2 ، حيث تسبب وجود الكيتوكونازول في زيادة بنسبة 60 بالمائة في تراكم R123 [40]. أظهر التراكم داخل الخلايا لـ DOACs لتحديد قيم IC أيضًا قيمًا أعلى مقارنةً بـ nilotinib و crizotinib. ومن المثير للاهتمام ، أن معظم قيم IC50 الموجودة في طرازي LLC-PK1 أو Caco -2 التي تستخدم الديجوكسين كركيزة P-gp كانت بين 3 و 4 ميكرومتر للكيتوكونازول [41 ، 42]. تختلف هذه القيم تمامًا عن تلك الموجودة في الدراسة الحالية (16.5 ميكرومتر و 16.9 ميكرومتر مع أبيكسابان وريفاروكسابان ، على التوالي). تؤكد هذه الملاحظة أن اختيارات الركيزة والنموذج المستخدم هي مؤثرات حاسمة عند تحديد القدرة المثبطة لـ P-gp. بالإضافة إلى ذلك ، أفادت دراسة حديثة أن مستويات التعبير عن ناقلات ABC في النماذج الخلوية المختبرية لها تأثير على فحوصات نقل الأدوية وبالتالي على تقييم DDIs المتعلقة بـ P-gp [43]. في الواقع ، كشف تحديد قيم IC للفيراباميل باستخدام rivaroxaban كركيزة P-gp عن عدم تجانس بين نماذج الخلايا MDCKMDR1 و Caco -2 ، بقيم IC50 تبلغ 6.94 ميكرومتر و 21.2 ميكرومتر على التوالي [43]. علاوة على ذلك ، تم أيضًا فحص تأثير nilotinib المعتمد على التركيز على التراكم داخل الخلايا لأبيكسابان وريفاروكسابان في خلايا Caco -2 في هذه الدراسة. ومن المثير للاهتمام ، أن قيم IC50 لـ nilotinib كانت أعلى بشكل ملحوظ في خلايا Caco -2 عنها في خلايا RPTEC / TERT1. يمكن تفسير هذه الملاحظة بالاختلاف في تعبير P-gp بين هذه النماذج. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أن توزيع P-gp يعتمد على الأنسجة التي يتم النظر فيها. فالون وآخرون. أظهر أن مستوى P-gp كان أعلى فيالكلىمن أنسجة الكبد عند البشر [45]. من ناحية أخرى ، يبدو أن مستوى تعبير P-gp أعلى في الأمعاء منه فيالكلىالأنسجة [46]. وبالتالي ، فإن استخدام الخلايا البشرية مثل نموذج RPTEC / TERT1 ، الذي لا يفرط في التعبير عن الناقلات ، يمكن أن يوفر بيانات إضافية. يمكن استخدام هذه البيانات وإسنادها في النمذجة الحركية الدوائية القائمة على أساس فسيولوجي (PBPK) من خلال دمج العديد من المعلمات ، مثل كمية P-gp في نسيج أو نموذج في المختبر أو قيم IC.

على الرغم من أن قيم IC5 0 الموجودة في الكيتوكونازول في نموذج RPTEC / TERT1 كانت أعلى من تلك التي لوحظت في الأدبيات ، فإن نسبة [I1] / IC50 - التي تم التحقق من صحتها كمؤشر على DDIs المحتملة ذات الصلة سريريًا للأدوية التي يتم تناولها عن طريق الفم - أظهرت القيم العالية التي كانت أعلى من عتبة 0.1 التي حددتها إدارة الغذاء والدواء. تتوافق هذه النتيجة مع دراسة سريرية أظهرت زيادة مضاعفة في التعرض لأبيكسابان مع الإدارة المشتركة للكيتوكونازول [44]. مجتمعة ، توضح كل هذه النتائج أن نموذج RPTEC / TERT1 هو أداة واعدة لتقييم إمكانات تثبيط P-gp.

سيحسن الكستانش من آلام الكلى / الكلى

استنتاج

أظهرت دراستنا أن تطبيق نموذج RPTEC / TERT1 مناسب لتقييم الإمكانات المثبطة لـ P-gp لفئات مختلفة من الأدوية. سمحت مقايسات تراكم رودامين 123 بإجراء فحص أولي للمخدرات. ومع ذلك ، يجب أيضًا فحص الإمكانات المثبطة لـ P-gp للأدوية التي لا تتفاعل مع موقع R لـ P-gp باستخدام ركائز إضافية لتكوين التنبؤات. تتوافق قيم IC50 المحددة من التراكم داخل الخلايا لأبيكسابان وريفاروكسابان مع سمات التثبيط الملحوظة مع رودامين 123. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الكيتوكونازول والوارفارين كمثبط قوي وغير مثبط لـ P-gp ، على التوالي ، أدى إلى موثوقية نموذج RPTEC / TER1 عند استخدامه للحصول على بيانات في المختبر حول الإمكانات المثبطة لأدوية P-gp. أخيرًا ، أظهرت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام نموذج RPTEC / TERT1 مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام خلايا Caco -2 أهمية إجراء دراسات في المختبر في نماذج خلوية مختلفة لتكوين المظهر المثبط لعقار معين.