التحقيق في سمية Ifosfamide يستحث منظم المنبع المشترك في الكبد والكلى

جهة الاتصال: emily.li@wecistanche.com

هيونغ يون هان وآخرون

الملخص:

Ifosfamide هو عامل مؤلكل ، وهو نظير اصطناعي للسيكلوفوسفاميد ، يستخدم لعلاج أنواع مختلفة من السرطانات الصلبة. في هذه الدراسة ، تم تقييم سمية ifosfamide باستخدام جرعة مفردة ومتعددة الجرعة داخل الصفاق في الجرذان وفقًا لإرشادات الممارسات المعملية الجيدة ، وتم اتباع تجربة ميكروأري إضافية لدعم الفسيفساء السمية. جرعة واحدة من ifosfamide (50 مجم / كجم) لم تسبب أي تغييرات مرضية. وفي الوقت نفسه ، لوحظت سمية كلوية شديدة في المجموعتين 7 و 28 يومًا على التوالي ، مع زيادات ملحوظة في مستويات نيتروجين اليوريا في الدم والكرياتينين. في تحليل قائمة السموم ، تأثرت الجينات المرتبطة بتخليق الكوليسترول في الغالب في الكبد وتأثرت الجينات المرتبطة بالفشل الكلوي فيالكلىبعد تناول ifosfamide. علاوة على ذلك ، تم اختيار العامل التنظيمي للإنترفيرون 7 باعتباره المنظم الرئيسي المنبع الذي تغير في كل منكبدوالكلى، ووجد أنه يتفاعل مع الجينات المستهدفة الأخرى ، مثل ubiquitin النوعي peptidase 18 ، ومجال S-adenosyl methionine الجذري الذي يحتوي على 2 ، والجين المحفز للإنترفيرون 15 ، والذي تم تأكيده بشكل أكبر من خلال تحليل RT-PCR في الوقت الحقيقي. في الختام ، تم إعادة تأكيد سمية عضو ifosfamide المتحيزة للكلية وتحديد الجينات المتغيرة بشكل مماثل في كل منكبدوالكلى. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات الجينية السمية الشاملة للكشف عن العلاقة الدقيقة بين الجينات التي يسببها إفوسفاميد وسمية الأعضاء.

الكلمات الدالة:إفوسفاميد. السمية الكبدية. السمية الكلوية. سمية داخل الصفاق

الكستانش مفيد للكبد والكلى

1 المقدمة

Ifosfamide هو عامل مؤلكل ، وهو نظير اصطناعي للسيكلوفوسفاميد ، يستخدم لعلاج أنواع مختلفة من السرطانات الصلبة ، بما في ذلك الأورام اللحمية والأورام اللمفاوية. Ifosfamide هو دواء مضاد للسرطان غير محدد دورة الخلية يتداخل مع تكرار الحمض النووي وإنتاج الحمض النووي الريبي [1]. على الرغم من أن إفوسفاميد جيد التحمل نسبيًا مقارنة بعوامل الألكلة السامة الأخرى ، فمن المعروف أنه يرتبط بالعديد من الآثار الضارة التي تهدد الحياة والتي تحد من استخدامه السريري [2]. تشمل الآثار الجانبية الرئيسية لـ ifosfamide الإصابة الكلوية الشديدة الناتجة عن الأنواع السامة التفاعلية من ifosfamide ، بما في ذلك الحادةالكلى إصابةوالتهاب الكلية الخلالي والتهاب المثانة النزفي ومتلازمة فانكوني [3]. في العيادات ، تم الإبلاغ عن تسمم شديد بأعضاء متعددة في المرضى الذين عانوا من سمية كلوية مبكرة وتكرار الجرعات العالية التي يسببها إفوسفاميد لفشل عضو واحد مما أدى إلى فشل عضو لاحق [4،5].

يعتبر المستقلب السام للإيفوسفاميد ، والأكرولين ، وكلورو أسيتالدهيد ، عاملاً رئيسياً مسؤولاً عن سمية عضو إفوسفاميد. ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على العوامل التي تؤثر على تحويل إفوسفاميد إلى مستقلبات سامة ، وخاصة السيتوكروم P450 (CYP) [6]. تؤدي وفرة CYP3A4 و CYP3A5 نسبيًا في الكلى إلى تغيرات سامة في ifosfamide وتحفز السمية الكلوية [7]. الأكرولين هو ألدهيد شديد التفاعل يمكنه تنشيط مسار الجينات المؤكسدة التفاعلية داخل الخلايا وإتلاف عضية الخلية. أبلغ الكلورو أسيتالدهيد عن قمع تنشيط المركب I في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا والذي قد يؤدي إلى استنفاد الجلوتاثيون داخل الخلايا (GSH) وموت الخلايا [8].

تعد الدراسة السمية للأعضاء المتعددة أكثر فائدة في فهم التأثيرات الجهازية للأدوية من استهداف أعضاء معينة لدراسات السمية. الكبد والكلى من الأعضاء الرئيسية التي تشارك في استقلاب الدواء وإفرازه ، وهذه الأعضاء الرئيسية معرضة للتفاعلات الدوائية الضارة ؛ غالبا ما يتبع سمية الأعضاء. علاوة على ذلك ، يمكن أن يقدم التقييم السمي التكاملي العديد من العوامل المرضية التي قد تساعد في فهم السمية التي يسببها الدواء والتنبؤ بها في النظام.

