arلغة
الصفحة الرئيسية / معرفة / المحتوى

معرفة

الإنزيمات النانوية المستشعرة للالتهاب والتي تحاكي الكاتلاز تخفف من إصابة الكلى الحادة عن طريق عكس الإجهاد التأكسدي المحلي Ⅳ

Jun 19, 2024

خاتمة

في ملخص،حساس لـ ROSتم تحضير وتقييم النانوزيم PTC-M المكون من dMn 3O4 الكاره للماء بنجاح. PTC-M يمكن أن يكون سلبيااستهداف الكلىوإطلاق dMn3O4 من خلال الاستجابة لمستويات عالية من ROS الموجودة في الموقع، ويمكن لـ dMn 3O4 الذي تم إصداره التخلص من ROS المفرط بشكل أكثر فعالية. وبالتالي، يمكن لـ PTC-M التغلب على عيوب dMn 3O4 عن طريق زيادة ذوبانه واستقراره وتوافقه الحيوي، ويمكنه تقليل جرعة dMn3O4. ويمكن أيضا أن تمارس بشكل تآزريمضاد التهابوالآثار المضادة لموت الخلايا المبرمج. أظهرت النتائج الحالية أن PTC-M يمكنه ذلكتخفيف إصابة الكلىفي الفئران IRI كنموذج تجريبي لـ AKI.
على وجه التحديد، خفف PTC-M بشكل فعال الالتهاب وموت الخلايا المبرمج في الخلاياالكلى من الفئران IRIومحمي ضد H2O2- الناجمإصابة الخلويةفي وكيل الإنسانالخلايا الظهارية الأنبوبية المالحة. هذه النتائج تسلط الضوء علىإمكانات PTC-M كعامل علاجي ليس فقط لIRI ولكن أيضًا لـ AKI.

1

الأعشاب العضوية لأمراض الكلى

المواد والأساليب

مواد

هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)، 1-دوديكانيثيول، ستيارامين (C18)، 1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد (EDC)، N-هيدروكسي سوسينيميد (NHS)، و 3- تم شراء حمض المركابتوبروبيونيك وثلاثي إيثيل أمين (TEA) من Sigma-Aldrich (St. Louis، MO، USA). تم شراء PEG-AM (2 كيلو دالتون) من PEG-Shop (Sunشركة بيو، كوريا الجنوبية). ثنائي هيدرات كلوريد المنغنيز (II).(منكل2.2H2O) وN، N-ثنائي ميثيل فورماميد (DMF)تم شراؤها من شركة ميرك (دارمشتات، ألمانيا). تريس
تم شراء (4 7-ثنائي فينيل-1 10-فينانثرولين) روثينيوم(ii) ثنائي كلوريد (Ru(DDP)) من شركة Chemcruz (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية).كان الرجال من الدرجة التحليلية واستخدموا كما تم استلامهم.

31

تخليق وتوصيف الجسيمات النانوية dMn3O4

تم تحضير الجسيمات النانوية dMn3O4 على النحو التالي. باختصار، تمت إضافة 4 مليمول NaOH في 2.5 مل من الماء المقطر (DW) قطرة قطرة إلى 2 ملي مول MnCl مذاب في 2.5 ملمن DW تحت التحريك القوي مع دوران المحلولجي البني. لاحقًا، تمت إضافة 1 ملي مول من 1- دوديكانيثيولإلى الخليط مع التحريك المستمر حتى المحلولأصبح عجينة. تم غسل المادة المترسبة في الإيثانولبواسطة الطرد المركزي بسرعة 5000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. كان الغسيلكرر خمس مرات وتم تجفيف الحبيبات النهائية وغسلهافي DW مرتين، ومجفف بالتجميد.
تم تحليل مورفولوجيا dMn 3O4 NPs المحضرة بواسطة FE-TEM، (JEM -2100 F؛ JEOL، طوكيو، اليابان) التي تعمل بسرعة 200 كيلو فولت. للتحقيق في حالة Mn في dMn3O4, تم إجراء تحليل XPS باستخدام صورة الأشعة السينية k-alphaنظام الطيف الضوئي الإلكتروني (Thermo Fisher Scientific، والثام، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت قياسات XRDتم إجراؤها باستخدام حيود الأشعة السينية، M18XHF-SRA (Macالعلوم، اليابان)، وتم تحليل نمط XRD باستخدامملف ICDD (المركز الدولي لـ DiDiffractionata).توليف وتوصيف PTC وجهاز الكمبيوتر

