يقوم مثبط JAK بحظر إشارات JAK-STAT-APOL1 الناجمة عن فيروس كورونا في الخلايا الكبيبية واعتلال الخلايا في عضويات الكلى البشرية Ⅱ

نتائجنا تغير النموذج الحالي الناجم عن الإنترفيروناعتلال الكلية APOL1-. عدة أمثلة فيالتي تسببت فيها حالات الإنترفيرون المرتفعة في انهيار اعتلال الكبيبات لدى حاملي المخاطر العاليةأبوول1الطراز العرقىأدى إلى نموذج يمنح الإنترفيرونات امتيازًا باعتبارها المحفزات الرئيسية الثانية لـ APOL1-اعتلال الكبيبات (31، 36، 37). وقد تم تعزيز هذا النموذج بشكل أكبر من خلال حقيقة أن الإنترفيرون ألفا وبيتا،وغاما المستحثةأبوول1التعبير في الخلايا الرجلية وخطوط الخلايا البطانية (22). لكن،يتم تحدي هذا النموذج الأصلي من خلال ملاحظة أن الإنترفيرون لا يرتفع دائمًا في مصل الدمالمرضى الذين يعانونعدوى فيروس كورونا-19.وCOVAN، في حين أن السيتوكينات الأخرى بما في ذلك IL-6، IL-1 و إلينوي-18يتم زيادة (4، 17، 18). في الدراسة الحالية، أثبتنا أنه حتى في غياب الإنترفيرون،هذه السيتوكينات غير الإنترفيرون قوية بشكل فردي وجماعيأبوول1التعبير في الإنسانpodosis وGECs مع تسليط الضوء أيضًا على التآزر الذي لم يتم تقديره سابقًا. بالتظاهرتشير نتائجنا إلى أن إشارات JAK-STAT هي الوسيط المركزي لهذه التأثيرات السيتوكينية المدمجةتفسير معقول لكيفية تحرك عاصفة السيتوكينات الخاصة بفيروس كورونا-19.أبوول1التعبير وارتفاعحدوث اعتلال كبيبات الكلى المنهار في المرضى الذين يعانون من متغيرات المخاطرأبوول1وكوفيد-19عدوى. هذه النتائج قد يكون لها آثار على الآخرينAPOL1-اعتلال الكلية. 

لمزيد من المعلومات يرجى الاتصال بنا على:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

هاتف/واتساب: +86 15292862950

بينما تظهر نتائجنا ذلكالسيتوكينات التي يسببها فيروس كورونا-19-.كافية للتحريضأبوول1تعبيروالتسبب في فقدانالخلايا الرجلية العضوية الدقيقة في الكلى، فهي لا تستبعد احتمال أن تكون حالات SAR-قد يصيب فيروس CoV-2 أيضًا خلايا الكلى بشكل مباشر كما تم الإبلاغ عنه مؤخرًا (38، 39). ومع ذلك، SARs-CoV-2في أنسجة الكلى البشرية لم يتم إثبات ذلك إلا في عينات التشريح التي حدث فيها الارتباكلا يمكن استبعاد مساهمة التحلل الذاتي للأنسجة (3، 4، 15، 16). معظم التقارير من خزعات الكلىمن المرضى الذين يعانون من COVAN فشلوا في اكتشاف فيروس SARs-CoV-2 على الرغم من استخدام طرق حساسة (3، 4)،بما في ذلك حالتين من الحالات التسع في الدراسة الحالية والتي تم اختبارها بواسطة الكيمياء المناعية وفيالتهجين الموضعي.

من خلال إظهار اعتلال الخلايا الناجم عن السيتوكينات، انحرف نموذجنا العضوي الدقيق للكلية عننشرت مؤخراعضوي الكلىنموذج لمرض الكلى APOL1-الذي وضعه ليو وآخرونتم إنشاء عضويات كلوية من iPSCs المحررة بتقنية CRISPR لمتبرع غير أفريقي حيث G0أبوول1تم تحرير الأليلات إلى أليلات G1 ولكن على الخلفية الجينية G0. بينما الإنترفيرون الناجم عن غاماأبوول1التعبير في عضوياتهم، فإنه لم يسبب السمية الخلوية (40). عدم وجود السمية الخلوية فيهاعضوي الكلىيمكن أن يفسر النموذج الخلفية الجينية الأقل سمية التي تعتمد عليها طفرات G1تم فرضه. ومن المعروف أن السمية الخلوية لأبوول1يتأثر النمط الفرداني بالوراثةالخلفية (41). الالكلى العضوية الدقيقةفي هذه الدراسة تم إنشاؤها من iPSCs غير المحررةحامل أمريكي من أصل أفريقي من النمط الجيني G1G2. قد يكون الحفاظ على النمط الفرداني الجيني الأصليساهمت في السمية الخلوية المرتبطة بـ APOL1-والتي شوهدت في موقعناالكائنات العضوية الدقيقة في الكلى. 

