الاستجابة المناعية الفطرية للصيام وإعادة التغذية في كلى الحمار الوحشي

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

Zongzhen Liao و Dihang Lin و Jirong Jia و Ran Cai و Yang Yu و Wensheng Li *

مختبر الدولة الرئيسي للمكافحة الحيوية ، مختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للحيوانات المائية الاقتصادية ، مركز أبحاث تكنولوجيا الهندسة بمقاطعة قوانغدونغ للتربية الصحية للأسماك الاقتصادية الهامة ، كلية علوم الحياة ، جامعة صن يات سين ، قوانغتشو 510275 ، الصين ؛

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL) ، lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL) ؛ jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ) ؛ Alan6382@163.com (RC) ؛ yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (YY)

* المراسلات: lsslws@mail.sysu.edu.cn

الكستانش جيد جدًا لوظيفة الكلى

الملخص: تكتسب الحيوانات العناصر الغذائية والطاقة من خلال التغذية لتحقيق التوازن بين النمو وصحة الكائن الحي. عندما يكون هناك تغيير في اكتساب المغذيات ، تتغير حالة النمو وقد تتسبب أيضًا في تغيرات في نظام المناعة الداخلي. النمو التعويضي (CG) ، ظاهرة نمو محددة ، تنطوي على مسألة ما إذا كانت التغيرات في النمو يمكن أن تكون مصحوبة بتغيرات في المناعة الفطرية. يمكن أن يكون الحمار الوحشي (Danio Rerio) ، وهو كائن نموذج معروف ، كنموذج مناسب. في هذه الدراسة ، خضع الحمار الوحشي للصيام لمدة 3 أسابيع وإعادة إطعامه لمدة 3 إلى 7 أيام. وجد أنه يمكن تحقيق CG في zebra sh. زادت حساسية الحمار الوحشي للمكورات العقدية agalactiae بعد الجوع. بالإضافة إلى ذلك ، زاد عدد مراكز البلازما الصغيرة بعد الصيام وزادت نسبة الأنابيب المصابة بعد إعادة التغذية لمدة 3 و 5 أيام على التوالي. علاوة على ذلك ، فإنالكلىمن الحمار الوحشي الذي يعاني من الجوع كان تحت الإجهاد التأكسدي ، وزاد نشاط العديد من الإنزيمات المضادة للأكسدة بعد الجوع ، بما في ذلك الكاتلاز ، والجلوتاثيون بيروكسيديز ، وديسموتاز الفائق. كانت العوامل المناعية الفطرية متأثرة بالجوع. بالإضافة إلى ذلك ، زاد نشاط الفوسفاتاز القلوي والليزوزيم بعد الجوع. تم رفع تعبير الرنا المرسال للجينات المرتبطة بالمناعة مثل il -1 إلى حد مختلف بعد الصيام مع أو بدون تحدي عديدات السكاريد الدهنية (LPS). أظهرت هذه الدراسة أن وظيفة الجهاز المناعي الفطري في الحمار الوحشي يمكن أن تتأثر بالحالة التغذوية.

الكلمات الرئيسية: جهاز المناعة الفطري. الكلى؛ الاكسدة؛ نمو تعويضي حمار وحشي ش

1 المقدمة

تعتمد أنشطة الحياة الأساسية على إمدادات الطاقة للكائن الحي. يمكن أن تؤثر الحالة الغذائية لجسم الحيوان على عمل جهاز المناعة [1،2]. النمو التعويضي (CG) هو فترة من النمو السريع بعد مرحلة من كبت النمو ، والتي يمكن أن تكون ناجمة عن نقص الغذاء والعوامل البيئية الأخرى [3،4]. تم تسجيل هذه الظاهرة لأول مرة في الثدييات وتم العثور عليها في نهاية المطاف في الطيور [3] و teleosts [5]. ينقسم CG إلى مرحلتين: المرحلة التقويضية ومرحلة الابتنائية المفرطة [6]. أحد الأنماط الأساسية لـ CG هو الصيام وإعادة التغذية. بعد إعادة التغذية ، يمكن أن تواجه sh تجربة جزئية ، كاملة ، أو لا يوجد تعويض [4]. يعتبر نظام التغذية الخاص للحمضيات الكربونية طريقة محتملة لتحسين كفاءة الإنتاج في الأنواع المستزرعة [7].

الاستجابة المناعية الفطرية هي أول حدود دفاع المضيف ، حيث تحمي الكائنات الحية من مسببات الأمراض. تشمل أعضاء الجهاز المناعي الغدة الصعترية ،رأسالكلى, الكلية الذيلية والخياشيم والكبد ،والأمعاء [8،9]. تشارك مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الاستجابات الدفاعية الخلوية غير المحددة في sh ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة / الضامة ، والخلايا غير السامة للخلايا ، والخلايا المحببة (العدلات). التمثيل الغذائي المناعي هو التفاعل بين العمليات المناعية والتمثيل الغذائي [10]. يمكن أن تؤثر الحالة التمثيلية للـ sh على وظيفتها المناعية. تؤثر الحالة التغذوية في البشر على عدد الخلايا المناعية ونشاطها [11]. وجد أن وظيفة الجهاز المناعي في الفئران يمكن أن تتأثر بحالتها الأيضية [12-14]. أدى الصيام المتقطع في مبروك الدوع (Carassius auratus) إلى تغيير المجتمعات البكتيرية في الأمعاء وزيادة نشاط ديسموتاز الفائق (SOD) والليزوزيم [15]. الجوع يغير أيضًا التعبير الجيني للاستجابات المناعية الفطرية في كبد السلمون [16]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن العثور على دراسات حول تأثيرات الحالة الأيضية على الجهاز المناعي في teleosts الأخرى [17-19]. ومع ذلك ، فإن تأثير حالة التمثيل الغذائي على الجهاز المناعي في teleosts لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. يمكن أن يحد الإجهاد التأكسدي من وظائف الجهاز المناعي الفطري ويحفز مكونات مثل المستقبلات الشبيهة بالحصيلة [20 ، 21]. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن تؤدي الجوع إلى زيادة إنتاج ROS والتسبب في الالتهام الذاتي [22 ، 23]. قد يكون من المفيد استكشاف ما إذا كان الإجهاد التأكسدي يتوسط العلاقة بين الجوع والمناعة.

