تداخل جليكوسيدات فينيلثانويد من سيستانش توبولوسا بمقايسة MTT

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

يو جي وانغ وسي مين زو وغانغ شو ويو تشي غاو

الملخص:

تم استخدام اختبار MTT ، كطريقة فحص ، على نطاق واسع لقياس جدوى الخلايا وتكاثرها. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن اختبار MTT قد لا يعكس بدقة تأثيرCistanche tubulosaالمستخلص الإيثانولي على صلاحية خلايا EA.hy926. لاستقصاء وتحديد المكونات المسؤولة عن الملاحظات المتناقضة لمقايسة MTT ، و echinacoside ، و acteoside ، تم عزل اثنين من الجليكوسيدات الفينيليثانويد الرئيسية ، من مستخلص C. tubulosa الإيثانولي. تشير البيانات المستمدة من فحوصات CCK -8 و Hoechst 33342 و Annexin V-FITC / PI إلى أن مجموعة الكافويل الموجودة في كلا المركبين المعزولين كانت مسؤولة عن النتائج المتضاربة لفحص MTT. تؤكد هذه البيانات على الحاجة إلى استخدام مجموعة متنوعة من الطرق المختلفة لتحديد تأثير العوامل الطبية على حيوية الخلية لتجنب التسبب في نتائج مضللة.

الكلمات الرئيسية: فحص MTT.جليكوسيد الفينيثانويد؛ حمض الكافيك صلاحية الخلية التشوش

مقدمة

النبات الطفيليCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (عائلة Orobanchaceae) منتشرة على نطاق واسع في دول شمال إفريقيا والعربية والآسيوية [1]. ينبع منCistanche tubulosaوCistanche Deserticolaتعتبر مهمة في الطب الصيني التقليدي ، حيث تم استخدامها في علاج العجز الجنسي والعقم وألم الظهر والإمساك بسبب القصور الذاتي للقولون [2]. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن المستخلص الإيثانولي من Cistanche tubulosa له تأثير وقائي كبير ضد نقص الأكسجة الدماغي في الفئران [3].

تلعب الخلايا البطانية دورًا مهمًا في التسبب في ارتفاع ضغط الدم الرئوي الناقص التأكسج. يتشابه خط الخلايا البطانية EA.hy926 إلى حد كبير مع الخلايا البطانية الأولية. خلال دراستنا للتأثير المضاد لنقص الأكسجةCistanche tubulosaالمستخلص الإيثانولي في الخلية البطانية EA.hy926 ، لاحظنا أن 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2 ، 5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) الفحص ، الذي يشيع استخدامه لتقييم جدوى الخلية في دراسات السمية الخلوية ونشاط تثبيط الخلايا ، ولّد نتائج متضاربة من خلال إظهار زيادة قابلية بقاء الخلية EAhy926 بعد العلاج.

يعد التقييم الدقيق لجدوى الخلية أمرًا ضروريًا لتحديد التأثيرات السامة للخلايا أو الواقية للخلايا لعامل طبي. لذلك ، قمنا بالتحقيق في المكونات الموجودة في المستخلص الإيثانولي من C. tubulosa التي قد تكون مسؤولة عن النتائج المتضاربة التي لوحظت مع اختبار MTT. قمنا بعزل اثنين من جليكوسيدات الفينيثانويد الرئيسية (PhGs) من مستخلص الإيثانول الأنبوبي من C. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل زيادة توضيح أي بديل للمركبين 1 و 2 قد يكون مسؤولاً عن النتائج المتناقضة ، قمنا باختبار aglycones ، وحمض الكافيك (المشار إليه فيما يلي بالمركب 3) و 3 ، 4- dihydroxylphenylethanol (المشار إليه فيما بعد بالمركب 4) ، على صلاحية الخلية EA.hy926 باستخدام نفس الأساليب.

النتائج والمناقشة

تحديد المركبات

تم تحديد هياكل المركبين المعزولين من المستخلص الإيثانولي من C. 1) و MS (m / z 785 [M − H] -) البيانات [4]. كانت أطياف المركب 2 NMR متشابهة إلى حد كبير مع أطياف المركب 1 ، باستثناء غياب مجموعة D-glucopyranosyl (الجدول 1). تم تحديد المركب 2 (m / z 623 [M − H] -) على أنه مركب أكتيوسيد [5]. الأهم من ذلك ، أن كلا المركبين لهما نفس الأجليكون ، والذي يتضمن حمض الكافيين (المركب 3) و 3 ، 4- ثنائي هيدروكسيل فينيل إيثانول (المركب 4).