تم إجراء تخليق رابط TK، والبولي إيثيلين جلايكول المرتبط برابط TK (PEG-TK)، و(PEG) - ستيرين (C18) مترافق (PTC) وفقًا لمنشورنا السابق [15]. كعنصر تحكم، قمنا أيضًا بإعداد بوليمر ROS غير حساس (PC) عن طريق ربط حامض دهني بـ PEG-AM. باختصار، تم تفاعل 200 مجم من m-PEG أمين مع 160 مجم من حمض دهني مع 160 ميكرولتر من TEA، و480 مجم من EDC، و290 مجم من NHS في 20 مل من DMF عند 37 درجة طوال الليل مع التحريك تحت تطهير N2. تمت بعد ذلك تنقية العينة عن طريق غسيل الكلى (MWCO =12 –14 كيلو دالتون) مقابل DW لمدة يوم واحد، يليها التجفيف بالتجميد. تم تكوين التركيبات الكيميائية لـ PTC و PC المُصنّعة باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للبروتون (1 H NMR) (400 هرتز ، Bruker: Billerica، MA، USA) في الكلوروفورم (CHCl3). تم تحضير المذيلات الفارغة PTC الحساسة لـ ROS و ROS غير الحساسة للكمبيوتر الشخصي من خلال التجميع الذاتي لـ PTC والكمبيوتر الشخصي تحت صوتنة وغسيل الكلى.

34

تحضير وتوصيف إنزيم ROS الحساس (PTC-M)

تم تحضير PTC-M بطريقة غسيل الكلى. باختصار، تم إذابة 2 ملغ من dMn3O4 و10 ملغ من PTC في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي (DMSO). تمت بعد ذلك إضافة الخليط قطرة قطرة إلى 20 مل من DW تحت صوتنة المسبار (سعة 30٪، 5 ثوانٍ تشغيل / إيقاف، 5 دقائق). تمت بعد ذلك غسيل المحلول (MWCO=12–14 KDa) مقابل DW لمدة يوم واحد، يليه التجفيف بالتجميد. وبالمثل ، تم أيضًا إعداد جزيئات النانو غير الحساسة (PC-M) المحملة بـ ROS NP من dMn3O4 كمجموعة تحكم. تم تقييم الأقطار الهيدروديناميكية وإمكانات زيتا للمذيلات النانوية الفارغة المحضرة (PTC و PC) والمذيلات النانوية المحملة dMn3O4 NP (PTC-M و ​​PC-M) عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (أداة Zetasizer Nano Z، Malvern، UK). تم تصور مورفولوجيا PTC و PTC-M المحضرة باستخدام FE − TEM. تمت ملاحظة زعزعة الاستقرار الحساسة لـ Te ROS عبر تدهور رابط TK لـ PTC-M بواسطة تحليل DLS و FE-TEM بعد معالجة العينات بـ 1 مم H2O2. تم تحليل محتوى تحميل dMn3O4 في PTC-M النهائي باستخدام محلل قياس الوزن الحراري (TGA N -1000، Scinco، سيول، كوريا) وتحليل ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker، Billerica، MA، USA) .