منطقة حمار وحشي (Danio rerio) نموذج مطبق على نطاق واسع في دراسة المناعة والأمراض. تبدأ أجهزة المناعة الفطرية للحمار الوحشي في التطور في اليوم الأول من التطور الجنيني ، ويغيب جهاز المناعة التكيفي حتى 4-6 أسابيع بعد الإخصاب. وهذا يجعل الحمار الوحشي نموذجًا رائعًا لدراسات الجهاز المناعي الفطري [9]. الكلى هي العضو اللمفاوي الأساسي في الحمار الوحشي [24]. يقوم الجين havcr1 بتشفير بروتين أنبوبي عبر الغشاء يسمىجزيء إصابة الكلى-1 (KIM -1) [25]. KIM -1 هو مؤشر لتلف أنسجة الكلى ، كما أن الإفراط في التعبير عن KIM -1 يسبب إصابة الكلى في الحمار الوحشي [26]. وجد أن الصيام يمكن أن يغير حالة التمثيل الغذائي في الحمار الوحشي [27]. أدى الصيام إلى انخفاض استهلاك الأكسجين ومحتوى الكبد من الدهون والجليكوجين. كما أنه زاد من نشاط 8- الأكسدة وتكوين السكر في الكبد. وفي الوقت نفسه ، شاركت أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في CG في حمار وحشي [28]. كانت ROS ، التي يتم إنتاجها في الكبد ، ضرورية لـ CG في zebra sh لأنها تسبب في مسار AMPK. في هذه الدراسة ، اعتمدنا استراتيجية للصيام وإعادة التغذية لاستكشاف نمط CG في حمار وحشي. تسبب streptococcus agalactiae في تعفن الدم الشديد والتهاب السحايا في الحمار الوحشي ويمكن أن يصيب أكثر من 30 نوعا من sh [29]. اخترنا Streptococcus agalactiae و lipopolysaccharides (LPS) للحقن لاستكشاف تأثير CG على جهاز المناعة الفطري ، جنبًا إلى جنب مع التغيرات في المعلمات المتعلقة بالمناعة والتعبير الجيني.

2. المواد والأساليب

2.1. الحمار الوحشي ، وأنظمة التغذية ، ووزن الجسم

تم شراء الحمار الوحشي البالغ المستخدم في التجربة من سوق Yuehe Fish-Bird-Flower (قوانغتشو ، الصين) وتم تأقلمه لمدة أسبوعين. تم إجراء جميع تربية جميع عمليات التربية في محطة التجربة الثقافية في جامعة صن يات سين ، مقاطعة قوانغدونغ ، الصين. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للإرشادات وموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة صن يات سين. خلال فترة التجربة ، تراوح الأس الهيدروجيني من 7.8 إلى 7.9 ، وتراوح الأكسجين المذاب من 6.95 إلى 7.23 مجم / لتر ، وتراوحت درجة حرارة الماء من 26.5 إلى 28 درجة مئوية. تم الحفاظ على تركيزات الأمونيا- N ونتروجين النيتروجين أقل من 0. 2 و 0. {{2 0}} 0 5 مجم / لتر ، على التوالي. كانت ملوحة الماء 0.2 جزء من الألف. تم الحفاظ على حمار وحشي في دورة 12: 12- h. لاستكشاف التغيرات في وزن الجسم أثناء الصيام وإعادة التغذية ، تم تسجيل وزن الجسم مرة واحدة في الأسبوع. كان وزن الجسم الأولي للحمار الوحشي في التجربة 0.35 ± 0.06 جم ، وكان عمرهم حوالي 3 أشهر. تم فصل الحمار الوحشي عشوائياً إلى خزانات سعة 24 لترًا ، وكان كل خزان يحتوي على 30 ميكرون. تم إعطاؤهم نظامًا غذائيًا تجاريًا مرتين يوميًا مع التغذية بالشبع. أنظمة التغذية لكل تجربة موضحة في الجدول 1. بعد العلاج ، تم تخدير الحمار الوحشي بجرعة زائدة MS -222 (سيغما ، بيرلينجتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم التضحية به. بعد ذلك ، تمت إزالة الكلية إلى أنبوب إيبندورف ووضعها في النيتروجين السائل على الفور. تم نقل العينة من النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

2.2. تحدي Streptococcus agalactiae

تم تحدي الحمار الوحشي الذي يمر بالصيام وإعادة التغذية بواسطة Streptococcus agalactiae. تم تقديم سلالة Streptococcus agalactiae عن طريق البروفيسور Anxing Li ، كلية علوم الحياة ، جامعة Sun Yat-sen [30]. تم فصل الحمار الوحشي في كل مجموعة إلى أربع مجموعات صغيرة ، مع 15 ش في كل مجموعة صغيرة. تم تخدير الحمار الوحشي في ثلاث من هذه المجموعات بواسطة 80 مجم / لتر MS -222 وحقن داخل الصفاق بـ 5 ميكروليتر تحتوي على 5 × 106 وحدات تشكيل مستعمرة من Streptococcus agalactiae. تم حقن الحمار الوحشي المتبقي بـ 5 ميكروليتر من PBS. تمت ملاحظة كل من الحمار الوحشي لمدة 4 أيام دون تغذية. تم تسجيل معدل الوفيات.

