التقييم المختبري للنشاط الضوئي والسمية الضوئية لمضادات الأكسدة الطبيعية من مادة البوليفينول

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comلمعرفة المزيد.

الملخص:البوليفينول هو عائلة كبيرة من المركبات الطبيعية المستخدمة على نطاق واسع في مستحضرات التجميل بسبب خصائصها المفيدة المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات وقدرتها على منع الإجهاد التأكسدي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية. نظرًا لأن هذه المركبات تقدم الكروموفور ويتم تطبيقها مباشرة على الجلد ، فإنها يمكن أن تتفاعل مع أشعة الشمس وتؤدي إلى تأثيرات سامة ضوئية. المعلومات العلمية المتاحة حول القدرة الضوئية لهذه المركبات الطبيعية نادرة ، وبالتالي كان الهدف من هذه الدراسة هو تقييم الفعالية الضوئية والسمية الضوئية لخمسة من المركبات الفينولية.مضادات الأكسدةمع الاستخدام الموثق في مستحضرات التجميل. تم التحقق من صحة اختبار ROS القياسي وتطبيقه لفحص النشاط الضوئي لمضادات الأكسدة الفينولية الطبيعية وحمض الكافيين وحمض الفيروليك وحمض الكوماريك p و 3 4- وحمض ثنائي هيدروكسي فينيل أسيتيك (DOPAC) وروتين. تم تحديد إمكانات السمية الضوئية باستخدام خط خلية كيراتينية بشرية (HaCaT) ، بناءً على اختبار السمية الضوئية 3T3 Neutral Red Uptake. على الرغم من كل شيءدرس مضادات الأكسدة الفينوليةتمتص الأشعة فوق البنفسجية / المرئية في نطاق 290 إلى 700 نانومتر ، فقط DOPAC كان قادرًا على توليد الأكسجين المفرد. إن توليد أنواع الأكسجين التفاعلية هو تفاعل كيميائي في مرحلة مبكرة كجزء من آلية السمية الضوئية. ومع ذلك ، لم تقلل أي من المركبات المدروسة من صلاحية الخلايا الكيراتينية بعد التشعيع ، مما أدى إلى استنتاج مفاده أنها لا تمتلك إمكانات سمية ضوئية. تشير البيانات التي تم الحصول عليها من هذا العمل إلى أن هذه المركبات آمنة عند دمجها في مستحضرات التجميل.

الكلمات الدالة:سلامة الصور نشاط ضوئي. السمية الضوئية. بوليفينول.مضادات الأكسدة الفينولية الطبيعية؛ أنواع الاكسجين التفاعلية؛ الخلايا الكيراتينية. عناية بالجلد؛ مستحضرات التجميل