استخدمت العديد من الدراسات ملامح التعبير الجيني للتنبؤ بالآثار السلبية المحتملة للمواد الكيميائية. ومع ذلك ، ركزت معظم الدراسات السابقة على تقييم سمية عضو واحد الهدف ، مع أعراض مرضية محدودة فقط [9]. علاوة على ذلك ، جنبًا إلى جنب مع التنميط الجيني القائم على ميكروأري ، فإنه سينتج فهمًا شاملاً على مستوى النظام للسمية التي يمكن أن تمنع السمية المحتملة المرتبطة بالعقاقير [10]. في هذا الصدد ، تم استخدام مناهج السمية متعددة الأعضاء التكاملية مع تحديد ملامح التعبير الجيني في دراسات نموذجية للتنبؤ بالسمية للتغلب على بيانات السمية المستمدة من تقييم سمية عضو واحد ، والتي لا تكفي لفهم الآليات السامة للأدوية في النظام [11].

في هذه الدراسة ، نصف سمية ifosfamide فيالكلىوكبدبعد التعرض الحاد والمتكرر في جرذان سبراج داولي (SD). تم إجراء فحوصات تحديد ملامح التعبير الجيني الداعمة للكشف عن الجين المستهدف الشائع الذي تم تغييره بواسطة ifosfamide في كل من الكبد والكلى، مما يشير إلى نظرة ثاقبة لسمية ifosfamide التكاملي.

2. النتائج

2.1. دراسة السمية أحادية الجرعة

لم يلاحظ أي سمية في المجموعات 12.5 و 25 و 50 ملغم / كغم من ifosfamide - وليس الموت أو الأعراض السامة أو تغيرات وزن الجسم أو التكوينات النسيجية المرضية.

وفي الوقت نفسه ، في دراسة أمراض الدم ، انخفض التعداد النسبي للخلايا الشبكية (RET) والتعداد المطلق للعدلات (NEUA) والخلايا الليمفاوية (LYMA) بطريقة تعتمد على الجرعة.

2.2. دراسة سمية الجرعة المتكررة لمدة أسبوع

انخفض الوزن الإجمالي للجسم بعد أسبوع واحد من إعطاء ifosfamide ، وكانت القيم المتوسطة لفقدان وزن الجسم في مجموعة 100 مجم / كجم أعلى من تلك الموجودة في مجموعة 75 مجم / كجم (الجدول 1). وفي الوقت نفسه ، تم زيادة الوزن النسبي للأعضاء تدريجياً في المجموعات المعالجة بالإيفوسفاميد (الجدول 2).

قام أسبوع واحد من إدارة ifosfamide IP المتتالية بقمع مؤشر أمراض الدم ، بما في ذلك RBC و HGB و HCT و MCV و PLT ، بطريقة تعتمد على الجرعة (الجدول 3). علاوة على ذلك ، زاد BUN و CREA بمقدار 1.2 مرة في المجموعة الضابطة مقارنة بمجموعة ifosfamide (الجدول 4).الكلىإصابةتم دعمه أيضًا من خلال دراسة الأنسجة المرضية.

لم يلاحظ أي علامات نسيجية مرضية في كبد الفئران في مجموعات 75 و 100 ملغم / كغم من ifosfamide (الشكل 1A). وفي الوقت نفسه ، فإنالكلىمن مجموع 75 و 100 ملغم / كغم من ifosfamide وجد أن لديهم درجة من الحد الأدنى إلى الطفيف من التغيير المرضي ، بما في ذلك التنكس / التوسيع الأنبوبي (1 متوسط ​​في مجموعة 100 مجم / كجم) ، نخر الخلية المفردة ، تضخم urothelium ، والنزيف البؤري / الازدحام (الجدول 5). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت زيادة واضحة في تعبير KIM -1 في منطقة الأنابيب الكلوية فيالكلىمن مجموعة 100 مغ / كغ (الشكل 1 ب).

2.3 دراسة سمية متكررة للجرعة لمدة أربعة أسابيع

لوحظ معدل الوفيات في المجموعات المعالجة 50 (5/10) و 70 (10/10) ملغم / كغم بعد 21 و 10 أيام من الإعطاء المتتالي ، على التوالي. علاوة على ذلك ، انخفاض وزن الجسم مع زيادة الوزن النسبي للأعضاء ،كبد، والكلى، في جميع المجموعات المعالجة بإيفوسفاميد ، يدعم سمية الجرعة المتكررة أسبوعًا 4-.

تم إجراء تحاليل كيميائية حيوية في الدم والمصل على الأشخاص الناجين. تم تقليل العديد من معايير الدم ، بما في ذلك RET و RBC و MONA و EOSA و LUCA ، بعد 4 أسابيع من إعطاء ifosfamide.

مقارنة بالمجموعة الضابطة ، أظهرت التحليلات الكيميائية الحيوية فروق ذات دلالة إحصائية بعد 4 أسابيع من إعطاء ifosfamide. على سبيل المثال ، زادت مستويات AST و CK بشكل كبير ، وانخفضت نسبة A / G و GLU و GGT (p <0. 01)="" في="" المجموعة="" المعالجة="" 50="" مجم="" كجم="" ،="" عند="" مقارنتها="" بمجموعة="" التحكم="">

2.4 تحليل التعبير الجيني الناجم عن إفوسفاميد

تم تحديد DEGs التي يسببها ifosfamide في الكبد والكلىالأنسجة (الجدول 6). بالنسبة للكبد ، تضمنت الجينات المعبر عنها تفاضليًا 2672 جينًا عند 100 مجم / كجم من وزن الجسم / يوم ، وتم إعادة تنظيم 1283 جينًا ، وتم تقليل تنظيم 1389 جينًا. في الكلى ، تم التعبير عن 401 جين بشكل تفاضلي عند 100 ملجم / كجم من وزن الجسم / يوم - تم إعادة تنظيم 149 جينًا ، وتم تقليل تنظيم 252 جينًا. في كل من الكبد والكلى ، كان عدد الجينات الخاضعة للتنظيم أكبر من عدد الجينات المنظمة. قد يشير هذا إلى أن علاج ifosfamide يبدو أنه يثبط التعبير الجيني.