فحوصات جدوى الخلية

تم استخدام فحوصات MTT و CCK {{0}} لتحليل تأثير المركبات 1-4 على صلاحية الخلية EA.hy926. أظهر فحص MTT أن صلاحية خلايا EAhy926 زادت بشكل ملحوظ بعد العلاج بـ 25 و 5 0 ميكرومتر مركب 1 أو 2 أو 3 (166.3 بالمائة و 174.1 بالمائة للمركب 1 و 205.8 بالمائة و 224.3 بالمائة للمركب 2 ، و 164.8 في المائة و 189.6 في المائة للمركب 3 ، على التوالي ؛ ف <0.05) ،="" عند="" مقارنتها="" بخلايا="" التحكم="" (الشكل="" 2="" أ).="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" حدد="" الفحص="" المورفولوجي="" للخلايا="" أن="" العلاج="" بمركب="" 50="" ميكرومتر="" 1="" أو="" 2="" أو="" 3="" زاد="" من="" تكوين="" بلورات="" فورمازان="" الأرجواني="" ،="" والتي="" تعتبر="" مؤشرًا="" مباشرًا="" لنسبة="" الخلايا="" الحية="" (الشكل="" 3).="" على="" العكس="" من="" ذلك="" ،="" اقترح="" اختبار="" cck="" -8="" أن="" قابلية="" بقاء="" الخلية="" انخفضت="" بشكل="" ملحوظ="" بعد="" العلاج="" بـ="" 12.5="" و="" 25="" و="" 50="" ميكرومتر="" مركب="" 1="" أو="" 2="" أو="" 3="" (75.5="" بالمائة="" و="" 45.1="" بالمائة="" و="" 43.7="" بالمائة="" للمركب="" 1="" ،="" 85.5="" بالمائة="" ،="" 51.8="" بالمائة="" و="" 34.3="" بالمائة="" للمركب="" 2="" و="" 64.5="" بالمائة="" و="" 48.2="" بالمائة="" و="" 36.4="" بالمائة="" للمركب="" 3="" على="" التوالي="" ؛="" p=""><0.05) مقارنة="" بخلايا="" التحكم="" (الشكل="" 2="" ب).="" لم="" يؤثر="" المركب="" 4="" على="" صلاحية="" الخلية="" في="" مقايسة="" mtt="" أو="" cck="" -8.="" يشير="" التناقض="" بين="" النتائج="" التي="" تم="" الحصول="" عليها="" بالمقايسين="" إلى="" أن="" أحد="" الاختبارين="" قد="" لا="" يعكس="" بدقة="" تأثيرات="" المركبين="" 1="" و="" 2="" على="" صلاحية="" الخلية="">

تقييم موت الخلايا المبرمج بواسطة Hoechst Staining

Hoechst 33342 عبارة عن صبغة DNA قابلة للنفاذ للخلايا تثيرها الأشعة فوق البنفسجية وتنبعث منها وميض أزرق عند 460 إلى 490 نانومتر. الكروماتين المكثف للخلايا المبرمج يكون أكثر سطوعًا من لونين الخلايا الطبيعية [6]. بينما أظهرت خلايا التحكم كروماتين مشتت بشكل موحد وعضيات طبيعية وأغشية خلوية سليمة ، أظهرت الخلايا المحتضنة بمركبات 50 ميكرومتر 1 أو 2 أو 3 لمدة 48 ساعة التلوين النموذجي للخلايا الأبوطوزية (الشكل 4 أ). على العكس من ذلك ، فإن تعرض الخلايا لـ 50 ميكرومتر من المركب 4 لا يزيد من عدد نوى موت الخلايا المبرمج مقارنة بمعالجة التحكم.