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

مقدمة 

تشكل مادة البوليفينول (PPs) واحدة من أكثر مجموعات المنتجات الطبيعية عددًا وتوزيعًا على نطاق واسع في المملكة النباتية. يتميز التركيب الكيميائي لـ PPs بوجود واحدة أو أكثر من مجموعات هيدروكسيل الفينول ، مرتبطة بواحد أو أكثر من أنظمة حلقات البنزين [1]. يعرض البوليفينول مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية المفيدة في البشر ، بما في ذلك مضادات الفيروسات ، ومضادات الجراثيم ، ومضادة للسرطان ، ومضادة للالتهابات ، ومضادات الأكسدة [2-5].كمضادات للأكسدة، قد تحمي البوليفينول مكونات الخلايا من التأثيرات الضارة المؤكسدة لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مثل الأكسجين المفرد ، والأكسجين الفائق ، وجذور الهيدروكسيل ، مما يحد من خطر الإصابة بالعديد من الأمراض المرتبطة بالإجهاد التأكسدي [6،7]. نظرًا لخصائصها الكيميائية ، فإن البولي بروبلين قادرة على نقب ROS وأيونات المعادن الانتقالية مثل الحديد والنحاس ، والتي جذبت اهتمام صناعة مستحضرات التجميل لاستخدامها في تركيبات العناية بالبشرة [8-10]. يعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) أحد العوامل الرئيسية المسببة لسرطان الجلد ، وقد تتضرر الخلايا الجلدية بشكل مباشر من الأشعة فوق البنفسجية أو بشكل غير مباشر من خلال زيادة إنتاج الأكسجين التفاعلية (ROS) بوساطة الأشعة فوق البنفسجية [11]. اقترحت الدراسات التجريبية والدراسات الوبائية أن مادة البوليفينول تحمي الجلد من الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية من خلال مسارات متعددة [12]. لذلك ، يتم بالفعل استخدام العديد من المركبات التي تنتمي إلى هذه العائلة كمكونات في عدد من مستحضرات التجميل التجارية المتاحة في السوق [13]. حثت طلبات المستهلكين المتزايدة على مستحضرات التجميل الطبيعية الصناعة على تطوير تركيبات باستخدام المستخلصات الطبيعية ذات المكونات النشطة ، مثل البوليفينول ، كحل واعد وفعال للعناية بالبشرة [13]. ومع ذلك ، فإن الكروموفورات الموجودة في بنية البوليفينول لديها القدرة على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية / المرئية والخضوع لتفاعلات كيميائية تؤدي إلى سلسلة من الأحداث التي قد تؤدي إلى تفاعلات سمية ضوئية [14]. يتم تعريف السمية الضوئية على أنها استجابة سامة ناتجة عن المواد الكيميائية الفعالة للضوء التي يتم تناولها موضعيًا أو نظاميًا بعد تعرض الجسم للضوء البيئي [15]. المكونات والسواغات الصيدلانية الفعالة للإعطاء الجهازي ، والتركيبات السريرية للتطبيق الموضعي ، والبقع الجلدية ، وغيرها ، لها إمكانات سمية ضوئية ويمكن أن تسبب تفاعلات سمية ضوئية ملحوظة. وبالتالي ، فإن الهيئات التنظيمية ، وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، والاتحاد الأوروبي للأدوية الأوروبية ، و ICH ، تقدم إرشادات لسلامة الصور ، وتقدم طرق الاختبار واستراتيجيات التقييم [15-17]. تقييم سلامة مستحضرات التجميل إلزامي وفقًا لتشريعات الاتحاد الأوروبي [18]. يشمل تقييم السلامة المطلوب دراسات السمية ذات الصلة على مكونات مستحضرات التجميل ، بما في ذلك تقييم السمية المستحث بالصور [18]. منذ أن تم حظر التجارب على الحيوانات لمنتجات مستحضرات التجميل ، تم اقتراح عدد من اختبارات سلامة الصور في المختبر على مدار السنوات الماضية ، بما في ذلك تحليل طيف الأشعة فوق البنفسجية ، واختبار السمية الضوئية للامتصاص الأحمر 3T3 (3T3 NRU PT) ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ( ROS) [18-20]. تم تصميم اختبار ROS لتقييم النشاط الضوئي للأدوية ، والذي يتمثل مبدأه في مراقبة التفاعلات الكيميائية الضوئية في مواد الاختبار الكيميائية المعرضة لأشعة الشمس المحاكية [19 ، 20]. من خلال هذه التفاعلات الكيميائية الضوئية ، يمكن توليد ROS ، مثل الأنيون الفائق والأكسجين الأحادي ، ويمكن أن تكون هذه العمليات الكيميائية الضوئية محفزًا للسمية الضوئية التي يسببها الدواء [19 ، 20]. يمكن أن تسبب المستويات العالية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تسممًا للخلايا من خلال تلف الحمض النووي والدهون والبروتينات بسبب الإجهاد التأكسدي.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlتستخدم المنهجية في المختبر 3T3 NRU-PT خط خلية الخلايا الليفية للماوس Balb / c 3T3 وامتصاص أحمر محايد كنقطة نهاية للسمية الخلوية. ثم يتم تحديد السمية الضوئية من خلال الانخفاض النسبي في صلاحية الخلايا المعرضة للمادة الكيميائية الاختبارية في وجود وغياب الضوء الذي يحاكي ضوء الشمس. خلصت الدراسات الواردة في الأدبيات إلى أن هذا الاختبار مفرط الحساسية ، ويتنبأ عن طريق الخطأ بمخاطر سلامة الصورة للحيوان والبشر ، مما يؤدي إلى عدد كبير من الإيجابيات الكاذبة عند مقارنتها بنتائج الجسم الحي [21-23]. بالنظر إلى هذا القيد ، اقترحت مجموعتنا تعديل منهجية 3T3 NRU-PT بناءً على استخدام خط خلية كيراتينية بشرية (HaCaT) [24]. نظرًا لأن هذه المنهجية تستخدم خلايا الخلايا الكيراتينية البشرية ، فإنها تمثل نموذجًا أكثر واقعية ، نظرًا لأن هذه هي أكثر أنواع الخلايا وفرة الموجودة في الطبقة الخارجية من الجلد ، حيث يتم تطبيق المركبات الموضعية وتعريضها لأشعة الشمس [24]. كان الهدف من هذه الدراسة هو تقدير إمكانات السمية الناتجة عن الصور لبوليفينول حمض الكوماريك الطبيعي وحمض الكافيك 3 و 4- حمض ثنائي هيدروكسي فينيل أسيتيك (DOPAC) وحمض الفيروليك والروتين (الشكل 1) ، التي تُستخدم بالفعل كمكونات تجميلية أو يتم أخذها في الاعتبار نظرًا لخصائصها الكيميائية ومضادات الأكسدة المثيرة للاهتمام [25-27]. تم التحقق من صحة اختبار ROS وتنفيذه من أجل التقييم الاستكشافي لسلامة الصور للمركبات ، كما تم تقييم سميتها الخلوية وسميتها الضوئية باستخدام خط الخلايا الكيراتينية البشرية (HaCaT).