2.3 حقن LPS

تم تحدي الحمار الوحشي الذي يخضع للصيام وإعادة التغذية (F24 و S24 و F21R3) باستخدام LPS (Sigma ، Burlington ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إذابة مسحوق LPS في ماء معقم لتركيز nal من 1 مجم / مل. قبل الاستخدام ، تم تخفيف 1 مجم / مل LPS باستخدام PBS ، وكان تركيز النيتروجين 20 ميكروغرام / مل. تم فصل الحمار الوحشي في كل مجموعة إلى مجموعتين صغيرتين ، وكان هناك 12 شلال في كل مجموعة صغيرة. تم حقن sh في المجموعتين مع LPS و PBS. تم تخدير الحمار الوحشي باستخدام MS -222 وحقن داخل الصفاق بـ 5 ميكرو لتر من 20 ميكروغرام / مل LPS أو PBS. بعد 3 ساعات ، تم تخدير وتضحية الحمار الوحشي. بعد ذلك ، تمت إزالة الكلية وحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2.4 علم التشريح المرضي

تم الحفاظ على الحمار الوحشي مع إعادة التغذية لمدة 14 يومًا بعد الجوع لمدة 21 يومًا. تم أخذ العينات في الأيام 21 و 24 و 28 و 35. بعد الذبح ، تمت إزالة كليتي الحمار الوحشي وغمرها في 4 في المائة من الفورمالديهايد. بعد ذلك ، خضعت الكلى لتقطيع البارافين. كانت المقاطع ملطخة بهيماتوكسيلين يوزين (HE) (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين) وتم ملاحظتها باستخدام مجهر ضوئي (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان). لتحديد تغيير الأنابيب المصابة ومراكز الضامة الميلانية (MMCs) ، تم التقاط 5 صور غير متداخلة من كل شريحة. تم قياس مناطق الأنابيب المصابة والعينة بأكملها باستخدام برنامج Cellsens (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان). من كل صورة ، تم حساب نسبة الأنابيب المصابة بقسمة منطقة الأنابيب المصابة على مساحة العينة بأكملها. تم حساب كمية MMCs في كل صورة ، ثم قسمة على مساحة العينة بأكملها. بعد ذلك ، تم حساب التغييرات الطية في MMCs مع المجموعة F21 كمعيار.

2.5 فحص المعلمات البيوكيميائية ذات الصلة

تم قياس محتويات malondialdehyde (MDA) وأكسيد النيتريك (NO) والأنشطة الأنزيمية لـ SOD ، والفوسفاتيز القلوي (ALP) ، والكتلاز (CAT) ، والجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH-Px) ، والليزوزيم في الكلى باستخدام مجموعات تجارية مقابلة. وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة. باختصار،الكلىتمت إزالته من حمار وحشي تم وضعه في نيتروجين سائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية. قبل الاختبار ، تم إخراج كل كلية وتحويلها إلى متجانسة في برنامج تلفزيوني قبل البرودة مع اضطراب الأنسجة.تجانس الكلىتم الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و 12 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق وتم أخذ المادة الطافية على أنهاالكلىاستخراج للكشف. تم الكشف عن محتوى MDA باستخدام مجموعة فحص MDA لبيروكسيد الدهون (Beyotime ، شنغهاي ، الصين) واستند الاكتشاف إلى تفاعل اللون بين MDA وحمض الثيوباربيتوريك. كان الطول الموجي المستخدم 535 نانومتر. تم قياس محتوى NO بواسطة نظام كاشف Griess (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية). يعتمد نظام كاشف Griess على تفاعل النتريت مع السلفانيلاميد و N -1- naphthyl ethylenediamine dihydrochloride في ظل الظروف الحمضية. تم حساب محتوى NO من خلال معيار نتريت الصوديوم وتم تطبيعه مع محتوى البروتين. تم قياس الامتصاصية باستخدام لتر عند 490 نانومتر. تم الكشف عن نشاط الليزوزيم باستخدام مجموعة فحص الليزوزيم (Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تم تحضين مستخلص الكلى بجدار خلية Micrococcus lysodeikticus المترافق مع uorescein. تم قياس التألق بعد 45 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، عند أطوال موجات الإثارة والانبعاثات 485 و 535 نانومتر. تم حساب قيمة الليزوزيم من خلال منحنى معياري وتم تطبيعها مع محتوى البروتين. تم اكتشاف الأنشطة الأنزيمية لـ SOD و ALP و CAT و GSH-Px بشكل منفصل باستخدام مجموعات مقايسة نوع SOD ومجموعات فحص الفوسفاتيز القلوية ومجموعات فحص الكاتلاز ومجموعات فحص الجلوتاثيون بيروكسيداز (نانجينج جيانتشينج ، نانجينغ ، الصين). تم تحديد وحدة نشاط SOD على أنها كمية من SOD المقابلة لتثبيط 50 بالمائة من معدل اختزال النيترو الأزرق تترازوليوم لكل مجم من البروتين في نظام 1 مل. كان الطول الموجي المستخدم 570 نانومتر. تم تحديد وحدة من نشاط ALP على أنها حجم إنزيم يتفاعل مع الركيزة لإنتاج 1 مجم من الفينول في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ويتم تطبيعه مع محتوى البروتين. كان الطول الموجي المستخدم 490 نانومتر. استند نشاط CAT على استهلاك بيروكسيد الهيدروجين. كان الطول الموجي المستخدم 405 نانومتر. تم قياس نشاط GSH-Px بمعدل تفاعل التحفيز بين بيروكسيد الهيدروجين و GSH. بطرح التفاعل غير الأنزيمي ، تم تحديد وحدة نشاط GSH-Px على أنها تقليل 1 مول / لتر في تركيز GSH في كل نظام. كان الطول الموجي المستخدم 405 نانومتر. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين). كان الطول الموجي المستخدم 570 نانومتر.

