عزل مستخلص من الكائنات الحية الدقيقة المتكافئة المرجانية الرخوة Salinispora Arenicola التي تمارس تأثيرات واقية من الخلايا ومضادة للشيخوخة ، الجزء 1

خلاصة: طورت الخلايا نظامًا متكاملاً للغاية مسؤولاً عن استقرار البروتين ، ألا وهو شبكة الانصمام البروتيني (PN). نظرًا لأن فقدان البروتين هو سمة مميزة للشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر ، فمن المحتمل أن يؤدي تنشيط وحدات التغذية بالحقن إلى إطالة الفترة الصحية. نقدم هنا بيانات عن النشاط الحيوي لمستخلص (SA 223- S2BM) تمت تنقيته من سلالة Salinispora arenicola TM 223- S2 التي تم عزلها من المرجان الناعم Scleronephthya lewinsohni ؛ تم جمع هذا المرجان على عمق 65 مترًا من النظام البيئي المتوسطي للبحر الأحمر EAPC (جنوب إيلات ، إسرائيل). خفضت معالجة الخلايا البشرية بوحدات البروتين الساكنة المنشطة من SA 223- S2BM من الحمل التأكسدي ووفرت الحماية ضد الإجهاد التأكسدي والسموم الجيني. علاوة على ذلك ، عزز SA 223- S2BM أنشطة البروتوزوم والليزوزومال كاثيبسين في ذبابة الفاكهة وأظهر تأثيرات وقائية للجلد كما يتضح من التثبيط الفعال للإنزيمات المرتبطة بالشيخوخة والإيلاستاز والتيروزيناز. نقترح أن يشكل مستخلص S2BM SA 223- مصدرًا واعدًا محتملًا لإعطاء الأولوية للجزيئات ذات الخصائص المضادة للشيخوخة.

يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ولديه القدرة على البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.

انقر فوق cistanches herba

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 8613632399501】

الكلمات الدالة: شيخوخة؛ استجابات مضادات الأكسدة الكائنات الحية الدقيقة البحرية؛ شبكة بروتينية Salinispora arenicola

1 المقدمة

تتميز الشيخوخة بانخفاض يعتمد على الوقت في القدرة الوظيفية ومقاومة الإجهاد ، بالإضافة إلى زيادة معدلات الوفيات والمراضة [1]. الشيخوخة ليست مجرد عملية سلبية ، حيث يتم تنظيمها من خلال أحداث الإشارات الجزيئية والخلوية المحفوظة التطورية [2،3]. تتعرض الكائنات الحية باستمرار لتحدي كل من الضغوطات الداخلية (المرتبطة بالتمثيل الغذائي) والخارجية (المشتقة من النظام الغذائي أو البيئي) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى التراكم التدريجي للجزيئات الحيوية التالفة وفي النهاية تعرض التوازن الخلوي للخطر [4،5]. تشارك البروتينات في جميع الوظائف الخلوية المحورية ، وبالتالي ، فإن التوازن البروتيني (التوازنات البروتينية) أمر بالغ الأهمية للوظائف الخلوية والبقاء على قيد الحياة [6].

يتم الحفاظ على سلامة البروتيوم من خلال شبكة الانصمام البروتيني (PN) ، والتي تمتد إلى جميع الأجزاء الفرعية الخلوية ويتم تنظيمها على المستويات الخلوية والأنسجة والعضوية لضمان صحة الكائن وطول العمر [7]. يتطلب استدامة البروتينات من الخلايا تنسيق وتنظيم وظائف التركيب والطي والفرز والنقل والتدهور لجميع البولي ببتيدات [8،9]. يتم تنفيذ هذه الوظائف الخلوية في الغالب من خلال ثلاثة فروع رئيسية مترابطة من PN ، وهي شبكة المرافقات الجزيئية ، و ubiquitin-proteasome- (UPP) ، و autophagy-lysosome- (ALP) مسارات التحلل البروتيني [10،11].