تم تقييم النشاط الشبيه بالكاتالاز لـ PTC-M النهائي من خلال ملاحظة الإزالة الحفزية لـ H2O2 بواسطة طريقة الفلورسنت باستخدام TA. باختصار، 1 ملم H2O2تمت إضافتها إلى العينات، تليها إضافة0.5 ملي تا (DMF). تم تدوير العينات، وتم تسجيل مضان (الإثارة: 320 نانومتر؛ الانبعاث:425 نانومتر) لمدة تصل إلى 45 دقيقة. النشاط الشبيه بالكاتلازتم أيضًا فحص PTC-M بتركيزات مختلفةطريقة مماثلة.

تم أيضًا إثبات تحلل H2O2 إلى الماء والأكسجين باستخدام Ru (DDP) كمسبار لتوليد الأكسجين. باختصار، تمت إضافة 1 ملم H2O2 إلى العينات، تليهاعن طريق إضافة 1 ميكرومتر رو (dDDP(دي إم إف). العيناتتم خلطها جيدًا وكثافة التألقعند الإثارة 440 نانومتر والانبعاث 530 - 730 نانومترالمسجلة. وفي وقت لاحق، تم تأكيد إنتاج الأكسجين أيضًاعن طريق تحديد تركيز الأكسجين المذاب باستخداممستشعر الأكسجين المذاب (RDO Optical Dissolved Senلذلك، الحرارية العلمية).

7

ثقافة الخلية والكواشف

أجريت دراسات في المختبر كما هو موضح سابقًا [37]. باختصار ، تم استخدام الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة من الكلى البشرية (خلايا HK -2 ، مجموعة American Type Culture Collection ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) في الدراسات المختبرية. تم استزراع خلايا HK -2 وتمريرها كل 3 - 4 أيام في أطباق 100- ملم تحتوي على مزيج من وسيط Eagle's (DMEM) المعدل وHams F -12 في Dulbecco (Welgene، Daegu، Korea) مكمل بـ 10% من مصل الأبقار الجنيني (FBS؛ ويلجين)، 100 وحدة/ مل من البنسلينو 100 ملغم / مل ستربتومايسين (سيجما الدريخ). تيتم بعد ذلك تحضين خلايا HK-2 في جو مرطبنسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون2و 95% هواء عند 37 درجة لمدة 24 ساعة و تحتمثقف حتى 70 - 80٪ متكدسة. كانت خلايا Te HK -2مطلي على أطباق 60-مم في وسط يحتوي على 10%FBS واحتضانها لمدة 24 ساعة. ثم تتكبد الخلايا

تم وضعه في وسط DMEM-F12 بدون FBS وتم معالجته بـ H2O2 (1 مم) لمدة 24 ساعة إضافية (باستثناء 15 دقيقة لـ ERK وJNK وp38). تمت إضافة PTC-M (2 ميكروغرام) لمدة ساعة واحدةقبل ح2O2علاج. جميع التجارب في المختبرتكررت مرتين لتحديد إمكانية تكرار نتائج وكانتيتم ذلك خلال مرور الثلاثين من الخلايا.



بقاء الخلية

في المختبر، تم تقييم صلاحية الخلية في خلايا HK -2 (1 × 104 خلية / بئر) في وسط DMEM F12 المحتضن طوال الليل. تم استنشاق الوسائط، وتم تحضين الخلايا بهاتركيزات مختلفة من PTC وPTC-M لمدة 24 ساعةتم تخفيضه بواسطة اختبار WST-1، والذي تم إجراؤه وفقًا لـبروتوكول الشركة المصنعة. لمقارنة تأثير المعارف التقليديةالروابط، قمنا أيضًا بمقارنة مدى صلاحية الخلايا المعالجةمع الكمبيوتر الشخصي وPC-M. وكانت قيم IC50 للعيناتتحليلها من بيانات بقاء الخلية. الخلايا غير المعالجةتم استخدامها كعناصر تحكم إيجابية والخلايا المعالجة0.1%تريتون×تم استخدام 100 كعناصر تحكم سلبية.


