يظهر الليبوكالين المرتبط بالجيلاتيناز المفرز قدرة أقوى على منع تضخم الكيس في خلايا ADPKD مقارنة بالشكل غير المفرز Ⅲ
Jun 25, 2024
3.4. آثار mNGAL على تكوين الكيس لخلايا 2L3 في الثقافة ثلاثية الأبعاد
تكاثر الخلايايزداد بشكل غير طبيعي في الفئران 2L3 ويؤدي إلى تكوين الكيس وتوسيعه [17]. بناءً على النتائج السابقة التي تم تثبيطها بواسطة mNGALتكاثر الخلايا 2L3 في ثقافة ثنائية الأبعاد(الشكل 3)، توقعنا أن mNGAL قد يمنع تكوين الكيس في خلايا 2L3. لاستكشاف ما إذا كان mNGAL يمكن أن يمنع تكوين الكيس في خلايا 2L3، أنشأنا منصة ثقافة ثلاثية الأبعاد توفر بيئة مناسبة مع Matrigel لتكوين الكيس (الشكل 6). تم زرع الخلايا في 96-ألواح جيدة (1000 خلية / بئر) فوق Matrigel المشكل مسبقًا طوال الليل. بعد أن تم إرفاق الخلايا بالهلام، تمت إضافة المزيد من Matrigel إلى الخلايا لتشكيل نمط يشبه الساندويتش (الشكل 6A). تم الحفاظ على الخلايا في ثقافة ثلاثية الأبعاد عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 أيام على الأقل لتكوين الخراجات. نمت الخراجات في الثقافة ثلاثية الأبعاد بشكل أكبر مع فترة ثقافة طويلة (الشكل 6B). للتأكد من أن التركيبات الكروية التي لوحظت في الثقافة ثلاثية الأبعاد كانت عبارة عن خراجات ذات تجويف، قمنا بإصلاحها وصبغها باستخدام DAPI وE-cadherin والأجسام المضادة للأكتين لتحديد نوى الخلية، وadh، وesion، والغشاء القمي، على التوالي. تمت ملاحظة أقسام z الضوئية المختلفة لكيس 2L3 في الثقافة ثلاثية الأبعاد من الأعلى (الطبقة 1) إلى الوسط (الطبقة 5) بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر، وتم تأكيد التجويف داخل الكيس الكروي (الشكل 6C، المادة التكميلية
أعشاب جديدة لـ ADPKD(مرض الكلية متعددة الكيسات)
للتحقيق في آثار mNGAL على تكوين الكيس لخلايا 2L3 في الثقافة ثلاثية الأبعاد، عولجت الخلايا في الثقافة ثلاثية الأبعاد بالفورسكولين من الأيام 1 إلى 3 للحث على تكوين الكيس. ثم تم علاج الخلايا مع أو بدون mNGAL من 4 إلى 8 أيام، وتم قياس أقطار الكيس كل يوم (الشكل 6D). نمت الخراجات في الثقافة ثلاثية الأبعاد بشكل متناسب مع عدد أيام الثقافة، بأقطار تتراوح من 40 إلى 120 ميكرومتر (الشكل 6E – G)، في حين قمعت mNGAL بشكل كبير أقطار الكيس (الشكل 6F) والمساحة (الشكل 6G) حتى اليوم 8. ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير في الزيادة في عدد الكيس بين مجموعات التحكم والمجموعات المعالجة بـ mNGAL من الأيام 4 إلى 8 (الشكل 6H). قمنا أيضًا بتحليل عدد الخراجات الكبيرة (القطر> 100 ميكرومتر) بين المجموعتين ووجدنا أن mNGAL قلل بشكل كبير من نسبة الخراجات الكبيرة مقارنة بالمجموعة الضابطة في اليوم 8 (الشكل 6I).