2.6. إنتاج ROS

محتوى ROS فيالكلىتم تحديده مع probe uorescent 2/، 7/- dichloro orourscein diacetate (DCF-DA) (Sigma ، Burlington ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) كما هو موضح سابقًا [28]. باختصار ، تم وضع الكلية التي تمت إزالتها من حمار وحشي في PBS 100 UL قبل البرد وتم تحويلها إلى متجانسة مع اضطراب الأنسجة. بعد الطرد المركزي لمدة 10 دقائق مع 10 ، 000 × جم في 4 درجات مئوية ، 20 ميكرولتر منالكلىمقتطفتمت إضافته إلى 96- ألواح ميكروسكوبية سوداء جيدة ، وتمت إضافة 25 ميكرومتر من DCF-DA إلى كل بئر. تم تحضين الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم قياس الإسفار في قارئ لوحة متعدد الملصقات (PerkinElmer Victor X5 ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع الإثارة والانبعاثات التي تم ضبطها عند 485 و 535 نانومتر. تم قياس محتوى البروتين في مستخلص الكلى باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA. تم حساب محتوى ROS لكل عينة عن طريق تطبيع قيمة التألق لمحتوى البروتين. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين). كان الطول الموجي المستخدم 570 نانومتر.

2.7. فحص انفجار الجهاز التنفسي

تم استخدام حمار وحشي يخضع للصيام وإعادة التغذية (F24 و S24 و F21R3) لقياس نشاط الاندفاع التنفسي. تم إجراء بروتوكول مقايسة انفجار الجهاز التنفسي وفقًا لطريقة منشورة مسبقًا [31،32]. باختصار ، فإنالكلىتم فصلها عن حمار وحشي مخدر ووضعها في {0} صفيحة دقيقة جيدة مع 100 ميكرولتر من وسط إيجل Dulbecco المعدَّل (DMEM) / F -12. بعد حضانة اللوح لمدة 30 دقيقة عند 28 درجة مئوية ، كان 100 ميكروليتر من DMEM / F -12 يحتوي على DCF-DA ، وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وخلات phorbol myristate (PMA) (Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) يضاف إلى كل بئر تم اكتشافه. وفي الوقت نفسه ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من DMEM / F -12 تحتوي على DMSO إلى كل بئر تحكم. كانت التركيزات النهائية للحلول المختلفة على النحو التالي: 500 نانوغرام / مل DCF-DA ، 0.2 في المائة DMSO و 200 نانوغرام / مل PMA. تم قياس الإسفار في قارئ لوحة متعدد الملصقات مع مجموعة الإثارة والانبعاثات عند 485 و 535 نانومتر. تألق كل بئر

تم قياسه مباشرة بعد إضافة المحاليل إلى البئر وكل 15 دقيقة بعد ذلك لمدة 150 دقيقة. كانت النقطة الزمنية لمقارنة قيم التألق 150 دقيقة. تم طرح قيم التألق لمجموعة التحكم غير المستحثة من التألق

قيم المجموعات الفردية التي يسببها PMA. تم حساب قيم التألق الطبيعي. تم تصنيف قيم التألق المقيسة هذه في ثلاثة أعمدة.

2.8. استخراج الحمض النووي الريبي و PCR في الوقت الحقيقي

المتجمدالكلىكانت مطحونة في تريزول (أوميغا ، نوركروس ، جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم فصل الحمض النووي الريبي الكلي وفقًا للبروتوكول [33]. بعد الهضم باستخدام DNase1 (NEB ، Ipswich ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، تم إنتاج cDNA بواسطة مجموعة توليف RevertAid First Strand (كدنا) (Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع Random Hexamer Primer. تم إعداد qRT-PCR في 10 مخاليط تفاعل uL تحتوي على 5 ميكرو لتر من 2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Bike ، Houston ، TX ، USA). تم تشغيل جميع العينات بشكل مكرر وطبيعتها لتعبير eEF1a1a. تم وصف تسلسل بادئات قليل النوكليوتيد المستخدمة في الدراسة الحالية في الجدول التكميلي S1. تم تحديد مقدار mRNA النسبي للهدف إلى المرجع باستخدام 2- طريقة AACT [34].