علاوة على ذلك، على النقيض من تعبير بروتين APOL1 المنتظم الذي نورده هنا، دراسة حديثةلم تجد فرقا فيأبوول1مستوى mRNA في خزعة الكلى لمريض واحد مصاب بـ COVAN مقارنة بـالضوابط الصحية (26). يمكن تفسير هذا الخلاف في نتائجنا بالطبيعة العابرة لـأبوول1mRNA نسبة إلى البروتين، خاصة عندما يتم الحصول على الخزعات بعد عدة أسابيع من الفحص الأوليتشخيص عدوى فيروس كورونا-19 عندما تسبب التأثيرات الحادة لفيروس كورونا-19-عاصفة السيتوكين وربما تبددت ملف تعريف تعبير mRNA المقابل. ومن المتصور أن يكون أبعدمن عاصفة السيتوكينات التي يسببها فيروس كورونا، كلما كانت متفاعلات المرحلة الحادة أضعف في اتجاه مجرى النهرتصبح مستقبلات السيتوكينات، بما في ذلك بروتينات STAT المفسفرة وأبوول1مرنا. نتائجناتشير إلى أن بروتين APOL1 المستحث يستمر بعد ذلكأبوول1مرنا وSTATs الفسفرة.

هذه الدراسة لها ثلاثة آثار سريرية رئيسية. أولاً، يؤكدون على الحاجة إلى النمط الجيني Black أوتبين أن الأفراد من أصل إسباني يعانون من اعتلال الكبيبات المنهار في سياق الإصابة بفيروس كورونا النشط أو الحديث-19عدوى. ومع ذلك، إذاخزعة الكلىليس ممكنا أو ممكنا،أبوول1التنميط الجيني للأسود أومن المحتمل أيضًا أن يكون الأفراد المصابون بفيروس كورونا من أصل إسباني-19-مع بيلة بروتينية جديدة أو متفاقمة والتهاب المفاصل الروماتويديارتفاع العائد. ثانيًا، لأن العديد من السيتوكينات التي يسببها فيروس كورونا تعمل على تنشيط JAK-STAT بشكل متكررطريق للتحريضأبوول1التعبير، استراتيجية علاجية تعتمد على الإزالة الانتقائية أومن غير المرجح أن يكون تثبيط أي سيتوكين واحد فعالاً في الوقاية من COVAN أو علاجه. حالياً،لا يُسمح باستخدام البارسيتينيب إلا بموجب تصريح استخدام طارئ لعلاج فيروس كورونا (COVID)-19تتطلب الأكسجين الإضافي. ولذلك، فإن إمكاناته كعلاج لمرض COVAN تتطلب جديةالنظر، وخاصة بالنسبة لحاملي السود واللاتينيين المعرضين للخطرأبوول1الأنماط الجينية الذين لديهمعدوى فيروس كورونا-19. وأخيرًا، بناءً على الأدلة التي تشير إلى أن نقص الإنترفيرون يرتبط بالإصابة الشديدةبعدوى فيروس كورونا-19، تم اقتراح إعطاء الإنترفيرون كعلاج لفيروس كورونا-19. في الوقت كتابة هذه السطور، وفقًا لموقع ClinicalTrials.gov، هناك ستة وثلاثون تجربة سريرية للإنترفيرون كعلاج فيفيروس كورونا-19 إما مستمر أو مكتمل. وعلى النقيض من الأساس المنطقي وراء هذه التجارب السريرية، لديناتحذر النتائج من استخدام الإنترفيرون كعلاج لعدوى فيروس كورونا-19 لدى حاملي فيروس كورونامخاطرة عاليةأبوول1النمط الجيني لأن الإنترفيرون يمكن أن ينظم التعبير عن مسببات الأمراضأبوول1فيالالكلى ويعجل COVAN. 

دراسة لديها بعض القيود. سلسلة حالات COVAN الخاصة بنا المكونة من تسع خزعات أثبتت انهيارهاحالات اعتلال الكبيبات هي عينة صغيرة الحجم نسبيًا وربما تكون قد قللت من تقدير الارتباطبين النمط الوراثي عالي الخطورة و COVAN أو تعرض لتحيز أخذ العينات. التحدي اللوجستي لإن الحصول على خزعات الكلى من المرضى المصابين بعدوى فيروس كورونا-19 النشطة في أماكن الرعاية الحادة يحد منتردد الخزعات الكلىفي هذه الفئة من السكان. من المحتمل أن يكون العامل نفسه مسؤولاً عن حقيقة ذلكتم إجراء معظم الخزعات في هذه الدراسة بعد عدة أسابيع إلى أشهر من التشخيص الأولي للمرضعدوى فيروس كورونا-19. قد يوفر تحليل خزعات الكلى التي تم الحصول عليها بالقرب من المسبب المعديرؤى إضافية في الأنماط الخلوية المبكرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الدراسة الحالية لا تحدد منومتى يتم علاج COVAN بمثبطات JAK. الإجابات على هذه الأسئلة وتحديدستكون فعالية تثبيط JAK كعلاج لـ COVAN محور التحقيقات المستقبلية.يسلط هذا العمل الضوء على الارتباط عالي المخاطرأبوول1التركيب الوراثي ودور JAK-STAT-APOL1الإشارة في تطوير COVAN. مع تطور فهمنا لوباء فيروس كورونا-19،هناك حاجة ملحة لزيادة وعي الأطباء والصحة العامة حول مضاعفات الكلىمن فيروس كورونا -19. هناك أيضًا حاجة ملحة لعلاج COVAN. تقدم دراستنا بيانات جديدة عن JAKالمثبطات كمرشحات علاجية قوية لـ COVAN المرتبطة بـ APOL1-.