تضمن المرافقات الجزيئية طي البروتين السليم والحفاظ على التوافق ، كما أنها تتعاون أيضًا مع مسارات التحلل [12]. UPP هو الموقع الرئيسي لمراقبة جودة تخليق البروتين ويشارك في إعادة تدوير البروتينات العادية قصيرة العمر والبروتينات غير المطوية أو غير القابلة للإصلاح [6] ، بينما ALP مسؤول عن التعرف على مجاميع البروتين والعضيات التالفة وإزالتها [13]. يعد فقدان الانصمام البروتيني سمة مميزة للشيخوخة [14] ، فضلاً عن كونه عامل خطر رئيسي للعديد من الأمراض البشرية المرتبطة بالعمر ، بما في ذلك السرطان والسكري واضطرابات القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية التنكسية [15]. لذلك ، يعتبر تنشيط التغذية بالحقن نهجًا واعدًا لتأخير ظهور و / أو تقدم الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالشيخوخة [16-18].

يتميز شيخوخة الجلد بالتغيرات الهيكلية والوظيفية (من بين أمور أخرى) في مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مثل الإيلاستين [19]. الإيلاستاز هو الإنزيم المسؤول عن تحلل الإيلاستين ، مما يؤدي إلى ظهور التجاعيد وفقدان المرونة [20]. Tyrosinase هو إنزيم رئيسي في تخليق الميلانين ، وهو المسؤول عن تصبغ (من بين أمور أخرى) جلد الإنسان [21،22]. ومع ذلك ، يرتبط التنشيط المفرط للتيروزيناز بالعديد من الاضطرابات الجلدية ، مثل فرط التصبغ وسرطان الجلد [22 ، 23]. لذلك ، فإن تثبيط الإيلاستاز والتيروزيناز يشكل نهجًا بارزًا ضد شيخوخة الجلد.

المنتجات الطبيعية (NPs) لها تاريخ طويل - موثق جيدًا ، قبل ولادة العلوم والتكنولوجيا الحديثة ، في مختلف الثقافات - في علاج الأمراض البشرية [24-26]. وبالتالي ، يمكن أن تعمل NPs كمواد انطلاق عالية التخصيب وسقالات لتطوير الأدوية ؛ في الواقع ، أكثر من نصف جميع الأدوية إما مشتق من NPs ، أو مشتق من NPs ، أو مستوحى من NPs [27-29]. إن العالم البحري ، الذي يضم أكبر قدر من التنوع البيولوجي ، لم يتم استكشافه إلى حد كبير ، وبالتالي قد يكون أكبر مورد لاكتشاف نقاط طاقة جديدة [30]. من بين الكائنات الحية التي تعيش في البيئات البحرية ، تعد الشعاب المرجانية اللينة مزوديًا واعدًا لمضادات الطاقة النووية النشطة بيولوجيًا ومن المعروف أنها تستضيف العديد من الكائنات الحية الدقيقة المتنوعة [31 ، 32].

بالنظر إلى هذه الحقائق ، نجري حاليًا فحصًا شاملاً عالي الإنتاجية لـ NPs لتحديد الجزيئات النشطة بيولوجيًا التي يمكن أن تؤخر الشيخوخة الخلوية و / أو الشيخوخة في الجسم الحي. في الدراسة المقدمة هنا ، قمنا بفحص مستخلص ميثانولي ، وهو SA 223- S2BM ، من سلالة Salinispora arenicola (S. وفي النهج الموجهة بيولوجيًا في الجسم الحي. S. arenicola TM 223- تم عزل سلالة S2 من الشعاب المرجانية الرخوة Scleronephthya lewinsohni (S. جنوب إيلات ، إسرائيل) على عمق 65 م. يعمل المستخلص الميثاني من SA 223- S2BM على تنشيط آليات الحماية الخلوية في كل من الخلايا البشرية وذباب Drosophila melanogaster (D. melanogaster) ويمارس خصائص وقائية للجلد في المختبر. لذلك ، يمكن أن يكون مستخلص SA 223- S2BM مصدرًا للتعريف المحتمل للجزيئات ذات الخصائص الواقية للخلايا ومقاومة الشيخوخة المحتملة.