2.9 تحليل احصائي

يتم عرض البيانات الكمية على أنها متوسط ​​القيمة ± SD. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام الإصدار 24 من SPSS (SPSS Inc. ، شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء المقارنات الإحصائية بين مجموعتين باستخدام اختبار الطالب أو الاختبار اللامعلمي ، اعتمادًا على نتيجة اختبار الحالة الطبيعية. تم إجراء التحليلات لمجموعات متعددة مع التوزيع الطبيعي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه ، وتم إجراء الباقي باستخدام الاختبارات اللامعلمية. يمكن التحقق من جميع البيانات والأساليب الإحصائية في الجدول S2.

3. النتائج

3.1. التغييرات في وزن الجسم والخصائص المضادة للبكتيريا من حمار وحشي أثناء الصيام وإعادة التغذية

تم تحقيق نمو تعويضي كامل في حمار وحشي sh. بعد الصيام لمدة 7 إلى 14 يومًا ، فقد الحمار الوحشي 15 بالمائة على الأقل من وزن الجسم. بعد 14 يومًا من إعادة التغذية ، لحق وزن جسم الحمار الوحشي في مجموعة الصيام وزن المجموعة الضابطة (الشكل 1 أ-ج). بعد الصيام وإعادة التغذية ، من أجل استكشاف مقاومة الحمار الوحشي لمسببات الأمراض ، تم حقنها داخل الصفاق بالمكورات العقدية agalactiae. زاد معدل وفيات الحمار الوحشي في مجموعة الصيام مقارنة مع مجموعة السيطرة. مع تمديد إعادة التغذية ، استمر معدل الوفيات في الانخفاض (الشكل 1 د).

الشكل 1. نموذج النمو التعويضي في حمار وحشي sh. أ إلى ج: تغير وزن جسم الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة التغذية. (أ) صام الحمار الوحشي لمدة 7 أيام وصدى لمدة 28 يومًا. (ب) صام الحمار الوحشي لمدة 14 يومًا وأرجع لمدة 21 يومًا. (ج) صام الحمار الوحشي لمدة 21 يومًا وأرجع لمدة 14 يومًا. ن=21 - 22. (D) معدل بقاء الحمار الوحشي الذي تم حقنه داخل الصفاق مع S. agalactiae ؛ F: التغذية ؛ S: الجوع. R: إعادة التغذية. n=3، *: p <{{1 0}}.="" 0="" 5،="" **:="" p=""><0.01؛ ***:="" ف=""><>

3.2 التغيرات المورفولوجية في كلاوي الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة التغذية

الالكلىهو النسيج المناعي الرئيسي في الحمار الوحشي. تسبب الجوع في تغيرات مورفولوجية فيالكلى. بعد 21 يومًا من الصيام ، أظهرت الكلية تغيرات شكلية واضحة. وجدنا أن المزيد من الأنابيب المصابة بقطرات زجاجية ظهرت بعد إعادة التغذية لمدة 3 و 5 أيام. تحسن هذا الوضع في 7 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن عدد مراكز الميلانوماكروفاج (MMCs) فيالكلىزاد بعد الجوع (الشكل 2 أ-ج). جنبا إلى جنب مع إعادة التغذية ، تم إنقاذ هذه الأعراض. زاد تعبير mRNA عن havcr1 بعد الصيام (الشكل 2 د) ، مما يدل على أن الجوع قد يسببالكلىإصابة.

الشكل 2. التغيرات المورفولوجية فيالكلىمن الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة الإطعام. (أ) سعادة تلطيخالكلىفي الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة التغذية. يشير المثلث الأسود إلى الأنابيب المصابة. يشير السهم الأحمر إلى MMC. تشير النجمة الحمراء إلى قطرات زجاجية. (ب) التحليل الإحصائي لنسبة الأنابيب المصابة فيالكلى. (ج) التحليل الإحصائي ل MMCs في الكلى. ن=3 - 4. (د) التعبير النسبي مرنا عن جين havcr1 فيالكلىمن الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة الإطعام. ن {0}} - 10. F: التغذية ؛ S: الجوع. R: إعادة التغذية. *: ف <>

3.3 الإجهاد التأكسدي يحدث أثناء الصيام وإعادة التغذية

تم تحسين محتوى MDA بشكل كبير بعد الصيام لمدة 21 و 24 يومًا وانخفض بعد 3 أيام من إعادة التغذية (الشكل 3 أ). ومع ذلك ، انخفض محتوى ROS مع 24 يومًا من الجوع وتعافى مع إعادة التغذية لمدة 7 أيام (الشكل 3 ب). زاد محتوى NO بعد الصيام لمدة 21 يومًا (الشكل 3C). زاد نشاط إنزيمات مضادات الأكسدة ، بما في ذلك SOD و GSH-Px و CAT ، بعد الصيام. انخفضت أنشطة GSH-Px و CAT بسرعة وتعافت في اليوم الثالث من إعادة التغذية. على الرغم من أن نشاط SOD انخفض مع إعادة التغذية ، إلا أنه كان لا يزال أعلى من عنصر التحكم (الشكل 4).