يتم سرد نتائج تحليل الوظيفة البيولوجية في الجدول 7. تم العثور على 1- إدارة ifosfamide الأسبوع لتغيير الجينات المتعلقة بتطور الأعضاء ، ومعظمها في الكبد. في الالكلى، تم التأكيد على أن الجينات المرتبطة بتوطين الخلايا المناعية تأثرت في الغالب.

في تحليل المسار القانوني لـ DEGs ، كانت التغيرات في تخليق الكوليسترول والجينات المرتبطة بمسار عرض المستضد واضحة فيكبدوالكلىالأنسجة ، على التوالي (الشكل 2). علاوة على ذلك ، كانت إشارات LXE / RXR واستجابة المرحلة الحادة هي المسار الكنسي المشترك الأعلى تنظيمًا فيكبدوالكلى، والتي تورطت في استتباب الدهون وإشارات السيتوكينات الالتهابية ، على التوالي.

في تحليل قائمة سموم الكبد ، تأثرت الجينات المرتبطة بتخليق الكوليسترول في الغالب ، تليها بروتينات استجابة المرحلة الحادة الإيجابية ولوحة الفشل الكلوي الحاد (الجدول 8). علاوة على ذلك ، كشفت نتائج قائمة الكلى أن الجينات المرتبطة بالفشل الكلوي قد تأثرت بشكل عام بالإيفوسفاميد ، بما في ذلك المؤشرات الحيوية لالتهاب كبيبات الكلى القابل للعكس ولوحة الفشل الكلوي الحاد.

استنادًا إلى قاعدة معارف IPA ، ينظم منظم المنبع الشائع التعبير الجيني في الكبد والكلى بعد علاج ifosfamide (الشكل 3). كان IRF7 هو المنظم الرئيسي الذي تغير في كل من الكبد والكلى ووجد أنه يتفاعل مع الجينات المستهدفة الأخرى مثل USP18 و RSAD2 و ISG15. علاوة على ذلك ، أكد تحليل RT-PCR في الوقت الفعلي التعبير عن IRF7 و USP18 و RSAD2 و ISG15. على الرغم من أن مدى التغيرات في كل جين كان مختلفًا بين الكبد والكلى ، فقد تم كبت التعبير في كل من أنسجة الكبد والكلى بعد أسبوع واحد من إعطاء ifosfamide. قام كل من RSAD2 و USP18 بتغيير الجينات في الغالب عن طريق علاج ifosfamide في الكبد والكلى ، على التوالي.

3. مناقشة

في هذه الدراسة ، تم استكشاف سمية ifosfamide الشاملة في أعضاء متعددة بجرعات مختلفة وشروط التعرض من خلال مسار IP في الفئران وفقًا لمعيار GLP. في العيادات ، يمكن للإيفوسفاميد أن يبذل مفعولًا مزدوجًا مضادًا للورم مع تأثيرات سامة للخلايا ومعدلة للمناعة مع العلاج المناعي بالتبني [12]. من المعروف أن Ifosfamide يتم التخلص منه بشكل رئيسي عن طريق الكلى وحوالي 80 في المائة من الجرعة في شكل غير متغير ، والسمية الكلوية هي أحد الآثار الجانبية المعروفة للإيفوسفاميد ، والمستقلبات مثل كلورو أسيتالدهيد والأكرولين مسؤولة عن استخدامه السريري [13 ، 14].

في هذه الدراسة ، كانت دراسة السمية المتكررة لمدة {{0} أسبوعًا مناسبة لاستكشاف سمية الأعضاء المشتقة من ifosfamide. قام أسبوع واحد من إعطاء إفوسفاميد بقمع مؤشر الدم بطريقة تعتمد على الجرعة ، مما قد يعكس كبت نقي طبيعي مشتق من إفوسفاميد. إلى جانب السمية الكلوية ، أشارت العديد من التقارير إلى أن كبت نقي العظم هو أحد السمية الرئيسية التي تحد من جرعة إفوسفاميد ، وأن قلة الكريات البيض بشكل عام أكثر حدة من قلة الصفيحات [15،16]. يمكن أن تؤدي السمية الكلوية Ifosfamide إلى متلازمة فانكوني ، حيث يوجد ضعف في وظيفة الأنابيب القريبة مما يؤدي إلى تلف لا يمكن إصلاحه ، ويؤدي المستقلب السام أكرولين إلى تسمم البول مع التهاب المثانة النزفي [17]. هذا يتوافق مع نتائج الدراسة الحالية. في دراسة التشريح المرضي ، تم فحص الكلى والكبد لاستكشاف التغيرات المرضية المشتقة من إفوسفاميد. في كل من المجموعتين 75 و 100 مجم / كجم من إفوسفاميد ، تم اكتشاف مناطق كبيرة من التنكس الأنبوبي والتوسع مع تضخم البولية في منطقة الحوض الكلوي. علاوة على ذلك ، فإن التعبير عن KIM -1 ، وهو جزيء إصابة في الأنابيب الكلوية القريبة ، يدعم وجود السمية الكلوية المرتبطة بالإيفوسفاميد. وفي الوقت نفسه ، لوحظ فقط الحد الأدنى من التجويف المحيط بالباب في الكبد. علاوة على ذلك ، على الرغم من انخفاض قيم AST و ALT بطريقة تعتمد على الجرعة ، كانت التغييرات ضمن النطاق المرجعي [18]. ستحتاج الأسباب الأعمق لانخفاض مستويات إنزيم الكبد إلى مزيد من الدراسة. من المقبول عمومًا أن ifosfamide هو عامل مؤلكل نادرًا ما يرتبط بالسمية الكبدية ، وقد تم الإبلاغ عن حالات قليلة فقط لتسبب إصابة الكبد ، خاصة عند الدمج مع أدوية العلاج الكيميائي الأخرى مثل دوكسوروبيسين [19].