طُرق

الأجسام المضادة والكواشف.

تم استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتينات التالية: أرنب APOL1معادية للإنسان [Genentech, 3.1C1&3.7D6; لطخة غربية [WB] 1:5000 (التركيز النهائي 0.05 ميكروغرام/مل)؛Genentech، 5.17D12 [IHC] 1:4000 (التركيز النهائي 0.95 ميكروغرام/مل) وفقًا للتقرير الأخير (42)]؛APOL1 الفأر المضاد للإنسان [Genentech، 4.17A5؛ التألق المناعي [IF] 1:2000 (التركيز النهائي2.13 ميكروغرام/مل)]؛ GAPDH الفأر المضاد للإنسان (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، sc47724؛ WB 1:200)؛ فينكولينفأر مضاد للإنسان (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); NEPH1 الفأر المضاد للإنسان (سانتا كروزالتكنولوجيا الحيوية، sc373787؛ وب 1:300)؛ أرنب WT1 مضاد للإنسان (Abcam، ab89901؛ WB 1: 1000)؛ STAT1الفأر المضاد للإنسان (تقنية تشوير الخلايا [CST]، 9176s؛ WB 1:1000)؛ STAT2 أرنب مضاد للإنسان(CST، 72604: WB 1:1000)؛ STAT3 فأر مضاد للإنسان (CST، 9139؛ WB 1:1000)؛ فسفرةSTAT1 (Y701) أرنب مضاد للإنسان (CST، 9167؛ WB 1:1000)؛ فسفرة-STAT2 (Y690) أرنب مضادبشري (CST, 88410; WB 1:1000); فسفرة-STAT3 (Y705) أرنب مضاد للإنسان (CST، 9145؛ WB)1:2000)؛ PODXL ماعز مضاد للإنسان (R&D, AF1658; IF 1:500)، أرنب E-Cadherin مضاد للإنسان (خليةالتشوير، 3195S؛ IF 1:200)، NEPH1 فأر مضاد للإنسان (سانتا كروز، sc-373787؛ IF 1:100). ثانويتضمنت الأجسام المضادة IgG المضادة للأرنب والماعز والأجسام المضادة المرتبطة بـ HRP (CST، 7074s؛ WB 1: 1000)؛ مكافحة الحصانالفأر IgG، الجسم المضاد المرتبط بـ HRP (CST، 7076s؛ WB 1:1000)؛ Alexa Fluor 488 مضاد للحمار المترافقالفأر (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000)، Alexa Fluor 594 مضاد الحمير المترافقالماعز (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000)، والحمار المقترن Alexa Fluor 405مضاد للأرنب (Thermo Scientific، A48258؛ 1:000). بالنسبة لـ qRT-PCR، فحوصات التعبير الجيني TaqManوشملت APOL1 (Hs 01066280_ m1)، GAPDH (Hs 03929097_ g1)، وPECAM -1 (Hs 00169777_ m1).تلوين الكيمياء المناعية للكلى لـ APOL1 وsynaptopodin وCD31. بدءا من الفورمالين ثابتشرائح خزعة الكلى المضمنة بالبرافين، وتم إجراء استرجاع المستضد باستخدام (محلول EDTA عند الرقم الهيدروجيني 8.0)لمدة 56 دقيقة عند 100 درجة. الأجسام المضادة الأولية لـ APOL1 (5.17D12، جينينتيك)، سيناتوبودين (بروجينتم تطبيق Biotechnik، 61094)، وCD31 (إشارات الخلية، 3528s) عند 1:4000 (التركيز النهائي 0.95).ميكروغرام/مل)، 1:100 و1:1600، على التوالي لمدة 60 دقيقة عند 36 درجة. جاهز للاستخدام HQ مترافقتم تحضين المتعددات الثانوية المضادة للأرنب (760-4815) لمدة 12 دقيقة عند 36 درجة. وقد تبع ذلكعن طريق إضافة HRP المضاد لـ HQ لمدة 12 دقيقة. تم تحضين DAB (760-159) لمدة 5 دقائق في الغرفةدرجة حرارة. تمت مقاومة قسم الأنسجة بالهيماتوكسيلين (760-2021) لمدة 4 دقائق عند درجة حرارة الغرفة.تمت إضافة كاشف الصبغة الزرقاء (760-2037) لمدة 4 دقائق عند درجة حرارة الغرفة.