الشكل 3. الإجهاد التأكسدي في كليتي الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة التغذية. (أ) محتوى MDA في الكلى. (ب) تغيير ROS في الكلى. (ج) محتوى NO في الكلى. F: التغذية ؛ S: الجوع. R: إعادة التغذية. ن=6 - 1 0. *: ف <0. 0="" 5،="" **:="" p=""><0.01؛ ***:="" ف=""><>

الشكل 4. نشاط الإنزيمات في أنظمة مضادات الأكسدة فيالكلىمن الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة الإطعام. (أ) نشاط SOD في الكلى. (ب) نشاط GSH-Px في الكلى. (ج) نشاط CAT في الكلى. F: التغذية ؛ S: الجوع. R: إعادة التغذية. ن=6 - 1 0. *: ف <0. 0="" 5،="" **:="" p=""><0.01؛ ***:="" ف=""><>

3.4. تأثر الجهاز المناعي الفطري لكلية الحمار الوحشي بالصيام وإعادة التغذية

زاد نشاط ALP في الكلى بعد الصيام وانخفض بعد إعادة التغذية (الشكل 5 أ). مع إعادة التغذية لمدة 7 أيام ، لم يكن هناك فرق كبير بين مجموعة إعادة التغذية ومجموعة التحكم. أظهر نشاط الليزوزيم في الكلى اتجاهًا مشابهًا لـ ALP ، والذي زاد مع الصيام (الشكل 5 ب). انخفض بسرعة بعد إعادة التغذية. لم تظهر استجابة انفجار الجهاز التنفسي في الكلى أي تغييرات مهمة في المجموعات المختلفة ، ولكن الاستجابة كانت أعلى في مجموعة الصيام وإعادة التغذية (الشكل 5C). أظهر تعبير mRNA عن السيتوكين الطليعي المؤيد -1 زيادة ملحوظة في جميع مجموعات الصيام ولكنه انخفض على الفور بعد إعادة التغذية (الشكل 6 أ). أظهر تعبير mRNA لـ tgfb1a و tgfb1b نفس الاتجاه مثل il -1 (الشكل 6E ، F). ومع ذلك ، فإن تعبير mRNA عن nfkb1 زاد بشكل ملحوظ فقط بعد الجوع لمدة 24 يومًا وانخفض بعد إعادة التغذية لمدة 3 أيام. أظهر تعبير mRNA لـ nfkb2 اتجاهًا مشابهًا لتلك الخاصة بـ nfkb1 (الشكل 6B ، C). يقوم الجين arg2 بترميز arginase II ، والذي يرتبط بالاستجابة الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، زاد تعبير مرنا لـ arg2 بشكل ملحوظ في جميع مجموعات الصيام وتم تقليله بعد إعادة التغذية (الشكل 6 د). بعد تحدي الحمار الوحشي الذي مر بالصيام وإعادة التغذية ، كانت الاستجابة أقوى في مجموعة الصائمين. كان تعبير mRNA لـ il -1 و mmp9 في مجموعة الصيام المعالجة بـ LPS أعلى بشكل ملحوظ من ذلك في مجموعات التحكم أو إعادة التغذية المعالجة بـ LPS (الشكل 7).

الشكل 5. معلمات الجهاز المناعي الفطري فيالكلىمن الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة الإطعام. (أ) نشاط ALP في كلية الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة التغذية. (ب) نشاط الليزوزيم فيالكلىمن الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة الإطعام. (ج) استجابة انفجار الجهاز التنفسي للكلية في الحمار الوحشي بعد الصيام والرجوع. (C1) قيمة التألق/البروتين من الكلى في أوقات مختلفة. (C2) مضان / قيم البروتين منالكلىفي 15 0 دقيقة. (C3) تطبيع قيمة التأثير/البروتين من الكلى في 15 0 دقيقة. F: التغذية ؛ S: الجوع. R: إعادة التغذية. ن=12. *: p <0. 05،="" **:="" p=""><0.01؛ ***:="" ف=""><>

الشكل 6. التعبير النسبي mRNA للجينات المرتبطة بالمناعة في كليتي الحمار الوحشي أثناء الصيام وإعادة التغذية. (أ - و): il -1 و nfkb1 و nfkb2 و arg2 و tgfb1a و tgfb1b. F: التغذية ؛ S: الجوع. R: إعادة التغذية. ن=8 - 1 {{1 0}}. *: p <0. 05،="" **:="" p=""><0.01؛ ***:="" ف=""><>

الشكل 7. التعبير النسبي مرنا للجينات ذات الصلة بالمناعة فيالكلىمن Zebra ، تم تحديها مع 5 ul من 2 0 ug/ml LPs بعد الصيام وإعادة التغذية. (أ - ج) il -1 و mmp9 و nfkb1. F: التغذية ؛ S: الجوع. R: إعادة التغذية. ن=8 - 12. *: ف <0. 0="" 5،="" **:="" p=""><0.01؛ ***:="" ف=""><>

4. مناقشة

في هذه الدراسة ، وجدنا أنه يمكن تحقيق CG الكامل في حمار وحشي بعد فترات مختلفة من الجوع. حتى بعد 3 أسابيع من الصيام ، وصل وزن جسم الحمار الوحشي إلى وزن المجموعة الضابطة بعد أسبوعين. وكانت هذه النتيجة متوافقة مع الأعمال السابقة [28]. وقد أظهرت الدراسات أن الجوع وإعادة التغذية يؤثران على الحالة الأيضية للحمار الوحشي [27 ، 28]. في الأنواع المستزرعة ، فإن مغزى CG هو أنه يحسن كفاءة الإنتاج. من المهم أن تحافظ الأنواع المستزرعة على الخصائص المضادة للبكتيريا أثناء الصيام وإعادة التغذية. خلال هذه العملية ، يمكن أن يعاني الحمار الوحشي من مسببات الأمراض. تم الإبلاغ عن أن الجوع لم يؤثر على الاستجابة المناعية في المصابة Piaractus mesopotamicus [18]. لسوء الحظ ، عزز الصيام قابلية الحمار الوحشي لـ S. agalactiae. في الوقت نفسه ، تأثرت العوامل الكيميائية الحيوية وتعبير الرنا المرسال للجهاز المناعي الفطري بسبب الجوع.