تحليل التدفق الخلوي لخلايا موت الخلايا المبرمج

يحدد اختبار الملصق المزدوج الملحق V-FITC / PI الخلايا المبرمج بواسطة الارتباط عالي التقارب للمرفق في V-FITC بالفوسفاتيديل سيرين ، والذي يتم تخريجه في الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج [7]. في هذا الاختبار ، لا ترتبط الخلايا القابلة للحياة بأي من الملحقين V أو PI ، وبالتالي فهي غير ملطخة (الربع الأيسر السفلي) ، وخلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة ملطخة باللون الأخضر من خلال ربط الملحق في V-FITC (الربع الأيمن السفلي) ، والخلايا المبرمجة المتأخرة ملطخة باللونين الأخضر والأحمر من خلال ارتباط الملحق V-FITC بفوسفاتيديل سيرين و PI بالخلايا الميتة ، على التوالي (الربع الأيمن العلوي). كما هو مبين في الشكل 4 ب ، الخلايا المحتضنة بمركبات 50 ميكرومتر 1 أو 2 أو 3 لمدة 48 ساعة ، زادت النسبة المئوية للخلايا المبرمجة من 3.74 بالمائة (خلايا التحكم) إلى 10.32 بالمائة و 12.95 بالمائة و 11.30 بالمائة على التوالي. مقارنة بخلايا التحكم ، لم يزيد المركب 4 نسبة الخلايا المبرمج EAhy926.

تمشيا مع النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مقايسة CCK -8 وبواسطة تلطيخ Hoechst 33342 ، أظهر فحص قياس التدفق الخلوي أن المركبات 1 و 2 و 3 تسببت في موت الخلايا المبرمج في خلايا EAhy926. إجمالاً ، تشير هذه الملاحظات إلى أن الزيادة في قابلية بقاء خلية EAhy926 التي لوحظت مع مقايسة MTT بعد العلاج بالمركبات 1–3 تمثل نتيجة إيجابية خاطئة.

مناقشة

في عام 1983 ، طور موسمان مقايسة لونية MTT ميكروسكوبية لقياس تكاثر الخلايا والسمية الخلوية [8]. يُستخدم هذا الاختبار البسيط والتعديلات عليه الآن على نطاق واسع في مختبرات بيولوجيا الخلية حول العالم. أشارت دراسات التجزئة في خلايا الثدييات إلى أن العامل المساعد لنيوكليوتيد البيريدين المختزل ، NADH ، مسؤول عن معظم تقليل MTT. تم دعم ذلك من خلال الدراسات التي أجريت باستخدام الخلايا الكاملة [9]. لذلك يرتبط اختزال MTT بالخلايا النشطة الأيضية ولا يقترن فقط بتنفس الميتوكوندريا ، ولكن أيضًا مع السيتوبلازم والأغشية غير الميتوكوندريا بما في ذلك حجرة الإندوسوم / الليزوزوم وغشاء البلازما [10]. صافي الشحنة الموجبة على جزيء MTT هو العامل الأساسي لامتصاصه الخلوي عبر إمكانات غشاء البلازما.

والجدير بالذكر أن مقايسة MTT قد لا تعكس أحيانًا بدقة التأثير الفعلي للمركب الذي تم اختباره على خلايا معينة. ومع ذلك ، لم يتم تحديد الهياكل أو المجموعات الكيميائية التي قد تسبب نتائج متضاربة في اختبار MTT. أظهرت الدراسات الحديثة أن اختبار MTT يمكن أن يقلل من التأثير المضاد للتكاثر لـ (-) - epigallocatechin -3- gallate ، البوليفينول الأكثر وفرة في الشاي الأخضر [11]. في الدراسات التي تستخدم اختبار MTT للكشف عن الحساسية الكيميائية للورم ، أظهرت عوامل العلاج الكيميائي المضادة للسرطان ، مثل epirubicin و paclitaxel و docetaxel و imatinib mesylate (Gleevec) ، زيادة قابلية الخلية للحياة [12 ، 13]. علاوة على ذلك ، أفاد عدد من الدراسات أن بعض المستخلصات النباتية وبوليفينول نشط الأكسدة والاختزال يمكن أن تتداخل مع مقايسة MTT لأنها تقلل بشكل مباشر ملح رباعي MTT في غياب الخلايا [14].