علاج السيتوكين للخلايا المزروعة.

الخلايا البطانية الكبيبية البشرية الأولية، الخلايا الرجلية الأوليةتمت زراعة فرعية من كلية مانحة بشرية، وتم علاج الخلايا المشتقة من الأعضاء بـ 50 نانوغرام/مل،تركيز 20 نانوجرام/مل، أو 10 نانوجرام/مل من السيتوكينات التالية: Recombinant Human CXCL9(بيوليجيند، 578102)؛ المؤتلف الإنسان CXCL10 (Biolegend، 573502)؛ الإنسان المؤتلفCXCL13 (بيوليجيند، 573502)؛ إيل-1 (بيبروتك، 200-01ب)؛ إيل -15 (بيبروتك، 200-15)؛ إيل-18(بيوليجيند، 592102)؛ إيل -8 (بيوليجيند، 574202)؛ إنترفيرون (IFN) ألفا 1 (سيجما ألدريتش، SRP4596)؛ الإنترفيرونبيتا (Peprotech، 300-02BC)؛ غاما الإنترفيرون (سيجما الدريخ، I17001)؛ إيل -6 (بيبروتك، 200-06)؛ TNF ألفا(بيبروتك، 300-01أ)؛ MCP -1 (CCL2) (Peprotech، 300-04)؛ MIP-1alpha (CCL3) (Peprotech، 300-08)؛إيل-10 (بيبروتك، 200-10)؛ إيل -7 (بيبروتيك، 200-07)؛ إيل -2 (بيبروتك، 200-02)؛ G-CSF (بيبروتك، 300-23). تم تحديد تركيز السيتوكين الموحد بمقدار 50 نانوجرام/مل مسبقًا بناءً على سابقة منتعمل علاجات الخلايا البشرية على تقييم متلازمات صدمة السيتوكين في عدوى فيروس كورونا-19 (17). متابعةاستخدمت التجارب تركيزات 20 نانوجرام/مل و10 نانوجرام/مل. العلاجات اللاحقة، بما في ذلك عضويوأجريت تجارب بودوسيت المشتقة من العضو العضوي، باستخدام 10 نانوغرام/مل. مثبط جاك 1/2،تم استخدام الباريسيتينيب (INCB028050) (Seleckchem، S2851) بتركيز نهائي قدره 10uM في جميعالتجارب.

ثقافة الخلايا البطانية الكبيبية البشرية الأولية. المتجمدمخزون منخفض المخاطر (G0G0) الإنسان الأساسيتم شراء الخلايا البطانية الكبيبية من Celprogen (36066-05)، وتم إذابتها وزراعتها في الإنسانزراعة الخلايا الأولية البطانية الكبيبية وسائل كاملة مع المصل، خالية من المضادات الحيوية (سيلبروجين،M36066-05SA) على ألواح مطلية بمصفوفة خارج الخلية خاصة (Celprogen، E36066-05-PD10 وE36066-05-12حسنًا) في البيئة المرطبة عند درجة حرارة 37 درجة و5% من ثاني أكسيد الكربون2. تم مرور الخلايا باستخدام 1Xالتربسين EDTA (سيلبروجين، T1509-014). واستخدمت الخلايا للتجارب بين المقاطع من 2 إلى 4.تم التحقق من صحة الخلايا بواسطة qRT-PCR مما يدل على التخصيب في التعبير الجيني PECAM1 (الخلية البطانيةعلامة، المعروف أيضا باسم CD31).

العزلة الكبيبية من الكلى البشرية المانحة وثقافة البودوسيت الفرعية.كانت كلية المتبرع البشريتم الحصول عليها من خلال التبادل الوطني لأبحاث الأمراض (NDRI). كان النمط الجيني APOL1 المانحجي0G1. تم إجراء العزل الكبيبي باستخدام طريقة الغربال المقتبسة من المنشور السابق (43،44). باختصار، أثناء العمل على الجليد في غطاء معقم، تم أولاً فك كبسولة الكلية وتقطيعها إلى نصفين في منتصف السهمي. تم تشريح النخاع بعيدا، وترك القشرة المتبقية. ثم تم فرم القشرةوتمريرها بالتتابع عبر مناخل شبكية من الفولاذ المقاوم للصدأ (أحجام 425 ميكرومتر، 250 ميكرومتر) ويتم تجميعها علىالجزء العلوي من منخل ثالث (150 ميكرومتر) أثناء الغسيل المتكرر بمحلول ملحي الفوسفات المبرد مسبقًا (PBS)مع 1٪ BSA (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) (Endecotts، المناخل 100SIW.150، 100SIW.250،100SIW.425). تم جمع الكبيبات وطردها وتعليقها في 5 مل من برنامج تلفزيوني. 10 ميكرولتر من العينةتم صبغها باستخدام كاشف NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific،R37605) وتصور بواسطة المجهر الضوئي. ثم تم تحضين الكبيبات في محلول الهضم[DMEM/F12، 1 ملغ/مل لكل من (الكولاجيناز I، IV، وV)، DNAse I (50 وحدة/مل أو 50 ميكروغرام/مل)] عند 37 درجة لـساعة واحدة للحصول على تعليق خلية واحدة (Thermo Fisher Scientific، 10565018؛ StemCell Technologies،07415 م 07426, 07430; سيجما الدريخ، 11284932001). DMEM/F12 مع 10% FBS (أنظمة البحث والتطوير،تمت إضافة S10350H) لإيقاف عملية الهضم وتم طرد العينة عند 450 جم دقيقة عند 4 درجات.تم زراعة الخلايا البودية المعزولة في Advanced RPMI (Fischer Scientific، MT10040CV) مع 10٪ FBSو1% بنسلين ستربتومايسين (Thermo Fisher Scientific، 15070063) على ألواح مغلفة بالفترونكتين(StemCell Technologies, 07004) عند 37 درجة و5% من ثاني أكسيد الكربون2. كانت الخلايا المزروعة فرعيًا مرئية في حوالي 5 أيام وتم علاجهم بعد أسبوعين في الثقافة.