في الآونة الأخيرة ، أدى التقدم الملحوظ في بيانات التعبير الجيني في علم السموم باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية إلى توليد مجموعات بيانات كبيرة بما فيه الكفاية في دراسات السمية ، وقد بذلت محاولات عديدة لتطبيق ملف الجينات على التنبؤ بالسمية الكيميائية [10،20]. في هذه الدراسة ، تم إجراء تحليل ميكروأري لتحليل استجابة النسخ الناجم عن إدارة ifosfamide ، وتم اختيار DEGs مع تغيير أضعاف أكبر من أو يساوي 1.5 على أنها الجين المستهدف وتم استخدام الوظيفة البيولوجية والمسار الكنسي وتحليل قائمة Tox لفهم وظيفة الجينات التي يسببها ifosfamide. تم إجراء تحليل إضافي لمنظم المنبع لتقييم إمكانية حدوث تسمم متعدد الأعضاء في الكبد والكلى.

في هذه الدراسة ، تغيرت DEGs 1. تم اختيار 5- أضعاف ، وكانت الجينات الخاضعة للتنظيم أكثر هيمنة قليلاً من الجينات المنتظمة في كل من الكبد (52 بالمائة) والكلى (62 بالمائة). أشارت نتائج تحليل الوظيفة البيولوجية إلى أن إفوسفاميد يغير الجينات ، مع وظائف بيولوجية مرتبطة بتطور الأنسجة والتي يتم ملاحظتها بشكل شائع في كل من الكبد والكلى.

دراسة سابقة قام بها Snouber et al. [21] تم العثور على علاج ifosfamide المبلغ عنه لتقليل تنظيم مسارات الاستجابة التأكسدية للإجهاد بوساطة Nrf -2 في ثقافة الموائع الدقيقة [21]. تمشيا مع الدراسات السابقة ، تم تعديل مسار استجابة الإجهاد التأكسدي بوساطة NRF 2- بشكل ملحوظ من قبل الشبكات العليا ، وهو ما أكده كل من المسار الكنسي الحالي وتحليل قائمة المواد السامة. قد تكون مسارات الاستجابة التأكسدية للضغط التي تم تغييرها حاليًا بواسطة Nrf -2 مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بمستقلب إفوسفاميد السام. يمكن أن تتفاعل نواتج الأيض السامة المتعددة من ifosfamide مع GSH ، أحد مضادات الأكسدة القوية ، لتكوين اتحادات في مواقع مختلفة على طول المسار ، وينتج عن انخفاض مستوى GSH زيادة السمية ، مما يشير إلى تأثير الإجهاد التأكسدي في سمية عضو ifosfamide [8،22 ]. في هذا الصدد ، تم استخدام mesna و N-acetylcysteine ​​للتخفيف من سمية أعضاء ifosfamide. تعمل المسنا كمزيل للسموم الإقليمية عن طريق الارتباط بالمستقلب السام إيفوسفاميد ، بشكل أساسي ضد الأكرولين ، من خلال إضافة مايكل لتشكيل مادة أقل ضررًا [23]. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن N-acetylcysteine ​​له نشاط مضاد للأكسدة ويحسن استنفاد GSH في ظل ظروف الإجهاد التأكسدي [24]. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوضيح العلاقة الدقيقة بين ترياق ifosfamide والمسار المنظم في ظل ظروف التسمم الكلوي. يمكننا التكهن بأن تحسين سمية ifosfamide بواسطة mesna أو N-acetylcysteine ​​يمكن أن يتبعه مسارات استجابة أكسدة إجهاد محسنة بوساطة Nrf -2-.

في هذه الدراسة ، تم تنظيم الإشارات المرتبطة بالالتهاب بشكل شائع في كل من الكبد والكلى ، والتي يمكن التعرف عليها من خلال إشارات المرحلة الحادة في تحليل المسار الكنسي. أشارت هذه النتيجة إلى تأثير التفاعل الالتهابي في الفيزيولوجيا المرضية لسمية عضو ifosfamide في كلا الأنسجة ، والتي تم دعمها بشكل أكبر من خلال تحليل المنظم الأولي. في تحليل منظم المنبع ، تم اختيار الجينات المرتبطة بإشارة IRF7 والإنترفيرون (IFN) ، بما في ذلك USP18 و RSAD2 و ISG15 ، كمنظمين شائعين في المنبع في الكبد والكلى. IRF7 هو عامل خاص باللمفوي ، والذي يتم التعبير عنه بشكل أساسي في سيتوبلازم الخلية المناعية ، ويمكن أيضًا تحريضه عن طريق النوع الأول من الإنترفيرون ، والعدوى الفيروسية ، والمحفزات الخارجية في الخلايا المختلفة [25]. أفادت دراسة سابقة عن خصائص مثيرة للجدل مؤيدة أو مضادة للورم لـ IRF7 في خلايا الورم المتنوعة ، وارتبطت التغييرات في تعبير IRF7 بتلف الحمض النووي [26-28].

بالإضافة إلى دوره التنظيمي المهم في النوع I IFN للوظائف المضادة للفيروسات ، تم الإبلاغ عن IRF7 لقمع الاستجابات الالتهابية من خلال مسار إشارات TLR4 [29]. علاوة على ذلك ، Stout-Delgado et al. [30] ذكرت أن الزيادة المؤكسدة الناتجة عن الشيخوخة تضعف نشاط IRF7 ، في حين أن تقليل الإجهاد بواسطة العوامل المضادة للأكسدة أدى إلى تحسين نشاط IRF7. في هذه الدراسة ، قمعت إدارة ifosfamide التعبير عن منظمات المنبع ، وكانت أنماط التعبير متطابقة في كل من الكبد والكلى. قد تتعلق التغييرات الحالية في تعبير IRF7 بالتفاعل الالتهابي وعامل الألكلة السام للخلايا لـ ifosfamide ، مما قد يشير إلى IRF7 كهدف واعد لسمية عضو ifosfamide.