3.5. آثار ترنسفكأيشن مع pN + LS و pN - LS على تعبير NGAL وتكاثر الخلايا في خلايا 2L3
لدراسة ما إذا كانت الحاجة إلى تركيز أعلى من mNGAL (2 ملغم/مل) في الثقافة ثلاثية الأبعاد لمنع نمو الكيس لخلايا 2L3 (الشكل 6) كانت بسبب عدم وجود تعديل ما بعد الترجمة لـ mNGAL، قمنا بتصميم بنية للإفراط في التعبير عن mNGAL في خلايا 2L3. بالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت أن NGAL يمكن أن يتفاعل مع NGAL-R ويحفز موت الخلايا المبرمج بشكل أكبر [29]. ولذلك، لفهم ما إذا كان NGAL تفاعل مع NGAL-R للحث على موت الخلايا المبرمج وأكثر من ذلكتمنع بقاء الخلية(الشكل 3) ونمو الكيس (الشكل 6)، تم أيضًا نقل بنية الإفراط في التعبير عن NGAL غير المفرز (بدون تسلسل القائد) إلى خلايا 2L3.
الفأر NGAL (NP_032517.1) والبشر NGAL (NP_005555.2) هما بروتينان 200-aa و198-aa، على التوالي، وكلاهما لهما {{6 }}أأ إشارة الببتيد للإفراز الموجود عند الطرف N من بروتين NGAL (الشكل 7A). وأظهرت مقارنة التسلسل هوية 62% وإيجابية 80% بين NGAL بالماوس وNGAL البشري. تبين أن Mouse NGAL يحتوي على موقعين من الارتباط بالجليكوزيل N على الأسباراجين (Asn, N) عند aa 81 و85، بينما كان لدى NGAL البشري موقع واحد عند aa 85 (الشكل 7A)، مما يكشف الفرق بينهما في تعديل ما بعد الترجمة.
الشكل 7. آثار ترنسفكأيشن مع pN + LS وpN - LS على التعبير NGAL وتكاثر الخلايا في خلايا 2L3. (أ) محاذاة الماوس NGAL (NP_032517.1) والبروتينات NGAL البشرية (NP_005555.2). تظهر ببتيدات الإشارة 20-aa باللون الأزرق. يتم تمييز موقعي الغليكوزيل المرتبطين بـ N على Asn (N) عند aa 81 و 85 من الماوس NGAL وواحد عند aa 85 من NGAL البشري بعلامة النجمة (*). الهويات: خط متصل؛ الإيجابيات: النقاط المقترنة. معلومات التسلسل أعلاه مأخوذة من برنامج BLASTP الموجود على موقع المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI). (ب) أنشئ رسمًا تخطيطيًا لـ mNGAL باستخدام (pN + LS) أو بدون (pN - LS) تسلسل زعيم Igκ المفرز على ناقل pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd. (C) أكدت نتيجة الرحلان الكهربائي للهلام بناء pN + LS (647 سنة مضت) وpN - LS (587 سنة مضت) التي تم هضمها بواسطة NheI وNotI. (د) الجدول الزمني للعدوى واختيار خلايا 2L3 مع pN + LSوpN - LS، على التوالي. تم إصابة الخلايا 2L3 بـ pN + LS أو pN - LS في لوحة 6a -well في اليوم الأول. بدأ الاختيار باستخدام بلاستيسيدين في اليوم الثاني وتم تغيير الوسيط كل 3 أيام. بعد الاختيار لمدة أسبوع، تم جمع الخلايا لتحليلها بواسطة RT-QPCR، وصمة عار الغربية، وELISA. (E) الكشف عن تعبير مراسل eGFP لفحص كفاءة ترنسفكأيشن من pN + LS وpN - LS في اليوم 2. أصيب حوالي 10٪ من الخلايا ببناء GFP. شريط النطاق: 50 ميكرومتر. أظهرت نتائج RT – qPCR أن كل من pN + LS و pN - LS لهما تعبير أعلى عن Lcn2 (يمثل إجمالي مستوى NGAL) (F) وc-myc (يمثل مستوى NGAL خارجي منقول) (G) مقارنة