استخراج البروتين والنشاف الغربي.تم الحفاظ على جميع لوحات وعينات الثقافة عند 4 درجة. أحادي الطبقةتم إفساد الخلايا وحصادها باستخدام Cell Lysis Buffer (Cell Signaling، 9803) مع اكتمالمثبط الأنزيم البروتيني المصغر ومثبط الفوسفاتيز (سيجما ألدريتش، 04693159001، 04906837001).

تم صوتنة العينات عند المستوى 4 لمدة 10 ثوانٍ لكل منها، وتم طردها عند 12000 دورة في الدقيقة × 5 دقائق، وتم طاف المادة الطافيةتم جمعها في أنبوب إيبندورف جديد، وتم تحديد تركيز البروتين عن طريق فحص البروتين BCA(بيرس، 23225). تم تخفيف lysates البروتين باستخدام 4x LaemmLi عينة عازلة 2- مركابتوإيثانول(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) وسخنه عند درجة 95-100 لمدة 5 دقائق. ليساتس البروتينتم بعد ذلك فصلها باستخدام المواد الهلامية الخالية من البقع Criterion TGX (4-20%) ونقلها باستخدام Bio-Rad Transنظام نقل لطخة توربو. تم حظر الأغشية المنقولة لمدة ساعة واحدة في حليب خالي الدسم بنسبة 3٪ في مخزن تريسملحي وحضنت بأجسام مضادة أولية محددة طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات. اليوم التالي بعدالغسيل القياسي ، تم تحضين الأغشية باستخدام بيروكسيداز الفجل الثانويالجسم المضاد لمدة لا تقل عن ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير باستخدام نظام التصوير Bio-Rad ChemiDoc MPحسب تعليمات الشركة المصنعة.

استخراج الحمض النووي الريبي وqRT-PCR.تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) من أحادي الطبقة للخلية باستخدام محلول تحلل RLT وQiagen RNEasy Mini Kit (74106) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) إلى [كدنا] باستخدامكواشف وبروتوكول Invitrogen SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher، 18091050).تم إجراء تفاعلات qRT-PCR باستخدام Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) وفحوصات التعبير الجيني باستخدام نظام QuantStudio 6 Flex(ثيرمو فيشر العلمي) باستخدام ∆∆Ct الطريقة مع GAPDH كجينات مرجعية.

التنميط الجيني.تم استخراج الحمض النووي من كتل الأنسجة FFPE باستخدام مجموعة الأنسجة QIAamp DNA FFPE(Qiagen، 56404) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء التنميط الجيني باستخدام النظم البيولوجية التطبيقيةفحوصات التمييز الأليلي لـ Taqman لـ G1 SNP (p.Ser342Gly) وتعدد الأشكال G2(p.Asn388_Tyr389del) باستخدام نظام QuantStudio 6 Flex. يتمتع هذا الاختبار بخصوصية تحليلية بنسبة 100%حساسية تحليلية (حد الاكتشاف) تبلغ 1.0 نانوغرام في الحمض النووي للكشف عنأبوول1متغيرات الخطر في الحمض النوويالمستخرجة من حيدات الدم المحيطية. تم التحقق من صحة المقايسات سابقا من خلال مقارنة النتائج معالتسلسل المباشر (تسلسل سانجر). وشملت تدابير مراقبة الجودة التنميط الجيني استخدامالتكرارات الفنية، مطابقة 100% للضوابط الإيجابية لكل نمط وراثي، والضوابط السلبية.