6

امتصاص الخلوية

للتحقيق في التوزيع داخل الخلايا وإطلاق الحمولة من PTC، تم تطوير PTC محملة بصبغة قريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR)، يوديد IR780 (PTC-IR780).
بالنسبة لدراسات الامتصاص، تم زرع خلايا HK-2 (3×104 خلية/بئر) في شرائح حجرة Lab-Tek ® واحتضانها طوال الليل. وكانت وسائل الإعلام يستنشق، وسام مختلفةأنواع IR780 فقط، وPTC-IR780 وPC-IR780 بوزن 4 ميكروغرام/تمت إضافة مل ما يعادل IR780 لكل بئر إلى الآبار، المجلدتم خفضه بواسطة حضانة 4-ساعة. وكانت الخلايا دون علاجتستخدم كعناصر تحكم. بعد الحضانة، وكانت وسائل الإعلام ASPIتصنيف، تليها الغسيل DPBS و4٪ بارافورمالدتثبيت الهايد (PFA). ثم تمت مقاومة الخلايامع 4′،6-دياميدينو-2-فينيل إيندول (DAPI). مضانتم تحليل شدة IR780 بواسطة مضانالفحص المجهري (Evos FL Auto 2، Thermo Fisher Scientific)لتحديد امتصاص IR780 بواسطة الخلايا. لإظهارزعزعة استقرار المذيلات النانوية بوساطة ROSإطلاق صبغة الفلورسنت كدواء نموذجي، وهو أكسيد
تم استخدام نموذج خلية HK2 المصابة بالإجهاد. تم إحداث الإجهاد التأكسدي عن طريق معالجة H2O2، 200 ميكرومتر H2O2 لمدة ساعتين، أو عن طريق تعريض الخلايا لبيئة نقص الأكسجينعن طريق احتضان الخلايا في غرفة نقص الأكسجة (1٪O 2، 5% ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 24 ساعة قبل العلاج. امتصاص الخلويةتم قياسها بشكل أكبر عن طريق تحليل التدفق الخلوي. باختصار،1× 105تم زرع خلايا/بئر HK-2 في 12-ألواح البئر واحتضنت بين عشية وضحاها. وكانت وسائل الإعلام تطلع، وفرقتمت إضافة عينات متفاعلة تليها حضانة لمدة 4 ساعات.
تم بعد ذلك جمع الخلايا وطردها للحصول على الحبيبات متبوعة بغسلين DPBS. تم بعد ذلك تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 3٪ FBSوكان فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS) لكلتم تشكيلها لقياس القدرة الاستيعابية لكل مجموعة.تم بوابات البيانات باستخدام مرشح APC-Cy 7. الخلويةتم تحديد امتصاص إنزيم PTC-M النهائي عبرتحليل ICP-MS. باختصار، 1× 105هونج كونج -2 خلايا / كانت جيدةيتم زرعها في 12-أطباق جيدة متبوعة بحضانة طوال الليلنشوئها. ثم تمت إزالة وسائل الإعلام، وconcens مختلفةتمت إضافة جرعات من PTC-M إلى الآبار واحتضانهالمدة 4 ساعات أخرى. بعد الحضانة، كانت الخلايا كولتم فرزها وطردها للحصول على الحبيبات التي كانتغسلها مع DPBS مرتين. تمت إضافة أكوا ريجيا (1 مل).إلى بيليه النهائي للهضم وتم أخذ العينات بعد ذلكتم تخفيفه وتحليله لمحتوى Mn بواسطة ICP-MS. غير المعالجةتم استخدام الخلايا كعناصر تحكم.