مع مجموعة التحكم. (ح) لم يكن هناك فرق كبير oinSlc22a17 (NGAL-R) بين المجموعتين. RQ: القياس الكمي النسبي=2−∆∆Ct; تم استخدام Gapdh كعنصر تحكم داخلي لكل عينة. تم تطبيع القيم إلى المجموعة الضابطة. (I) أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن pN + LS وpN - LS كان لهما تعبير أعلى عن NGAL مقارنة بالمجموعة الضابطة. (J) أظهرت ELISA أن خلايا pN + LS وpN - LS على حد سواءيفرز NGAL أعلى بكثير من المجموعة الضابطة، في حين أن كمية NGAL المفرزة من خلايا pN - LS كانت أقل بكثير من خلايا pN + LS. (K) أظهر دمج BrdU أن خلايا pN + LS وpN - LS لديها نسبة تكاثر خلايا أقل من المجموعة الضابطة، في حين أن خلايا pN - LS لديها نسبة تكاثر خلايا أعلى من خلايا pN + LS. تم إجراء اختبار t للطالب لتحديد الأهمية بين المجموعتين (n=3 في RT – qPCR وELISA، n=4 في اللطخة الغربية وتأسيس BrdU). *ص < 0.05; ** ع < {{10}}.01; *** ف < 0.001 مقابل 2L3 لكل مجموعة؛ # ف < 0.05؛ ### p <0.001 مقابل مجموعة pN + LS؛ ns: لا يوجد فرق كبير.
في هذه الدراسة، استخدمنا تسلسل زعيم سلسلة Igκ الفأري (LS) [44] بدلاً من ببتيد الإشارة الأصلي لـ mNGAL لضمان زيادة إفراز بروتين mNGAL الخارجي. للتعبير الزائد عن NGAL المفرز أو غير المفرز، تم استخدام NGAL مع أو بدون LS في pLAS2.1w.PeGFP-I2-ناقلات Bsd، وهي pN + LS وpN - LS، وتظهر في الشكل 7B. تم استخدام اثنين من المروجين، pCMV وhPGK، لدفع التعبير المستقل عن بروتينين، NGAL-c-myc-His6 وeGFP. لضمان إدخال التركيبة، تم استخدام NheI وNotI لهضم البلازميدات، وأظهرت نتائج التحليل الكهربي للهلام نطاق 647- bp من pN + LS ونطاق 587- bp من pN - LS (بسبب عدم وجود تسلسل زعيم 60-bp) (الشكل 7C).
بالنسبة لعدوى pN + LS وpN-SP إلى خلايا 2L3، تمت إضافة البوليبرين والفيروس البطيء إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، تليها الاختيار مع بلاستيسيدين (الشكل 7D). تم إجراء الكشف عن التعبير GFP بواسطة المجهر الفلوري بعد الإصابة (الشكل 7E). تم حصاد الخلايا المصابة بعد أسبوع واحد من اختيار بلاستيسيدين لـ RT – qPCR، وصمة عار غربية، وELISA لتحليل مستوى تعبير NGAL (الشكل 7F – J). أظهرت نتائج RT – qPCR أن إصابة خلايا 2L3 بـ pN + LS و pN - LS أدت إلى زيادة التعبير عن Lcn2 (الشكل 7F) و Lcn2-c-myc (الشكل 7G)، والذي يمثل مستويات إجمالي وNGAL خارجي، على التوالي، في حين لم تكن هناك اختلافات في مستويات التعبير Slc22a17 (NGAL-R) (الشكل 7H). أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن خلايا pN + LS وpN - LS لديها مستويات أعلى من التعبير NGAL داخل الخلايا من خلايا التحكم 2L3 (الشكل 7I). أظهرت نتائج ELISA لطاف الخلية أن خلايا pN + LS وpN - LS لديها مستويات أعلى بكثير من NGAL المفرز من مجموعة التحكم في الخلايا 2L3 (الشكل 7J). بالإضافة إلى ذلك، كانت كمية NGAL التي تفرزها خلايا pN - LS أقل بكثير من تلك التي تفرزها خلايا pN + LS (الشكل 7J)، في