اشتقاق العضو الدقيق للكلية iPSC للمريض G1G2.تم اشتقاق الكائنات العضوية الدقيقة في الكلى وفقًا لـالبروتوكول رقم (27) مع بعض التعديلات. باختصار، الخلايا الجذعية البشرية المحفزة (iPSC)تم فصلها إلى خلايا مفردة باستخدام TrypLE Select وتم زرعها على ألواح مطلية بالفيترونيكتينوسائط StemFlex (Thermo Fisher Scientific، A3349401) مع مثبط Rho kinase 10uM (Tocrisالعلوم البيولوجية، 1254) بكثافة 11،000-14،000 خلية / سم2 ومثقف في بيئة رطبة في37 درجة و5% ثاني أكسيد الكربون2. تم بعد ذلك نقل الخلايا إلى وسائط TeSR-E6 (Stemcell Technologies، 05946) باستخدام8 ميكرومتر CHIR99021 (Tocris Bioscience، 4423) لمدة 4 أيام. من اليوم الخامس إلى اليوم السابع، تم علاج الخلايا200 نانوغرام/مل FGF9، 1 ميكروغرام/مل هيبارين و1 ميكرومتر CHIR99021. في اليوم السابع، تم غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ومنفصلة مع TrypLE. تم بعد ذلك غسل الخلايا المنفصلة باستخدام DMEM العادي وطردها عند300x جرام لمدة 5 دقائق. تمت إعادة تعليق بيليه الخلية في وسائط Stage1 [TeSR-E6 يحتوي على 200 نانوغرام / ملFGF9، 1 ميكروغرام/مل هيبارين، 1 ميكرومتر CHIR99021، 0.1% PVA، 10 ميكرومتر مثبط رو كيناز (Tocris Bioscience)]ونقلها إلى 24-لوحة بئر AggreWell 400 (Stemcell, 34411) بحوالي 1.2 مليونالخلايا / جيد. تم بعد ذلك طرد اللوحة عند 100x جرام لمدة 3 دقائق وحضنها لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة ثقافة الخلية القياسية. وبعد 48 ساعة (اليوم7+2)، تم العثور على الكائنات العضوية من AggreWellتم نقلها إلى 6-لوحة مرفقة منخفضة جيدًا مع وسائط Stage2 [TeSR-E6 تحتوي على 200 نانوجرام/مل FGF9، 1ميكروغرام/مل هيبارين، 1 ميكرومتر CHIR99021، 0.1% PVA] على شاكر مداري داخل حاضنة الخلية لمدة 72 أخرىساعات. من اليوم 7+5 فصاعدًا، تم تحديث جميع الكائنات العضوية باستخدام وسائط المرحلة 3 [TeSR-E6 التي تحتوي على0.1% PVA] في أيام بديلة حتى يتم استخدامه للتجارب.

عزل البودوسيت من الكائنات العضوية الدقيقة.تم تعديل عزل الكبيبات من عضويات الكلى من أالبروتوكول الموصوف سابقاً (45). باختصار، مجموعات من عضويات الكلى المشتقة من iPSC مع حرف أوليرقم الخلية البداية 1.2x106 تم فصل iPSCs عن طريق الحضانة باستخدام TrypLE Select (Thermoفيشر) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة. تم تطبيق الخلط اللطيف باستخدام ماصة 1 مل كل 2-3 دقيقة للمساعدةالتفكك. لكل مجموعة، تم وضع مصفاة خلية واحدة بحجم 70 ميكرومتر (PluriSelect) على أنبوب سعة 50 مل (Falcon)وتم ترطيب الشبكة باستخدام برنامج تلفزيوني. تمت إضافة محلول الخلية إلى ماصة 1 مل، مما يسمح بالتدفق من خلالمن الحل عن طريق الجاذبية. باستخدام المكبس من حقنة معقمة 1 مل، الخلية المتبقيةتم دفع المحلول الذي تم التقاطه على المصفاة بلطف عبر الشبكة. تم غسل المصفاة بهابرنامج تلفزيوني والتخلص منها، والحفاظ على تدفق الخلايا من خلال. تم بعد ذلك تمرير التدفق عبر الخلية إلى رطب مسبقًامصفاة خلايا بحجم 40 ميكرومتر (Pluriselect) وتوضع على أنبوب جديد سعة 50 مل (Falcon) مما يسمح بخلايا مفردةللتدفق عن طريق الجاذبية وغسل الغربال على نطاق واسع باستخدام PBS لإزالة أي مفردة متبقيةالخلايا. ثم تم جمع أكبر الكبيبات من مصفاة الخلية 40 ميكرومتر عن طريق قلب المنخل علىأنبوب 50 مل جديد وغسله باستخدام برنامج تلفزيوني لطرد الكبيبات التي تم التقاطها. كانت هذه العمليةكرر باستخدام التدفق من خلال عملية 40 ميكرومتر باستخدام مصفاة الخلية النهائية 30 ميكرومتر (PluriSelect) إلىجمع الكبيبات الأصغر. تم زراعة الكبيبات المعزولة من عضويات الكلى المشتقة من IPSCصفائح مطلية بالفيترونيكتين مع RPMI 1640 المتقدم الذي يحتوي على 10% FBS في ثقافة الخلية القياسيةالحاضنة عند 37 درجة بالإضافة إلى 5% ثاني أكسيد الكربون. تم تحديث الوسائط كل يوم حتى يتم استخدام الخلاياالتجارب.