2. المواد والأساليب

2.1. أصل 223- مستخلص S2BM وعزله

2.1.1. مجموعة المرجان

تم جمع الشعاب المرجانية الناعمة S. Levinson بواسطة ROV H800 (ECA Robotics) التي يديرها Sam Rothberg R / V من معهد Interuniversity للعلوم البحرية في إيلات (IUI). في الموقع ، تم إجراء التصوير باستخدام كاميرا VS300 ذات الإضاءة المنخفضة بالأبيض والأسود (ECA Robotics) وكاميرا 1CAM Alpha HD (SubC Imaging). تم الحصول على العينات بواسطة ذراع ROV من الشعاب المرجانية المتوسطة في إيلات ، قبالة محطة رصيف النفط (29 درجة 300 47. 0900 شمالًا ، 34 درجة 350 56. 7100 شرقًا) ، على ارتفاع 65 مترًا ، في 7 مارس 2017. يتميز موقع التجميع بانحدار معتدل مع بقع صخرية محاطة بقاع البحر الرملي. عند التجميع ، تم تجميد المادة على الفور عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. تم حفظ عينة قسيمة في 70 بالمائة من الإيثانول لتحديد التصنيف وتم إيداعها في متحف Steinhardt للتاريخ الطبيعي ، جامعة تل أبيب (SMNHTAU _ Co _37500).

2.1.2. عزل السلالة وتحديد الهوية

تم عزل S. arenicola TM 223- S2 من عينة 1 مل من S. Levinson. تم طحن عينة المرجان اللين التي تم جمعها في مياه بحر معقمة وتم تسخينها عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يخفف المعلق الناتج بشكل متسلسل ، ويطلى على وسط أجار عزل انتقائي ، ويحتضن عند 28 درجة مئوية لمدة 6 أسابيع على الأقل. تم عزل سلالة Salinispora ، وتمت تنقية المستعمرة على أجار المرق البحري (MBA) (Difco ، Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وحفظها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول جلسرين بنسبة 10 بالمائة.

2.1.3. التحقيق في علم الوراثة

تم إجراء تحليل النشوء والتطور باستخدام جزء من جين 16S rRNA مضخمًا من الحمض النووي الجيني لـ S. arenicola TM 223- S2. تم عزل الحمض النووي الجيني للسلالة TM 223- S2 باستخدام DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تضخيم جزء الحمض النووي الريبوزي 16S بواسطة PCR باستخدام البادئات 16S F 27 ، AGA GTT TGA TC (AC) TGG CTC AG (Tm: 56.3 درجة مئوية) ، و 16 S R 1492 ، TAC GG (CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( تم: 57.5 درجة مئوية). تم تسلسل الأمبليكون بواسطة تسلسل سانجر وتمت محاذاة التسلسلات مع قاعدة بيانات الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S لمشروع Targeted Loci الخاص بـ NCBI باستخدام MUSCLE. تم فحص المحاذاة يدويًا وإزالة الفجوات. تم استنتاج التاريخ التطوري باستخدام طريقة الاحتمال الأقصى ونموذج Tamura – Nei [33] مع 1000 مكرر. تم الحصول على الشجرة الأولية للبحث التجريبي تلقائيًا عن طريق تطبيق خوارزميات ربط الجوار وخوارزميات BioNJ على مصفوفة من المسافات الزوجية المقدرة باستخدام نهج الاحتمالية القصوى للمركب (MCL) ثم اختيار الهيكل ذي قيمة احتمالية تسجيل متفوقة. أجريت التحليلات التطورية في MEGA X الإصدار 10.1.7 [34].