في هذه الدراسة ، وجدنا جينًا مثبطًا بشكل مماثل في كل من الكبد والكلى بعد إعطاء إفوسفاميد ، لكن تفسير أهميته السمية ركز فقط على الكلى ، مما يحد من الاكتشاف الحالي. علاوة على ذلك ، قد تدعم الدراسات التأكيدية الإضافية المتعلقة بتأثير ترياق ifosfamide المتاح تجاريًا على الجين المتغير حاليًا التوصيفات الحالية.

في الختام ، وجد أن دراسة السمية المتكررة (أسبوع واحد) من إعطاء ifosfamide لها سمية كلوية متحيزة بدلاً من سمية كبدية. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم النتائج الحالية دليلًا على السمية الكبدية التي يسببها ifosfamide وآلية السمية الكلوية التي تتضمن تثبيط IRF -7. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات السمية الجينية للأعضاء المرتبطة بالمناعة لتوضيح آلية السموم الجهازية للإيفوسفاميد ، ولدعم العلاقة بين سمية الجينات والأعضاء.

4. المواد والطرق

4.1 دراسة الحيوان

تم الحصول على فئران Sprague-Dawley (SD) الخالية من مسببات الأمراض البالغة من العمر ثمانية أسابيع (ن=140) من شركة Orient Bio Inc. (سيونغنام ، كوريا). تم فحص الحيوانات وتأقلمها مع الظروف البيئية المعملية لمدة أسبوع قبل التجربة. تم إيواء جميع الحيوانات في أقفاص بلاستيكية تحت ظروف معملية خاضعة للرقابة (درجة الحرارة ، 23 ± 3 درجة مئوية ؛ الرطوبة ، 55 ± 10 في المائة ؛ و 12 / {{10} ساعة دورة الضوء / الظلام) مع طعام المختبر والمياه الإعلانية. تمت الموافقة على الدراسة على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في المعهد الكوري لعلم السموم (دايجون ، كوريا) ، وتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقًا لإرشادات الاختبار لتقييم سلامة الأدوية من إدارة الغذاء والدواء الكورية. تم تقسيم الدراسة على الحيوانات إلى ثلاثة أقسام: جرعة واحدة (حادة) وجرعة متكررة (أسبوع و 4 أسابيع) دراسة سمية تعاطي متتالية. تم تقسيم أربعين فأراً عشوائياً إلى أربع مجموعات (مجموعة التحكم ، t1 ، t2 ، و t3) باستخدام نظام المسار / Tox (الإصدار 4.2.2 ، Xybion Medical Systems Corporation ، Lawrenceville ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) في كل دراسة سمية.

4.2 تجربة السمية

تم تقسيم دراسة السمية إلى ثلاثة أقسام: جرعة واحدة (حادة) وجرعتين متكررتين (جرعة متتالية من أسبوع أو 4 أسابيع) دراسات سمية. لكل دراسة سمية ، تم تعيين الفئران بشكل عشوائي لمجموعات مناسبة (المجموعة الضابطة ، والجرعة 1 ، والجرعة 2 ، والجرعة 3 لدراسات السمية الفردية و 4- أسبوعًا ؛ والمراقبة ، والجرعة 1 ، والجرعة 2 من أجل 1- دراسة السمية الأسبوعية) باستخدام نظام Path / Tox (الإصدار 4.2.2 ، Xybion Medical Systems Corporation ، Lawrenceville ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية). في دراسة السمية ، تم إعطاء ifosfamide عبر الطريق داخل الصفاق (IP) ، وتلقت المجموعة الضابطة الماء المقطر (DW). كانت جرعة ifosfamide المستخدمة في دراسة السمية على النحو التالي: دراسة السمية الحادة (12.5 ، 25 ، و 50 ملجم / كجم) ، 1- دراسة سمية أسبوعية (75 و 100 مجم / كجم من وزن الجسم / يوم) ، و {{19 }} دراسة سمية أسبوعية (25 و 50 و 70 ملجم / كجم من وزن الجسم / يوم). تم تسجيل الأعراض السريرية العامة للحيوانات ووزن الجسم ونفوقها يوميًا أثناء الإعطاء ، وتم التضحية بجميع الحيوانات على مدار 24 ساعة بعد آخر إعطاء ifosfamide. تم جمع عينات الدم ووضعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأنابيب EDTA-K2 لتحليل الكيمياء الحيوية في الدم وتحليل الدم على التوالي. تم تثبيت أنسجة الكبد والكلى في الفورمالديهايد واخضاعها للتحليل التشريحي المرضي. تم إجراء كيمياء مناعية إضافية ، وتحليل ميكروأري ، و RT-PCR في الوقت الحقيقي على أنسجة الكبد والكلى من دراسة السمية تحت الحاد (100 مجم / كجم من وزن الجسم / يوم).

4.3 تحليل الدم والكيمياء الحيوية في الدم

تم إجراء اختبارات الدم القياسية باستخدام نظام أمراض الدم ADVIA 120 (باير ، فيرنفالد ، ألمانيا). تم استخدام المؤشرات التالية: عدد خلايا الدم البيضاء (WBC) ، عدد خلايا الدم الحمراء (RBC) ، الهيماتوكريت (HCT) ، تركيز الهيموغلوبين ، متوسط ​​حجم الجسم (MCV) ، متوسط ​​الهيموغلوبين العضلي (MCH) ، عدد الصفائح الدموية (PLT) ، اللمفاويات (LYM) ، وحيدات (MON) ، العدلات (NEU) ، القاعدية (BAS) ، الحمضات (EOS) ، والخلايا غير الملوثة الكبيرة (LUC) ، وعدد الخلايا الشبكية (RET).