تلطيخ المناعي، العضوية الدقيقة.تم غسل الكائنات العضوية الدقيقة في الكلى باستخدام برنامج تلفزيوني وثابت في 4٪ PFA في PBS لمدة 30-45 دقيقة على الجليد. تم بعد ذلك غسل الأعضاء الثابتة ثلاث مرات باستخدام برنامج PBS،وحضنت في 30% سكروز في برنامج تلفزيوني طوال الليل عند 4 درجات. تم تضمين الأعضاء العضوية في OCT وتعرض إلى 10 ميكرومتر من التجميد باستخدام ناظم البرد لايكا. تم غسل عمليات التجميد العضوي ثلاث مراتمرات باستخدام PBS ثم تم حجبها باستخدام المخزن المؤقت 1 (1% جيلاتين السمك، 2% مصل الحمير، 0.3% تريتونX-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تم تحضين عمليات التجميد باستخدام الابتدائيالأجسام المضادة في منع المخزن المؤقت 1 بين عشية وضحاها عند 4 درجات. تم غسل عمليات التجميد ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. بعدالغسيل، تم تحضين عمليات التجميد باستخدام الأجسام المضادة الثانوية في منع المخزن المؤقت 1 لمدة ساعتين في الغرفةدرجة حرارة. بعد خمس عمليات غسل باستخدام برنامج PBS، تم تركيب مقاطع التجميد باستخدام مضاد التلاشي Prolong Glassحل التركيب (Thermo Scientific، P36980). تم إنشاء صور الفلورسنت باستخدام ECHOمجهر.

تلطيخ المناعي، بودوسيت.تم غسل الثقافات بودوسيت مع برنامج تلفزيوني وثابتة في 4٪PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، تم غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيونيوتم حظره في منع المخزن المؤقت 2 (1٪ جيلاتين فيشر، 2٪ مصل الحمير، 0.1٪ سابونين في برنامج تلفزيوني) لـ 30-60دقيقة. تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الأولية في منع المخزن المؤقت 2 لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة(أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات). تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام حاجز عازل 2، واحتضانهاالأجسام المضادة الثانوية في منع المخزن المؤقت 2 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلاتمن خلال منع المخزن المؤقت 2 وغسل نهائي واحد باستخدام PBS، تم تركيب الخلايا باستخدام Drop-n-Stain EverBriteوسط التركيب (البيوتيوم، 23008). تم التقاط صور الفلورسنت باستخدام مجهر ECHO.

اختبار الجدوى. من أجل بقاء الخلية وقياسات ATP، كانت الخلايا المشتقة من الأعضاء مطليةعلى صفيحة جيدة 96- مطلية بالفيترونكتين في وسائط 100 ميكرولتر (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) ومثقف في RPMI المتقدم +10%FBS+1%PS (Fischer Scientific، MT10040CV؛ ThermoFisher Scientific, 15070063) في بيئة رطبة عند 37 درجة و5% ثاني أكسيد الكربون2. مشتقة من العضو العضويتم طلاء الخلايا الرجلية في نفس الوقت على 6-لوحة البئر لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) لـ qPCR وعلى 24-صفيحة جيدة لاستخدامها في الكيمياء المناعية (IHC). عولجت الخلايا في confluency ~ 80٪مع ستة شروط [التحكم، IFNG (10ng/mL)، IFNG (10ng/mL) + baricitinib (التركيز النهائي 10uM)،جميع السيتوكينات (10 نانوجرام/مل)، وجميع السيتوكينات (10 نانوجرام/مل) + البارسيتينيب (التركيز النهائي 10 ميكرومتر)]. وسائطتم تغييرها في Q48hrs وتم تقييم الخلايا في 96hrs. 96-تمت معالجة لوحة البئر باستخدام Promegaبقاء الخلية وفحوصات ATP كما هو مذكور أدناه؛ تمت معالجة 6-لوحة البئر من أجل RNAالاستخراج، وتوليف [كدنا]، وQRT-PCR؛ و24- تم إصلاح لوحة البئر بنسبة 4% من PFA لـ IHC. CellTiterفلورTMفحص صلاحية الخلية (Promega، G6080) وCellTiter-Glo® 2.0 الفحص (بروميجا، G9241) كانيتم تنفيذها باستخدام تعليمات البروتوكول القياسية المقدمة من قبل الشركة المصنعة. وكانت المقايسات متعددةلكل بروتوكول. كان الإسفار (مقايسة الأنزيم البروتيني غير التحللي) والتلألؤ (مقايسة ATP التحللي).تم قياسه باستخدام مقياس التألق SpectramaxM3. تم تحديد الفرق في التدابير من قبل الطالباختبار t غير المقترن.