2.1.4. شروط الزراعة

S. arenicola TM 223- تم حفظ جراثيم S2 عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في 10 بالمائة من الجلسرين. قبل الزراعة ، تم إحياء السلالة لمدة 15 يومًا على طبق بتري 15 سم يحتوي على MB (Difco ، Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مكملًا بنسبة 2 بالمائة Agar (Difco ، Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم سكب ماء البحر المعقم (4 × 10 مل) على سطح اللوحة ، وتم استرداد الجراثيم والأفطورة من اللوحة عن طريق الخدش اللطيف للسطح بمشرط لتكوين اللقاح. تم إجراء تخمير الحالة السائلة (LSF) في دورق مخروطي سعة 2 لتر لمدة 20 يومًا عند 28 درجة مئوية و 130 دورة في الدقيقة. تمت إضافة راتنج Amberlite XAD16 (30 جم / لتر) (Amberlite XAD16HP N ، Certis ، Lenntech ، Delfgauw ، هولندا) قبل التعقيم للسماح بحبس المستقلبات الميكروبية في الموقع. تم استخدام خمسة مليلتر من اللقاح لتلقيح 1 لتر على ميجابايت تحتوي على 30 جم من راتنج أمبرلايت XAD16. تم إجراء تخمير Agar-state المقترن باستخراج الطور الصلب (SPE) [35] على وسيط MB (Difco ، Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مكملًا بنسبة 2 في المائة من Agar (Difco ، Thermo Fisher Scientific Inc. والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) أكثر من 20 يومًا عند 28 درجة مئوية. تم تعقيم Amberlite XAD16 (35 جم) ممزوجًا بـ 35 مل من اللقاح بشكل متجانس على سطح صفيحة بتري أجار 1 ميجابايت (25 سم × 25 سم).

بالنسبة لـ LSF ، تم فصل راتينج XAD16 من ثقافة المرق عن طريق الترشيح وغسله بالماء قبل التصفية التتابعية باستخدام أسيتات الإيثيل (100 مل) ثم باستخدام الميثانول (100 مل). تم تركيز الواتس على التجفيف في وسط مفرغ وتم إذابته في DMSO بتركيز 10 مجم / مل. تم استخدام المستخلص الناتج ، SA 223- S2LAE (المستخلص باستخدام أسيتات الإيثيل) ، في التقييمات البيولوجية.

بالنسبة لـ SPE ، تم استرداد راتينج XAD16 عن طريق خدش سطح لوحة أجار بعناية. تم غسل الراتنج المستعاد بالماء للتخلص من الكتلة الحيوية قبل التصفية التتابعية باستخدام أسيتات الإيثيل (100 مل) ثم بالميثانول (100 مل). تم تركيز الواتس على التجفيف في وسط مفرغ وتم إذابته في DMSO بتركيز 10 مجم / مل. تم استخدام المستخلصات الناتجة ، SA 223- S2BAE (المستخرجة باستخدام أسيتات الإيثيل) و SA 223- S2BM (المستخرجة باستخدام الميثانول) ، في التقييمات البيولوجية.

2.2. الأنشطة المثبطة للإيلاستاز والتيروزيناز

تم تقييم النشاط المثبط للإيلاستاز للمستخلص ذي الأولوية باستخدام الإيلاستاز من البنكرياس الخنازير (PPE) من النوع الرابع (Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا) والركيزة N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Merck KGaA ، Darmstadt ، ألمانيا) ، كما سبق وصفه [36]. تم تحديد قدرة المستخلص على تثبيط العمل التحفيزي للتيروزيناز في أكسدة L-DOPA إلى الدوباكروم ، كما ورد سابقًا [37].

2.3 خطوط الخلايا ، وظروف ثقافة الخلية ، ومقايسة جدوى الخلية

تم شراء الخلايا الليفية للقلفة البشرية (خلايا BJ) من مجموعة زراعة الأنسجة الأمريكية (ATCC) ، في حين تم الحصول على الخلايا الكيراتينية البشرية الخالدة (خلايا HaCaT) من Elabscience، Inc. Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مكملًا بنسبة 10 في المائة (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و 1 في المائة (ت / ت) أحماض أمينية غير أساسية وتم الحفاظ عليها في ظروف 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، 95 في المائة الرطوبة و 37 درجة مئوية. في جميع الإجراءات التجريبية المطبقة ، تمت زراعة الخلايا باستخدام محلول التربسين / EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقدير تأثير SA 223- مستخلص S2BM على صلاحية الخلية باستخدام مقايسة MTT ، كما ورد سابقًا [38]. تم إجراء معالجة الخلية باستخدام بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) ودوكسوروبيسين (DXR) كما هو موضح في أساطير الشكل ؛ تم الحصول على H2O2 و DXR من Merck KGaA (دارمشتات ، ألمانيا).