حين كان لدى المجموعتين مستويات تعبير NGAL مماثلة (الشكل 7I). دعم هذا الاكتشاف توقعاتنا بأن الإفراط في التعبير عن NGAL بدون إشارة الببتيد (pN - LS) يحد من إفراز NGAL على الرغم من وجود مستوى عالٍ من NGAL داخل الخلايا. للتحقيق في ما إذا كان NGAL المفرز بدلاً من NGAL غير المفرز يمنع تكاثر الخلايا، تم إجراء اختبار دمج BrdU، والذي أظهر أن خلايا pN + LS وpN - LS كان لها تكاثر أقل بكثير من مجموعة التحكم (الشكل 7K). بالإضافة إلى ذلك، كان لخلايا pN - LS تكاثر أعلى بكثير من خلايا pN + LS (الشكل 7K). تشير هذه النتائج إلى أن إفراز NGAL من خلايا 2L3 كان مطلوبًا لمنع تكاثر الخلايا.
3.6. آثار الإفراط في التعبير العقلي الذي يؤدي إلى مسارات الإشارة في خلايا 2L3
استنادًا إلى نتائجنا السابقة التي توضح أن mNGAL يمكن أن يمنع مسارات ERK وAKT في خلايا 2L3 (الشكل 4) ويزيد من تقليل تكاثر الخلايا (الشكل 3) وتضخم الكيس (الشكل 6)، استخدمنا النشاف الغربي لتحليل ما إذا كان ERK وAKT تأثرت المسارات في خلايا pN + LS وpN - LS (الشكل 8). أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن مجموعتي pN + LS وpN - LS كان لهما نسبة أقل بكثير من p-ERK (T202/Y204)/ERK مقارنة بالمجموعة الضابطة، وكان لدى مجموعة pN - LS نسبة أعلى من p-ERK (T202/Y204)/ERK من مجموعة pN + LS (الشكل 8A). كانت نسبة p-AKT (S473) / AKT أقل في مجموعة pN + LS عنها في المجموعة الضابطة، في حين أن خلايا pN - LS لم تكن مختلفة بشكل كبير عن تلك الموجودة في مجموعات التحكم ومجموعات pN + LS (الشكل 8B). كانت نسبة p-CREB (S133) / CREB أعلى بكثير في مجموعة pN - LS عنها في مجموعة pN + LS، بينما لم تظهر pN + LS ولا pN - LS فرقًا كبيرًا عن مجموعة التحكم (الشكل 8C). تشير هذه النتائج إلى أن pN + LS وpN - LS كان لهما فروق ذات دلالة إحصائية في نسبة p-ERK/ERK (الشكل 8A)، في حين أن مجموعة pN + LS لم تظهر تأثيرًا أفضل في AKT (الشكل 8B) وCREB (الشكل 8A). الشكل 8C) التنشيط.
وفقا للنتائج السابقة التي يمكن أن يؤدي تطبيق mNGAL إلى موت الخلايا المبرمج (الشكل 3) والبلعمة الذاتية في خلايا 2L3 (الشكل 5) وتقليل تكاثر الخلايا (الشكل 3) وتوسيع الكيس (الشكل 6)، استخدمنا النشاف الغربي للتحقيق في التأثير على موت الخلايا المبرمج. والبلعمة الذاتية في خلايا pN + LS وpN - LS (الشكل 9). أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن خلايا pN + LS لديها نسبة أعلى بكثير من المشقوق-/pro-caspase-3 (الشكل 9A) والمشقوق-/pro-PARP (الشكل 9B) من مجموعة التحكم؛ أظهرت خلايا pN - LS عدم وجود فرق كبير في نسبة المشقوق - / المؤيد لكاسباس -3 (الشكل 9A) والمشقوق - / المؤيد لـ PARP (الشكل 9B) مقارنة مع مجموعة التحكم، ونسبة المشقوق - /pro-caspase-3 كان أقل بكثير من ذلك الموجود في مجموعة pN + LS (الشكل 9B). أظهرت هذه النتائج أن الإفراط في التعبير عن NGAL المفرز بدلاً من NGAL غير المفرز يسبب موت الخلايا المبرمج في خلايا 2L3.