إحصائيات.يتم تقديم جميع البيانات على أنها ± SD. تم استخدام برنامج GraphPad Prism 8.3.1 للبياناتanalysis. Cytokine conditions inducing >1.5 أضعافأبوول1نسخة مقارنة بالتحكم المعالج بالوسائطتم تحليل الأهمية باستخدام اختبار t غير المقترن مع تصحيح Holm-Sidak لعدة مراتمقارنات. القيم P المبلغ عنها هي القيم p المعدلة. تم تحديد الأهمية في ص<0.05.

الموافقة على الدراسة. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بجامعة ديوك،شمال كارولينا. لم تكن موافقة المريض المستنيرة مطلوبة من قبل مجلس الهجرة واللجوء (IRB) لأن هذا جزء من الحالةكانت الدراسة عبارة عن مراجعة بأثر رجعي للمواد المرضية السريرية والمحفوظة فقط. الكلى البشرية لتم شراء العزلة الكبيبية وثقافة البودوسيت الفرعية من خلال المركز الوطني لأبحاث الأمراضالتبادل (NDRI)؛ تمت الموافقة أيضًا على أبحاث الأنسجة البشرية هذه مسبقًا من خلال مجلس الهجرة واللاجئين التابع لجامعة ديوك. ندرييتطلب من جميع مواقع مصدر الأنسجة الحصول على موافقة مستنيرة من المتبرع بالأنسجة أو بديله.

الكاتب الاشتراكاتأجرى SEN وGL وSD وKS وDS تجارب ومخطوطات محررة. تم تنفيذ AW وDT وتفسير التشريح المرضي، وIHC، وتحرير المخطوطة. ساهم GH بالكواشف الأساسية وقام بتحرير ملفمخطوطة. قامت SEN وOAO بتصميم الدراسة، وتحليل البيانات وتفسيرها، والأرقام المصممة، وكتب وحرر المخطوطة.

شكر وتقديرتم دعم هذا العمل من قبل 1DP2DK124891-01، و1R01MD016401-01، وجائزة Whitehead Scholar Award.(أواو)؛ تم دعم SEN من خلال منحة تدريب Duke Nephrology T32 (5T32DK007731-24). نشكرSuzie Scales (Genentech) على الهدية السخية المتمثلة في الأجسام المضادة المحددة لـ APOL1-. نشكر البحثمختبر الأنسجة في جامعة ديوك BRPC وستيفن ر. كولون في PhotoPath، قسم علم الأمراض في جامعة ديوك.

مراجع

1. تشان إل، تشودري ك، ساها أ، شوهان ك، فيد أ، تشاو إس، وآخرون. القصور الكلوي الحاد لدى المرضى المصابين بفيروس كورونا في المستشفى-19. J صباحا سوك نيفرول.2021;32(1):151-60.

2. هيرش جس، نغ جه، روس دو، شارما ف، شاه سمو، بارنيت رل، وآخرون. إصابة الكلى الحادة لدى المرضىتم إدخاله إلى المستشفى مصابًا بفيروس كورونا-19.كثافة العمليات في الكلى.2020;98(1):209-18. 

3. ماي آر إم، كاسول سي، هانودي أ، لارسن سي بي، ليرما إيف، هاون آر إس، وآخرون. مجموعة متعددة المراكز بأثر رجعيتحدد الدراسة نطاق أمراض الكلى في مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19).كثافة العمليات في الكلى.2021.

4. وو ح، لارسن كب، هيرنانديز-أرويو CF، محمد إم إم بي، كازا تي، شارشير إم، وآخرون. AKI والانهياراعتلال الكبيبات المرتبط بـCOVID-19 والنمط الجيني APOL 1 عالي الخطورة.J صباحا سوك نيفرول.2020;31(8):1688-95. 

5. جينوفيز جي، فريدمان دي جي، روس إم دي، ليكوردير إل، أوزوريو بي، فريدمان بي، وآخرون. جمعيةمتغيرات ApoL1 المثقبية مع أمراض الكلى لدى الأمريكيين من أصل أفريقي.علوم.2010;329(5993):841-5.

6. فريدمان دي جي، وبولاك إم آر. اعتلال الكلية APOL1: من علم الوراثة إلى التطبيقات السريرية.كلين J صباحا شركة نفط الجنوبنيفرول.2020. 

7. فريدمان دي جي، وبولاك إم آر. APOL1 وأمراض الكلى: من علم الوراثة إلى علم الأحياء.آنو القس فيسيول.2020;82:323-42. 8. تسور إس، روسيت إس، شيمر آر، يودكوفسكي جي، سيليج إس، طارقجن إيه، وآخرون. الطفرات الخاطئة في APOL1ترتبط بشكل كبير بمخاطر الإصابة بأمراض الكلى في المرحلة النهائية والتي كانت تُعزى سابقًا إلى جين MYH9.هوم جينيت.2010;128(3):345-50. 

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

احصل على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد لعلاج عدوى الكلى