2. النتائج والمناقشة 

الاعتبار الأولي لتقييم الجهد الضوئي هو ما إذا كان المركب يمتص الفوتونات عند أي طول موجي بين 290 و 700 نانومتر. يُعتبر المركب الذي يحتوي على معامل انقراض مولاري (MEC) أكبر من 1000 لتر مول 1 سم -1 عند أي طول موجي بين 290 و 700 نانومتر نشطًا ضوئيًا بدرجة كافية لينتج عنه سمية ضوئية مباشرة [15]. أطياف امتصاص أحماض الكافيين ، والكوماريك ، والفيروليك ، DOPAC ، والروتين في DMSO في الضوء المرئي للأشعة فوق البنفسجية موضحة في الشكل 2. تمتص جميع المركبات في النطاق الطيفي من 200 إلى 700 نانومتر ، مع أقصى طول موجي عند أو أعلى من 290 نانومتر ومع MEC أكبر عادة من 4000 لتر مول 1 سم -1 (الجدول 1). البوليفينول مركبات بيولوجية تحتوي على π أنظمة مترافقة مع مجموعات هيدروكسيل الفينول. التحولات الإلكترونية للمدارات الجزيئية من النوع هي المسؤولة عن الطيف المرئي للأشعة فوق البنفسجية لهذه المجموعة من المركبات [28]

قدمت جميع المركبات المختبرة MEC أعلى من 1000 لتر مول 1 سم -1 ، مما يعني أن جميع المركبات المحتملة السمية الضوئية تستحق الدراسة [15]. قبل إجراء اختبار ROS ، تم تقييم المحاكي الشمسي ، وتم تحسين الظروف التجريبية للتأكد من أن القيم المقاسة للأكسجين القمري (SO) وأنيون الأكسيد الفائق (SA) كانت قريبة من تلك المذكورة في الأدبيات [29]. تم إجراء تحسين اختبار توليد ROS باستخدام عناصر تحكم إيجابية وسلبية وأجريت دراسة جدوى باستخدام المواد الكيميائية المرجعية. في ظل الظروف التجريبية المستخدمة ، استوفت جميع المواد المختبرة في دراسة الجدوى معايير القبول التي أعطت قيمًا لـ SO و SA ضمن نطاقات القيمة المقبولة [29].

تم إجراء اختبار ROS لمركبات البوليفينول ، وترد قدرة المواد المختبرة على توليد ROS بتركيز 200 ميكرومتر في الجدول 2. الجدول 2. تم الحصول على نتائج للمركبات المختبرة باستخدام مقايسة ROS.

أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها أنه ، باستثناء DOPAC ، يمكن تصنيف جميع المركبات على أنها غير نشطة للضوء. على الرغم من أن هذه المواد أظهرت امتصاصًا للضوء المرئي للأشعة فوق البنفسجية و MEC أعلى من 1 0 00 L mol 1 cm 1 ، إلا أنها لم تولد ROS في ظل الظروف المختبرة ، سواء من نوع SO أو SA. من المثير للدهشة أن DOPAC كانت قادرة على تحفيز توليد أنواع SO ، وبالتالي تم تصنيفها على أنها نشطة ضوئيًا ، على الرغم من أن هذا المركب له أقل قيمة MEC في النطاق المرئي للأشعة فوق البنفسجية بين جميع المركبات التي تمت دراستها. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم النتائج التي تم الحصول عليها من DOPAC ، والتي قد تكون مهمة أيضًا ، في المستقبل القريب ، لإنشاء علاقة متبادلة بين التركيب الكيميائي للمركب وقدرته على أن يكون ضوئيًا. تم تقييم السمية الخلوية لـ DMSO المستخدمة لتقييم التأثيرات السمية الضوئية ، في وجود وغياب التشعيع ، بعد ساعة واحدة من التعرض. بالنسبة للوحة غير المشععة ، لم يُظهر DMSO فرقًا مهمًا من الناحية الإحصائية بالنسبة إلى الضوابط السلبية. ومع ذلك ، بالنسبة للوحة المشعة ، كان هناك فرق كبير بين 1 في المائة DMSO والتحكم في المذيبات بالنسبة إلى الضوابط السلبية (p <0.0001) ،="" مما="" يبرر="" استخدام="" التحكم="" في="" المذيبات="" في="" جميع="" التجارب="" لضمان="" أن="" الاختلافات="" في="" صلاحية="" الخلية="" كانت="" تُنسب="" فقط="" إلى="" المركبات="" قيد="" الدراسة.="" للتأكد="" من="" جدوى="" اختبار="" السمية="" الضوئية="" باستخدام="" خط="" خلية="" كيراتينية="" بشرية="" (hacat)="" ،="" تم="" اختبار="" 5-="" ميثوكسي="" سورالين="" ،="" وهيدروكلوريد="" كلوربرومازين="" ،="" وكينين="" كعناصر="" تحكم="" إيجابية="" ،="" وحمض="" أسيتيل="" ساليسيليك="" ،="" وسداسي="" كلوروفين="" ،="" وكبريتات="" لوريل="" الصوديوم="" كعناصر="" تحكم="" سلبية="" [24].="" النتائج="" التي="" تم="" الحصول="" عليها="" من="" مقايسة="" السمية="" الضوئية="" التي="" تقارن="" حيوية="" الخلية="" لخلايا="" hacat="" ،="" المشععة="" وغير="" المشععة="" ،="" في="" وجود="" المركبات="" الفينولية="" (البولي)="" المختبرة="" موضحة="" في="" الشكل="" 3.="" نطاقات="" تركيزات="" المواد="" الكيميائية="" المختبرة="" في="" الوجود="" تم="" تحديد="" (irr="" plus)="" وغياب="" (irr−)="" للضوء="" في="" تجارب="" تحديد="" مدى="" الجرعة="" ،="" مع="" الأخذ="" في="" الاعتبار="" أقصى="" تركيز="" 1000="" ميكرومتر.="" تم="" استخدام="" سلسلة="" تخفيف="" هندسية="" وتعديلها="" ،="" عند="" الضرورة="" ،="" كدالة="" للتركيز="" -="" الاستجابة="" في="" وجود="" وغياب="" التشعيع.="" ضمن="" نطاق="" التركيز="" الذي="" تم="" اختباره="" (12.5="" ؛="" 31.25="" ؛="" 62.5="" ؛="" 125="" ؛="" 250="" ؛="" 500="" ،="" 1000="" ميكرومتر)="" لم="" تتسبب="" أي="" من="" مواد="" الاختبار="" في="" انخفاض="" بنسبة="" 50="" في="" المائة="" في="" صلاحية="" الخلية="" ،="" لذلك="" ،="" لم="" يكن="" من="" الممكن="" حساب="" قيم="" ic50="" و="" pif="" المقابلة="" .="" على="" العكس="" من="" ذلك="" ،="" كان="" من="" الممكن="" ملاحظة="" زيادة="" تعتمد="" على="" الجرعة="" في="" صلاحية="" الخلايا="" المشعة="" في="" وجود="" المواد="" المختبرة="" ،="" ربما="" بسبب="" التأثيرات="" الواقية="" من="" الضوء="" لمضادات="" الأكسدة="" هذه="" ضد="" الضرر="" التأكسدي="" الناجم="" عن="" الإشعاع="" مما="" يؤدي="" إلى="" نسبة="" أعلى="" من="" الخلايا="" القابلة="" للحياة="" عند="" مقارنتها="" بالتحكم="" (الخلايا="" المشعة="" غير="" المعالجة).="" موصوفة="" في="" الأدبيات="" أن="" الأشعة="" فوق="" البنفسجية="" تؤدي="" إلى="" توليد="" ros="" ،="" والإفراط="" في="" إنتاج="" أكسيد="" النيتريك="" ،="" واستنفاد="" الدفاعات="" المضادة="" للأكسدة="" في="" الخلايا="" الكيراتينية="" [30].="" لهذه="" الأسباب="" ،="" تمت="" دراسة="" مادة="" البوليفينول="" ذات="" القدرة="" المضادة="" للأكسدة="" كعوامل="" واقية="" من="" الضوء.="" على="" الرغم="" من="" أن="" معظم="" الدراسات="" ركزت="" على="" قدرة="" الحماية="" الضوئية="" للبوليفينول="" ،="" إلا="" أنها="" لم="" تدرس="" إمكاناتها="" السمية="" الضوئية.="" أكدت="" الدراسات="" السابقة="" قدرة="" أحماض="" الكافيين="" والفيروليك="" وبي-كوماريك="" على="" البحث="" عن="" أنواع="" النيتروجين="" التفاعلي="" وأنواع="" النيتروجين="" التفاعلي="" (rns).="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" تم="" إنشاء="" حماية="" ضد="" التأثيرات="" الضارة="" للأشعة="" فوق="" البنفسجية="" في="" خلايا="" الجسم="" الحي="" أو="" الجلد="" لهذه="" المركبات="" الفينولية="" الثلاثة="" [31-34].="" قد="" تفسر="" هذه="" البيانات="" الزيادة="" في="" النسبة="" المئوية="" للخلايا="" القابلة="" للحياة="" عند="" تعرضها="" للإشعاع="" في="" وجود="" المركبات="" قيد="" الدراسة.="" تم="" اختبار="" روتين="" ،="" مثل="" أحماض="" الكافيين="" ،="" والفيروليك="" ،="" والكوماريك="" سلبية="" في="" اختبار="" توليد="" ros="" ولم="" يتسبب="" في="" السمية="" الضوئية="" في="" خط="" خلايا="" hacat.="" هناك="" بعض="" المعلومات="" المتناقضة="" في="" الأدبيات="" المتعلقة="" بإمكانية="" السمية="" الضوئية="" لروتين="" ،="" ومن="" هنا="" جاءت="" الفائدة="" من="" النتائج="" التي="" تم="" الحصول="" عليها.="" أظهر="" تقييم="" إمكانات="" السمية="" الضوئية="" باستخدام="" نظام="" الخلايا="" الكيراتينية="" (hacat)="" أن="" روتين="" أظهر="" سمية="" ضوئية="" [35].="" على="" العكس="" من="" ذلك="" ،="" باستخدام="" إعداد="" تجريبي="" يستخدم="" الرحلان="" الكهربائي="" الشعري="" مع="" الكشف="" الكهروكيميائي="" والكشف="" عن="" الأشعة="" فوق="" البنفسجية="" لاختبار="" السمية="" الضوئية="" للمستخلصات="" النباتية="" ومكوناتها="" من="" حيث="" استهلاك="" الأكسجين="" وتوليد="" أنواع="" الأكسجين="" التفاعلية="" عند="" التشعيع="" بالضوء="" المرئي="" ،="" كان="" من="" الممكن="" استنتاج="" أن="" الروتين="" كان="" غير="" سام="" للضوء="" [36]="" ،="" والذي="" كان="" متفقًا="" مع="" النتائج="" التي="" تم="" الحصول="" عليها="" في="" هذا="" العمل="" حيث="" لم="" يُظهر="" روتين="" نشاط="" ضوئي="" لأنه="" لم="" يولد="" أيًا="" من="" so="" أو="" sa="" في="" اختبار="" توليد="" ros.="" من="" ناحية="" أخرى="" ،="" في="" هذا="" العمل="" ،="" تبين="" أيضًا="" أن="" روتين="" في="" حد="" ذاته="" لا="" يمثل="" أي="" إمكانات="" ضوئية="" في="" خط="" خلية="" hacat.="" تسلط="" هذه="" النتائج="" المتناقضة="" الضوء="" على="" أهمية="" استخدام="" شروط="" اختبار="" موحدة="" وكذلك="" استخدام="" مصدر="" ضوء="" مناسب="" لتجنب="" النتائج="" المضللة.="" ومن="" المثير="" للاهتمام="" ،="" وعلى="" الرغم="" من="" التشابه="" الهيكلي="" بين="" dopac="" و="" pps="" الأخرى="" التي="" تمت="" دراستها="" ،="" فإن="" dopac="" أنتجت="" so="" في="" اختبار="" توليد="" ros="" ،="" وتم="" تصنيفها="" على="" أنها="" ضوئية.="" ومع="" ذلك="" ،="" عند="" اختباره="" في="" خط="" خلية="" hacat="" ،="" أظهر="" dopac="" أنه="" غير="" سام="" للضوء.="" من="" النتائج="" التي="" تم="" الحصول="" عليها="" ،="" يبدو="" أن="" dopac="" نشط="" ضوئيًا="" ولكنه="" غير="" سام="" للضوء="" ،="" لذلك="" لا="" يُتوقع="" حدوث="" تفاعلات="" سمية="" ضوئية="" بعد="" التطبيق="" الموضعي="" لهذا="">