تم تحديد نسبة أعلى من LC3B II/LC3B I (الشكل 9C) ونسبة أقل من p62/GAPDH (الشكل 9D) في خلايا pN + LS مقارنة مع مجموعة التحكم؛ لم يكن لخلايا pN - LS فرق كبير في نسبة LC3B II/LC3B I (الشكل 9C) وp62/GAPDH (الشكل 9D) مقارنة مع مجموعة التحكم، وكانت نسبة LC3B II/LC3B I أقل بكثير مما كانت عليه في مجموعة pN + LS (الشكل9C). كشفت هذه النتيجة أن الإفراط في التعبير عن NGAL المفرز بدلاً من NGAL غير المفرز يسبب الالتهام الذاتي في خلايا 2L3.
3.7. آثار الإفراط في التعبير عن mNGAL على تكوين الكيس لخلايا 2L3 في الثقافة ثلاثية الأبعاد
استنادًا إلى النتائج السابقة التي تفيد بأن mNGAL يمنع تكاثر خلايا 2L3 وتضخم الكيس في الثقافة ثنائية وثلاثية الأبعاد، على التوالي (الشكلان 3 و6)، نشتبه في أن الإفراط في التعبير عن NGAL المفرز قد يمنع أيضًا تضخم الكيس لخلايا 2L3 من خلال تثبيط تكاثر الخلايا ( الشكل 7 ك).
للتحقيق في آثار فرط التعبير NGAL في خلايا 2L3 على تكوين الكيس، تمت معالجة خلايا التحكم 2L3 وpN + LS وpN - LS باستخدام forskolin في الأيام 1-3 للحث على تكوين الكيس. تم قياس أقطار الكيس ومنطقة وأرقام يوميا بعد تحريض فورسكولين (الشكل 10A). نمت أكياس التحكم 2L3 وخلايا pN + LS وpN - LS في الثقافة ثلاثية الأبعاد بطريقة تعتمد على أيام الثقافة (الشكل 10B) وأظهرت اختلافات واضحة في حجم الكيس من الأيام 4 إلى 8. وكان لدى مجموعة pN + LS أقطار الكيس أصغر بكثير (الشكل 10C) والمناطق (الشكل 10D) من المجموعة الضابطة من الأيام 4 إلى 8، في حين أن مجموعة pN - LS كان لها أقطار الكيس أصغر بكثير من مجموعة التحكم في الأيام 6 و 8 (الشكل 10C). لم يكن هناك اختلاف كبير في منطقة الكيس بين مجموعات التحكم ومجموعات pN - LS. بالإضافة إلى ذلك، كان لمجموعة pN - LS أقطار ومناطق كيس أكبر بكثير من مجموعة pN + LS في اليوم 8 (الشكل 10C، D). على الرغم من عدم وجود اختلاف كبير في معدل زيادة عدد الكيس بين خلايا التحكم، pN + LS، وpN - LS (الشكل 10E)، فإن مجموعتي pN + LS وpN - LS كان لهما نسب أقل بكثير من الخلايا الكبيرة (القطر> 100 ميكرومتر) من الخراجات من المجموعة الضابطة (الشكل 10F) من الأيام 4 إلى 8. وأظهرت هذه النتائج أن pN + LS وpN - LS كلاهما يمنع تضخم الكيس، في حين أن التأثير المثبط لـ pN - LS كان أضعف من تأثير pN + LS . كشفت هذه النتيجة أن الإفراط في التعبير عن mNGAL المفرز كان له قدرة فائقة على منع تضخم الكيس لخلايا 2L3 في الثقافة ثلاثية الأبعاد مقارنة بـ mNGAL غير المفرز.