تم إجراء اختبار الكيمياء الحيوية باستخدام محلل آلي (TBA 120FRNEO ؛ Toshiba Corp. ، طوكيو ، اليابان) مع مصل طرد مركزي. كانت المؤشرات الكيميائية الحيوية الرئيسية هي ألانين aminotransferase (ALT) ، الأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST) ، الفوسفاتيز القلوي (ALP) ، نيتروجين البول في الدم (BUN) ، الكرياتينين (CREA) ، الجلوكوز (GLU) ، الكوليسترول الكلي (TCHO) ، نسبة الألبومين / الجلوبيولين (A / G) ، الدهون الثلاثية (TG) ، إجمالي البيليروبين (TB) ، جاما جلوتاميل ترانسفيراز (GGT) ، الفوسفوليبيدات (PL) ، الكالسيوم ، الكلوريد ، الصوديوم غير العضوي ، الفوسفور ، والبوتاسيوم.

4.4. فحص الأنسجة المرضية والكيمياء المناعية

تم تقسيم الأنسجة التي تحتوي على البارافين بسمك 5- ميكرومتر ، وملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ، وفحصها مجهريًا.

تعرضت أنسجة الكلى للكيمياء المناعية. تم تحضين المقاطع المنزوعة الكافيين والمغسولة مسبقًا بمصل الماعز بنسبة 10 في المائة لمنع تلطيخ غير محدد. ثم تم تحضين الشرائح طوال الليل باستخدام الجسم المضاد الأساسي المضاد لـ KIM1 (1: 750 ؛ سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد إزالة الأجسام المضادة الأولية ، تمت معالجة الأقسام باستخدام مجموعة VECTASTAIN Elite ABC HRP (Vector Laboratories ، Peterborough ، المملكة المتحدة) ، وتم فحص تعبير KIM1 تحت المجهر الضوئي.

4.5 تحليل ميكروأري وتحليل تفاعل البروتين والبروتين (PPI)

تم تجانس الكبد والكلى من مجموعة الأسبوع 1- (100 مجم / كجم) ، وتم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة RNase الصغيرة (Qiagen). تم تحقيق تخليق (كدنا) باستخدام مجموعة توليف (كدنا) (أفيميتريكس ، أفيميتريكس ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتعرض لتحليلات ميكروأري و PPI.

تم إجراء تحليل ميكروأري باستخدام Affymetrix GeneChip Rat {0}}. 0 باستخدام GeneChip Scanner 3 0 0 0 (Affymetrix Santa Clara ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و تمت معالجة النتائج باستخدام برنامج التحليل GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم اختيار الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) ، والتي تغيرت أكثر من 1. 5- أضعاف بعد إعطاء ifosfamide ، باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار Tukey اللاحق. تم تحليل الوظائف البيولوجية والمسارات القانونية لأدوات DEGs المحددة باستخدام برنامج تحليل مسار الإبداع (IPA ، الإصدار 9.0 ؛ أنظمة الإبداع ، Redwood City ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم إجراء تحليل للمنظم الأولي لتحديد المنظمين الأوليين الذين قد تكون مسؤولة عن DEGs المشتقة من سمية ifosfamide. تم إجراء تحليل إضافي لشبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) لـ DEGs باستخدام برنامج STRING (الإصدار 10) ، وتم تأكيد التفاعل عندما كانت درجة الثقة المتوسطة أعلى من 0.4. تفاعل البروتين هو الاحتمال التقريبي لوجود ارتباط متوقع بين بروتينين في موسوعة كيوتو للجينات ومسار الجينوم.

4.6 دراسة كمية RT-PCR في الوقت الحقيقي

تم تأكيد التعبير عن جينات المنظم الشائعة في دراسة ميكروأري باستخدام RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم الحصول على البادئات الخاصة بالجينات من Bioneer (Daejeon ، كوريا). كانت تسلسلات التمهيدي كما يلي: عامل تنظيم الإنترفيرون 7 (IRF7): الأمام ، 5- TGCTTGTCTAGCACCAATAG -3 والعكس ، 5- CACAAGGTCCACTAGAGATG -3 ؛ يوبيكويتين ببتيداز 18 (USP18): إلى الأمام ، 5- CTGTAGTTTGTCTCCCAACA -3 وعكس 5- GAACTGATTACCTCCCACTG -3 ؛ يحتوي نطاق ميثيونين S-adenosyl الجذري على 2 (RSAD2): الأمام ، 5- ACCAATCATCAGAGGTTGAC -3 والعكس ، 5- CTGCATGATTGTTCTTGGAC -3 ؛ الجين المحفّز للإنترفيرون 15 (ISG15): الأمام ، 5- AAGTCTCCCAAGACCAATTC -3 والعكس ، 5- CTACATTGGCTCTGGATAGG -30.

تم نسخ إجمالي الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) باستخدام SuperScript II (Invitrogen ، Carls bad ، CA ، USA) وبادئات oligo-dT ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحليل مستويات تعبير mRNA للجينات ذات الصلة بالتنظيم المنبع باستخدام نظام StepOnePlus Real-Time PCR (النظم البيولوجية التطبيقية ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع مزيج رئيسي anSYBR Green (Applied Biosystems) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم استخدام 18S الريبوسوم RNA التمهيدي كعنصر تحكم داخلي ، وتم التعبير عن النتائج كتغيير أضعاف بالنسبة لمجموعة التحكم العادية.