الحاجة إلى إذابة بلورات فورمازان MTT قبل التحليل الطيفي في قارئ الصفيحة الدقيقة وطبيعة نقطة النهاية المتأصلة للتفاعل تحد من استخدام اختبار MTT في تطبيقات معينة. أدى ذلك إلى تطوير نظائر التترازوليوم حيث تم تزيين شقوق فينيل بمجموعات سلفونات سالبة الشحنة ، مثل 2 ، 3- مكرر - (2- methoxy -4- نيترو - 5- sulfophenyl) -2 H-tetrazolium -5- كاربوكساميد (XTT) ، ملح داخلي سالب الشحنة [15] و 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيل ثيازول -2- يل) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- sulfophenyl) -2 H-tetrazolium (MTS) ، ملح داخلي ضعيف الحمضية وثيق الصلة بـ MTT [16] . أدت هذه التعديلات إلى إنتاج مستنبتات فورمازان متوسطة الذوبان التي ألغت متطلبات خطوة الإذابة قبل التحديد الكمي. بالمقابل ، نظرًا لأن الشحنة السالبة المتزايدة على هذه الجزيئات قللت من قدرتها على الحركة عبر أغشية الخلايا [17] ، فإن مستقبلات الإلكترون الوسيطة (IEA) ، مثل 1- ميثوكسي -5- ميثيل فينازينيوم ميثيل سلفات ({{25 }} methoxy PMS) لتسهيل تقليل صبغة التيرازول أو لتعزيز معدل الاختزال.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير جيل جديد من أملاح التترازوليوم القابلة للذوبان في الماء والتي يعتبر WST -1 نموذجًا أوليًا لها [18]. WST -1 ، ملح داخلي مفصول سالب الشحنة يحتوي على بقايا اليود ، وهو أكثر استقرارًا من XTT و MTS في وجود 1- methoxy PMS ، وهو IEA الإلزامي. أدى ذلك إلى تسويق WST -1 / 1- methoxy PMS كمجموعة ملائمة لتكاثر خلايا الكاشف الفردي. تم تطوير العديد من أملاح التترازوليوم الأخرى في سلسلة WST ، وأكثرها فائدة ربما يكون WST -8 [19]. يبدو أن WST -8 لها خصائص اختزال خلوية متشابهة جدًا مع WST -1 ويتم تسويقها بشكل مستقل كمقايسة CCK -8. WST -8 غير منفذة للخلية وبالتالي يتم تقليله خارج الخلية ، عن طريق نقل الإلكترون من NADH داخل الخلايا إلى WST -8 عبر غشاء البلازما بوساطة 1- methoxy PMS. على الرغم من أن كلا من MTT و WST -8 / 1- يتم تقليل PMS بواسطة NADH داخل الخلايا ، يبدو أن مصدر NADH يختلف في هاتين الطريقتين. WST -8 / 1- تقليل الميثوكسي PMS يعتمد بدرجة أكبر على مكوك malate / aspartate الذي يربط دورة حمض الكربوكسيل ثلاثي الكربوكسيل للميتوكوندريا مع الفضاء خارج الميتوكوندريا [20].

في التجارب الأولية ، أكدنا أن المركبات 1 و 2 و 3 و 4 لا يمكن أن تقلل بشكل مباشر من ملح رباعي الترازوليوم MTT (غير معروض). في هذه الدراسة ، تم التخلص من التأثير المباشر للمركبات نفسها مع الكاشف عن طريق غسل الألواح الدقيقة بعناية بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) قبل إضافة محلول MTT أو CCK -8 ، كما هو موضح في بروتوكولات الشركة المصنعة. ومع ذلك ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقتين لا تزال متناقضة (الشكل 2). كما هو متوقع ، أدى احتضان الخلايا بالمركبات 1 و 2 و 3 إلى زيادة اختزال ملح تترازوليوم إلى فورمازان أرجواني ، مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 3) ، مما يشير إلى أن مجرد تقليل ملح التيرازوليوم في وجود مركب معين لا يكفي للحكم على قدرة المركب على التدخل في اختبار MTT.

لتحديد ما إذا كانت المركبات 1 و 2 و 3 و 4 يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج في خلايا EAhy926 ، تم تقييم التغيرات المورفولوجية الخلوية وإخراج الفوسفاتيديل سيرين. تمشيا مع الانخفاض في الجدوى الخلوية التي لوحظت مع اختبار CCK -8 ، أشارت نتائج تحليل تلطيخ Hoechst وقياس التدفق الخلوي باستخدام الملحق V-FITC / PI إلى أن تثبيط النمو الذي لوحظ بعد العلاج المركب 1 و 2 و 3 كان يرجع ، جزئيًا على الأقل ، إلى موت الخلايا المبرمج EAhy926. دعمت نتائجنا أيضًا فكرة أن مجموعة الكافيين الموجودة في كلا المركبين 1 و 2 كانت مسؤولة عن النتائج المتناقضة التي تم الحصول عليها باستخدام اختبار MTT.