في الحمار الوحشي ، العقد الليمفاوية غائبة ، والكلى هي العضو اللمفاوي الأساسي ، أي ما يعادل نخاع عظم الثدييات [24]. في الحمار الوحشي البالغ ، الكلى هي الموقع الرئيسي لتكوين الدم [35]. السكان في نخاع الكلى تحتوي على العديد من أنواع الخلايا المكونة للدم ، بما في ذلك الضامة ، العدلات ، والخلايا الليمفاوية [36،37]. تعتبر الوظيفة المناسبة للكلية مهمة لجهاز المناعة الفطري في الحمار الوحشي. في هذه الدراسة ، لاحظنا بعض التغيرات المورفولوجية في كليتي الحمار الوحشي المعرضة للجوع. زاد ترسب الـ MMCs في الكلى بشكل ملحوظ بعد الجوع. سبق أن وجد أن الجوع يمكن أن يسبب ترسب الضامة الميلانو (MMs) في الكلى والطحال في sh [38]. تظهر MMCs بشكل رئيسي في الكلى والكبد والطحال وتكون منتشرة وأقل تنظيماً في الكلى [39]. تعتبر MMCs تعمل في كل من الدفاعات المناعية والعمليات الفيزيولوجية غير المناعية والطبيعية. الوظيفة الأساسية لـ MMCs هي البلعمة. يُعتقد أن MMCs قد تشارك في كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. قد تكون إضافة MMCs بعد الجوع ناتجة عن كثرة البلعمة وإزالة حطام الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، في الأيام الأولى لإعادة التغذية ، لوحظ هيكل قطيرات هيالين. يُعتقد أن وجود قطرات هيالين يشير بشكل أساسي إلى alpha2u-globulin في الخلايا الطلائية الأنبوبية [40]. بالإضافة إلى ذلك ، في نموذج ساركوما المنسجات ، أنتجت المنسجات الورمية الليزوزيم ، والليزوزيم المتراكم في الخلايا الطلائية الأنبوبية [41]. باختصار ، يحدث تكوين قطرات الهيالين لأن الكلى لا تستطيع هضم البروتين الذي يتراكم في الخلايا الظهارية الأنبوبية. يمكن أن يشير مستوى KIM -1 (المشفر بواسطة havcr1) إلى التلف البنيوي للأنابيب [42]. بعد الجوع ، زاد تعبير mRNA عن havcr1 بشكل ملحوظ وانخفض مع إعادة التغذية. يمكننا أن نتنبأ بأن وظيفة الكلى تتضرر بسبب الصيام ، ومع إعادة التغذية تتعافى وظائف الكلى. ومع ذلك ، فإن المتطلبات مرهقة في بداية إعادة التغذية.

البلعمة هي عملية مهمة للدفاع في الجهاز المناعي الفطري في sh. سيحد الإجهاد التأكسدي من الاستجابة المناعية [20]. يعتمد الدفاع المضاد للأكسدة بشكل أساسي على الإنزيمات. SOD ، GPx ، والكتلاز مكونات مهمة لأنظمة مضادات الأكسدة [43]. يتوسط SOD في تحويل أنيون فائق الأكسيد و H2O2. يشارك كاتالاز في إزالة السموم من الماء. يحفز GPx هيدروبيروكسيدات (على سبيل المثال ، H2O2 وهيدروبيروكسيدات الدهون) إلى H2O عن طريق أكسدة الجلوتاثيون (GSH) في الجلوتاثيون ديسول دي (GSSH) [43-45]. MDA هو أحد منتجات أكسدة الدهون الرئيسية ويتم إنتاجه من الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) عن طريق التفاعلات الكيميائية والتفاعلات التي تحفزها الإنزيمات. يمكن لـ ROS بيروكسيد PUFAs لتوليد MDA. محتوى MDA هو علامة بيولوجية شائعة الاستخدام لتقييم الإجهاد التأكسدي [46]. في العمل الحالي ، على الرغم من انخفاض محتوى ROS ، زاد محتوى MDA في الكلى بشكل ملحوظ ، كما ارتفع نشاط جميع الإنزيمات التي تنتمي إلى نظام مضادات الأكسدة. إن اكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية هو استجابة عابرة. كان تغيير نشاط الإنزيم المضاد للأكسدة نتيجة الصيام طويل الأمد. قد ترجع الاتجاهات المعاكسة بين ROS والإنزيمات المضادة للأكسدة إلى حقيقة أن عمليات النشاط الخلوي الطبيعي تنتج ROS ، بينما يؤدي الجوع لفترات طويلة إلى تضاؤل ​​النشاط الخلوي. أظهرت هذه النتيجة أن الجوع يسبب الإجهاد التأكسدي في الكلى بشكل مزمن. قد يتسبب الإجهاد التأكسدي المستمر في تلف المواد الموجودة في الخلايا مثل الدهون والبروتينات ويؤدي في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج وتراكم الركام الجزيئي المؤكسد [20]. في teleosts ، تم الإبلاغ عن أن الجوع تسبب في محتوى MDA في الكبد والأمعاء وزيادة نشاط إنزيمات مضادات الأكسدة [47-49]. أشارت هذه النتائج إلى أنه على الرغم من تنشيط نظام مضادات الأكسدة ، إلا أنه لم يكن كافياً لإزالة الضرر الناجم عن الجوع. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن ينشط الإجهاد التأكسدي نطاقًا كبيرًا من عوامل النسخ ، مثل NF-kB و Nrf2 و HIF -1 أ. بعد ذلك ، تحفز عوامل النسخ هذه على التعبير عن العديد من السيتوكينات والكيموكينات. وبالتالي ، يمكن أن يؤدي الإجهاد التأكسدي إلى حدوث تأكسد مزمن [44].