4.7 تحليل احصائي

تم تحليل البيانات إحصائيا باستخدام طرق مقارنة متعددة. عندما أظهر اختبار بارتليت عدم وجود انحرافات ذات دلالة إحصائية عن تجانس التباين ، تم استخدام تحليل التباين (ANOVA) لتحديد ما إذا كان أي من وسائل المجموعة يختلف عند مستوى أهمية p <{0}}. 05.="" بالإضافة="" إلى="" ذلك="" ،="" تم="" استخدام="" اختبار="" dunnett="" لتحديد="" الاختلافات="" في="" البيانات="" بين="" مجموعة="" التحكم="" ومجموعات="" العلاج="" عندما="" تم="" العثور="" على="" البيانات="" لتكون="" مهمة="" من="" اختبار="" anova.="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" عندما="" لوحظت="" انحرافات="" كبيرة="" عن="" تجانس="" التباين="" من="" اختبار="" bartlett="" ،="" تم="" إجراء="" اختبار="" مقارنة="" غير="" حدودي="" ،="" اختبار="" kruskal-wallis="" (h)="" ،="" لتحديد="" ما="" إذا="" كان="" أي="" من="" متوسطات="" المجموعة="" يختلف="" عند="" p=""><0.05. عندما="" لوحظ="" اختلاف="" كبير="" في="" اختبار="" kruskal-wallis="" (h)="" ،="" تم="" إجراء="" الاختبار="" الفرعي="" لترتيب="" dunn="" لتحديد="" الأزواج="" المحددة="" لبيانات="" المجموعة="" التي="" كانت="" مختلفة="" بشكل="" كبير="" عن="" المتوسط.="" تم="" إجراء="" اختبار="" فيشر="" الدقيق="" لمقارنة="" أزواج="" من="" البيانات="" (بما="" في="" ذلك="" الانتشار="" والنسبة="" المئوية).="" تم="" تعيين="" مستوى="" الاحتمال="" على="" 1="" أو="" 5="" بالمائة.="" تم="" إجراء="" التحليلات="" الإحصائية="" من="" خلال="" مقارنة="" البيانات="" من="" مجموعات="" العلاج="" المختلفة="" مع="" تلك="" الخاصة="" بالمجموعة="" الضابطة="" باستخدام="" path="" tox="" (الإصدار="" 4.2.2="" ،="" xybion="" medical="" systems="" corporation="" ،="" lawrenceville="" ،="" nj="" ،="" الولايات="" المتحدة="">

بيان توفر البيانات:

البيانات الواردة في المادة أو المواد التكميلية.

تضارب المصالح:

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

مراجع

1 - بالميريني ، إي. سيتولا ، إي. غرينياني ، ج. D'Ambrosio، L.؛ كوماندون ، أ. ريجي ، أ. لونجي ، أ. سيزاري ، م. بايولي ، أ. حكيم ، ر. وآخرون. جرعة عالية من ifosfamide في مرضى الساركوما العظمية عالية الدرجة الانتكاسة وغير القابلة للاستئصال: سلسلة بأثر رجعي. خلايا 2020، 9، 2389. [CrossRef]
2. Klastersky، J. الآثار الجانبية لل ifosfamide. علم الأورام 2003 ، 65 ، 7-10. [CrossRef]
3. Sprangers ، ب. ؛ لابمان ، س. الآلام المتزايدة للإيفوسفاميد. كلين. كلية الكلى 2020 ، 13 ، 500-503. [CrossRef]
4. إلياس ، AD ؛ عياش ، ل. ويلر ، سي ؛ شوارتز ، ج. تبلر ، أنا. ماكولي ، م. مازانيت ، ر. شنيبر ، إل. Frei ، E. ، 3rd ؛ Antman ، KH جرعة عالية من ifosfamide / carboplatin / etoposide مع دعم الخلايا الجذعية المكونة للدم ذاتيًا: السلامة والتوجيهات المستقبلية. سيمين. اونكول. 1994 ، 21 ، 83-85. [PubMed]
5. مولينكوف ، أ. دو بوا ، أ. Meerpohl ، HG دورة تدريبية متسلسلة والإدارة المستقبلية للسمية متعددة الأعضاء التي يسببها ifosfamide. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996 ، 56 ، 525-528. [CrossRef]
6. ألكسا ، ك. ماتسيل ، د. كراوز ، ك. Gelboin ، H. إيتو ، إس. كورين ، ج. سيتوكروم بي 450 3 أ و 2 ب 6 في تطور الكلى: الآثار المترتبة على إفوسفاميد السمية الكلوية. بيدياتر. نفرول. 2005 ، 20 ، 872-885. [CrossRef] [PubMed]
7. لوينبيرج ، د. شوكة ، CF ؛ ديستا ، ز. Flockhart ، DA ؛ التمان ، RB ؛ Klein ، ملخص TE PharmGKB: مسارات Ifosfamide ، الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية. فارماكوجينيت. جينوم. 2014، 24، 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister، SL؛ مارتن بريساك ، ن. لاو ، ف. يانغ ، ك. O'Brien و PJ Acrolein و chloroacetaldehyde: فحص للخلية ومؤشرات السمية الحيوية الخالية من الخلايا. تشيم. بيول. تفاعل. 2013 ، 202 ، 259-266. [CrossRef]
9. Kim، J .؛ شين ، م. نموذج تكاملي للتنبؤ بالسمية التي يسببها العقاقير متعددة الأعضاء باستخدام بيانات التعبير الجيني. BMC Bioinform. 2014 ، 15 ، S2. [CrossRef]
10. الكسندر دان ، ب. بروتينو ، ليرة لبنانية ؛ أورتون ، إي. شارما ، ن. Berindan-Neagoe ، I. ؛ مودوس ، د. بندر ، أ.التطورات في علم الجينوميات: فهم السمية التي يسببها المركب والتنبؤ بها من بيانات التعبير الجيني. مول. Omics 2018 ، 14 ، 218-236. [CrossRef]
11. أن ، ريال ؛ كيم ، جي. Kim، YS بناء نموذج تنبؤي لتقييم سمية أعضاء متعددة. مول. خلية توكسيكول. 2016 ، 12 ، 1-6. [CrossRef]
12- بينوتو ج. ترينتين ، إل. سيمينزاتو ، ج.إيفوسفاميد وسيكلوفوسفاميد: التأثيرات على ترصد المناعة. علم الأورام 2003 ، 65 ، 17-20. [CrossRef]
13. Schwerdt، G.؛ جوردجاني ، ن. بنيسيك ، أ. فرويدنجر ، ر. وولني ، ب. كيرشوف ، أ. Gekle ، M. Chloroacetaldehyde- والموت الناتج عن الأكرولين لخلايا الأنابيب البشرية القريبة. بيدياتر. نفرول. 2006 ، 21 ، 60-67. [CrossRef]
14. Ensergueix، G .؛ البليت ، ن. جولي ، د. ليفي ، سي. شوفيه ، إس. تريفين ، سي ؛ أوغوستو ، جي إف ؛ بودت ، ر. Aboudagga، H.؛ توشارد ، ج. وآخرون. السمية الكلوية Ifosfamide في المرضى البالغين. كلين. كلية الكلى 2020، 13، 660–665. [CrossRef]
15. ديشانت ، كوالالمبور ؛ Brogden ، RN ؛ بيلكنجتون ، تي. فولدز ، د. إفوسفاميد / ميسنا. مراجعة لنشاطها المضاد للأورام ، وخصائص الحرائك الدوائية ، والفعالية العلاجية في السرطان. أدوية 1991 ، 42 ، 428-467. [CrossRef]
16. برونك، LC؛ Schrijvers ، د. Schellens ، JHM ؛ De Bruijn، EA ؛ زراعة ، أ. Locci-Tonelli ، D. ؛ جرولت ، ف. Verweij ، J. ؛ Van Oosterom ، AT Phase I دراسة على docetaxel و ifosfamide في المرضى الذين يعانون من أورام صلبة متقدمة. Br. J. السرطان. 1998 ، 77 ، 153-158. [CrossRef] [PubMed]
17. سكينر ، ر. السمية الكلوية المزمنة في الأطفال. ميد. بيدياتر أونكول. 2003 ، 41 ، 190–197. [CrossRef]
18. شارب ، ص. فيلانو ، شبيبة الفأر المختبر ؛ مطبعة CRC: بوكا راتون ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2012.
19. تشيونغ ، إم سي ؛ جونز ، RL ؛ جودسون ، سمية الكبد الحادة مع إفوسفاميد في علاج الساركوما: تقرير حالة. جيه ميد. ممثل الحالة. 2011، 5، 180. [CrossRef]
20. Cui، Y .؛ Paules، RS استخدام النسخ في فهم آليات السمية التي يسببها الدواء. علم الصيدلة الجيني 2010 ، 11 ، 573-585. [CrossRef]
21. سنوبر ، ل. جاك ، س. مونج ، م. Legallais ، سي ؛ Leclerc ، E. تحليل ترانسكريبتوميك لتأثير ifosfamide على خلايا MDCK المزروعة في رقائق بيولوجية ميكروفلويديك. علم الجينوم 2012 ، 100 ، 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven، HA؛ ميجينز ، إل. أودشورن ، إم جي ؛ دينجيمانسي ، ماساتشوستس ؛ فان أومين ، ب. Van Bladeren ، PJ Glutathione اقتران عقار ifosfamide المثبط للخلايا ودور الجلوتاثيون البشري S-transferase. تشيم. الدقة. توكسيكول. 1995 ، 8 ، 979-986. [CrossRef]
23. جيلاني ر. جهانبخش ، س. كوهان غدر ، HR ؛ ثاكور ، م. خان ، س. الظاهري ، ر. يانغ ، زي. أندريا ، ب. موريس ، ر. أبو السعود ، HM Mesna (2- مركابتوإيثان سلفونات الصوديوم) يعمل كمنظم للميلوبيروكسيداز. راديك مجاني. بيول. ميد. 2017، 110، 54-62. [CrossRef]