3. المواد والطرق

3.1. الكواشف

3 ، 4- حمض ثنائي هيدروكسي فينيل أسيتيك (DOPAC) ، وحمض الكافيين ، وحمض ترانس-فيروليك ، وحمض ب-كوماريك ، وروتين ، وكلوربرومازين هيدروكلوريد ، وفوسفات هيدروجين ثنائي الصوديوم ، وفوسفات الصوديوم أحادي الهيدرات ، ومحايد أحمر (NR) ، وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) تم شراؤها من Sigma – Aldrich (مدريد ، إسبانيا). تم شراء الكينين هيدروكلوريد ، بنزوكائين ، ديكلوفيناك ، وإريثروميسين من Acofarma (مدريد ، إسبانيا). تم الحصول على خط خلية الخلايا الكيراتينية البشرية الخالدة (HaCaT) من Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim ، ألمانيا). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 4.5 جم / لتر D-glucose و L-glutamine و 25 mM HEPES و DMEM مع 4.5 جم / لتر D-glucose و L glutamine و 25 mM HEPES مع عدم وجود الفينول الأحمر ومحلول ملحي مخزّن من فوسفات Dulbecco تم شراء (DPBS) و Fetal Bovine Serum (FBS) و trypsin EDTA من Gibco Life Technologies (والتهام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم توفير الإيثانول من قبل شركة Aga (لشبونة ، البرتغال). تم شراء N و N-Dimethyl -4- nitroguanidine (RNO) و imidazole و Nitro Blue Tetrazolium (NBT) من Alfa Aesar (Kandel ، ألمانيا).

3.2 الامتصاص الطيفي 

تم تحديد طيف الامتصاص لكل مركب مدروس في نطاق 290 إلى 700 نانومتر ، وفقًا لإرشادات اختبار OECD 101 ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي Jasco V650 UV / VIS [37]. تمت إذابة المواد في DMSO من أجل الحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل وتم قياس أطياف الامتصاص باستخدام أنابيب الكوارتز الشفافة للأشعة فوق البنفسجية (طول المسار=10 مم). تم تصحيح كل طيف لامتصاص خط الأساس الخاص بالمذيبات. تم حساب معاملات الانقراض المولي (MEC) باستخدام أعلى قمم امتصاص من 290 إلى 700 نانومتر [15].