التدفق الخلوي

تم إجراء تحليل التدفق الخلوي كما هو موضح سابقًا [38]. تم استخدام مجموعة تلوين Annexin V FLUOS (SigmaAldrich) لقياس مستوى ربط Annexin V وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، بعد العلاج بـ 0 أو 1 ملي مولار من الماء لمدة 24 ساعة مع أو بدون 2 ميكروغرام من المعالجة المسبقة PTC-M، تم حصاد خلايا HK-2 وغسلها مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات مبرد مسبقًا وتم إعادة تعليقها. في مخزن مؤقت ملزم يحتوي على Annexin V. بعد الحضانة في الظلام لمدة 15 دقيقة، تم تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي (Becton – Dickinson، San Jose، CA، USA). تم استخدام العديد من عناصر التحكم لتحسين إعدادات الأداة وتحديد البوابة للنظام الأساسي الذي يعمل بنظام Windows. تم تعريف الخلايا المبرمج على أنها سالبة PI و Annexin V-FITC إيجابية.


تحديد جيل ROS داخل الخلايا

لتحديد توليد ROS، استخدمنا الفلوروفور DCF-DA (المجسات الجزيئية، يوجين، OR، الولايات المتحدة الأمريكية) كما هو موضح سابقًا [38]. تم تحضين خلايا HK-2 بـ 0 أو 1 ملي مولار H2O2 لمدة 24 ساعة مع أو بدون 2 ميكروغرام من المعالجة المسبقة PTC-M، وغسلها مرتين بمحلول ملح هانك المتوازن، ثم حضنتها بملح هانك المتوازن. محلول (بدون أحمر الفينول) يحتوي على DCF-DA لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة في الظلام. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان (نيكون، طوكيو، اليابان).



الحيوانات التجريبية والبروتوكولات

تم تنفيذ جميع الطرق التجريبية وفقًا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل رعاية الحيوانلجنة اللوائح بجامعة تشونام الوطنيةمستشفى (CNUHIACUC-20009).


تم شراء فئران ذكور C57BL6 عمرها سبعة أسابيع ويتراوح وزنها بين 20 و22 جم من سامتاكو (كوريا). تم إيواء الفئران في منشأة رعاية الحيوانات في تشونام الوطنيةكلية الطب بالجامعة وتتغذى على نظام غذائي قياسيالوصول إلى المياه حسب الرغبة. تم تقسيم الفئران إلىثلاث مجموعات: الشام (ن=4)، إيري (ن=4) و IRI مععلاج PTC-M (ن=4). للحث على نموذج الفئران IRI،تم إجراء الجراحة على النحو التالي. بعد التخديرالتحريض باستخدام الحقن داخل الصفاق من الكيتامين(70 ملغم / كغم؛ يوهان، سيول، كوريا الجنوبية) وزيلازين(7 ملغم/كغم؛ باير، ليفركوزن، ألمانيا)، خط الوسطتم إجراء سيون لفضح تجويف البطن وكلاهماتم تثبيت عنيقات الكلى بمشبك صغير (ROBOZ،Gaithersburg، MD، USA) لمدة 30 دقيقة على درجة حرارةطاولة منظمة (38.5 درجة) للحفاظ على درجة حرارة الجسم.جماعة الشام (ن=4) خضع لنفس الإجراء، باستثناءأن المقطع لم يتم تطبيقه.



في التوزيع الحيوي في الجسم الحي

لتحليل التوزيع الحيوي، تم حقن مجموعة IRI عن طريق الوريد بـ PTC-IR780 بجرعة 0.5 ملجم/كجم (مكافئ IR780). تم الموت الرحيم للفئران في وقت سابقالأوقات المنتهية (6، 12، 24، و 48 ساعة) والأعضاء الرئيسيةتم جمعها. إشارات مضان من التي تم جمعهاتم تحليل الأعضاء باستخدام المسمى مضانأداة التصوير الحيوي للكائن الحي (FOBI، NEO Science،جيونجي، كوريا). شدة مضان عناتتم قياس الأعضاء الرئيسية المقسمة لتقييم العضوتراكم PTC-IR780. كان التوزيع الحيوي كذلكمقارنة مع PC-IR780 أو IR780 بعد إدارةمبلغ يعادل IR780. التوزيع الحيوي PTC-IR780وتمت مقارنة نشوئها أيضا في الفئران العادية بعد الحقن الوريديإدارة.