على غرار النتائج التي توصلنا إليها ، لم تظهر Rottlerin ، وهي فتاحة قناة بوتاسيوم قوية التوصيل كبيرة ، تفاعلاً تجاه MTT في المختبر. ومع ذلك ، فقد عزز بقوة تكوين بلورات فورمازان داخل الخلايا ، وهي النتيجة التي كانت في تناقض واضح مع تثبيط Rottlerin لـ NF-B وتكاثر الخلايا الذي لوحظ من خلال تحليل [3 H] دمج ثيميدين في الحمض النووي [21]. تُعزى الآلية التي من خلالها Rottlerin عزز اختزال MTT إلى تأثير عدم اقتران الميتوكوندريا [22]. يحتوي روتليرين على مجموعة بديلة لحمض سينامويل. مقارنة بحمض سينامويل ، يحتوي المركب 3 على بقايا هيدروكسيل إضافية ، والتي توجد في C -3 و C -4. لذلك ، فإننا نتوقع أن الآلية التي تسبب بها المركبات 1 و 2 نتائج متضاربة في اختبار MTT قد ترتبط أيضًا بتأثيرات فك اقتران الميتوكوندريا. لاختبار هذه الفرضية ، هناك حاجة لدراسات مقارنة بين المركبات 1 ، 2 ، ومحلول الفصل الكيميائي ، مثل ثلاثي فلورو كربونيل سيانيد فينيل هيدرازون (FCCP).

القسم التجريبي

الكواشف والكيماويات

تم شراء المركب 3 (مسحوق حمض الكافيين ، نقاء=98. 6 بالمائة) من شركة Chengdu Push Bio-Technology Co.، Ltd. (تشنغدو ، الصين). تم الحصول على المركب 4 (3 ، 4- زيت ثنائي هيدروكسي فينيل إيثانول ، نقاء=98. 5 بالمائة) من شركة Chengdu Must Bio-Technology Co.، Ltd. (تشنغدو ، الصين). تم الحصول على MTT وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مقايسة CCK -8 من Dojin Laboratories (Kumamoto ، اليابان). تم شراء Hoechst 33342 و Annexin V-FITC / PI للكشف عن موت الخلايا المبرمج من معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية (Haimen ، الصين)

المواد النباتية

تم جمع سيقان C. tubulosa من محافظة Yutian ، منطقة Xinjiang Uygur ذاتية الحكم ، الصين. تم إيداع عينات القسائم في المختبر الرئيسي لطب المرتفعات ، الجامعة الطبية العسكرية الثالثة (تشونغتشينغ ، الصين) وتم توثيقها من قبل يي تشانغ من جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (تشنغدو ، الصين)

استخراج وعزل المواد النباتية

تم تجفيف السيقان المجففة بالهواء (0. 6 كجم) واستخلاصها باستخدام 5 0 بالمائة من الإيثانول لمدة ساعتين عند 70 درجة. بعد إزالة المذيب تحت ضغط مخفض ، تمت إذابة المستخلص الإيثانولي (212.5 جم) وتعليقه في ماء (2 لتر) واستخلاصه باستخدام n- بيوتانول (2 لتر × 3). تم إجراء تحليل كروماتوجرافي لمستخلص n-butanolic (110 جم) على عمود بولي أميد وتمت التصفية التتابعية باستخدام الإيثانول / الماء (0: 100 ، 5:95 ، 15:85 ، 30:70 ، 50:50) مما أدى إلى إنتاج خمسة كسور (A –E) . تم تجزئة الجزء B (65 جم) على عمود ODS ؛ شطف مع الإيثانول: الماء (1: 9) مركب منفصل 1 (3 جم). تم تجزئة الجزء D (10.5 جم) على عمود مادة مستنفدة للأوزون ؛ شطف مع الإيثانول / الماء (1: 4) مركب منفصل 2 (1 جم).

تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي على مطياف Bruker Avance 600 في CD3OD باستخدام Tetramethylsilane (TMS) كمعيار داخلي. تم تنفيذ أطياف الكتلة على مطياف الكتلة BioTOF-Q.

زراعة الخلايا

تم الحصول على خطوط الخلايا EA.hy926 من American Type Culture Collection (ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استنبات الخلايا في وسط RPMI 1640 ، مكملًا بنسبة 10 في المائة (حجم / حجم) مصل بقري جنيني و 1 في المائة (ت / ت) بنسلين ستربتومايسين في بيئة رطبة مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة.