3.3 فحص أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) 

تم إنشاء بروتوكول اختبار ROS ، وأجريت دراسات التحقق من الصحة وفقًا للإجراء الموضح في الأدبيات [19،29]. تم تحضير محاليل المخزون لجميع المواد المختبرة بتركيز 10 ملي مولار في DMSO واستخدمت في نفس اليوم ، محمية من الضوء. باختصار ، تم اكتشاف توليد الأكسجين المفرد (SO) عن طريق القياس الطيفي لتبييض p-nitrosodimethylaniline (RNO) عند 440 نانومتر باستخدام إيميدازول كمستقبل انتقائي للأكسجين المفرد. تم وضع العينات التي تحتوي على المادة الكيميائية المختبرة (200 ميكرومتر) ، RNO (50 ميكرومتر) ، والإيميدازول (50 ميكرومتر) في محلول فوسفات الصوديوم 20 ملي مولار (PB ، الرقم الهيدروجيني 7.4) ، في أنبوب وخلطها بخلاط دوامة وصوتنة ، محمية من الضوء لمدة 10 دقائق. تم نقل الخليط إلى خلية زجاجية عالية الأداء من Hellma quartz وفحص الترسيب تحت المجهر قبل التعرض للضوء. بعد ذلك ، تم تشعيع العينات باستخدام جهاز محاكاة الطاقة الشمسية الحرارية Fitoclima S600PL (Aralab ، البرتغال) ، المجهز بثمانية مصابيح Repti Glo (20 W) UV-Vis ، لمدة 90 دقيقة عند 25 درجة مئوية. بعد التشعيع ، تمت قراءة الامتصاصية مرة أخرى عند 440 نانومتر. تم اكتشاف جيل أنيون الفائق (SA) من خلال ملاحظة اختزال النيتروبلو تترازوليوم (NBT) إلى أحادي فورمازان (NBT plus) ، والذي يمكن رصد تكوينه بطريقة طيفية عند 560 نانومتر. تم تشعيع العينات التي تحتوي على المركبات المختبرة (200 ميكرومتر) و NBT (50 ميكرومتر) في 20 ملي كلوريد الصوديوم ، وتم قياس الانخفاض في NBT عن طريق زيادة الامتصاص عند 560 نانومتر بنفس الطريقة المستخدمة لتحديد SO. أجريت التجارب في ثلاث نسخ. نظرًا لأن جهاز محاكاة الطاقة الشمسية المستخدم كان مختلفًا عن النماذج الموصى بها ، كان من الضروري التحقق من صحة ظروف التشعيع. تم إجراء اختبار ROS للتأكد من أن ظروف التشعيع تفي بالمعايير الموصى بها باستخدام الضوابط الإيجابية (الكينين) والسلبية (sulisobenzone) والمركبات الكيميائية المرجعية [29]. وفقًا للنتيجة (متوسط ​​التحديدات الثلاثية) من اختبار ROS ، تم تصنيف مركبات البوليفينول المختبرة كمواد تفاعلية للضوء عندما تم قياس قيمة SO 25 أو أكثر و / أو قيمة SA البالغة 20 أو أكثر ؛ بدوره ، تم تحديده على أنه مادة غير نشطة للضوء عندما تم تسجيل قيم أقل من 25 لـ SO وأقل من 20 لـ SA [29].