تم أيضًا إجراء تحليل التوزيع الحيوي لعينات PTC-M النهائية. باختصار، تم حقن مجموعة IRI بـ 0.5 مجم/كجم من عينات PTC-M (مكافئ المنغنيز)،الموت الرحيم للفئران في الوقت المحدد سلفاالفترات المذكورة أعلاه وكانت الأجهزة الرئيسيةتم جمعها. ثم تم علاج الأعضاء بالماء الملكي،وتم تحليل العينات باستخدام ICP-MS للردعمنجم تركيز الأنسجة Mn.

للتحقق من التأثير العلاجي لـ PTC-M في الجسم الحي، تم إعطاء مجموعة العلاج جرعة واحدة قدرها 0.5 ملغم/كغم من PTC-M عن طريق الحقن في الوريد الذيل بعد الجراحة. الفئرانتم الموت الرحيم بعد 48 ساعة من ضخه. عينات الدمتم جمعها من القلب، والكلية اليسرىكانتتم إزالتها ومعالجتها بسرعة للنشاف الغربي أومثبت في محلول بارافورمالدهيد 4% للنسيج المناعيالكيمياء (IHC). الالكلى اليمنىتم تجميده عند−80 درجةلتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي.


قياس البلازما NGAL

تم قياس مستويات الليبوكالين المرتبطة بالجيلاتيناز (NGAL) في البلازما باستخدام مجموعة ELISA التجارية (R&D Systems، Minneapolis، MN، USA) وفقًاللبروتوكول المقدم من قبل الشركة المصنعة. أ 1:400تم إجراء تخفيف العينة لقياسات NGAL البلازما.

12

التطعيم المناعي شبه الكمي

تم إجراء تحليل لطخة غربية كما هو موضح سابقًا [37]. تم تجانس أنسجة الكلى في محلول عزل بارد مثلج يحتوي على 0.3 م سكروز، 25 ملي إيميدازول، 1 ملي مولار من حمض إيثيلين أمينيتراسيتيك (EDTA)، 8.5 ملي لوبيبتين، و1 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (الرقم الهيدروجيني 7.2). تم الطرد المركزي للمتجانسات عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات لإزالة الخلايا الكاملة والنواة والميتوكوندريا. تم قياس تركيز البروتين الكلي بواسطة مجموعة فحص حمض البيسينكونيك (BCA) (بيرس؛ روكفورد، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعديل جميع العينات للوصول إلى نفس تركيزات البروتين النهائية. تم بعد ذلك إذابتها عند 65 درجة لمدة 15 دقيقة في محلول عينة يحتوي على كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) وتخزينها عند درجة -20 درجة. لتأكيد التحميل المتساوي للبروتينات، تم تلوين الجل الأولي باللون الأزرق Coomassie. تم إجراء SDS- بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE) على 9 أو 12٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد. تم نقل البروتينات كهربائيًا إلى أغشية النيتروسليلوز (Hybond ECL RPN3032D؛ Amersham Pharmacia Biotech؛ Little Chalfont، UK) باستخدام جهاز Bio-Rad Mini Protean II (Bio-Rad؛ Hercules، CA، USA). تم حظر البقع باستخدام 5٪ حليب في PBS-T (80 ملي مولار Na2HPO4، 20 ملي مولار NaH2PO4، 100 ملي كلوريد الصوديوم، و0.1% توين -20 عند درجة الحموضة 7.5) لمدة ساعة واحدة؛ المحتضنة طوال الليل عند 4 درجات مع الأجسام المضادة الأولية؛ ويتم احتضانها باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب أو الفأر أو الماعز بعد ذلك. ثم تم تصور الكتل المناعية باستخدام نظام التألق الكيميائي المعزز. تم قياس مستويات البروتين باستخدام قياس الكثافة. تم قياس الشدة النسبية لإشارات الكتل المناعية عن طريق قياس الكثافة باستخدام برنامج Scion Image for Windows (Scion Corporation، 2000–2001. الإصدار Alpha 4.0.3.2. MD، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم التعبير عنها كتغييرات أضعاف بالنسبة لعناصر التحكم. يتم سرد الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة في التطعيم المناعي في الجدول S1.


تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي (PCR في الوقت الحقيقي)

تم إجراء تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل كما هو موضح سابقًا [37]. تم تجانس القشرة الكلوية في كاشف Trizol (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA). تم استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام الكلوروفورم، وتم ترسيبه باستخدام الأيزوبروبانول، وغسله بنسبة 75٪ من الإيثانول، ثم تم إذابته في DW. تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر (Ultraspec 2000؛ PharMacia Biotech، Cambridge، UK). تم تحديد تعبير mRNA للسيتوكينات الالتهابية وجزيئات الالتصاق بواسطة PCR في الوقت الحقيقي. تم تصنيع [كدنا] عن طريق النسخ العكسي 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي باستخدام فتيلة oligo (dT) والنسخ العكسي المرتفع II (InvitRogen، Carlsbad، CA، USA). تم قياس كمية [كدنا] باستخدام نظام Smart Cycler II (Cepheid، Sunnyvale، CA، USA)، وتم استخدام SYBR Green للكشف. تم إجراء كل تفاعل PCR في 10 مساءً تمهيدي أمامي، 10 مساءً تمهيدي عكسي، 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC، Seta 3-4-1، اليابان)، 0.5 ul cDNA، وH2O لجلب الحجم النهائي إلى 20 ماي. تم تحديد المستويات النسبية لـ mRNA بواسطة PCR في الوقت الفعلي، باستخدام نظام كاشف Rotor-GeneTM 3000 (أبحاث Corbette، Mortlake، NSW، أستراليا). يتم سرد تسلسلات الاشعال في الملف الإضافي 1: الجدول S2. تم إجراء PCR وفقا للخطوات التالية: 1) 95 درجة لمدة 5 دقائق؛ 2) 95 درجة لمدة 20 ثانية؛ 3) 58 إلى 60 درجة لمدة 20 ثانية (الأمثل لكل زوج تمهيدي)، و4) 72 درجة لمدة 30 ثانية للكشف عن SYBR Green. تم تكرار الخطوات من 2 إلى 4 لمدة 40 دورة إضافية، بينما في نهاية الدورة الأخيرة، تمت زيادة درجة الحرارة من 60 إلى 95 درجة لإنتاج منحنى ذوبان. تم جمع البيانات من التفاعل وتحليلها باستخدام برنامج Corbett Research Software. تم استخدام قيم العتبة الحرجة المقارنة من القياسات الرباعية لحساب التعبير الجيني، مع التطبيع إلى GAPDH كعنصر تحكم داخلي. تم إجراء تحليل منحنى الانصهار لتعزيز خصوصية رد فعل التضخيم.