2.4 خطوط ذبابة الفاكهة ومقايسة طول العمر

في هذه الدراسة ، استخدمنا سلالة ذبابة الفاكهة W1118 المشتراة من Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington ، IN ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية و 60 في المائة من الرطوبة على ضوء 12 ساعة: 12 ساعة دورة مظلمة. في جميع التجارب المقدمة ، تم تحليل الأنسجة الجسدية فقط (الرأس والصدر) للذباب ، حيث أن الأنسجة التناسلية تظهر تنظيمًا متميزًا لآليات البروتيوستات ومعدلات الشيخوخة مقارنة بالأنسجة الجسدية [39].

تم تقييم طول عمر الذباب كما هو موضح سابقًا [4 0] باستخدام ذباب إناث وذكور (عدد متساوٍ لكل جنس) تم تربيته في قوارير تحتوي (أو لا) على المستخلص المدروس. تم نقل الذباب إلى قوارير تحتوي على طعام طازج كل يومين وتم تسجيل الوفيات يوميًا. بالنسبة لمنحنيات البقاء والتحليل الإحصائي ، تم استخدام إجراء Kaplan-Meier واختبار رتبة السجل (Mantel-Cox) ؛ تم قبول الأهمية عند p <0.05.

2.5 قياس أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)

تم تحضين أنسجة الخلايا أو الذباب بصبغة CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) بتركيز 1 0 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في الظلام (37 درجة مئوية و 25 درجة مئوية على التوالي). بعد إزالة الصبغة ، تم تحضين الخلايا أو أنسجة الذباب باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في الظلام (37 درجة مئوية و 25 درجة مئوية ، على التوالي) ، وتم تحللها في محلول تحلل [150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 في المائة (ت / ت) NP {{ 11}} ، 50 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.0] ، ثم طرد مركزيًا عند 14 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة (4 درجات مئوية). بعد ذلك ، تم قياس محتوى البروتين بمقايسة برادفورد (Bio-Rad Laboratories ، Inc. ، Hercules ، CA ، USA) ، وتم قياس التألق الناتج في قارئ الصفيحة الدقيقة متعدد الأوضاع Spark® (Tecan Trading AG ، Männedorf ، سويسرا) عند الإثارة وأطوال موجات الانبعاث 490 و 540 نانومتر على التوالي. تم استخدام بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) كعنصر تحكم إيجابي ، حيث من المعروف على نطاق واسع أنه يسبب ضررًا / إجهادًا تأكسديًا [41].

2.6. استخراج الحمض النووي الريبي ، وتوليف (كدنا) ، والتحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR (Q-RT-PCR)

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام RNAiso plus (Takara Bio Inc. ، Shiga ، اليابان) وتم قياسه باستخدام مقياس الطيف الضوئي BioSpec-nano (Shimadzu Inc. ، كيوتو ، اليابان). بعد ذلك ، تم تحويل 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) باستخدام FastGene Scriptase II cDNA Kit (NIPPON Genetics ، Düren ، ألمانيا). لإجراء التحليلات الكمية في الوقت الحقيقي PCR ، تم استخدام 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne ، Tartu ، إستونيا) ونظام PikoReal TM Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم وصف المواد الأولية المحددة للجينات البشرية التي تمت دراستها على النحو الموصوف من قبل [42]. تم استخدام جين HMBS كعامل تطبيع.

2.7. تحليل التجلط المناعي وقياس نشاط البروتيازوم والكاثيبسين

أجريت دراسات التجلط المناعي على النحو الموصوف سابقًا [43]. تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالبيروكسيديز الأولي والفجل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وتم تطوير الكتل المناعية باستخدام مجموعة كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ClarityTM Western ECL Substrate ، Bio-Rad Laboratories ، Inc. ، Hercules ، CA ، USA). تم إجراء تقدير الكميات المناعية عن طريق مسح قياس الكثافة وبرنامج ImageJ [44].

تم قياس الأنشطة الأنزيمية البروتيازوم والكاثيبسين في الخلايا أو أنسجة الذباب في نظام VersaFluor ™ Fluorometer (Bio-Rad Laboratories ، Inc. ، Hercules ، CA ، USA) باستخدام Suc-LLVY-AMC (نشاط يشبه الكيموتريبسين ، CT-L) و Z-FR-AMC fluoropeptides (Enzo Life Sciences ، Inc. ، Farmingdale ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، على التوالي ، كما هو موضح سابقًا [42،45،46]. تم استخدام 6- bromoindirubin -30 - oxime (6BIO) كعنصر تحكم إيجابي ، حيث يُعرف بتنشيط UPP في كل من الخلايا البشرية وذباب الدروسوفيلا [42،47] ؛ تم استخدام عقار Rapamycin كعنصر تحكم إيجابي لتحريض ALP والكاثيبسين [48].