3.4. زراعة الخلايا 

تم الحفاظ على خلايا HaCaT عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 95 بالمائة من الهواء و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون في الحاضنة في DMEM مع 1 0 بالمائة من FBS و 1 بالمائة من المضادات الحيوية. باستخدام مجهر مقلوب ، لوحظ التقاء الخلايا وإذا وصلت الخلايا إلى 7 0 - 80٪ التقاء ، تم إجراء ثقافة فرعية لمنع موت الخلايا. لهذا الغرض ، تم استنشاق وسط المزرعة وغسل الخلايا باستخدام DPBS ، تمت إضافة 2 مل من التربسين 0.25 بالمائة واحتضانها لمدة 7 إلى 8 دقائق عند 37 درجة مئوية في جو 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد فصل الخلايا ، تمت إضافة وسط جديد لمنع عمل التربسين. لعد الخلايا ، تم وضع 10 ميكرولتر من التعليق الخلوي في غرفة Neubauer حيث تم حساب الخلايا. تم بعد ذلك تقسيم المعلق الخلوي الذي تم الحصول عليه إلى قوارير جديدة بوسط زراعة خلية جديدة. لتجميد الخلايا ، تم استخدام DMSO (5 بالمائة حجم / حجم) كمادة حافظة مبردة لمنع تكوين البلورات أثناء مرحلة التخزين. من أجل تحديد الوقت اللازم لتكرار الخلايا ، تم زرع 1 × 106 خلية في خمس قوارير بحجم 75 سم 2 وحضنت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون للوصول إلى الالتزام الكامل. ثم تم عد خلايا كل دورق في أوقات مختلفة. تم رسم النتائج في رسم بياني يمثل رقم الخلية مقابل الوقت ، والذي تم من خلاله حساب وقت المضاعفة باستخدام تحليل الانحدار الخطي. كان وقت المضاعفة المحسوب 20.43 ساعة ، وهو ما يتوافق مع القيم المذكورة في الأدبيات ، مما يؤكد أن الخلايا المستخدمة كانت في ظروف نمو طبيعية [38]. 3.5 فحص السمية الضوئية لدراسة السمية الضوئية ، تم اتباع بروتوكول سابق تم تنفيذه في مختبرنا [24]. تم تعديل ارتفاع مصباح أوسرام UVA / UVB (240V E27) من أجل تشعيع الخلايا بجرعة إشعاع من UVA تبلغ 1.7 ميجاوات / سم 2 (مقياس الإشعاع Cosmedico ، UVM -7) ، وفقًا لإرشادات منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية [23] . أثناء التشعيع (10 دقائق) ، تم الاحتفاظ باللوحات داخل مستقبل الستايروفوم الذي يحتوي على نظام تبريد مائي ، وتم مراقبة درجة الحرارة طوال الإجراء. باختصار ، لإجراء اختبار امتصاص NR ، تم زرع خلايا HaCaT (2 × 104 خلية / بئر) واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 بالمائة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت إزالة الوسيط ، وأضيفت تركيزات مختلفة من مواد الاختبار ، وحضنت الخلايا تحت نفس الظروف لمدة ساعة واحدة. تم الاحتفاظ بإحدى الصفيحتين في الظلام بينما تم تشعيع الصفيحة الأخرى لمدة 10 دقائق مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 29-32 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم استبدال وسط الخلايا بـ DMEM جديد بدون أحمر الفينول وحضنت لمدة 18-22 ساعة. بعد فترة الحضانة هذه ، تم غسل الخلايا من كلا الصفيحتين باستخدام DPBS وأضيف DMEM الكامل الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل NR إلى كل بئر وحضنت لمدة 3 ساعات. بعد الحضانة باستخدام NR ، تمت إزالة محلول NR ، وأضيف محلول امتصاص NR (50 بالمائة إيثانول: 1 بالمائة حمض أسيتيك: 49 بالمائة ماء مقطر) لاستخراج صبغة NR من الخلايا. لإجراء القراءة ، تم قياس الامتصاصية عند 540 نانومتر. داخل كل لوحة ، تم اختبار ضوابط DMSO. تم التعبير عن بيانات جدوى الخلية التي تم الحصول عليها من كل لوحة على أنها نسبة الامتصاص للخلايا المعالجة إلى خلايا التحكم في المذيبات واستخدمت أيضًا لتقدير قيم IC باستخدام تحليل الانحدار الخطي. تم حساب قيمة عامل التهيج الضوئي (PIF) لكل مادة اختبار على أنها النسبة بين قيمة IC 50 المشع (Irr plus) مقابل قيمة IC للخلايا غير المشعة (Irr−). وفقًا للمبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي ، فإن مؤشر مساحيق التركيبات أقل من 2 يتنبأ بغياب تأثير السمية الضوئية ، ويتنبأ مؤشر مساحيق تركيبات الرضع بين 2 و 5 بتأثير ضوئي محتمل ، ويتنبأ مؤشر تركيبة التركيبة الأعلى من 5 بتأثير سمي ضوئي [23]. تم تقييم المركبات المختبرة في مجموعة من التركيزات: 12.5؛ 31.25 62.5 ؛ 125 ؛ 250 ؛ 500 و 1000 ميكرومتر. 3.6 التحليل الإحصائي يتم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (SD) من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل تعمل في ثلاث نسخ. لتأكيد الحالة الطبيعية والتجانس للتباين ، تم استخدام اختبار الوضع الطبيعي D'Agostino-Pearson omnibus ، وبعد ذلك ، تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا باختبار Dunnett اللاحق (مقارنة بخلايا التحكم السلبية مع المذيب) ، تم تنفيذ. تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام برنامج GraphPadPrism لنظام التشغيل Windows (الإصدار 6.0 ، برنامج GraphPad ، Inc. (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