بعد تحدي Streptococcus agalactiae ، عانى الحمار الوحشي في مجموعة الصيام من معدل وفيات أعلى من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة. وفي الوقت نفسه ، تحسن نشاط ALP والليزوزيم مع الجوع. Lysozyme هو عنصر مهم في الجهاز المناعي الفطري لـ sh ويشارك في عملية البلعمة [50]. وفقًا للنتائج ، تسبب الجوع في تعبير الرنا المرسال لكل من il -1 و nfkb1 و tgfb1a و tgfb1b و arg2. قد تكون هذه التغييرات ناجمة عن الإجهاد التأكسدي. TGFB1 هو سيتوكين له تأثيرات مؤيدة ومضادة للاضطراب [51]. أظهر TGFB1 المؤتلف نشاطًا مثبطًا للمناعة وقلل من تنظيم التعبير عن السيتوكينات المؤيدة للداخل في الكريات البيض في الكريات البيض. في حمار وحشي ، تسبب التعبير عن tgfb1a في الذروة في الكبد [52]. تم تنشيط تحريض tgfb1a المزمن في الذروة ، وتسبب تعبيره في حدوث تليف الكبد في سرطان الخلايا الكبدية المبكر في الحمار الوحشي. Arginase هو إنزيم بدائي وهو مسؤول عن تحويل L-arginine إلى L-ornithine واليوريا. يحتوي Arginase على اثنين من متماثلات الإنزيم (أرجيناز الأول وأرجيناز الثاني) [53،54]. Arginase II هو جين مرتبط بالمناعة ووجد أنه مرتبط بالاستجابات الأولية في البلاعم عبر الميتوكوندريا ROS. أظهرت هذه البيانات أن الجوع يمكن أن يحفز استجابة مناعية في الكلى. في الفئران ، قلل الجوع من الحساسية تجاه LPS ولم يؤثر على تعبير il -1 [55]. ومع ذلك ، أظهرت Zebra التي تم تحفيزها باستخدام LPs استجابة تقريبية لـ LPS ، وكان التعبير عن IL -1 و MMP9 أعلى بشكل كبير منه في المجموعات الأخرى. على عكس الفئران ، أصبح الحمار الوحشي أكثر حساسية لـ LPS بعد الجوع ، لذا فإن الجوع قد يضعف قدرتها على التخلص من مسببات الأمراض.

5. الاستنتاجات

في هذه الدراسة ، قمنا باستكشاف تأثير الصيام وإعادة التغذية على الجهاز المناعي الفطري للحمار الوحشي. تم تحقيق نمو تعويضي في الحمار الوحشي ، مصحوبًا بزيادة التعرض لمسببات الأمراض بعد الجوع. قد يكون الإجهاد التأكسدي - الناجم عن الجوع والأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر التي تنتجها الأنابيب الكلوية المصابة - قد ساهم في حدوث الذروة. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لاستكشاف كيف تزيد الجوع من القابلية للإصابة وكيف تؤثر الحالة الأيضية على أنواع مختلفة من الخلايا المناعية.

المواد التكميلية: ما يلي متاح على الإنترنت على https://www.mdpi.com/article/10 .3390 / biom11060825 / s1 ، الجدول S1: قائمة الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة ؛ الجدول S2: النتيجة الإحصائية للتجربة.

مساهمات المؤلف: Conceptualization، ZL، and WL؛ تنظيم البيانات ، JJ ؛ التحليل الرسمي ، ZL ، و DL ؛ اقتناء التمويل ، WL ؛ التحقيق ، ZL ، DL ، RC ، و YY ؛ المنهجية ، ZL ؛ الإشراف ، WL ؛ الكتابة - المسودة الأصلية ، ZL ؛ كتابة - مراجعة وتحرير ، WL لقد قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

التمويل: تم تمويل هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير في الصين (2018YFD0900101) ، ونظام البحوث الزراعية الصيني التابع لوزارة المالية ومارا (CARS -46) ، وبرنامج المواهب الصينية المتميزة في أبحاث العلماء الزراعيين ({{3 }}) إلى Wensheng Li.

بيان مجلس المراجعة المؤسسية: أجريت الدراسة وفقًا لإرشادات إعلان هلسنكي ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة صن يات سين.

بيان الموافقة المستنيرة: لا ينطبق.

بيان توفر البيانات: لا ينطبق.

تضارب المصالح: يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.