24. النهدي ، أ. جون ، أ. Raza، H. N-acetyl cysteine ​​يخفف من الإجهاد التأكسدي واختلال الأكسدة والاختزال المعتمد على الجلوتاثيون الناجم عن ارتفاع الجلوكوز / ارتفاع حمض البالمتيك في خلايا البنكرياس رين -5 F. بلوس وان 2019 ، 14 ، e0226696. [CrossRef]

25. Zhang، L.؛ Pagano، JS IRF -7 ، عامل تنظيمي جديد مضاد للفيروسات مرتبط بوقت استجابة فيروس Epstein-Barr. مول. خلية بيول. 1997 ، 17 ، 5748-5757. [CrossRef]
26. باجانو ، شبيبة الفيروسات والأورام اللمفاوية. إنجل. جيه ميد. 2002 ، 347 ، 78-79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez، R.؛ سوليس ، م. ناردين ، أ. جوباو ، د. بارون بودو ، ف. لين ، ر. ماسي ، ب. سالسيدو ، م. Hiscott، J. أدوار مميزة للعامل التنظيمي IFN (IRF) -3 و IRF -7 في تنشيط الخصائص المضادة للورم في الضامة البشرية. الدقة السرطان. 2006 ، 66 ، 10576-10585. [CrossRef]
28. نينغ ، س. باجانو ، شبيبة ؛ Barber، GN IRF7: التنشيط والتنظيم والتعديل والوظيفة. الجينات المناعية. 2011 ، 12 ، 399-414. [CrossRef]
29. Chen، PG؛ كوان ، YJ ؛ زها ، GM ؛ جياو ، إكس كيو ؛ تشو ، HS ؛ تشانغ ، قبرصي ؛ وانغ ، YY ؛ Li ، HP Swine IRF3 / IRF7 يخفف من الاستجابات الالتهابية من خلال مسار إشارات TLR4. Oncotarget 2017 ، 8 ، 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado، HW؛ يانغ ، العاشر ؛ ووكر ، نحن ؛ القيصر ، BM ؛ Goldstein ، DR Aging يضعف عامل تنظيم IFN 7 التنظيم الأعلى في الخلايا المتغصنة البلازمية أثناء تنشيط TLR9. J. إمونول. الدقة. 2008 ، 181 ، 6747 - 6756. [CrossRef]