4 - نتائج

في هذه الدراسة ، تم استخدام مقايسة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ومقايسة 3T3 المحايدة للامتصاص الأحمر (3T3 NRU-PT) لفحص سلوك مضادات الأكسدة الفينولية الطبيعية عند تعرضها للإشعاع الذي يحاكي ضوء الشمس من أجل فحص نشاطها الضوئي وسميتها الضوئية. القدره. سمحت النتائج التي تم الحصول عليها باستنتاج أنه على الرغم من أن أحماض روتين وكافيك وبي كوماريك وحمض الفيروليك تمتص إشعاع الضوء المرئي فوق البنفسجي وتوفر MEC أعلى من 1000 لتر مول 1 سم -1 ، إلا أنها مصنفة على أنها غير نشطة للضوء. علاوة على ذلك ، لم تحفز هذه المركبات السمية الضوئية عند اختبارها باستخدام خط خلية HaCaT. البيانات التي تم العثور عليها تشير إلى ذلكهذه مضادات الأكسدةلا يُتوقع أن تسبب في حد ذاتها سمية ضوئية وبالتالي يمكن اعتبارها آمنة للاستخدام في مستحضرات التجميل. من ناحية أخرى ، كان من الممكن ملاحظة زيادة في قابلية الخلية للحياة المعرضة للإشعاع عندما تكون في وجود هذه المواد المضادة للأكسدة تكشف عن تأثير محتمل للضوء يمكن أن يكون مثيرًا للدراسة لدعم استخدامها كعوامل حماية محتملة للضوء في مستحضرات التجميل. في حالة DOPAC ، أظهر هذا المركب أنه نشط ضوئيًا ، على الرغم من عدم ملاحظة السمية الضوئية في اختبار 3T3 Neutral Red Uptake. ومع ذلك ، ينبغي إجراء المزيد من الدراسات لفهم الآليات الكامنة وراء نشاط DOPAC الضوئي ، لضمان سلامة صورها ، وكذلك لفهم الدور والعلاقة بين التركيب الكيميائي وإمكانية أن يكون المركب نشطًا للضوء. مساهمات المؤلف: التحليل الرسمي ، بكالوريوس ؛ الكتابة - إعداد المسودة الأصلية ، بكالوريوس ؛ المفاهيم IFA و HC و JG: Resources و IFA و HC و JMSL و JG ؛ الكتابة — مراجعة وتحرير ، IFA ، HC ، JMSL ، و JG ؛ الإشراف ، IFA ، HC ، و JG ؛ اقتناء التمويل ، IFA ، HC ، JMSL ، و JG قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها التمويل: لم يتلق هذا البحث أي تمويل خارجي بيان مجلس المراجعة المؤسسية: غير قابل للتطبيق بيان الموافقة المستنير: غير قابل للتطبيق البيانات بيان التوفر: تم تضمين جميع البيانات المقدمة في هذه الدراسة في المقالة. / 04378/2020 من ResearchUnit on Applied Molecular Biosciences-UCIBIO والمشروع LA / P / 0140/2020 لمعهد AssociateLaboratory للصحة والاقتصاد الحيوي-i4HB و UIDB / 00081/2020 الممولة من قبل FCT / MCTES (PIDDAC). تضارب المصالح: يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح توافر العينة: لا ينطبق.

مراجع

1. Zillich، OV؛ Schweiggert-Weisz، U.؛ ايسنر ، ص. Kerscher، M. Polyphenols كمكونات نشطة لمنتجات التجميل. كثافة العمليات J. كوزميت. علوم. 2015 ، 37 ، 455-464. [CrossRef]
2. يلينا ، CH ؛ جورجيو ، ر. جوستينا ، ج. ندى ، م. ناتاسا ، إس. أرتور ، ب. جوزيبي ، ج.التأثيرات المفيدة للبوليفينول على الأمراض المزمنة والشيخوخة. في البوليفينول: الخصائص ، والاستعادة ، والتطبيقات ؛ Galanakis ، CM ، Ed. ؛ وودهيد للنشر: كيدلينجتون ، المملكة المتحدة ، 2018 ؛ ص 69 - 102.
3. كوري ، هـ. باساريلي ، إس. Szeto ، J. ؛ تامز ، م. Mattei، J. دور البوليفينول في صحة الإنسان والنظم الغذائية: مراجعة مصغرة. أمامي. نوتر. 2018 ، 5 ، 87. [CrossRef]
4. فراجا ، سي جي ؛ كروفت ، دينار كويتي ؛ كينيدي ، دو ؛ Tomás-Barberán، FA آثار مادة البوليفينول وغيره من المواد النشطة بيولوجيًا على صحة الإنسان. وظيفة الغذاء. 2019 ، 10 ، 514-528. [CrossRef]
5. برتيللي ، أ. بياجي ، م. كورسيني ، م. بيني ، ج. كابيلوتشي ، جي ؛ Miraldi، E. Polyphenols: من النظرية إلى التطبيق. الأطعمة 2021 ، 10 ، 2595. [CrossRef]
6. تشين ، ك. لو ، ص ؛ بيراكا ، نيو مكسيكو ؛ سوكوتشيفا ، الزراعة العضوية ؛ Madhunapantula ، SV ؛ ليو ، ياء ؛ Sinelnikov، MY؛ نيكولينكو ، في إن ؛ بوليجين ، KV ؛ ميكاليفا ، إل إم ؛ وآخرون. طفرات الميتوكوندريا وعلم الوراثة المتقدرية: التركيز على تنظيم الاستجابات المؤكسدة التي يسببها الإجهاد في سرطانات الثدي. سيمين. بيول السرطان. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. فورمان ، هج. Zhang ، H. استهداف الإجهاد التأكسدي في المرض: الوعد والقيود على العلاج بمضادات الأكسدة. نات. القس اكتشاف المخدرات. 2021، 20، 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo، YC هل يمكن أن تحمي المركبات الفينولية النباتية الجلد من الجسيمات العالقة في الهواء؟ مضادات الأكسدة 2019 ، 8 ، 379. [CrossRef]
9. Jesumani، V.؛ دو ، ح. بي ، ص. أسلم ، م. دراسة مقارنة حول نشاط حماية الجلد للمستخلص الغني بالبوليفينول والمستخلص الغني بعديد السكاريد من Sargassum vachellianum. بلوس وان 2020، 15، e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10- صراف س. Kaur ، CD Phytoconstituents كتركيبات تجميلية جديدة واقية من الضوء. العقاقير. القس 2010 ، 4 ، 1-11. [CrossRef]