- تم إجراء اختبار لتحديد الأهمية بين المجموعات (ن=3). * ع < 0.05; *** ع < 0.001 مقابل مجموعة التحكم؛ # p <0.05 مقابل مجموعة pN + LS
caspase {{0}} (A) والمشقوق-/pro-PARP (B) من المجموعة الضابطة، والتي تمثل تحريض موت الخلايا المبرمج عن طريق إفراز mNGAL. لم يكن لخلايا pN - LS فرق كبير في نسبة المشقوق - / pro-caspase -3 والمشقوق - / pro-PARP مقارنةً بالمجموعة الضابطة. كان لخلايا pN + LS نسبة أعلى من LC3B II / LC3B I (C) ونسبة أقل من p62 (D) مقارنة مع مجموعة التحكم. لم يكن لخلايا pN −LS فرق كبير في نسبة LC3B II / LC3B I و p62 مقارنة بالمجموعة الضابطة. تم استخدام Tubulin وVinculin وGAPDH كعناصر تحكم داخلية لكل عينة. تم تطبيع القيم إلى المجموعة الضابطة. تم إجراء اختبار الطالب لتحديد الأهمية بين المجموعات (ن=3). * ع < 0.05؛ ** ع < 0.01; *** ف < 0.001 مقابل المجموعة الضابطة؛ # ف < 0.05؛ ## p <0.01 مقابل مجموعة pN + LS.
الشكل 9. آثار الإفراط في التعبير عن البروتين mNGAL على موت الخلايا المبرمج والبلعمة الذاتية في خلايا 2L3. أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن خلايا pN + LS لديها نسبة أعلى بكثير من المشقوق-/pro-caspase-3(A) والمشقوق-/pro-PARP (B) من المجموعة الضابطة، والتي تمثل تحريض موت الخلايا المبرمج بواسطة mNGAL المفرز. لم يكن لخلايا pN −LS فرق كبير في نسبة المشقوق-/pro-caspase-3 والمشقوق-/pro-PARP مقارنة مع مجموعة التحكم. كان لخلايا pN + LS نسبة أعلى من LC3BII/LC3B I (C) ونسبة أقل من p62 (D) مقارنة مع مجموعة التحكم. لم يكن لخلايا pN - LS فرق كبير في نسبة LC3B II / LC3B I و p62 مقارنة بالمجموعة الضابطة. تم استخدام Tubulin وVinculin وGAPDH كعناصر تحكم داخلية لكل عينة. تم تطبيع القيم إلى المجموعة الضابطة. تم إجراء اختبار الطالب لتحديد الأهمية بين المجموعات
(ن {{0}}). * ع < 0.05; ** ع < 0.01; *** ف < 0.001 مقابل المجموعة الضابطة؛ # ف < 0.05؛ ## p <0.01 مقابل مجموعة pN + LS
4-8. تم استخدام رقم الكيس في اليوم الرابع من كل مجموعة كعنصر تحكم لحساب نسبة عدد الكيس. (F) النسبة المئوية للحجم الكبير من الخراجات في الثقافة ثلاثية الأبعاد للمجموعة الضابطة، وخلايا pN + LS، وpN - LS خلال الأيام 4-8. تم إجراء اختبار الطالب لتحديد الأهمية بين المجموعات (ن=3). * ع < {{10}}.05; ** ع < 0.01 مقابل المجموعة الضابطة؛ # ف < 0.05؛ ## p <0.01 مقابل مجموعة pN + LS.