2.8 الأجسام المضادة المستخدمة

الأجسام المضادة الأولية ضد 5 (sc -55009) الوحدة الفرعية البروتيازوم ، NQO1 (sc -16464) ، Beclin 1 (BECN1) (sc -11427) ، Clusterin (CLU) (sc {{7} }) ، HSP27 (sc -13132) ، HSP70 (sc -59570) ، و GAPDH (sc -25778) ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية المقترنة ببيروكسيداز الفجل ، تم شراؤها من سانتا كروز Biotechnology، Inc. (دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على الأجسام المضادة الأولية ضد 53BP1 (4937) و phospho-Histone H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) و phosphor-p53Ser15 (9286) من Cell Signaling Technology ، Inc. (Danvers ، MA ، USA). تم شراء الجسم المضاد ضد SQSTM1 / p62 (BML-PW9860) من Enzo Life Science ، Inc. (Farmingdale ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.9 تحاليل احصائية

تم إجراء التجارب على الأقل في التكرارات. تم استخدام MS Excel للتحليلات الإحصائية. تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار الطالب (اختبار t). تتوافق نقاط البيانات مع متوسط ​​التجارب المستقلة وتشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (SD) ؛ الأهمية عند p <0. 0 5 أو p <0.01 يشار إليها في الرسوم البيانية بعلامة نجمية أو اثنتين على التوالي.

3. النتائج

3.1. تحديد الفطر الشعاعي المرتبط بـ Soft Coral S. Levinson

تم عزل السلالة الميكروبية المستهدفة من سلالة S. Levinson المرجانية اللينة المتوطنة في البحر الأحمر. توجد مستعمرات هذا المرجان عادةً في المواقع العميقة ، في كل من النظم البيئية للشعاب المرجانية متوسطة الحجم (30-60 مترًا) وفي النظم البيئية للشعاب المرجانية متوسطة الحجم (60-105 مترًا) [49]. علاوة على ذلك ، فهو عبارة عن شعاب مرجانية ناعمة من azooxanthellate تحصل على متطلباتها النشطة من خلال التغذية بالترشيح ، وبالتالي فهي توجد في الموائل المعرضة لتيارات مائية قوية.

من تحليل النشوء والتطور على أساس تسلسل الرنا الريباسي 16S ، وجد أن عزل TM 223- S2 ينتمي إلى جنس Salinispora (الشكل 1).

نظرًا لأنه يمكن تمييز S. arenicola عن S. تمت زراعة السلالة كما ورد في قسم المواد والطرق وتم استخلاصها على التوالي بواسطة أسيتات الإيثيل والميثانول. أشار التحقيق البيولوجي الأولي إلى أن المستخلص من المزرعة السائلة ، SA 223- S2BAE ، ومستخلص أسيتات الإيثيل من المزرعة الصلبة ، SA 223- S2LAE ، كانا خاليين من أي نشاط بيولوجي مهم (الشكل S1). لذلك ، تم استخدام المستخلص الميثانولي فقط من المزرعة الصلبة المرتبطة باستخلاص المرحلة الصلبة ، SA 223- S2BM ، في هذه الدراسة.

3.2 لا يُظهر استخراج SA 223- S2BM أي سمية في الخلايا البشرية وينشط المكونات الأساسية لـ PN

أولاً ، قمنا بفحص تأثير SA 223- S2BM على قابلية بقاء الخلايا الليفية BJ للجلد الطبيعي والخلايا الكيراتينية HaCaT التي خلدها الإنسان عن طريق إجراء اختبار السمية MTT. لهذا الغرض ، تم تحضين الخلايا لمدة 24 ساعة بتركيزات متزايدة من المستخلص ، وكما هو مبين في الشكل 2 أ 1 ، أ 2 ، فإن المستخلص لا يمارس تأثيرًا سامًا للخلايا على أي من خطي الخلايا اللذين تم فحصهما بتركيزات تصل إلى 10 ميكروغرام / مل ؛ بتركيزات أعلى (أعلى من 10 ميكروغرام / مل) ، يقلل المستخلص من قابلية بقاء الخلية في الغالب في خلايا HaCaT.