الأنسجة

تم تحضير أنسجة الكلى كما هو موضح سابقًا [37]. تم تثبيت أنسجة الكلى باستخدام بارافورمالدهيد بنسبة 4%، ودمجها في البارافين، وتقطيعها إلى مقاطع يبلغ سمكها 3- ميكرومتر. تم إجراء تلطيخ حمض شيف الدوري وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Abcam، Cambridge، MA، USA). بالنسبة للكيمياء المناعية، تم استرجاع أقسام الأنسجة منزوعة الكافيين بواسطة مضادات الجينات عن طريق التسخين عند درجة حرارة 1{{10}}0 لمدة 15 دقيقة في المخزن المؤقت للسيترات، الرقم الهيدروجيني 6.0 (سيجما- ألدريتش). تم تحضين المقاطع طوال الليل عند 4 درجات مع تخفيف الأجسام المضادة الأولية في مانع العازلة (1٪ [وزن / حجم] ألبومين المصل البقري المذاب في 0.3٪ [حجم / حجم] Triton X -100 محضر في PBS [0.3٪ PBS-) ت]). بعد أن تم غسل المقاطع لفترة وجيزة ثلاث مرات بنسبة 0.3٪ PBS-T، تم تحضينها لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة مع تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة المخزن المؤقت. تم حساب درجات الإصابة الأنبوبية بالطريقة الموصوفة مسبقًا [39، 40]. تم قياس درجة الإصابة الأنبوبية عن طريق فحص أكبر من أو يساوي 10 HPF من الوصل القشري النخاعي (× 200 تكبير) في المقاطع الملطخة بـ PAS (n =5 –7). يتم سرد الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة في التحليلات الكيميائية المناعية في الجدول S3. تم اكتشاف موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية الأنبوبية من خلال تلطيخ TUNEL باستخدام ApopTag Plus Perوكسيدase In Situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم جمع أقسام الأنسجة من جميع الأعضاء الرئيسية مضمنة بالبرافين وملطخة بالهيماتوكسيلين / الأيوزين (H&E) لمقارنة التغيرات النسيجية.


التحليل الإحصائي

يتم التعبير عن النتائج على أنها الخطأ المعياري المتوسط ​​للوسط (SEM). تم إجراء مقارنات متعددة بين المجموعات الثلاث باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) واختبار الفرق الهام الذي أجراه توكي بصدق. تعتبر الاختلافات ذات القيم الاحتمالية الأقل من 0.05 ذات أهمية.


مساهمات المؤلف

IKP، EHB، SWK، وHSC تصور وتصميم التجارب. أجرى HSC، وAPJ، وSJ، وAV، وIJK، وSAG التجارب، وقاموا بتحليل البيانات، وإجراء التحليل الإحصائي. HSC، APM كتب وحرر الورقة. إس إتش إس، كسك، سكم، سوك،قام كل من IKP وEHB بالإشراف والإدارة.
التمويل تم دعم هذا البحث من خلال برنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال منحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية، وMSIT (NRF-2022R1C1C1007573 وNRF-2019R1F1A1041451) ومن خلال منحة ( CRI18038-1 وBCRI21056) من معهد البحوث الطبية الحيوية بمستشفى جامعة تشونام الوطنية. تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال منحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (رقم 2020R1A2C2005620، 2019R1A2C1003971، و2020R1A5A2031185). توفر البيانات والمواد تم تضمين جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها خلال هذه الدراسة في هذه المقالة المنشورة وملفها الإضافي 1. لا تتم مشاركة بيانات البحث. الموافقة على الأخلاقيات والموافقة على المشاركة تم تنفيذ جميع إجراءات استخدام الحيوان من قبل لجنة لوائح رعاية الحيوان في مستشفى جامعة تشونام الوطنية. الموافقة على النشر يقرأ جميع المؤلفين المخطوطة النهائية ويوافقون عليها. المصالح المتنافسة يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة. تفاصيل المؤلف 1 قسم الطب الباطني، كلية الطب بجامعة تشونام الوطنية، 160، بايكسيورو، دونغ غو، غوانغجو 61469، جمهورية كوريا. 2 أقسام الطب الباطني، مستشفى جامعة تشونام الوطنية، غوانغجو، جمهورية كوريا. 3 قسم العلوم الطبية الحيوية، مركز BK21 PLUS لعلماء الطب الحيوي المبدعين، كلية الطب بجامعة تشونام الوطنية، 160، بايكسيو-رو، دونج-غو، غوانغجو 61469، جمهورية كوريا. 4 برنامج الدراسات العليا في العلوم الطبية الحيوية (BMSGP)، جامعة تشونام الوطنية، هواسون غون، جولانام دو، جمهورية كوريا.




















قد يعجبك ايضا