حيوية الخلية

تم تقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسات MTT و CCK {0}. تم إذابة المركبين 1 و 2 ، وحمض الكافيين (3) و 3 ، 4- ثنائي هيدروكسيل فينيل إيثانول (4) في DMSO إلى تركيز DMSO النهائي <0.1 بالمائة="" (حجم="" حجم)="" في="" وسط="">

تم زرع خلايا EA.hy926 على 96- أطباق جيدة عند 4 × 103 خلية / بئر. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، عولجت الخلايا بمركب 6.25-50 ميكرومتر 1 ، 2 ، 3 ، أو 4 لمدة 24 ساعة. تمت إزالة وسط المزرعة وغسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS). تمت إضافة قسامات (10 ميكرولتر) من محلول MTT المخزون (5 مجم · مل) إلى كل بئر تحتوي على 100 ميكرولتر من الوسط واحتضانها بالخلايا لمدة 4 ساعات. بعد الحضانة ، تمت إزالة الوسط وإضافة 150 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة بلورات فورمازان. تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (Bio-Tek Synergy HT ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التعبير عن صلاحية الخلية كنسبة مئوية من تخفيض MTT ، مع تخصيص قيمة 100 بالمائة لامتصاص خلايا التحكم. تم إجراء جميع التجارب ثلاث مرات وقدمت على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (SD).

تم إجراء اختبار CCK -8 باتباع الأدبيات مع تعديلات طفيفة [23]. على وجه التحديد ، عولجت الخلايا باستخدام 6.25-50 ميكرومتر من المركبات 1 ، 2 ، 3 ، أو 4 لمدة 24 ساعة وغسلها مرتين باستخدام PBS قبل إضافة 10 ميكرولتر من محلول CCK -8 و 100 ميكرولتر من وسط المزرعة. بعد احتضان الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة لمدة ساعتين ، تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. تم التعبير عن صلاحية الخلية كنسبة مئوية من الخلايا القابلة للحياة بالنسبة لخلايا التحكم (100 بالمائة). تم إجراء جميع التجارب ثلاث مرات وتم التعبير عنها على أنها متوسط ​​± SD.

تقييم موت الخلايا المبرمج بواسطة Hoechst 33342 Staining

لوحظت تغيرات مورفولوجية موت الخلايا المبرمج بواسطة تلطيخ Hoechst 33342. باختصار ، تم زرع خلايا EA.hy926 على 48- ألواح جيدة (2 × 104 خلية / بئر) وعولجت بمركب 50 ميكرومتر 1 أو 2 أو 3 أو 4 لمدة 48 ساعة عند 37 درجة ، وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، وثابتة بنسبة 4 في المائة (ت / ت) لامتصاص العرق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الشطف مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم تلوين الخلايا بـ Hoechst 33342 (10 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. تم تصور نوى Hoechst الملطخة باستخدام مجهر مضان (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان).

تحليل موت الخلايا المبرمج بواسطة التدفق الخلوي

تم الكشف عن الخلايا المبرمج عن طريق الملحق في V-FITC / PI مزدوج التلوين وتحليل التدفق الخلوي. باختصار ، بعد العلاج بمركب 50 ميكرومتر 1 أو 2 أو 3 أو 4 لمدة 48 ساعة ، تم حصاد الخلايا وإعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني عند 1 × 105 خلية · مل -1. بعد الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة ، تمت إضافة 195 ميكرولتر من محلول ربط V-FITC و 5 ميكرولتر من الملحق في V-FITC. بعد الخلط الدوامي اللطيف ، تم تحضين الخليط لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة ، تمت إضافة 190 ميكرولتر من الملحق المترافق مع FITC في المخزن المؤقت للربط V و 10 ميكرولتر PI. بعد الخلط الدوامي اللطيف ، تم تحليل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي FACSCalibur (بكتون ديكنسون ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) في غضون 30 دقيقة.

تحليل احصائي

تم التعبير عن جميع البيانات التجريبية على أنها تعني ± SD. تم تقييم أهمية الاختلافات بين العينات التجريبية والمراقبة المقابلة عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) باستخدام برنامج SPSS (الإصدار 11.5). تم تعيين الدلالة الإحصائية عند p <0.>

الاستنتاجات

تشير نتائجنا إلى أن المبالغة في تقدير عدد الخلايا القابلة للحياة التي لوحظت في اختبار MTT يمكن أن تحجب السمية الخلوية لمركبات معينة. لذلك ، أثناء عمليات فحص تعاطي المخدرات ، نوصي باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق لتحديد تأثير المركب المحدد في صلاحية الخلية (مثل CCK -8 و 3 فحوصات H-TdR) لتجنب توليد نتائج مضللة.