ثم درسنا تأثير المستخلص على المسارات الخلوية ، والتي تضمن استقرار البروتين في الخلية. لاحظنا أن التعرض قصير المدى (24 ساعة) للخلاصة الليفية BJ إلى المستخلص المدروس أدى بشكل كبير إلى التعبير عن جين البروتوزوم PSMB7 (بتركيز 10 ميكروغرام / مل) ، بينما كان بالتوازي يميل إلى زيادة التعبير عن الجين. جين PSMB6 بنفس التركيز (الشكل 2B1). بالإضافة إلى ذلك ، تسبب المستخلص في التعبير عن الجين البروتيني 20S ، PSMB6 ، والجين البروتيني 19S ، RPN11 بتركيز 1 ميكروغرام / مل في خلايا HaCaT (الشكل 2B2). علاوة على ذلك ، أدى علاج الخلايا الليفية BJ بالمستخلص لمدة 24 ساعة إلى تحريض خفيف لمستويات التعبير للوحدة الفرعية البروتيازوم 20S 5 بتركيز 1 ميكروغرام / مل (الشكل 2C). دعماً للنتائج التي توصلنا إليها ، أدى التعرض للمستخلص إلى زيادة نشاط البروتياز الشبيه بالكيموتريبسين بشكل كبير في كل من الخلايا الليفية BJ والخلايا الكيراتينية HaCaT بعد حضانة 24 ساعة (الشكل 2D1 ، D2) ؛ يمكن أن تعزى النتائج المختلفة لتركيزات المستخلص التي تم فحصها بين خلايا BJ و HaCaT إلى التأثيرات الخاصة بنوع الخلية.

بالإضافة إلى ذلك ، كشفت تحليلات التعبير Q-RT-PCR أن علاج الخلايا الليفية BJ بالمستخلص لمدة 24 ساعة تسبب في مستويات التعبير عن الجينات المرتبطة بـ ALP ، المسماة CTSB و CTSL و CTSD و SQSTM1 ، بتركيز 10 ميكروغرام / مل ( الشكل 3 أ 1). علاوة على ذلك ، لاحظنا أن تعرض خلايا HaCaT للمستخلص لمدة 24 ساعة أدى إلى تحريض مستويات التعبير عن الجينات المشاركة في وظيفة ALP (CTSB و CTSL و CTSD و SQSTM1) (الشكل 3A2).

تمشيا مع هذه النتائج ، لاحظنا تنظيم البروتينات المرتبطة بالتهام الذاتي BECN1 و SQSTM1 / p62 بعد تعرض الخلايا الليفية BJ للمستخلص بتركيز 1 ميكروغرام / مل (الشكل 3B1) ؛ لوحظ أيضًا زيادة مستويات التعبير عن البروتينات BECN1 و SQSTM1 / p62 في الخلايا الكيراتينية HaCaT بتركيزات مدروسة (الشكل 3B2). وفقًا لذلك ، وجدنا أن المستخلص عزز النشاط الأنزيمي للكاثيبسين الليزوزومي في كل من خلايا BJ و HaCaT (الشكل 3C1 ، C2) ؛ مرة أخرى ، يمكن أن تُعزى النتائج المختلفة للتركيزات التي تم فحصها للمستخلص بين خلايا BJ و HaCaT إلى التأثيرات الخاصة بنوع الخلية.

علاوة على ذلك ، قمنا بفحص تأثير المستخلص على مستويات التعبير الجزيئي الرئيسية للمرافقين. وهكذا ، كشفت تحليلات التكتل المناعي أن المستخلص تسبب في مستويات التعبير عن المرافقات الجزيئية CLU (في كل من التركيزات المدروسة) في خلايا BJ (الشكل 3 D1) ، وكذلك HSP27 (1 ميكروغرام / مل) و HSP70 (في كل من التركيزات المدروسة) في خلايا HaCaT (الشكل 3 D2).

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 8613632399501】